CN105838746A - 一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由顺9，顺12‑亚油酸制备反10，顺12‑共轭亚油酸的方法，该方法包括重组解脂亚罗酵母CCFM‑JU277‑9全细胞催化剂转移至缓冲液中，添加顺9，顺12‑亚油酸乳化液底物与乙酸钠，在摇床中进行催化反应，得到所述的反10，顺12‑共轭亚油酸。本发明反10，顺12‑共轭亚油酸产量远远高于现有技术达到的产量，并且本发明生产工艺简单，生产工艺稳定，生产成本低，具有非常良好的市场应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法。
【背景技术】
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，在7与9位、8与10位、9与11位、10与12位、11与13位或12与14位碳原子为顺式或反式共轭双键。其中反10，顺12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)是最重要的活性单体之一，主要具有抗癌生理活性及减少人类脂肪细胞中甘油三酯积累的功效。
来源于痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶(PAI)作用于(c9,c12-LA)亚油酸分子的C9双键，生成高度专一的t10,c12-CLA单体。本实验室将PAI在解脂耶氏酵母细胞内成功重组表达，并证明该重组菌株是适合t10,c12-CLA合成的微生物系统。全细胞催化拥具有许多优势，例如能为酶反应提供稳定环境、高效、可多批次转化、产物易分离、易控制等。利用完整的重组解脂耶氏酵母细胞作为催化剂，外源添加底物c9,c12-LA，全细胞催化合成t10,c12-CLA。但是，重组解脂耶氏酵母细胞壁和细胞膜成为影响底物c9,c12-LA进入细胞内与酶PAI接触，生成产物t10,c12-CLA高效输出的主要因素。增加细胞壁和细胞膜的通透性，可促进底物进入细胞内与酶接触并迅速催化反应，从而提高产物的合成效率，缩短整个全细胞催化反应时间，具体反应过程参见附图1。
关于全细胞催化合成单一的t10,c12-CLA文献报道较少，Xihong He等人在Yeast cell surface display of linoleic acid isomerase fromPropionibacterium acnes and its application for the production of trans-10,cis-12conjugated linoleic acid[J].Biotechnology and applied biochemistry，2015，62(1):1-8中描述了将亚油酸异构酶(PAI)在酿酒酵母中成功异源表达，使PAI定位在细胞表面，添加外源c9,c12-LA为底物，全细胞催化20h，优化了反应条件，仅仅获得25.4mg/L的t10,c12-CLA产量。
全细胞催化过程中，c9,c12-LA底物和t10,c12-CLA产物会被重组解脂耶氏酵母细胞通过β氧化额外消耗，抑制产物和底物的减少是急需解决的问题。王丽菊、余晓斌在十五碳二元酸发酵过程中β氧化的控制[J].生物技术，2008，18(4):76-78中研究了热带假丝酵母(Candida tropicalis)发酵过程中添加乙酸钠，能够作为碳源为生命活动提供能量，从而脂肪酸削弱β氧化，乙酸钠能够促进真菌发酵过程中脂质的积累。
针对现有技术存在的这些技术缺陷，本发明人通过大量实验研究与分析，终于研制出一种新的t10,c12-CLA制备方法。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法。
该方法的步骤如下：
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.05～1.00M、pH 6.0～8.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至15～45g/L，添加乙酸钠至0.5～2.5g/L，接着置于摇床中，在温度28～50℃与转速50～300rpm的条件下进行催化反应8～48h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的缓冲液是磷酸氢二钠与磷酸二氢钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述缓冲液的浓度是0.05～0.50M，它的pH值是6.8～7.5。
根据本发明的另一种优选实施方式，顺9，顺12-亚油酸乳化液配制方法如下：
将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.18～0.22％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化4～6分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
根据本发明的另一种优选实施方式，顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度是25～45g/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乙酸钠添加至1.0～2.0g/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述催化反应在温度35～40℃与转速50～250rpm的条件下进行15～48h。
根据本发明的另一种优选实施方式，将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.1M、pH 7.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至40g/L，添加乙酸钠至1.5g/L，接着置于摇床中，在温度40℃与转速200rpm的条件下进行催化反应40h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法。
该方法的步骤如下：
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.05～1.00M、pH 6.0～8.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至15～45g/L，添加乙酸钠至0.5～2.5g/L，接着置于摇床中，在温度28～50℃与转速50～300rpm的条件下进行催化反应8～48h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
本发明使用的重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂的制备方法步骤如下：
A、确定菌体收集时间
本发明使用的重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株保藏于在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.7284。CN103233036A、申请号为CN 201310120175.1的中国发明专利申请也公开了该菌株。在有些文献中，该菌株也可能被记载为重组耶氏解脂酵母CCFM-JU277-9。
在温度-80℃下保存的重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株在YNBD平板培养基中在温度28℃下活化培养4～5天，再在YNBD液体种子培养基中在温度28℃与转速200rpm的条件下摇床种子培养48h；得到的种子培养液接种于分别含有0.0～10.0g/L油酸的YPD液体培养基中进行培养，其中，添加的油酸代替YPD液体培养基中对应浓度的葡萄糖，使各组培养基中的碳元素含量保持一致。同时在不同的培养时间取样，样品经洗涤、干燥，称量并由下式计算得到菌体干重：
菌体干重(g/L)＝冻干菌体重量(g)/培养体系体积(L)；
以培养时间为横坐标，以菌体干重为纵坐标绘制生长曲线，由所述生长曲线确定收集菌体时间为36h；
所述的YPD液体培养基不含油酸时，它是含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物与20g/L胰蛋白胨的pH为6.8的培养基，该培养基在温度115℃下灭菌20min；所述的YPD液体培养基含有油酸时，只是使用油酸替代所述YPD液体培养基中对应浓度的葡萄糖，使各组培养基中的碳元素含量保持一致。其它不变。
所述的YNBD液体种子培养基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L无氨基酸无硫酸铵酵母氮源与5g/L硫酸铵的pH为5.5的培养基，该培养基在温度115℃下灭菌20min。
所述的YNBD固体种子培养基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L无氨基酸无硫酸铵酵母氮源、5g/L硫酸铵与20g/L琼脂粉的pH为5.5的培养基，该培养基在温度115℃下灭菌20min。
B、确定培养基中油酸浓度
将在含有0.0～10.0g/L油酸的YPD液体培养基中培养36h的重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株培养液，在温度4℃与8000r/min的条件下离心10min，并用灭菌生理盐水洗涤2次，收集酵母菌体，重悬于磷酸盐缓冲液中，使其湿菌体终浓度为100g/L，再添加底物c9,c12-LA，在转速200rpm、温度28℃与pH 6.8的条件下进行催化反应24h，根据t10,c12-LA产率确定在培养基中的油酸浓度为5.0g/L；
C、确定培养细胞时间
重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的YPDO培养基中进行培养，收集培养时间为32、36和40h的菌体，转移至20ml磷酸盐缓冲液中，再添加底物c9,c12-LA，在温度28℃下进行全细胞催化反应24h，以t10,c12-CLA产量为纵坐标，以培养时间为横坐标绘制出生长曲线，将t10,c12-CLA产量最高的培养时间确定为培养细胞时间；
D、透性化处理
在根据步骤A-C确定的条件下，重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的YPDO培养基中进行培养36h，收集培养时间为36h的菌体，重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9菌株全细胞转移至20ml磷酸盐缓冲液中，将全细胞湿重调节至100g/L，接着采用液氮速冻30s，然后在温度28℃的水浴中解冻4.5～5.5min，以同样方式重复进行3次，于是得到能够提高t10,c12-CLA产量的重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂。
在本发明中，所述的缓冲液是磷酸氢二钠与磷酸二氢钾缓冲液(即磷酸盐缓冲液)、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液。其中Tris-HCl缓冲液是由三(羟甲基)氨基甲烷与HCl组成的缓冲液；柠檬酸缓冲液是由柠檬酸和磷酸氢钠组成的缓冲液。它们都是本技术领域里通常使用的缓冲液。
在本发明中，在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，在磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液中进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应试验，同时测定了t10，c12-CLA产量，其t10，c12-CLA产量分别是10.05、9.05、10.70g/L，这些试验结果列于附图1中。所述催化反应与t10，c12-CLA产量测定方法将在下面详细描述。
由附图1可以看出，磷酸氢二钠与磷酸二氢钾缓冲液和柠檬酸缓冲液产量高，且无显著性差异，二者为最适缓冲液。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，以磷酸盐缓冲液浓度0.05、0.1、0.5和1.0M进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应试验，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于附图2中。由附图2可以看出，磷酸盐缓冲液为上述浓度0.05～1.0M范围时，其t10，c12-CLA产量分别是10.05、12.71、9.30、7.70g/L。由附图2还可以看出，磷酸盐缓冲液浓度优选地是0.05～0.50M，更优选地是0.1M。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，以柠檬酸缓冲液pH6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应试验，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于附图3中。由附图3可以看出，柠檬酸缓冲液pH为上述pH 6.0～8.0范围时，其t10，c12-CLA产量分别是3.81、6.62、10.05、11.17、11.07、7.00g/L。由附图3还可以看出，柠檬酸缓冲液pH优选地是6.8～7.5，更优选地是pH7.0。
在本发明中，把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L。
在本发明中，所述重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度应该理解是YPD培养基中菌体培养36h，收集培养液，在温度4℃与转速8000r/min的条件下离心10min，并用灭菌生理盐水洗涤2次，弃上层溶液，得下层酵母菌体，天平称量湿菌体重量，再取一定湿重菌体重悬所述缓冲液中，使湿菌体重量(g)与缓冲液体积(L)比为全细胞催化剂浓度(100g/L)。
如果所述的全细胞催化剂浓度小于100g/L，则会由于菌体量少，导致t10，c12-CLA产量降低，各组全细胞催化剂浓度一致才能保证后续确定催化反应条件实验在同一水平进行。
所述的全细胞催化剂湿重调节方法是天平称量。
根据本发明，顺9，顺12-亚油酸乳化液配制方法如下：
将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.18～0.22％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化4～6分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
所述的滤膜是目前市场上销售的产品，例如由金晶科技公司以商品名微孔滤膜(混纤.水系)销售的产品。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，以顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度15、20、25、30、35、40、45g/L进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应试验，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于附图4中。由附图4可以看出，顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度为15～45g/L时，其t10，c12-CLA产量分别是6.04、7.86、10.05、10.32、10.97、13.46、12.40g/L。由附图4还可以看出，顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度优选地是25～45g/L。更优选地是40g/L。
根据本发明，添加乙酸钠的基本目的是减少解脂亚罗酵母对于脂肪酸的β氧化降解作用，从而降低底物顺9，顺12-亚油酸和产物t10，c12-CLA的损耗。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，以乙酸钠浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应试验，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于图5中。由附图5可以看出，乙酸钠浓度为0.5～2.5g/L范围时，其t10，c12-CLA产量分别是10.05、11.76、12.10、12.52、12.27、11.44g/L。由附图5还可以看出，乙酸钠浓度优选地是1.0～2.0g/L，更优选地是1.5g/L。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，分别在温度28、30、35、37、40、45、50℃下进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于附图6中。由附图6可以看出，全细胞催化反应温度为28～50℃时，其t10，c12-CLA产量分别是10.05、10.10、11.36、12.99、15.57、0.62、0.47g/L。由附图6还可以看出，所述全细胞催化反应温度优选地是35～40℃，更优选地是40℃。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，分别在转速50、100、150、200、250、300rpm的条件下进行了本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于图7中。由附图7可以看出，在转速50～300rpm的条件下，其t10，c12-CLA产量分别是7.61、7.98、8.66、10.05、7.00、5.01g/L。由附图7还可以看出，其转速优选地是50～250rpm，更优选地是200rpm。
在其它催化反应条件和体系保持不变的情况下，本发明重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化反应分别进行8、16、24、32、40、48h时，同时测定了t10，c12-CLA产量，其试验结果列于图8中。由附图8可以看出，全细胞催化反应时间为8～48h时，其t10，c12-CLA产量分别是6.64、9.35、13.13、14.01、15.55、13.39g/L。由附图8还可以看出，全细胞催化反应时间优选地是15～48h，更优选地是40h。
非常优选地，根据本发明，将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.1M、pH 7.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至40g/L，添加乙酸钠至1.5g/L，接着置于摇床中，在温度40℃与转速200rpm的条件下进行催化反应40h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
在本发明中，以g/L计t10，c12-CLA产量是重组解脂亚罗酵母菌株CCFM-JU277-9全细胞催化反应生成的在细胞内和细胞外的以g计t10，c12-CLA总质量与以L计反应体系体积的比值。
细胞外脂肪酸分析如下：
取100μL转化液加到5ml干净玻璃瓶中，同时加入50μL十七烷酸脂肪酸内标和1mL 10％盐酸甲醇溶液，在温度50℃水浴中保温2h，接着冷却至室温，再加入1mL正己烷和1mL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡30s，在转速3000r/min下离心3min，移取上层溶液。再往沉淀物中加入1mL正己烷再次萃取，两次萃取液合并，用氮气吹干，然后加入1mL正己烷，振荡混匀，转入气相瓶进行高效气相色谱定性、定量分析，计算在细胞外的产物t10，c12-CLA含量。
细胞内脂肪酸分析如下：
称取20～25mg真空冷冻干燥的菌体于5mL玻璃瓶中，加入50μL的十七烷酸脂肪酸内标(5mg/ml)、1mL 10％盐酸甲醇溶液和500μL正己烷，在温度50℃水浴中保温3h(每半小时振荡1min)，接着冷却至室温，再加入500μL正己烷和1mL饱和氯化钠溶液，振荡混匀，以转速3000r/min离心分离3min，移取上层溶液，再往沉淀物中加入1mL正己烷再次萃取，两次萃取液合并，用氮气吹干，然后加入1mL正己烷，振荡混匀，转入气相瓶进行高效气相色谱定性、定量分析。计算在细胞内的产物t10，c12-CLA含量，并计算总脂质含量。
所述高效气相色谱分析的条件如下：
色谱柱为DB-WAX(30m×0.32mm，；Agilent，美国)、氢火焰离子(FID)检测器检测；氮气为载气，流量为2mL/min，采用分流方式进样1μL，分流比为15:1，进样口温度为240℃；升温程序如下：120℃保持3min，以5℃/min升温速度至190℃，再以1℃/min升温速度至温度达到210℃，保持3min。
脂肪酸甲酯标准品气相色谱分析，并通过保留时间对样品脂肪酸定性；十七烷酸甲酯为内标物，通过面积归一法计算共轭亚油酸的含量，进行定量分析。
通过数据处理计算全细胞转化体系中t10，c12-CLA产量：
t10,c12-CLA产量(g/L)＝(细胞内t10,c12-CLA含量(g)+细胞外t10,c12-CLA含量(g))/转化体系体积(L)
菌体无脂质生物量(g/L)＝(菌体干总重(g)-细胞内脂质总量(g))/转化体系体积(L)
t10，c12-CLA产率(g/g)＝t10，c12-CLA产量(g/L)/菌体无脂质生物量(g/L)
本发明由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法能够非常显著提高反10，顺12-共轭亚油酸产量，生产工艺简单，生产工艺稳定，生产成本低，具有非常良好的市场应用前景。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法能够得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸，远远高于现有技术达到的产量，并且本发明生产工艺简单，生产工艺稳定，生产成本低，具有非常良好的市场应用前景。
【附图说明】
图1是不同缓冲液对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图；
图2是磷酸盐缓冲液浓度对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图；
图3是柠檬酸缓冲液pH对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图；
图4是顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图；
图5是乙酸钠浓度对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图；
图6是全细胞催化反应温度对合成t10,c12-CLA产量影响的示意图；
图7是转速对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响的示意图；
图8是反应时间对全细胞催化合成t10,c12-CLA产量影响示意图。
图1-8中：字母a、b、c代表组间差异显著，P＜0.05。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：制备反10，顺12-共轭亚油酸
该实施例的实施步骤如下：
配制顺9，顺12-亚油酸乳化液：将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.20％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后使用由宁波新芝生物科技股份有限公司以商品名scientz-1200E销售的超声设备在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化5分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.50M、pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂湿重调节至100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至25g/L，添加乙酸钠至1.0g/L，接着置于由上海知楚仪器有限公司以商品名ZQZY-VS3销售的摇床中，在温度28℃与转速50rpm的条件下进行催化反应30h，采用本说明书描述的方法测定，得到反10，顺12-共轭亚油酸的产量为11.0g/L。
实施例2：制备反10，顺12-共轭亚油酸
该实施例的实施步骤如下：
配制顺9，顺12-亚油酸乳化液：将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.18％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后使用由宁波新芝生物科技股份有限公司以商品名scientz-1200E销售的超声设备在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化4分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.05M、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至15g/L，添加乙酸钠至0.5g/L，接着置于由上海知楚仪器有限公司以商品名scientz-1200E销售的摇床中，在温度35℃与转速100rpm的条件下进行催化反应8h，采用本说明书描述的方法测定，得到反10，顺12-共轭亚油酸的产量为11.5g/L。
实施例3：制备反10，顺12-共轭亚油酸
该实施例的实施步骤如下：
配制顺9，顺12-亚油酸乳化液：将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.22％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后使用由宁波新芝生物科技股份有限公司以商品名scientz-1200E销售的超声设备在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化5分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度1.00M、pH8.0的磷酸盐缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至45g/L，添加乙酸钠至2.5g/L，接着置于由上海知楚仪器有限公司以商品名ZQZY-VS3销售的摇床中，在温度50℃与转速300rpm的条件下进行催化反应48h，采用本说明书描述的方法测定，得到反10，顺12-共轭亚油酸的产量为12.4g/L。
实施例4：制备反10，顺12-共轭亚油酸
该实施例的实施步骤如下：
配制顺9，顺12-亚油酸乳化液：将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.20％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后使用由宁波新芝生物科技股份有限公司以商品名scientz-1200E销售的超声设备在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化6分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.70M、pH 7.5的柠檬酸盐缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至35g/L，添加乙酸钠至2.0g/L，接着置于由上海知楚仪器有限公司以商品名ZQZY-VS3销售的摇床中，在温度40℃与转速250rpm的条件下进行催化反应15h，采用本说明书描述的方法测定，得到反10，顺12-共轭亚油酸的产量为13.2g/L。
Claims (8)
1.一种由顺9，顺12-亚油酸制备反10，顺12-共轭亚油酸的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.05～1.00M、pH 6.0～8.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至15～45g/L，添加乙酸钠至0.5～2.5g/L，接着置于摇床中，在温度28～50℃与转速50～300rpm的条件下进行催化反应8～48h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲液是磷酸氢二钠与磷酸二氢钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于所述缓冲液的浓度是0.05～0.50M，它的pH值是6.8～7.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于顺9，顺12-亚油酸乳化液配制方法如下：
将顺9，顺12-亚油酸加到浓度为以重量计0.18～0.22％的Tween 80水溶液中，达到终浓度为200g/L，然后在频率20kHz与功率200w的条件下进行超声乳化4～6分钟，再通过0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到所述的乳化液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于顺9，顺12-亚油酸乳化液底物浓度是25～45g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的乙酸钠添加至1.0～2.0g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述催化反应在温度35～40℃与转速50～250rpm的条件下进行15～48h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于将重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂转移至浓度0.1M、pH 7.0的缓冲液中，再把重组解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9全细胞催化剂浓度调节至以菌体湿重计100g/L，然后添加顺9，顺12-亚油酸乳化液底物至40g/L，添加乙酸钠至1.5g/L，接着置于摇床中，在温度40℃与转速200rpm的条件下进行催化反应40h，得到11.0g/L以上的反10，顺12-共轭亚油酸。
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