BR102015004964A2 - método para obter variante natural de enzima e celobio-hidrolase super-termoestável - Google Patents

Abstract

método para obter variante natural de enzima e celobio-hidrolase super-termoestável. um método para se obter, seletivamente, um variante natural de uma enzima que tem atividade que inclui (1) uma etapa de detectar uma sequência de orf de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases de dna metagenômico da microbiota ambiental; (2) uma etapa de obter pelo menos um clone de pcr que inclui a sequência de orf que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de orf ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através da deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido em uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de orf, realizando-se a clonagem de pcr em pelo menos um dna metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um iniciador projetado com base na sequência de orf; (3) uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada através da sequência de base para cada clone de pcr obtido na etapa (2); e (4) uma etapa de selecionar uma variante natural de uma enzima que tem atividade através da medição de atividade de enzima de proteínas codificada por cada clone de pcr obtido na etapa (2).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA OBTER VARIANTE NATURAL DE ENZIMA E CELOBIO-HIDROLASE SUPER-TERMOESTÁVEL".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para obter uma variante natural de uma enzima e se refere a uma celobio-hidrolase super-termoestável obtida através do método.

[002] A prioridade é reivindicada no Pedido de Patente n- JP 2014-050083, depositado no dia 13 de março de 2014, cujo conteúdo encontra-se incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[003] A biomassa de lignocelulose está disponível de maneira abundante na Terra e, por esse motivo, espera-se que o biocombustí-vel, tal como o etanol cujo material bruto é a lignocelulose se torne uma energia de transporte que substitui os combustíveis fósseis. Para converter a lignocelulose em etanol, a hidrólise de celulose ou hemice-luloses deve ser realizada. A hidrólise de celulose é categorizada em dois métodos que incluem hidrólise de ácido sulfúrico e hidrólise enzi-mática. A hidrólise enzimática com o uso de glicosídeo -hidrolases, que são coletivamente chamadas de enzimas celulase em geral, tem as vantagens de não gerar pasta fluida de ácido sulfúrico diferente da hidrólise de ácido sulfúrico, consome uma pequena quantidade de energia e resulta em um maior rendimento sem gerar uma degradação excessiva da lignocelulose.

[004] A celulose que constitui as paredes de célula de planta tem uma estrutura de cristal em que as moléculas de celulose são combinadas uma com a outra através de uma ligação de hidrogênio forte e, consequentemente, a celulose praticamente não é dissolvida em água.

Entretanto, a hidrólise enzimática de celulose é uma reação de sólido-líquido. Durante a reação de sólido-líquido, a hidrólise da celulose cristalina ocorre sobre a superfície sólida e, consequentemente, a eficácia de hidrólise que resulta a partir da enzima é significativamente baixa. Por exemplo, a celobio-hidrolase (CBH) como uma -hidrolase de celulose principal resulta em uma taxa de hidrólise que é inferior à de outros lisados de polissacarídeo por um único algarismo ou dois algarismos. Consequentemente, a enzima deve ser usada em uma grande quantidade para a hidrólise de biomassa de celulose e esse é um fator principal que gera uma elevação no custo de biocombustíveis à base de celulose. Para reduzir o custo de etanol de celulose, a eficácia de hidrólise da enzima celulase deve ser amplamente aprimorada.

[005] Como um dos métodos para aprimorar a eficácia de enzima, a termoestabilidade da proteína enzimática é aprimorada. A fim de aprimorar a termoestabilidade da proteína enzimática, diversos meios para realizar a reengenharia da enzima através da introdução de mutação de aminoácido, tal como um método de evolução direcionada (DE), em que as sequências de aminoácidos são aleatoriamente substituídas, um método de mutagênese direcionado ao sítio (SDM), em que a substituição de aminoácidos é realizada apenas em um sítio específico e foi testado um método em que uma sequência quimérica é formada através da divagem de uma pluralidade de genes em diversos sítios e, em seguida, embaralhando-se os fragmentos.

[006] Teoricamente, a modificação de enzima realizada pelo método de DE tem uma eficácia insatisfatória. Isso se deve ao fato de que um, assim chamado, problema de "explosão combinatória" ocorre de modo que a quantidade de variantes aumente exponencialmente conforme a quantidade dos casos de mutação de ponto aumenta. A fim de se obter sequências de aminoácidos ideais, é necessário construir bibliotecas de mutantes para as combinações de todos os resíduos de aminoácido e para realizar um ensaio de funcionalidade de amino, entretanto, isso é impossível em princípio. Ademais, embora a maior parte das mutações sejam mutações de tipo de perda de função que resultam em perda de função, a mutação neutra ou a mutação do tipo de ganho de função através da qual as funções vantajosas são obtidas é extremamente rara e também retarda o método de DE ao pesquisar, de modo eficaz, as sequências de aminoácidos ideais.

[007] Devido ao fato de que uma quantidade enorme de bibliotecas de mutantes deve ser triada para se obter mutantes eficazes e ao fato de que não há um método de triagem de alto rendimento eficaz ou um sistema de expressão de gene estável (por exemplo, consulte Himmel e outros, Current Opinion in Biotechnology, 1999, volume 10, páginas 358 a 364.), a função da enzima celulase não foi suficientemente aprimorada pelo método de DE.

[008] Por exemplo, Nakazawa e outros relataram que endogluca- nase seja submetida à reengenharia EGIII de um fungo de apodrecimento de madeira, Trichoderma reesei, através do método de DE (consulte Nakazawa e outros, Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, volume 83, páginas 649 a 657). A EGIII é uma proteína que é constituída por 218 resíduos de aminoácido e tem um peso molecular relativamente pequeno. Entretanto, até mesmo no caso de uma proteína tão pequena, a quantidade de variantes obtidas através da introdução de mutação de modo a gerar uma substituição de aminoácidos em qualquer sítio único se torna 4.360 (20 x 218); a quantidade de variantes obtidas através da introdução de mutação em quaisquer dois sítios se torna 9.460.000 (20 x 20 x 218 x 217 -h 2); e a quantidade de variantes obtidas através da introdução de mutação em quaisquer três sítios se torna 13.624.130.000 (20 x 20 x 20 x (218 x 217 x 216 6)) devido à explosão combinatória.

[009] Para se obter variantes em que a mutação tenha ocorrido em apenas dois a três sítios, de dezenas de milhões a dezenas de bilhões de bibliotecas de mutantes devem ser construídas e a triagem funcional das mesmas deve ser realizada. Portanto, tal método não é prático. Embora Nakazawa e outros tenham realizado a triagem funcional para um total de 11.000 mutantes de primeira geração e segunda geração, a temperatura ideal da mesma foi aumentada em apenas + 5°C e os mesmos não atingiram um grande aprimoramento na termo-estabilidade. Naturalmente, se a escala da biblioteca de mutantes for pequena, os mutantes eficazes não são revelados. Ademais, de 9.000 colônias das bibliotecas de mutantes da primeira geração que foram submetidas à triagem funcional, as variantes que têm atividade hidrolí-tica de CMC são obtidas em apenas 46 colônias. Considera-se que as 8.954 mutantes restantes perderam sua função devido à mutação de aminoácido ou têm falha de expressão de gene e a maior parte das mutações aleatórias causadas por PCR errônea do método de DE resultam na perda de função da proteína enzimática. De tal maneira, devido ao fato de que o método de DE produz uma grande quantidade de mutantes de tipo de perda de função, a eficácia de triagem do mesmo é extremamente insatisfatória.

[0010] O método de embaralhamento de gene não foi bem sucedido na obtenção de genes quiméricos que têm a termoestabilidade superior à dos genes parentais dos mesmos. Por exemplo, Heinzelman e outros propuseram um método para aprimorar a função de uma enzima através da criação de genes quiméricos por meio da divagem de uma pluralidade de genes de celobio-hidrolase em diversos sítios e o embaralhamento dos fragmentos dos mesmos (consulte Heinzelman e outros, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, volume 106, páginas 5.610 a 5.615). De acordo com tal método, a fim de aprimorar a termoestabilidade de uma exoglucanase CBH II de Trichoderma reesei, os genes da enzima CBH II de fungos filamentosos termofílicos Humicola insolens e Chaeto-mium thermophilum são combinados através do embaralhamento de gene, preparando-se, assim, uma enzima quimérica. Entretanto, a termoestabilidade da enzima quimérica não é superior à da CBH II do fungo filamentoso termofílico Chaetomium thermophilum como uma parental da mesma e o embaralhamento de gene é ineficaz.

[0011] Embora o método de DE seja um método para gerar a substituição de aminoácidos através de mutação aleatória, o método de SDM é um método para gerar uma mutação tal como substituição, deleção ou inserção de aminoácidos com base nos dados de estrutura tridimensional de proteínas enzimáticas. Ao contrário do método de DE, o método de SDM não exige triagem de uma quantidade enorme de mutantes. Entretanto, em geral, é difícil identificar o sítio envolvido no aprimoramento da função de uma enzima e é raro que o método de SDM exerça um efeito marcado sobre o aprimoramento da enzima ce-lulase.

[0012] Por exemplo, na celobio-hidrolase, o N-terminal e o C-terminal da mesma têm uma estrutura de laço e forma uma estrutura de túnel que cobre o centro ativo. Com base em tal estrutura, foi testado o método de SDM para substituir o aminoácido no interior do laço. A fim de aprimorar a termoestabilidade, Zhang e outros estimaram a estrutura tridimensional de uma celobio-hidrolase, TfCel6B, de um ac-tinomiceto termofílico Thermobifida fusca, e introduziu uma ligação de dissulfeto no laço do N-terminal e do C-terminal de modo a formar a estrutura de túnel do sítio ativo através da mutação dupla. Entretanto, ao contrário de suas expectativas, na variante obtida, uma temperatura T50 em que as metades da atividade enzimática foram reduzidas em 10 °C (consulte Zhang e outros, European Journal of Biochemistry, 2000, volume 267, páginas 3101 a 3115). Zhang et al. relataram que, embora os resíduos de glicina em 4 sítios com alanina, serina e proli- na, sendo que nenhuma celobio-hidrolase dos mesmos cuja termoes-tabilidade foi aprimorada através da mutação foi obtida e a termoesta-bilidade foi reduzida em 5 °C a 10 °C na maior parte dos mutantes.

[0013] Ademais, Wohlfahrt e outros relataram que, para aprimorar a estabilidade do calor de uma celobio-hidrolase, TrCel6A, que pertence a uma família GH6 do fungo filamentoso T. reesei, foi fabricada uma variante através da introdução da mutação nos resíduos de ami-noácido posicionados no laço do N-terminal e no laço do C-terminal e resíduos de aminoácidos posicionados próximos aos laços e, como um resultado, uma temperatura de desnaturação térmica (Tm) da variante aumentou em um pH de 7,0, porém, o valor de Tm diminuiu em um pH de 5,0 que é o pH ideal de TrCel6A de tipo selvagem (consulte Wohlfahrt e outros, Biochemistry, 2003, volume 42, páginas 10.095 a 10.103). Entretanto, para estabilizar uma estrutura de exo-laço que forma um laço de túnel do centro ativo de uma celobio-hidrolase, TrCel7A, que pertence a uma família GH7 do fungo filamentoso T. reesei, von Ossowski e outros prepararam uma variante obtida através da introdução de uma ligação de SS (dissulfeto) no laço, porém, em tal variante, o aprimoramento da termoestabilidade não foi observado (consulte von Ossowski e outros, Journal of Molecular Biology, 2003, volume 333, páginas 817 a 829). Conforme descrito acima, a tentativa de introduzir uma ligação de hidrogênio ou uma ligação de SS no laço de C-terminal que forma a estrutura de laço, que é considerada profundamente envolvida com a função da enzima de celobio-hidrolase, foi realizada de diversas formas, porém, até o presente momento, a tentativa ainda não gerou sucedida no aprimoramento da função da enzima, tal como com o aprimoramento da termoestabilidade.

[0014] A partir da comparação entre genes homólogos de espécies, constatou-se que existe um domínio que é bem preservado e um domínio no qual a mutação de aminoácido é frequentemente introduzí- da. O domínio preservado é chamado de uma "sequência consenso" devido ao fato de ser uma sequência comum que caracteriza uma proteína de uma categoria específica. Se os resíduos de aminoácido na sequência consenso forem mutados, a enzima perde facilmente sua função. Se for considerado que, por esse motivo, o sítio foi bem preservado ao longo de um longo processo evolucionário. Consequentemente, a mutação que gera a mutação de aminoácido na sequência consenso tem uma grande probabilidade de resultar na perda de função. Portanto, o método de SDM foi testado, sendo que o mesmo gera a mutação em uma proteína, com a exceção da sequência consenso. Entretanto, tal método pode ser aplicado, apenas, às enzimas das quais a estrutura tridimensional de proteína é determinada através de análise de estrutura de cristal por raios X e existem apenas poucas proteínas enzimáticas das quais a estrutura tridimensional foi identificada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para se obter, de modo eficaz, uma variante de tipo de ganho de função.

[0016] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma celo-bio-hidrolase super-termoestável inovadora que é obtida através do método supracitado, um polinucleotídeo que codifica uma celobio-hidrolase super-termoestável, um vetor de expressão que é destinado a expressar a celobio-hidrolase super-termoestável, um transformante no qual o vetor de expressão foi incorporado e um método para fabricar um produto de degradação de celulose com o uso da celobio-hidrolase super-termoestável.

[0017] A fim de alcançar os objetivos acima, os presentes inventores realizaram pesquisas extensas. Como um resultado, constatou-se que se a PCR de colônia for realizada para uma grande quantidade de colônias de DNA metagenômico da microbiota contida em solo altitér-mico, por exemplo, 300 ou menos colônias de DNA metagenômico da microbiota contida no solo altitérmico com o uso de um iniciador que é projetado a partir de uma sequência de base de uma enzima de celo-bio-hidrolase separada do DNA metagenômico da microbiota contida no solo altitérmico, é possível se obter uma variante natural que causa a substituição de uma pluralidade de aminoácidos ou tem atividades de uma pluralidade de celobio-hidrolases super-termoestáveis que têm polimorfismo de nucleotídeo único silencioso (SNP). Com base nas constatações, os presentes inventores concluíram a presente invenção.

[0018] Na presente invenção, o termo "variante natural" se refere a um mutante que é gerado naturalmente (ou seja, gerado incidental-mente) em vez de ser gerado por meios artificiais.

[0019] O termo "super-termoestável" significa que uma temperatura ideal de uma atividade de enzima ou uma temperatura de desnatu-ração térmica de uma proteína enzimática é 80 °C ou mais.

[0020] Ou seja, um método para obter uma variante natural de uma enzima, um método para fabricar uma variante de uma enzima, uma celobio-hidrolase super-termoestável, um polinucleotídeo que codifica a celobio-hidrolase super-termoestável, um vetor de expressão que é para expressar a celobio-hidrolase super-termoestável, um transformante em que o vetor de expressão foi incorporado, um método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável, uma mistura de celulase e a método para fabricar a produto de degradação de celulose da presente invenção são exemplificados a seguir, de [1] a [13].

[0021] [1] Um método para obter seletivamente uma variante natural de uma enzima que tem atividade que inclui: [0022] (1) uma etapa de detectar uma sequência de ORF (dora- vante, também chamado de "quadro de leitura aberta" em alguns casos) de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases de DNA me-tagenômico da microbiota ambiental;

[0023] (2) uma etapa de obter pelo menos um clone de PCR que inclui a sequência de ORF que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de ORF ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através de deleção, substituição, ou adição de pelo menos um resíduo de amino-ácido em uma sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF, através da realização de clonagem de PCR em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF;

[0024] (3) uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de base para cada clone de PCR obtido na etapa (2); e [0025] (4) uma etapa de selecionar uma variante natural de uma enzima que tem atividade através da medição da atividade de enzima de proteínas codificadas por cada clone de PCR obtido na etapa (2).

[0026] [2] Método para fabricar uma variante de uma enzima que tem atividade, que inclui: [0027] (1) uma etapa de detectar uma sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases de DNA metagenômico de microbiota ambiental;

[0028] (2) uma etapa de obter pelo menos um clone de PCR que inclui a sequência de ORF que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de ORF ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através de deleção, substituição, ou adição de pelo menos um resíduo de amino- ácido em uma sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF, através da realização de clonagem de PCR em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF;

[0029] (3) uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de base para cada clone de PCR obtido na etapa (2);

[0030] (4) a etapa de medir a atividade de enzima de proteínas codificadas por cada clone de PCR obtido na etapa (2);

[0031] (5) uma etapa de investigar a relação entre a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ORF e a atividade de enzima após as etapas (3) e (4); e [0032] (6) uma etapa de fabricar uma variante aprimorada em termos da atividade de enzima gerando-se a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ORF, com base na relação entre a sequência de aminoácidos e a atividade de enzima que é obtida na etapa (5).

[0033] [3] O método para fabricar uma variante de uma enzima descrito em [2], em que o DNA metagenômico da microbiota ambiental é DNA metagenômico derivado do solo altitérmico e a enzima é uma enzima termoestável que exibe atividade de enzima em uma temperatura de pelo menos 70 °C.

[0034] [4] O método para fabricar uma variante de uma enzima descrita em [2] ou [3], em que a enzima é celulase.

[0035] [5] Uma celobio-hidrolase super-termoestática que tem um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que inclui (A) um polipep-tídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:1, (B) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através de deleção, substituição ou adi- ção de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de ami-noácidos representada através da SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a serina na 414a posição na sequência de aminoácidos, em que a deleção, substituição ou adição do aminoácido ainda não ocorreu, são excluídas) e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, ou (C) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (neste documento, na sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posição é a serina) que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com a sequência de aminoácidos representada através da SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[0036] [6] Um polinucleotídeo que tem um domínio que codifica um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que inclui (a) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada através da SEQ ID NO: 1, (b) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através da deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido da sequência de aminoácidos representada através da SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a serina na 414a posição na sequência de aminoácidos em que a deleção, substituição ou adição do aminoácido ainda não ocorreu, são excluídas) e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, (c) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (no presente documento, na sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posi- ção é a serina) que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com a sequência de aminoácidos representada através da SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, (d) a sequência de base que codifica um polipeptídeo que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, ou (e) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que é uma sequência de base de um polinucleotídeo hibridizado com um polinucleo-tídeo que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 sob condições rígidas e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[0037] [7] Um vetor de expressão em que o polinucleotídeo descrito em [6] foi incorporado e que pode expressar um polipeptídeo que tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5 em uma célula hospedeira.

[0038] [8] Um transformante em que o vetor de expressão descrito em [7] foi introduzido.

[0039] [9] O transformante descrito em [8] que é um microrganis-mo eucariota.

[0040] [10] Um método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável que inclui uma etapa de produzir uma celobio-hidrolase super-termoestável no transformante descrito em [8] ou [9].

[0041] [11] Uma mistura de celulase que contém a celobio-hidrolase super-termoestável descrita em [5] ou a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada pelo método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável descrita em [10] e pelo menos um outro tipo de celulase.

[0042] [12] Um método para fabricar um produto de degradação de celulose que inclui uma etapa de produzir um produto de degradação de celulose colocando-se um material que contém celulose em contato com a celobio-hidrolase super-termoestável descrita em [5], com o transformante descrito em [8] ou [9] ou a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada através do método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável descrita em [10].

[0043] [13] O método para fabricar um produto de degradação de celulose descrito em [12], que inclui adicionalmente uma etapa de colocar o material que contém celulose em contato com pelo menos um outro tipo de celulase.

[0044] Através do uso do método para obter uma variante natural de uma enzima de acordo com a presente invenção e com o método para fabricar uma variante de uma enzima com o uso do método supracitado, é possível obter de modo eficaz uma variante de tipo de ganho de função de uma enzima.

[0045] Ademais, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5. Portanto, a celobio-hidrolase super-termoestável é adequada para a hidró-lise de celulose sob condições de alta temperatura.

[0046] Ademais, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, o vetor de expressão ao qual o polinucleotídeo foi incorporado e o transformante em que o vetor de expressão foi introduzido são usados de maneira adequada para fabricar a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0047] A Figura 1 é uma vista que mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos de AR19G-166RA, AR19G-166QV, AR19G-166QA e AR19G-166RASFS no Exemplo 1.

[0048] A Figura 2 é uma vista que mostra resultados da análise de SDS-PAGE realizada no Exemplo 1 em proteínas enzimáticas de ce-lobio-hidrolase codificada por variantes naturais do gene AR19G-166.

[0049] A Figura 3 é uma vista que mostra resultados obtidos através da medição de atividade hidrolítica de PSA das proteínas enzimáticas de celobio-hidrolase codificadas pelas variantes naturais do gene AR19G-166 no Exemplo 1.

[0050] A Figura 4 é uma vista que mostra resultados obtidos através da medição atividade de celobio-hidrolase de AR19G-166RASFS em relação aos respectivos substratos no Exemplo 1.

[0051] A Figura 5 é uma vista que mostra resultados obtidos através da medição da atividade hidrolítica de PSA de AR19G-166RASFS nas respectivas temperaturas no Exemplo 1.

[0052] A Figura 6 é uma vista que mostra resultados obtidos atrav da medição da atividade hidrolítica de PSA (50 °C, 70 °C ou 90 °C) de AR19G-166RASFS nos respectivos níveis de pH no Exemplo 1.

[0053] A Figura 7 é uma vista que mostra resultados obtidos através da medição de uma temperatura T50, em que a atividade hidrolítica de PSA de AR19G-166RASFS diminui em 50% após a pré-incubação durante 40 minutos no Exemplo 1.

[0054] A Figura 8 é uma vista que mostram a alteração na intensidade de fluorescência de SYPRO Laranja que é causada como um resultado da desnaturação térmica das respectivas proteínas enzimáticas de AR19G-166RA e AR19G-166RASFS como uma variante de substituição de aminoácidos do AR19G-166RA no Exemplo 1. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

MÉTODO PARA OBTER VARIANTE NATURAL DE ENZIMA

[0055] O método para obter seletivamente uma variante natural de uma enzima que tem atividade de acordo com a presente invenção (doravante, chamada de "método para obter variante natural de acordo com a presente invenção" em alguns casos) se refere a um método para obter seletivamente uma variante natural de uma enzima que tem atividade a partir do DNA metagenômico preparado a partir da micro-biota ambiental, com o uso de um iniciador projetado com base em uma sequência de quadro de leitura aberta (ORF) do gene de enzima.

[0056] O DNA metagenômico pode ser preparado a partir da mi-crobiota ambiental através de um método conhecido com o uso de, por exemplo, um kit de extração de DNA (ISOIL Large for Beads versão 2, NIPPON GENE CO., LTD.).

[0057] Se uma biblioteca de variantes puder ser construída coletando-se apenas mutantes do tipo de ganho de função, é possível evitar a triagem desnecessária realizada para remover a enorme quantidade de mutantes disfuncionais gerados e obter, de modo eficaz, variantes que têm funções aprimoradas através da realização de um ensaio funcional em uma quantidade relativamente pequena de variantes de substituição de aminoácidos. O DNA metagenômico preparado a partir da microbiota ambiental inclui uma grande quantidade de variantes naturais de tipo de ganho de função. Portanto, se o DNA metagenômico for usado como uma base, é possível se obter, de modo eficaz, variantes de tipo de ganho de função.

[0058] Na presente invenção, o termo "que tem atividade" significa que existe uma diferença significativa na quantidade de extremidade de redução ou uma reação cromogênica, em relação a pelo menos um substrato, e comparação com o controle negativo.

[0059] O motivo pelo qual o DNA metagenômico preparado a partir da microbiota ambiental inclui uma grande quantidade de variantes naturais de tipo de ganho de função pode ser explicado com base na teoria neutra de evolução molecular. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) é um dos polimorfismos de sequência de base que ocorrem frequentemente no DNA genomico. Por exemplo, diz-se que no DNA genômico humano, o SNP ocorre aproximadamente em uma ba- se por cerca de 1.000 bases. O SNP que ocorre em genes causa a mutação de aminoácido ou causa mutação silenciosa que não sugere uma mutação de aminoácido, tal substituição sinônima ou SNP em um íntron. Quando o SNP gera a mutação de aminoácido, as proteínas codificadas pelo gene são submetidas a algumas alterações estruturais ou funcionais em alguns casos. De acordo com a teoria neutra da evolução molecular que é amplamente aceitada (Kimura, Nature, 1968, volume 217 (5.129), páginas 624 a 626), a mutação genética que causa substituição de aminoácidos, o que pode exercer uma influência negativa sobre a válvula de sobrevivência de indivíduos gerando-se a deterioração funcional ou falha funcional e, assim, é desvantajosa quanto à evolução, é excluída de um grupo. Em contraste, se a mutação for neutra ou vantajosa evolutivamente, um indivíduo que porta o gene mutante não é excluído do grupo. O gene é doado para a próxima geração e a diversidade genética, tal como o SNP, é acumulada. De acordo com a teoria neutra da evolução molecular, considera-se que a variante natural que tem o SNP que gera a substituição de aminoácidos inclui mutação neutra ou vantajosa que não gera uma falha funcional, ou seja, mutação do tipo de ganho de função.

[0060] Ou seja, o método para obter a variante natural de acordo com a presente invenção é um método para se obter seletivamente uma variante natural de uma enzima que tem atividade e inclui as seguintes etapas (1) a (4).

[0061] (1) Uma etapa de detectar uma sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases de DNA metagenômico de microbiota ambiental;

[0062] (2) Uma etapa de obter pelo menos um clone de PCR que inclui a sequência de ORF que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de ORF ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através de deleção, substituição, ou adição de pelo menos um aminoácido em uma sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF, através da realização de clonagem de PCR em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF;

[0063] (3) Uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de base para cada clone de PCR obtido na etapa (2) [0064] (4) Uma etapa de selecionar uma variante natural de uma enzima que tem atividade através da medição da atividade de enzima de proteínas codificadas por cada clone de PCR obtido na etapa (2).

[0065] O DNA metagenômico da microbiota ambiental está obtida fragmentando-se, fisicamente, o DNA genômico da microbiota ambiental (um grupo de microrganismos contidos em uma amostra ambiental) em pequenos pedaços. Como o DNA metagenômico da microbiota ambiental usado na presente invenção, é possível usar o DNA metagenômico preparado a partir de microbiota de solo, pasta fluida, água lacustre, água do mar e similares. Para obter uma enzima variante excelente em termos de termoestabilidade, é preferencial usar DNA metagenômico preparado a partir de microbiota de uma amostra coletada de um ambiente altitérmico. Os exemplos da amostra coletada de um ambiente altitérmico incluem uma amostra de solo de termas de alta temperatura e similares. Neste documento, os exemplos do "solo de termas de alta temperatura" incluem água de alta temperatura e similares que contêm solo, lama e biomassa de 30 °C a 80 °C e similares.

[0066] No método para obter uma variante natural que tem atividade de acordo com a presente invenção, primeiramente, com a etapa (1), uma sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima é detectada a partir de um banco de dados genômicos incluindo sequências de bases de DNA metagenômico de microbiota ambiental. O banco de dados genômicos pode ser realizando-se um método tal como um método de sequenciamento de tipo shotgun usado para se-quenciar a análise de DNA de cadeia longa no DNA metagenômico da microbiota ambiental.

[0067] Especificamente, o DNA metagenômico da microbiota ambiental está sujeito à montagem e anotação de dados de sequenciamento de tipo shotgun e uma sequência de ORF que codifica uma sequência específica de aminoácidos é detectado. A sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima-alvo pode ser detectada através de um conjunto de procedimentos conhecido de modo que a análise de homologia (identidade de sequência) de sequência de base com base em uma sequência de base de um gene que tem a atividade de enzima-alvo e cuja sequência de base já é conhecida. Por exemplo, a análise de homologia é, preferencialmente, estabelecida de modo a detectar uma sequência 30% ou mais homóloga à sequência de base de um gene que tem a atividade de enzima e cuja sequência de base já é conhecida.

[0068] Portanto, como a etapa (2), com o uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF, uma clonagem de PCR é realizada em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental. O iniciador a ser usado é, um iniciador que está projetado de modo que possa amplificar pelo menos um domínio que inclui um domínio de catalisador da enzima na sequência de ORF através de PCR. Reali-zando-se a clonagem de PCR a partir do DNA metagenômico, pelo menos um clone de PCR, que consiste em uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos formada através de dele-ção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de ORF que tem um comprimento completo; uma sequência parcial da sequência de ORF; ou uma sequência de aminoá- cidos codificada pela sequência de ORF, é clonado.

[0069] Então, a sequência de base de cada clone de PCR obtida na etapa (2) é analisada e uma sequência de aminoácidos codificada pelo clone de PCR é determinada (etapa (3)). Subsequentemente, uma proteína codificada pelo clone de PCR é fabricada, sendo que a atividade de enzima da proteína é medida e uma variante de uma enzima que tem atividade é selecionada (etapa (4)). De tal maneira, uma variante que tem atividade de enzima pode ser seletivamente obtida.

[0070] Na presente invenção, é preferencial realizar a clonagem de PCR em uma pluralidade de DNAs metagenômicos derivados a partir de diferentes fontes com o uso do mesmo iniciador. Se a clonagem de PCR for realizada não apenas no DNA metagenômico como uma base para projetar o iniciador, porém, em uma pluralidade de DNAs metagenômicos derivados de diferentes fontes e uma biblioteca de PCR for construída coletando-se colônias combinadas com um plasmídeo que contém fragmentos amplificados do iniciador projetado em grande escala, por exemplo, coletando-se centenas ou mais colônias, mais variantes de substituição de aminoácidos (variantes naturais) do gene de enzima são obtidos.

[0071] Em geral, na clonagem de PCR, os genes-alvo são clona-dos coletando-se 1 a 10 colônias. Entretanto, no método para obter uma variante natural de acordo com a presente invenção, é preferencial clonar genes coletando-se colônias em grandes quantidades, tais como 100 pelo menos, por cada amostra de DNA metagenômico. De tal maneira, é possível construir uma biblioteca constituída com variantes naturais incluindo vários SNPs dos genes de enzima-alvo.

MÉTODO PARA FABRICAR UMA VARIANTE DE ENZIMA

[0072] Na presente invenção, a variante natural biblioteca construída conforme mencionado acima é submetida à triagem funcional e de tal maneira, a função da enzima, tal como a termoestabilidade, é apri- morada de modo eficaz. Como um resultado, é possível fabricar de modo eficaz uma variante inovadora aprimorada em termos da atividade de enzima.

[0073] Ou seja, o método para fabricar uma variante de uma enzima de acordo com a presente invenção (doravante, o método será chamado como um "método para fabricar variante de acordo com a presente invenção" em alguns casos), compreende adicionalmente as seguintes etapas (5) e (6) além das etapas (1) a (4).

[0074] (5) Uma etapa de investigar a relação entre a sequência de aminoácidos codificada através da sequência de ORF e a atividade de enzima para uma pluralidade de variantes após as etapas (3) e (4) [0075] (6) Uma etapa de fabricar uma variante aprimorada em termos da atividade de enzima gerando-se a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ORF, com base na relação entre a sequência de aminoácidos e a atividade de enzima que é obtida na etapa (5).

[0076] Neste documento, o termo "aprimoramento de atividade de enzima" significa que a atividade da enzima codificada plea sequência de ORF, em que a deleção, substituição ou adição de pelo menos one resíduo de aminoácido ocorreu, é superior à atividade da enzima codificada pela sequência de ORF em que a deleção, substituição ou adição do resíduo de aminoácido ainda não ocorreu.

[0077] Por exemplo, na etapa (5), se as atividades de enzima de proteínas, que são codificadas por dois clones de PCR que diferem entre si em termos de um, dois ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácidos, forem comparadas uma com a outra, a mutação de aminoácido que pode aprimorar a atividade de enzima é claramente visualizada. Subsequentemente, na etapa (6), se a mutação de base para causar a mutação de aminoácido que pode aprimo- rar a atividade de enzima for introduzida tanto nos fragmentos de DNA que consistem na sequência de ORF ou no clone de PCR obtido na etapa (2) e, de tal modo, pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF é submetido à deleção, substituição ou adição, uma variante aprimorada em termos de atividade de enzima é fabricada. A substituição ou similares da base que é para gera a mutação de um, dois ou mais resíduos de aminoácido pode ser realizada por um método comum. CELOBIO-HIDROLASE SUPER-TERMOESTÁVEL

[0078] Conforme mostrado no Exemplo 1, que será descrito posteriormente, os presentes inventores prepararam o DNA genômico (DNA metagenômico) de um grupo de microrganismos do solo das termas de alta temperatura (por exemplo, água de alta temperatura e similares que contêm solo, lama e biofilme de 30 °C a 80 °C) coletados a partir de cinco sítios em um local no Japão. Com o uso dos respectivos DNAs metagenômicos, os presentes inventores realizaram o método para obter uma variante natural de acordo com a presente invenção e obtiveram uma celobio-hidrolase inovadora excelente em termos de termoestabilidade.

[0079] Especificamente, primeiro, a partir de um DNA metagenômico, treze quadros de leitura aberta (ORF) que têm um grau de ho-mologia de sequência de aminoácidos (ou seja, identidade igual ou superior a 30%) com uma enzima celobio-hidrolase (CBH) conhecida foram obtidos. Com base nas informações de sequência de base de tais ORFs, um iniciador foi projetado e através de PCR, o domínio de catalisador de celobio-hidrolase foi clonado a partir do DNA metagenômico do solo das termas de alta temperatura. O DNA clonado através de PCR (clone de PCR) foi incorporado em E. coli, de modo que uma proteína codificada pela sequência de base fosse expressa e a triagem funcional fosse realizada através de ensaio para a atividade de degradação do Avicel inchado por ácido fosfórico (PSA) atividade de degradação de carboximetilcelulose (CMC).

[0080] Por fim, a partir do quadro de leitura aberta AR19G-166, uma celobio-hidrolase super-termoestável inovadora (AR19G-166RA) que tem atividade de degradação de PSA foi obtido.

[0081] O quadro de leitura aberta AR19G-166 tem uma sequência incompleta em que a metionina do início do códon foi perdida. Consequentemente, o gene AR19G-166RA clonado a partir do ORF foi um gene parcial constituído apenas com um domínio de catalisador de GH6.

[0082] Portanto, com o uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF, cinco DNAs metagenômicos foram clonados através de clonagem de PCR. Como um resultado, doze tipos de variantes de substituição de aminoácidos de AR19G-166RA foram finalmente obtidos. A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é AR19G-166RASFS (uma variante em que o resíduo de aminoácido na 299a posição é a arginina, o resíduo de aminoácido na 351a posição é alanina, o resíduo de aminoácido na 88a posição é serina, o resíduo de aminoácido na 230a posição é a fenilalanina e o resíduo de aminoácido na 414a posição é a serina) que tem a maior termoestabilidade dentre as variantes de AR19G-166RA. A sequência de aminoácidos de AR19G-166QA que apareceu mais frequentemente é representada por SEQ ID NO: 3, e a sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos é representada por SEQ ID NO:4. A sequência de aminoácidos de AR19G-166RASFS é representada por SEQ ID NO: 1 e a sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos está representada por SEQ ID NO: 2.

[0083] Conforme mostrado no Exemplo 1, que será descrito posteriormente, a AR19G-166RASFS exibiu um alto grau de atividade hidro-lítica em relação ao PSA. Ademais, a AR19G-166RASFS exibiu ativi- dade de degradação em relação ao Lichenan que consiste em glucano que tem uma ligação de β-1,3 e uma ligação de β-1,4 ou ao Avicel como celulose cristalina, embora a atividade de degradação tenha sido fraca. Por outro lado, a AR19G-166RASFS quase não exibiu nenhuma atividade de degradação em relação à CMC ou ao Laminarina que consiste em glucano que tem uma ligação β-1,3 e uma ligação β-1,6. Ademais, como um resultado de pesquisa para a sequência de amino-ácidos da AR19G-166RASFS em um banco de dados de sequência de aminoácidos conhecido, confirmou-se que uma sequência de aminoá-cidos que tem a maior identidade de sequência com a sequência de aminoácidos supracitada é um glicosídeo -hidrolase (SEQ ID NO: 11) que pertence a uma família GH6 de Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 como uma bactéria termofílica mesofílica no filo Chlroflexi e a identidade de sequência foi de apenas 66%. A especificidade de substrato, análise por HPLC do produto de uma reação de hidrólise de PSA e a identidade de sequência (homologia) da sequência de aminoácidos com a celobio-hidrolase conhecida mostrou claramente que a AR19G-166RASFS é uma celobio-hidrolase inovadora que pertence à família GH6.

[0084] A AR19G-166RASFS tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5. Na realidade, conforme mostrado em <9> de Exemplo 1, que será descrito posteriormente, a AR19G-166RASFS exibe a atividade de celobio-hidrolase em uma ampla faixa de temperatura de 50 °C a 95 °C. O grau de atividade de celobio-hidrolase da AR19G-166RASFS expressa com o uso de E. coil conforme um hospedeiro é intensificado conforme a temperatura é aumentada na faixa de 50 °C a 95 °C e a termoestabilidade da AR19G-166RASFS é muito melhor do que a da AR19G-166QA e as variantes de substituição de aminoácidos da AR19G-166QA.

[0085] Em geral, em uma proteína que tem uma determinada atividade fisiológica, a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido podem ser realizadas sem prejudicar a atividade fisiológica. Em outras palavras, na AR19G-166RASFS, a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido pode ser realizada sem fazer com que a enzima perca atividade de celobio-hidrolase.

[0086] Ou seja, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é uma celobio-hidrolase super-termoestável que tem um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que consiste em qualquer uma de (A) a (C) a seguir.

[0087] (A) Um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:1.

[0088] (B) Um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através da deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina está na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a serina está na 414a posição na sequência de aminoácidos, em que a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido ainda não ocorreu, são excluídas) e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[0089] (C) Um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (neste documento, em uma sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posição é a serina) que tem identidade de sequência igual ou superior a 85% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[0090] No polipeptídeo (B), a quantidade de resíduos de aminoáci- do na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 que são submetidos à deleção, substituição ou adição é, de preferência, de 1 a 20, mais preferencial mente 1 a 10 e ainda mais preferencialmente de 1 a 5.

[0091] No polipeptídeo (C), a identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 não é particularmente limitada, contanto que a identidade de sequência seja igual ou superior a 80%. Entretanto, a identidade de sequência é, preferencialmente, igual ou superior a 85%, mais preferencialmente igual ou superior a 90% e ainda mais preferencialmente igual ou superior a 95%.

[0092] A identidade de sequência (homologia) entre as sequências de aminoácidos é obtida da seguinte maneira. Ou seja, em um estado em que um vão é formado em posições em que a inserção e a deleção ocorrem, duas sequências de aminoácidos estão justapostas uma em relação à outra, de modo que os aminoácidos correspondentes se tornem tão idênticos entre si quanto possível; e a razão dos aminoácidos idênticos para as sequências de aminoácidos totais, excluindo o vão no alinhamento obtido, é calculada como a identidade de sequência. A identidade de sequência entre as sequências de aminoácidos pode ser obtida com o uso de vários softwares de pesquisa de homologia conhecidos no campo da técnica relacionada. Na presente invenção, o valor da identidade de sequência da sequência de aminoácidos é obtido através do cálculo com base no alinhamento obtido através do software de pesquisa de homologia conhecido BLASTP.

[0093] Os polipeptídeos (B) e (C) podem ser artificialmente projetados. Alternativamente, os mesmos podem ser tanto homólogos à AR19G-166 e similares quanto às proteínas parciais da mesma.

[0094] Cada um dos polipeptídeos (A) a (C) pode ser quimicamen-te sintetizado com base na sequência de aminoácidos. Alternativamen- te, os mesmos podem ser produzidos através de um sistema de expressão de proteína com o uso de polinucleotídeos de acordo com a presente invenção que será descrita posteriormente. Ademais, cada um dos polipeptídeos (B) e (C) pode ser artificialmente sintetizado através do de um conjunto de procedimentos de recombinação genética de modo a introduzir a mutação de aminoácido, com base no poli-peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1.

[0095] Os polipeptídeos (A) a (C) têm uma atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5. Os polipeptídeos têm um grau extremamente alto de atividade de celobio-hidrolase até mesmo em uma temperatura de 80°C a 100 °C. Portanto, se a enzima tiver qualquer um dos polipeptídeos (A) a (C) com um domínio de catalisador de celobio-hidrolase, uma celobio-hidrolase super-termoestável pode ser obtida.

[0096] A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção tem PSA como um substrato. A celobio-hidrolase super-termoestável pode ter um β glucano diferente de PSA como o substrato. Os exemplos dos glucanos mencionados anteriormente incluem β Lichenan que consiste em uma ligação β-1,3 ideal e uma ligação β-1,4, celulose cristalina tal como Avicel, bactérias de celulose cristalina (Bacterial microcrystalline cellulose, BMCC) e filtros de papel, carbometiicelulose (CMC), glucano que consiste em uma ligação β-1,3 e uma ligação β-1,6, glucano que consiste em uma ligação β-1,3, glucano que consiste em uma ligação β-1,6, xilano e similares. A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção tem, preferencialmente, como o substrato, PSA e pelo menos um dentre glucano que consiste em uma ligaçõ β-1,3 e uma ligação β-1,4 e celulose cristalina e mais preferencialmente tem, como o substrato, PSA, glucano que consiste em uma ligação β-1,3 e uma ligação β-1,4 e celu- lose cristalina.

[0097] O pH ideal da celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é na faixa de um pH de 5,0 a um pH de 6,5, embora o mesmo varie com a temperatura de reação. A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção exibe, preferencialmente, uma atividade de celobio-hidrolase pelo menos em uma faixa de um pH de 5,0 a um pH de 6,5 e, mais preferencialmente, exibe uma atividade de celobio-hidrolase em uma faixa de um pH de 4,0 a um pH de 7,0.

[0098] A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser atividade hidrolítca de celulose além da atividade de celobio-hidrolase. Os exemplos das outras atividades hi-droiítcas de celulose supracitadas incluem uma atividade de endoglu-canase, atividade de xilanase, atividade de β-glucosidase e similares.

[0099] A celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser uma enzima que inclui apenas um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que consiste em qualquer um dos polipeptídeos (A) a (C) ou pode incluir outros domínios. Os exemplos de outros domínios incluem domínios diferentes de um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que as celobio-hidrolases conhecidas têm. Por exemplo, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção inclui enzimas que são obtidas substituindo-se o domínio de catalisador de celobio-hidrolase de celobio-hidrolases conhecidas pelos polipeptídeos (A) a (C).

[00100] Quando a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção inclui um domínio além do domínio de catalisador de celobio-hidrolase, é preferencial que a celobio-hidrolase super-termoestável inclua um módulo de ligação de celulose. O módulo de ligação de celulose pode estar posicionado a montante (lado do N-terminal) ou a jusante (lado do C-terminal) do domínio de catalisador de celobio-hidrolase. Ademais, o módulo de ligação de celulose e o domínio de catalisador de celobio-hidrolase podem estar diretamente ligados um ao outro ou ligados um ao outro através de um domínio li-gante que tem um comprimento adequado. Na celobio-hidrolase su-per-termoestável de acordo com a presente invenção, o módulo de ligação de celulose está, preferencialmente, conectado a montante ou jusante do domínio de catalisador de celobio-hidrolase através do domínio ligante e, mias preferencialmente, conectado a montante do domínio de catalisador de celobio-hidrolase através do domínio ligante.

[00101] O módulo de ligação de celulose contido na celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é, preferencialmente, um domínio que tem uma habilidade de se ligar à celulose, por exemplo, PSA ou celulose cristalina, e a sequência de aminoácidos do mesmo não é, particularmente, limitada. Como o módulo de ligação de celulose, por exemplo, o módulo de ligação de celuloses incluído nas proteínas conhecidas ou nos domínios obtidos modificando-se adequadamente os módulos supracitados pode ser usado. Ademais, quando a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção tem o domínio de catalisador de celobio-hidrolase e o módulo de ligação de celulose, os mesmos são, preferencialmente, conectados um ao outro através de uma sequência ligante. A sequência de aminoácidos, o comprimento e similares da sequência ligante não são, particularmente, limitados. Além disso, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ter, adicionalmente, um peptídeo de sinal, que pode ser localizado ao ser transferido para um domínio específico em uma célula ou um peptídeo de sinal, que é secretado do lado de fora de uma célula, no N-terminal ou no C-terminal. Os exemplos do peptídeo de sinal incluem um peptídeo de sinal de transporte apoplástico, um peptídeo de sinal de retenção de retículo endoplasmático, um peptídeo de sinal de transporte nuclear, um peptídeo de sinal de secreção e similares. Os exemplos do peptídeo de sinal de retenção de retículo endoplasmático incluem um peptídeo de sinal consiste um uma sequência de aminoá-cidos de HDEL e similares.

[00102] Ademais, quando a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é produzida com o uso de um sistema de expressão, para torna possível simplesmente purificar a enzima, várias etiquetas podem ser adicionadas, por exemplo, ao N-terminal ou ao C-terminal. Como as etiquetas, por exemplo, é possível usar etiquetas, tais como a etiqueta de His, uma etiqueta de hemaglu-tinina (HA), uma etiqueta de hemaglutinina Myc e uma etiqueta de sinalização, que são amplamente usadas para a expressão e purificação de proteínas recombinantes.

POLINUCLEOTÍDEQ DE CODIFICAÇÃO DE CELOBIO-HIDROLASE SUPER-TERMOESTÁVEL

[00103] O polinucleotídeo de acordo com a presente invenção codifica a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção. A celobio-hidrolase super-termoestável pode ser produzida através do uso de um sistema de expressão de um hospedeiro que é obtido através da introdução de um vetor de expressão, no qual o polinucleotídeo foi incorporado, no hospedeiro.

[00104] Especificamente, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção é um polinucleotídeo que codifica um domínio que inclui um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que consiste em qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos (a) a (e).

[00105] (a) Uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.

[00106] (b) Uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através de deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoá-cido da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a serina na 414a posição estão excluídas) e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[00107] (c) Uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (no presente documento, na sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posição é a serina) que tem uma identidade de sequência igual ou superior a 85% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[00108] (d) Uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[00109] (e) Uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que é uma sequência de base de um polinucleotídeo hibridizado com um polinucleotídeo que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 sob condições rígidas e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

[00110] Na presente invenção e no presente relatório descritivo, os exemplos das "condições rígidas" incluem o método descrito em Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL Terceira edição (Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Por exemplo, sob a condição, em um tampão de hibridização que consiste em 6x SSC (composição de 20x SSC: cloreto de sódio 3 M, solução de ácido cítrico 0,3 M, um pH de 7,0), 5x solução de Denhardt (composição de 100x solução de Denhardt: 2%, em massa, de albumina de soro bovino, 2%, em massa, de ficoll, 2%, em massa, de polivinilpirrolidona), 0,5%, em massa, de SDS, 0,1 mg/ml de DNA de espermatozóide de salmão e 50% de formiamido, a hibridização é realizada através da incubação das proteínas durante diversas horas ou de um dia para o outro em uma temperatura de 42 °C a 70 °C. Conforme um tampão de lavagem usado para lavar após a incubação, uma solução de 1x SSC que contém 0,1%, em massa, de SDS é preferencial e uma solução de 0,1x SSC que contém 0,1%, em massa, de SDS é mais preferencial.

[00111] Nas sequências de bases (a) a (e), como um códon degenerado, é preferencial selecionar uma sequência que é muito frequentemente usada como um códon do hospedeiro. Por exemplo, a sequência de base (a) pode ser tanto a sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 quanto uma sequência de base obtida modificando-se a sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 no códon que é muito frequentemente usado no hospedeiro sem alterar a sequência de aminoácidos a ser codificada. A modificação do códon pode ser realizada por conjuntos de procedimentos de recombinação genética.

[00112] O polinucleotídeo que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 pode ser quimicamente sintetizado com base em informações de sequência de base. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser obtido adquirindo-se um gene de comprimento completo que codifica AR19G-166 (o gene pode ser chamado de um "gene AR19G-166" em alguns casos) ou um domínio parcial do mesmo que inclui o domínio de catalisador de celobio-hidrolase da natureza através do uso de um conjunto de procedimentos de recombinação genética. Por exemplo, o gene de comprimento completo AR19G-166 ou o domínio parcial do mesmo pode ser obtido de uma maneira em que uma amostra que contém microrganismos seja obtida da natureza; e uma PCR é realizada com o uso de um iniciador direto e um iniciador inverso projetados através de um método comum com base na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 através do uso de DNA genômico coletado da amostra como um modelo. O cDNA, que é sintetizado por uma reação de transcrição inversa realizada com o uso de mRNA coletado da amostra como um modelo, pode ser usado como um modelo. Ademais, a amostra, da qual um ácido nucleico a ser um modelo é coletado, é preferencialmente uma amostra coletada de um ambiente de alta temperatura tal como o solo de uma terma.

[00113] Na sequência de base (d), a identidade de sequência com a sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 não é particularmente limitada contanto que seja igual ou superior a 80%. Entretanto, uma identidade de sequência é, preferencialmente, igual ou superior a 85%, mais preferencialmente, igual ou superior a 90% e, ainda mais preferencialmente, igual ou superior a 95%.

[00114] A identidade de sequência (homologia) entre as sequências de bases é obtida da seguinte maneira. Ou seja, em um estado em que um vão é formado nas posições em que a inserção e deleção ocorrem, duas sequências de bases são justapostas uma em relação à outra de modo que as sequências de bases correspondentes se tornem tão idênticas uma à outra quanto possível; e uma razão das sequências de bases idênticas para as sequências de bases totais exclu-indo-se o vão no alinhamento obtido conforme calculado como a identidade de sequência. A identidade de sequência entre as sequências de bases pode ser obtida com o uso de vários softwares de pesquisa de homologia conhecidos no campo da técnica relacionada. Na presente invenção, o valor da identidade de sequência da sequência de base é obtido através do cálculo com base no alinhamento obtido pelo software de pesquisa de homologia conhecido, BLASTN.

[00115] Por exemplo, cada um dos polinucleotídeos que consistem na sequência de base (b) ou (c) pode ser artificialmente sintetizado causando-se a deleção, substituição ou adição de pelo menos uma base no polinucleotídeo que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2. Ademais, a sequência de base (b) ou (c) pode ser uma sequência de comprimento completo ou uma sequência parcial de um gene homólogo ao gene AR19G-166. O gene homólogo ao gene AR19G-166 pode ser obtido através de um conjunto de procedimentos de recombinação genética usado para se obter um gene homólogo a um gene cuja sequência de base já é conhecida.

[00116] O polinucleotídeo de acordo com a presente invenção pode ter apenas o domínio que codifica o domínio de catalisador de celobio-hidrolase. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ter domínios que codificam um módulo de ligação de celulose, uma sequência ligante, vários peptídeos de sinal, várias etiquetas e similares, em adição ao domínio supracitado.

VETOR DE EXPRESSÃO

[00117] O vetor de expressão de acordo com a presente invenção é um vetor de expressão em que o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção foi incorporado e que expressa um polipeptídeo que tem atividade de celobio-hidrolase em uma célula hospedeira sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5. Ou seja, é um vetor de expressão em que o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção foi incorporado em um estado em que pode expressar a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção. Especificamente, um cassete de expressão, que consiste em DNA que tem uma sequência promotora, o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção e DNA que tem uma sequência de terminador localizada a montante, deve estar incorporado no vetor de expressão. O polinucleotídeo pode estar incorporado no vetor de expressão com o uso de um conjunto de procedimentos de recom-binação genética conhecido e um kit de preparação de vetor de expressão comercialmente disponível pode ser usado.

[00118] O vetor de expressão pode ser um vetor de expressão introduzido em células procariontes tais como E. coli ou um vetor de expressão introduzido em células eucariotas, tais como levedura, fungos filamentosos, células de cultura de inseto, células de cultura de mamífero e células de planta. Como tais vetores de expressão, qualquer um dos vetores de expressão geralmente usados, compatíveis com o hospedeiro, pode ser usado.

[00119] O vetor de expressão de acordo com a presente invenção não é limitado ao polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, e é, preferencialmente, um vetor de expressão em que um gene resistente a fármaco ou similares tenham sido incorporados. Isso deve pelo fato de que tal vetor de expressão torna fácil selecionar um hospedeiro que foi submetido a uma transformação e um hospedeiro que não foi submetido a uma transformação.

[00120] Os exemplos do gene resistente a fármaco incluem um gene resistente a canamicina, um gene resistente a higromicina, um gene resistente a bialafos e similares.

TRANSFORMANTE

[00121] O transformante de acordo com a presente invenção contém o vetor de expressão de acordo com a presente invenção introduzido no mesmo. No transformante, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser expressa. As celobio-hidrolases conhecidas na técnica relacionada são expressas apenas em uma faixa estreita de hospedeiros de expressão. Ou seja, muitas das celobio-hidrolases não são facilmente expressas em diferentes tipos de células hospedeiras. Por outro lado, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser expressa em uma ampla faixa de células de expressão, tal como E. coil, levedura, fungos filamentosos e o cloroplasto de plantas superiores. Ou seja, o transformante de acordo com a presente invenção inclui E. coil, levedura, fungos filamentosos, o cloroplasto de plantas superiores e similares nos quais o vetor de expressão da presente invenção foi introduzido.

[00122] O método para preparar o transformante com o uso do vetor de expressão não é particularmente limitado e pode ser realizado através de métodos geralmente usados para preparar transformantes. Os exemplos dos métodos incluem um método de agrobactéria, um método de canhão de partículas, um método de eletroporação, um método de polietileno glicol (PEG) e similares. Quando o hospedeiro é uma célula de planta, é preferencial usar um método de canhão de partículas ou um método de agrocbactéria dentre os métodos acima.

[00123] Em outro aspecto, os hospedeiros em que o vetor de expressão é introduzido podem ser células procariontes, tais como E. coli ou células eucariotas tais como levedura, fungos filamentosos, células de cultura de inseto, células de cultura de mamífero e células de planta. Cultivando-se os transformantes de E. coli, a celobio-hidrolase su-per-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser produzida em massa de modo mais simples. Entretanto, em células eucariotas, a proteína é submetida à glicosilação. Portanto, se os transformantes das células eucariotas forem usados, uma celobio-hidrolase super-termoestável superior em termos de termoestabilidade é obtida em comparação a um caso de uso dos transformantes das células procariontes. Particularmente, quando os transformantes são micror-ganismos eucariotas, tal como um fungo filamentoso como Aspergillus ou levedura, uma celobio-hidrolase super-termoestável superior em termos de termoestabilidade pode ser produzida em massa de uma maneira relativamente simples.

[00124] Quando as células procariontes, levedura, fungos filamen-tosos, células de cultura de inseto, células de cultura de mamífero e similares são usados como hospedeiros, em geral, os transformantes obtidos podem ser cultivados através de um método comum da mesma maneira usada para os hospedeiros que não foram submetidos a uma transformação.

[00125] Quando o transformante de acordo com a presente invenção é uma planta, como o hospedeiro, a célula de cultura de planta, os órgãos de planta ou tecidos de planta podem ser usados. Com o uso de métodos de cultura de tecido de planta e similares conhecidos, as plantas transformadas podem ser obtidas a partir de células de planta transformadas, calo e similares. Por exemplo, se as células de planta transformadas forem cultivadas com o uso de um meio de rediferenci-ação isento de hormônios e a planta jovem obtida, que formou raiz, é transplantada no solo ou similares e cultivada, uma planta transformada pode ser obtida.

MÉTODO PARA FABRICAR CELOBIO-HIDROLASE SUPER-TERMOESTÁVEL

[00126] O método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é um método para produzir uma celobio-hidrolase super-termoestável no transformante de acordo com a presente invenção. No transformante fabricado com o uso do vetor de expressão, em que o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção foi incorporado a jusante de um promotor que não pode controlar o tempo de expressão ou similares, a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é expressa constantemente. Por outro lado, um transformante fabricado com o uso de um, assim chamado, promotor de tipo de indução à expressão, que induz a expressão dependendo de um composto específico, condições de temperatura e similares, é submetido a um tratamento de indução adequado para as respectivas condições de expressão e de tal maneira, a celobio-hidrolase super-termoestável é expressa no transformante.

[00127] A celobio-hidrolase super-termoestável produzida pelo transformante pode ser usada em um estado que está retida no transformante ou pode ser extraída ou purificada do transformante.

[00128] O método para extrair e purificar a celobio-hidrolase super-termoestável do transformante não é particularmente limitado contanto que seja um método que não prejudica a atividade da celobio-hidrolase super-termoestável. A celobio-hidrolase super-termoestável pode ser extraída através de um método que é, em geral, usado para extrair polipeptídeos de células ou tecidos biológicos. Os exemplos do método incluem um método de imergir o transformante em um tampão de extração adequado, extrair a celobio-hidrolase super-termoestável e, em seguida, separar a enzima, então, extrair e um resíduo sólido. O tampão de extração contém, preferencialmente, um agente solubilizan-te tal como um tensoativo. Quando o transformante é uma planta, o transformante pode ser fracionado ou fragmentado antes de ser imerso no tampão de extração. Ademais, como o método para separar a enzima em um estrato e um resíduo sólido, por exemplo, é possível usar um tratamento de separação sólido-líquido conhecido, tal como um método de filtração, um método de filtração de comparação e um método de centrifugação. Ademais, o transformante em um estado imerso no tampão de extração pode ser espremido. A celobio-hidrolase super-termoestável no extrato pode ser purificada com o uso de um método de purificação conhecido tal como um método de relar-gagem, um método de ultrafiltração e um método de cromatografia.

[00129] Quando a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é expressa em um estado em que tem um peptídeo de sinal de secreção no transformante, cultivando-se o trans- formante e, em seguida, coletando-se o sobrenadante de cultura, excluindo o transformante da cultura obtida, uma solução que contém a ceiobio-hidrolase super-termoestável pode ser obtida simplesmente. Ademais, quando a ceiobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção tem uma etiqueta tal como uma etiqueta de His, a ceiobio-hidrolase super-termoestável no extrato ou o sobrenadante pode ser simplesmente purificado(a) por um método de croma-tografia de afinidade com o uso da etiqueta.

MISTURA DE CELULASE

[00130] A ceiobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção ou a ceiobio-hidrolase super-termoestável fabricada através do método para fabricar uma ceiobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção também pode ser usada como uma mistura de celulase que contém pelo menos um outro tipo de celulase. A ceiobio-hidrolase super-termoestável fabricada pelo método para fabricar uma ceiobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção pode ser usada em um estado em que está contida no transformante ou pode ser extraída ou purificada do transformante. Se a ceiobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção for usada como uma mistura, que contém outra celulase, para uma reação de degradação de celulose, a lignoce-lulose recalcitrante pode ser degradada de modo mais eficaz.

[00131] A outra celulase supracitada além da ceiobio-hidrolase super-termoestável que está contida na mistura de celulase não é, particularmente, limitada contanto que a celulase exiba atividade hidrolítca em relação à celulose. Os exemplos das mesmas incluem uma hemi-celulase tal como xilanase ou β-xilosidase, β-glucosidase, endogluca-nase e similares. A mistura de celulase de acordo com a presente invenção contém, preferencialmente, pelo menos uma dentre a hemice-lulase e a endoglucanase e, mais preferencialmente, contém tanto a hemiceiulase quanto a endoglucanase. Particularmente, a mistura de ceiulase contém, preferencialmente, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste em xilanase, β-xilosidase, β-glucosidase e endoglucanase e, mais preferencialmente, contém todos dentre xilanase, β-xilosidase, β-glucosidase e endoglucanase.

[00132] A outra ceiulase supracitada contida na mistura de ceiulase é, preferencialmente, uma ceiulase termostável que tem atividade de ceiulase em uma temperatura de pelo menos 70 °C e, mais preferencialmente, uma ceiulase termostável que tem atividade de ceiulase a uma temperatura de pelo menos 70 °C a 90 °C. Se todas as enzimas contidas na mistura de ceiulase forem resistentes ao calor, a reação de degradação da celulose realizada com o uso da mistura de ceiulase pode ser realizada de modo eficiente sob condições altitérmicas. Ou seja, quando a mistura de ceiulase contém apenas celulases termos-táveis, se a mistura de ceiulase for usada para a hidrólise de lignocelu-lose, uma reação de hidrólise de lignoceluloses pode ser realizada sob uma condição altitérmica em uma temperatura de hidrólise de 70 °C a 90 °C. Através da hidrólise realizada sob a condição de alta temperatura, a quantidade da enzima e tempo levado para a hidrólise podem ser significativamente diminuídos e o custo de hidrólise pode ser amplamente reduzido.

MÉTODO PARA FABRICAR PRODUTO DE DEGRADAÇÃO DE CELULOSE

[00133] O método para fabricar um produto de degradação de celulose de acordo com a presente invenção é um método para obter um produto de degradação degradando-se a celulose com o uso da celo-bio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção. Especificamente, colocando-se um material que contém celulose em contato com a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, o transformante de acordo com a presente inven- ção ou a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada pelo método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, um produto de degradação de celulose é produzido.

[00134] Neste documento, o termo "produto de degradação de celulose" significa um celo-oligossacarídeo que contém, principalmente, celobiose, celotriose e similares.

[00135] O material que contém celulose não é, particularmente, limitado contanto que contenha celulose. Os exemplos do material incluem biomassa à base de celulose, tais como ervas e resíduo agrícola, resíduo de papel e similares. Antes de ser colocado em contato com a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, o material que contém celulose é, preferencialmente, submetido a um tratamento físico tal como a fragmentação ou fracionamento e tratamento físico com o uso de um ácido, um álcali e similares, imerso em um tampão adequado ou submetido a um tratamento de dissolução.

[00136] A condição de reação da reação de hidrólise da celulose realizada pela celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção é, preferencial mente, uma condição sob a qual a celobio-hidrolase super-termoestável exibe atividade de celobio-hidrolase. Por exemplo, a reação é, preferencialmente, realizada sob condições de uma temperatura de 55 °C a 100 °C e um pH de 3,5 a 7,0 e, mais preferencialmente, realizada sob condições de uma temperatura de 70 °C a 100 °C e um pH de 4,0 a 6,0. O tempo de reação é adequadamente ajustado considerando-se o tipo do material que contém celulose usado para a reação de hidrólise, o método de pré-tratamento do material, a quantidade do material e similares. Por exemplo, a reação pode ser realizada durante 10 minutos a 100 horas. No caso de degradação de biomassa à base de celulose, a reação po- de ser realizada durante 1 hora a 100 horas.

[00137] Para a reação de hidrólise de celulose, em adição à celo-bio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, pelo menos um outro tipo de celulase é, preferencialmente, usado. Conforme a outra celulase supracitada, a mesma celulase que a celulase contida na mistura de celulase pode ser usada e a celulase é, preferencialmente, a celulase termostável que tem atividade de celulase em uma temperatura de pelo menos 70 °C e, mais preferencialmente, em uma temperatura de pelo menos 70 °C a 100 °C. Ademais, no método para fabricar o produto de degradação de celulose, em vez de a celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, o transformante de acordo com a presente invenção ou a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada pelo método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável de acordo com a presente invenção, a mistura supracitada de celulase pode ser usada.

EXEMPLOS

[00138] A seguir, a presente invenção será descrita mais especificamente com base nos exemplos, porém, a presente invenção não se limita aos exemplos a seguir.

EXEMPLO 1 CLONAGEM DE CELOBIO-HIDROLASE SUPER-TERMOESTÁVEL INOVADORA A PARTIR DE SOLO DE TERMAS <1> PREPARAÇÃO DE DNA METAGENÔMICO DE SOLO DE ALTA TEMPERATURA

[00139] A partir de uma área no Japão da qual existem jatos de termas de alta temperatura, o solo que contém água de alta temperatura, a lama e a biomassa foram coletados. A temperatura e o pH das amostras recém-coletadas estavam em uma faixa de 33 °C a 78 °C e 7,2 a 8, respectivamente. Dentre as amostras de solo de termas, cinco amostras denominadas AR19, OJS2, OJS4, OJS7 e OJS9, respectivamente, como amostras de DNA metagenômico foram submetidas à extração de DNA. A partir de 10 g de cada uma das amostras coletadas de solo de termas, o DNA foi extraído com o uso de um kit de extração de DNA (ISOIL Large for Beads, versão 2, NIPPON GENE CO., LTD.). A partir de AR19, o DNA foi obtido em uma quantidade igual ou superior a 10 pg e o sequenciamento metagenômico foi realizado em 5 pg do DNA com o uso de Titânio GS FLX 454 fabricado pela Roche Diagnostics. O DNA restante foi usado para a clonagem de PCR de genes de celulase. Entretanto, as amostras, das quais uma pequena quantidade (igual ou menos que 10 pg) de DNA foi obtida, foram submetidas à amplificação de genoma com o uso de um kit de amplificação de DNA genômico (GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, fabricado pela GE Healthcare).

<2> MONTAGEM E ESTATÍSTICA DE DADOS METAGENÔMICQS DE SOLO DE TERMAS

[00140] Com o uso de AR19 como uma das amostras de DNA genômico extraídas dos metagenomas de solo de termas, o sequenciamento do tipo shotgun foi realizado três vezes de acordo com o proto-colo-padrão do sequenciamento do tipo shotgun de tecnologia de Ti-tâncio 454 GS FLX fabricada pela Roche. O resultado (arquivo sff) da Roche 454 foi submetido à chamada de rebase pela PyroBayes (Quin-lan e outros, Nature Methods, 2008, volume 5, páginas 179 a 781.) e, como um resultado, os arquivos de sequência de formato FASTA e os arquivos de valor de Qualidade foram obtidos. As terminações das leituras de sequência obtidas foram cortadas de modo a aprimorar a qualidade das mesmas e as leituras de sequência foram montadas com o uso do software de montagem, Newbler, versão 2.3 da 454 Life Science. A montagem foi realizada sob condições estabelecidas como "correspondência de sobreposição aceitável mínima (mi) = 0,9", "opção:-grande (para genomas grandes ou complexos, acelera a montagem, mas reduz a precisão)".

[00141] As leituras que foram submetidas ao processamento de fil-tração de Qualidade e montadas contíguas de modo a terem um comprimento igual ou superior a 100 bp tinham um comprimento de 330 Mbp no total e os dados estabelecidos foram usados para a análise de gene de enzima celulase. Dentre um total de 2.766.332 leituras, 2.040.651 leituras foram montadas em contiguidade (101.372 contigui-dades no total) de modo a terem um comprimento igual ou superior a 1.027 bp em média e dentre as mesmas, a contiguidade mais longa tinha um comprimento de 187.970 bp.

[00142] Para as sequências montadas, todas as contiguidades e singletos foram classificados filogeneticamente em cinco categorias incluindo bactérias, archea (archaebactéria), procariontes, vírus e um grupo que não pertence a nenhum desses, com referência ao banco de dados KEGG (Kanehisa, M. Science & Technology, Japão, 1996, n-59, páginas 34 a 38, http://www.genome.jp/kegg/, 2011/5/11 (pesquisado)). No comprimento de 330 Mbp (= comprimento total de contiguidade + comprimento total de singleton) da sequência montada, o comprimento do acerto de sequência em bactérias foi de 59,9 Mbp, o comprimento do acerto de sequência em archea foi de 3,1 Mbp, o comprimento do acerto de sequência em procariontes foi de 25,499 bp e o comprimento do acerto de sequência em vírus foi de 384,255 bp. Tais resultados mostraram, evidentemente, que o banco de dados metage-nômico incluíram apenas 19,2% da sequência de DNA conhecida. O comprimento da sequência que não pertence a nenhuma das categorias acima foi de 266,7 Mbp e contribuiu com 80,8% de toda a sequência montada. Essas são sequências inovadoras derivadas de qualquer uma dentre as bactérias, archea e procariontes.

<3> PREVISÃO DE QUADRO DE LEITURA ABERTA (ORF) DE CE-LOBIO-HIDROLASE

[00143] A partir do banco de dados UniProt (http://www.uniprot.org/), as sequências de EC n— 3. 2. 1.4 (celulase), 3. 2. 1. 37 (β-xilosidase), 3. 2. 1. 91 (celulose 1,4-p-cellobiosidase), e 3. 2. 1.8 (endo 1,4-p-xilanase) foram transferidos por download (número de acesso: 2009/4/13) e um banco de dados de local proteômico de tais genes de glicosídeo -hidrolase foi construído. Com o uso do software de anotação Orphelia (Hoff e outros, Nucleic Acids Research, 2009, 37 (Emissão de servidor da Web: W101-W105)), um domínio de gene (= quadro de leitura aberta) foi estimado a partir das sequências contíguas obtidas na seção <2> (Opção Orphelia: padrão (modelo = Net 700, sobreposição máxima = 60)). Para extrair genes de glicosídeo -hidrolase do ORF estimado, o BLASTP (biastall, versão 2.2.18) foi usado e o banco de dados local foi consultado. As condições de opção de BLASTP foram estabelecidas como "Sequência de filtro de levantamento = falsa", "Valor de expectativa (E) < 1e'20", "valores-padrão: Custo para abrir um vão = -1, Custo para estender um vão = -1, valor de retirada de X para alinhamento incompleto = 0, Limite para extensão de acertos = 0, Tamanho de palavra = padrão", e as sequências de acertos foram coletadas como genes de glicosídeo -hidrolase.

[00144] As glicosídeo -hidrolases, tais como celulase, endo-hemiceiulase e enzimas de desramificação, obtidas da maneira supracitada foram submetidas à classificação funcional com base em HMMs de pfam (Pfam, versão 23.0 e HMMER v 2.3 Finn e outros, Nucleic Acids Research Database, 2010, Edição 38, páginas D211 a 222) como o banco de dados de sequência de domínio funcional de proteínas. Especificamente, com o uso de um algoritmo de pesquisa de homolo-gia de sequência HMMER (Durbin e outros, The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of preteins and nucleic acids’, 1998, Cambridge University Press.; O hmmpfam (Versão 2.3.2), recorte de E-valor < 1e'5; Banco de dados = Pfam_fs (modelos que podem ser usados para encontrar fragmentos dos domí- nios representados em uma sequência)) com o uso de um modelo de Markov escondido, as sequências foram classificadas em uma família de glicosídeo -hidrolase (GH) com base na homologia das mesmas com o banco de dados de domínio Pfam.

<4> CLONAGEM DE AR19G-166RA E AR19G-166QV

[00145] A partir do metagenoma AR19 do solo de termas, treze ORFs que incluem sequência de domínio de catalisador de celobio-hidrolase que pertencem a GH6, GH9, GH48 e outras famílias de GH foram obtidos. Para tais ORFs, os iniciadores foram projetados e os genes foram clonados a partir do metagenoma AR19 do solo de termas por meio de PCR. A partir do quadro de leitura aberta AR19G-166, os genes de celobio-hidrolase (AR19G-166RA e AR19G-166QV) que pertencem à família GH6 foram clonados.

<5>AR19G-166 DE QUADRO DE LEITURA ABERTA

[00146] O AR19G-166 de quadro de leitura aberta codificou um po-lipeptídeo (SEQ ID NO: 5) que consiste em 474 resíduos de aminoáci-do. Entretanto, o AR19G-166 consistia em uma sequência incompleta em que o códon inicial foi perdido e foi constituído apenas com a sequência parcial de um ligante e o domínio de catalisador de GH6. O domínio de catalisador de GH6 de AR19G-166 foi clonado nos genes AR19G-166RA e AR19G-166QV através de clonagem de PCR e exibiu 66% de identidade de sequência de aminoácidos em relação a um glicosídeo -hidrolase GH6 (Genbank: ABX 04776.1) de Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 como uma bactéria termofílica mesofílica no filo Chlroflexi. Através da clonagem de PCR com o uso de um iniciador direto que consiste em uma sequência de base representada por SEQ ID NO: 7 (5’-CACCATGTTGGACAATCCATTCATCGGAG-3’: obtida através da adição de sete bases (CACCATG) ao lado do 5’-terminal de uma sequência de base representada por SEQ ID NO: 6; na sequência adicionada, o ATG no lado 3’ é um códon inicial e CACC no lado 5’ é uma sequência para ser inserida em um vetor) e um iniciador inverso que consiste em uma sequência de base representada por SEQ ID NO: 8 (5’-TTAGGGTTGGATCGGCGGATAG-3’), dois ciones de gene (AR19G-166RA e AR19G-166QV) foram obtidos a partir de AR19G-166. As sequências de aminoácidos codificadas pro AR19G-166RA e AR19G-166QV foram diferentes uma da outra apenas em termos de dois resíduos de aminoácido na 299a posição e a 351a posição. Em AR19G-166RA, o resíduo de aminoácido na 299a posição foi a arginina e o resíduo de aminoácido na 351a posição foi a alanina. Em AR19G-166QV, o resíduo de aminoácido na 299a posição foi a glutamina e o resíduo de aminoácido na 351a posição foi a valina.

<6> CLONAGEM DE PCR DE VARIANTE NATURAL

[00147] Os cinco DNAs metagenômicos supracitados (AR19, OJS2, OJS4, OJS7, e OJS9) foram submetidos à clonagem de PCR de genes de celobio-hidrolase com o uso de um iniciador direto que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 8. A sequência dos clones de acerto foi decodificada por um se-quenciador Sanger. O genótipo e a mutação de aminoácido de cada um dos clones são mostrados nas Tabelas 1 e 2. Através da realização de clonagem de PCR em uma pluralidade de amostras de DNA metagenômico, um total de quarenta e seis clones de variantes naturais que têm uma grande quantidade de SNPs foram obtidos. Tais variantes mostraram SNPs em um total de vinte e sete sítios incluindo c6t, g51a, a69g, a201g, c259t, c433t, c450t, g456c, c531t, a627g, a896g, c1116t, c98t (A33V), t251c (I84T), c262t (P88S), g497a (R166H), c683t (T228I), c688t (L230F), a762t (E254D), a761g (E254G), c805t (R269C), a896g (R299Q), a916g (S306G), c1052t (A351V), a1078g (E360K), g1216a (A406T) e t1241c (F414S) (o SNP é representado em letras pequenas e as letras nos parênteses repre- sentam a substituição de aminoácidos gerada pelo SNP). O SNP gerou a substituição de aminoácidos em quatorze sítios dentre os vinte e sete sítios (Tabelas 1 e 2). Em todos os clones que mostram o SNP, a mutação IN/DEL (inserção e deleção de uma sequência de DNA de base) não foi observada. TABELA 1 [00148] Dentre os quarenta e seis clones obtidos conforme acima, vinte e nove clones, que eram mais do que a metade dos clones, eram AR19G-166QA variantes (doravante, abreviado como "QA", SEQ ID NO: 3) que codificam uma sequência de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido na 299a posição era glutamina e o resíduo de ami-noácido na 351a posição era alanina; um clone era um AR19G-166QV variante (doravante, abreviado como "QV", SEQ ID NO: 9) que codifica uma sequência de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido na 299a posição era glutamina e o resíduo de aminoácido na 351a posição era valina; e quatro clones eram AR19G-166RA variantes (doravante, abreviado como "RA", SEQ ID NO: 10) que codificam uma sequência de aminoácidos em que o resíduo de aminoácido na 299a posição era arginina e o resíduo de aminoácido na 351a posição era alanina (Tabela 1).

[00149] Doze outros clones foram variantes formadas através de mutação de um a três resíduos de aminoácido em QA, RA ou OV. Dentre os doze clones, nove clones eram variantes formadas através da substituição de um a dois resíduos de aminoácido na sequência de aminoácidos codificada por AR19G-166QA (Tabela 1). Os nove clones incluem dois clones de QA/A33V em que a alanina na 33a posição foi substituída por valina; um clone de QA/T228I em que a trenonina na 228a posição foi substituída por isoleucina; um clone de QA/R269C em que a arginina na 269a posição foi substituída por cisteína; um clone de QA/E254G em que o ácido glutâmico na 254a posição foi substituído por glicina; dois clones de QA/S306G em que a serina na 306a posição foi substituída por glicina; um clone de QA/R166H/E360K em que a arginina na 166a posição e o ácido glutâmico na 360a posição foram substituídos por histidina e glicina, respectivamente; e um clone de QA/I84T/A406T em que a isoleucina na 84a posição e a alanina na 406a posição foram substituídas por trenonina.

[00150] Três outros clones foram variantes formadas através da substituição de um ou três resíduos de aminoácido na sequência de aminoácidos codificada por AR19G-166RA. Tais clones incluíram um clone de RA/E254D em que o ácido glutâmico na 254a posição foi substituído por ácido aspártico; e dois clones de RA/P88S/L230F/F414S (também chamado de "AR19G-166RASFS", SEQ ID NO: 1) em que a prolina na 88a posição, a leucina na 230a posição, e a fenilalanina na 414a posição foram substituídas por serina, fenilalanina e serina, respectivamente.

[00151] A Figura 1 mostra o alinhamento de sequência de resíduos de aminoácido codificados por AR19G-166RA, AR19G-166QV, AR19G-166QA e AR19G-166RASFS. Esses quatro tipos de genes foram genes clonados a partir de cinco amostras metagenômicas de solo de alta temperatura através da clonagem de PCR com o uso do mesmo conjunto de iniciadores. No desenho, "·" representa o mesmo resíduo de aminoácido, e os resíduos de aminoácido substituídos são representados letras brancas.

[00152] O AR19G-166QA foi o clone que apareceu mais frequentemente e um total de vinte e nove clones de AR19G-166QA foram obtidos a partir de cinco tipo de DNA metagenômico (Tabela 2). Os vinte e nove clones de AR19G-166QA incluem os SNPs em sete sítios (c6t, a201g, c259t, c450t, g456t, c531t e a627g) na sequência de base.

[00153] Diferente dos genes de AR19G-166QA, a sequência de base dos genes de AR19G-166RA inclui os SNPs em três sítios (a51g, a201g e a896g) (Tabela 2). Dentre esses, dois sítios eram de mutação silenciosa e as guaninas tanto na 51a posição quanto na 201a posição da sequência de base foram substituídas por adenina. O um sítio restante foi o SNP envolvido na substituição de aminoácidos e a adenina na 896a posição foi transformada em guanina. Devido ao SNP, em AR19G-166RA, o resíduo de aminoácido na 299a posição na sequência de aminoácidos foi substituído por arginina.

[00154] A sequência de base dos genes de AR19G-166QV inclui SNP em um sítio (Tabela 2). Na sequência de base, a citosina na 1.052a posição foi transformada em timina. Consequentemente, em AR19G-166QV, o resíduo de aminoácido na 351a posição da sequência de aminoácidos codificada por AR19G-166QA foi substituído por valina.

[00155] Dentre os doze tipos de variantes de AR19G-166SNP, o AR19G-166RASFS que exibe a termoestabilidade mais forte incluiu os SNPs em cinco sítios (a201g, c262t (P88S), c688t (L230F), a896g (Q299R) e t1241c (F414S)), diferente do AR19G-166QA (Tabela 2). Dentre os mesmos, quatro sítios foram envolvidos na substituição de aminoácidos. Em um sítio dentre os quatro sítios, a adenina na 896a posição foi transformada em guanina de modo similar ao AR19G-166RA e o resíduo de aminoácido na 299a posição na sequência de aminoácidos codificada por AR19G-166RASFS foi substituída por arginina. Em outros três sítios, a citosina na 262a posição foi transformada em timina, a citosina na 688a posição foi transformada em timina e a timina na 1241a posição foi transformada em citosina. Devido aos SNPs, na sequência de aminoácidos codificada por AR19G-166RASFS, a prolina na 88a posição foi substituída por serina, a leuci-na na 230a posição foi substituída por fenilalanina e a fenilalanina na 414a posição foi substituída por serina.

<7> EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE VARIANTE DE SUBSTITUIÇÃO DE AMINOÁCIDOS NATURAIS

[00156] Os plasmídeos obtidos através da clonagem de PCR foram introduzidos em uma cepa de pLysS de Rosetta-gamiB (DE3) (fabricada pela Merck & Co., Inc) de E. coli para a expressão de proteína por um método de choque de calor. A E. coli que tem genes-alvo foi inocu-lada em um meio de LB que contém ampicilina em 100 mg/L e cultivada até que o OD600 se tornasse cerca de 0,2 a 0,8. Portanto, o IPTG (isopropil^-D(-)-tiogalactopirandosídeo) foi adicionado ao mesmo e a bactéria foi cultivada durante 20 horas para induzir a expressão de proteínas-alvo. Após a cultura, a E. coli foi coletada realizando-se a centrifugação e o tampão de acetato 200 mM (um pH de 5,5), que tem um volume de 0,05 do volume do fluido de cultura, foi adicionado à mesma de modo a suspender a bactéria. Subsequentemente, com o uso de um dispositivo de fragmentação ultrassônica, BioRuptor UCD-200T, (fabricado pela COSMO BIO CO., LTD.), o resultado foi submetido à fragmentação durante 30 segundos e, em seguida, a fragmentação foi interrompida durante 30 segundos. O processo de tratamento foi repetido 10 vezes e, como um resultado, o sobrenadante que contém as proteínas-alvo que foi submetido à substituição de aminoácidos foi obtido. O sobrenadante foi tomado como um líquido de amostra de enzima bruto.

[00157] As proteínas-alvo no líquido de amostra de enzima bruto foram confirmadas através de análise de SDS-PAGE. A Figura 2 mostra os resultados da análise de SDS-PAGE (manchamento CBB) de proteínas enzimáticas de celobio-hidrolase codificadas por variantes naturais dos genes de AR19G-166.

[00158] Uma coluna de troca de íon HiTrap Q HP (fabricada por GE Healthcare) equilibrada com o uso de tampão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0) foi preenchida com o líquido de amostra de enzima bruto. Portanto, com o uso de um modelo de AKTA de sistema de cromatografia de líquido de alta pressão/meio (fabricado pela GE Healthcare) e tam- pão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0) que continha NaCI 1 M, as proteínas foram fracionadas em um gradiente de concentração de 0% a 50%. As frações que têm atividade de celobio-hidrolase foram misturadas e, em seguida, a solução das mesmas foi trocada com a tampão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0) que contém sulfato de amônio 750 mM com o uso de uma membrana de ultrafiltração de centrífuga, VIVAS-PIN 20, (fabricada pela Sartorius Stedim Biotech). Então, a coluna de separação de interação hidrofóbica, HiTrap Phnenyl HP, (fabricada pela GE Healthcare) equilibrada com o uso da mesma solução tampão foi preenchida com a fração que tem atividade de celobio-hidrolase que foi submetida à troca de solução e as proteínas foram extraídas em um gradiente de concentração de 100% a 0% através do uso de tampão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0). As frações que têm atividade de celobio-hidrolase foram misturadas e, em seguida, concentradas com o uso de VIVASPIN 20 até que a quantidade de líquido da mesma se tornasse aproximadamente 8 ml. A amostra concentrada foi adicionada a uma coluna de filtração de gel, Hiload 26/60 superdex 200 pg, (fabricada pela GE Healthcare) equilibrada com o uso de tampão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0) que contém 150 mM NaCI e o fraciona-mento foi realizado fazendo-se com que a mesma solução tampão com um volume de 1 a 1,5 vezes maior que o da coluna flua a uma taxa de 2 ml/min. a 3 ml/min. Após as frações que têm atividade de celobio-hidrolase serem misturadas, a solução das mesmas foi trocada com tampão Tris-HCI 50 mM (um pH de 8,0), seguido de uma concentração, obtendo-se, assim, um líquido de amostra de enzima purificado que tem uma concentração final de aproximadamente 1 mg/ml. <8> MEDIÇÃO DE ATIVIDADE DE CELOBIO-HIDROLASE QUE TEM PSA COMO SUBSTRATO (ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE PSA) [00159] Para medir a atividade de celobio-hidrolase, o Avicel inchado por ácido fosfórico (PSA) foi usado como um substrato. O PSA foi preparado de uma maneira em que o pó de Avicel (pó fino de celulose cristalina, fabricado pela Merck & Co., Inc) fosse dissolvido em uma solução de ácido fosfórico; a água destilada esterilizada foi, então, adicionada à mesma para precipitar os cristais e os cristais foram lavados até que o pH dos mesmos se tornasse igual ou mais a 5,0. Todo o PSA usado no seguinte experimento foi preparado dessa maneira.

[00160] Uma solução de reação para medir a atividade de PSA foi composta por uma solução de PSA que tem uma concentração final de 0,5%, tampão de acetato 50 mM (um pH de 5,5) e o líquido de amostra de enzima bruto (preparado na seção <7>) diluído adequadamente. A solução de reação foi reagida durante 20 minutos em uma temperatura de 50 °C a 90 °C. Após a reação ser finalizada, a quantidade da extremidade de redução hidrolisada com o uso de reagente de ácido 3,5-dinitrossalicíclico (DNSA) foi medida através de um espectrofotômetro (540 nm) e através do uso de uma curva de calibração criada com o uso de glicose, a quantidade de açúcar reduzido foi calculada. Portanto, a partir da diferença na quantidade entre uma seção de controle e uma seção experimental, a quantidade de açúcar reduzido gerada através da hidrólise da enzima foi calculada. A quantidade máxima do açúcar reduzido foi considerada como 100 e a quantidade do açúcar reduzido em cada temperatura foi plotada como um valor relativo.

[00161] A Figura 3 mostra os resultados obtidos através da medição da atividade de PSA. Todas as variantes de substituição de aminoáci-dos do gene de enzima de celobio-hidrolase, AR19G-166, clonado a partir do DNA metagenômico do solo de alta temperatura exibiram atividade hidrolítica de PSA. A temperatura ideal das variantes de substituição de aminoácidos de AR19G-166QV e AR19G-166QA foi inferior à de AR19G-166RA e às variantes de substituição de aminoácidos de AR19G-166RA. Em QA/T228I, Tideai = 80 °C; em QA/S306G, Tideai. = 70°C; e em outras variantes de substituição de aminoácidos de AR19G-166QA, Tideai = 75 °C. Por outro lado, em AR19G-166RA e RA/E254D como uma variante de substituição de aminoácidos dos mesmos, Tideai = 80 °C; e em AR19G-166RASFS como uma variante de substituição de aminoácidos de AR19G-166RA, Tideai, > 90 °C.

[00162] No método de DE que causa, artificialmente, a mutação, uma grande quantidade de variantes de perda de função é gerada, por esse motivo, o ensaio funcional se torna inútil em diversos casos. Entretanto, toda a grande quantidade de variantes clonadas através do método para obter uma variante natural de acordo com a presente invenção teve atividade de enzima e o AR19G-166RASFS de celobio-hidrolase que exibiu estabilidade do calor igual ou superior a 15 °C foi obtido a partir da biblioteca de variantes constituída com uma quantidade relativamente pequena de clones.

<9> EXAMINAÇÃO SOBRE CARACTERÍSTICAS DE ENZIMA

[00163] As proteínas enzimáticas da variante AR19G-166RASFS, que confirmou-se que tem a temperatura ideal mais alta Tideai no ensaio de atividade hidrolítica de PSA e formadas através de substituição de três aminoácidos (P88S/L230F/F414S) de AR19G-166RA, foram purificadas e considerando-se a especificidade de substrato, as características de pH, as características de temperatura (temperatura ideal e estabilidade do calor), as características de enzima foram medidas especificamente. (ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO) [00164] A especificidade de substrato foi medida com o uso de pó de Avicel, carboximetilcelulose (CMC, fabricada pela Sigma-Aldrich Co, LLC.), xilano (de Beechwood, fabricado pela Sigma-Aldrich Co, LLC.), Lichenan (fabricado pela MP Biomedicals, LLC.) e Laminarina (de Laminaria digitata, fabricado pela Sigma-Aldrich Co, LLC.). A solução de reação foi composta por 100 pl de uma solução aquosa de 1% de cada substrato, 50 pl de tampão de acetato 200 mM (um pH de 5.5) , 40 μΙ de água purificada e 10 μΙ do líquido de amostra de enzima purificado. A solução de reação foi reagida durante 20 minutos a 70 °C. Da mesma maneira que na seção <8>, a quantidade de açúcar reduzido gerada pela hidrólise da enzima foi calculada e a atividade específica (U/mg) foi calculada. Cada medição foi realizada três vezes independentemente e o erro-padrão e de média foram calculados.

[00165] A Figura 4 mostra os resultados de medição. O AR19G-166RASFS exibiu um alto grau de atividade hidrolítca em relação ao Avicel inchado por ácido fosfórico solúvel em água, PSA, (1,90589 U/mg) e exibiu atividade de degradação em relação à Lichenan que consiste em glucano que tem uma ligação β-1,3 e uma ligação β-1,4 (0,12553 U/mg). Por outro lado, o AR19G-166RASFS praticamente não exibiu atividade de degradação em relação à CMC (0,01026 U/mg) ou à Laminarina que consiste em glucano que tem uma ligação β-1,3 e uma ligação β-1,6 (-0,16264 U/mg). Embora o AR19G-166RASFS tenha exibido uma atividade hidrolítca extremamente fraca em relação ao Avicel de celulose cristalina (0,08606 U/mg), o mesmo exibiu uma atividade hidrolítca marcada no ensaio em que a reação foi realizada durante 2 horas (0,18001 U/mg). O AR19G-166RASFS não exibiu atividade hidrolítca em relação ao xilano (-0,015 U/mg). (DEPENDÊNCIA DE TEMPERATURA) [00166] A dependência de temperatura da atividade hidrolítica de PSA dp AR19G-166RASFS foi investigada. Para medir a atividade hidrolítica de PSA, uma solução de reação composta por 100 μΙ de uma solução de PSA de 1%, 50 μΙ de um tampão de acetato (um pH de 5.5) , 40 μΙ de água purificada e 10 μΙ do líquido de amostra de enzima purificado foram usados e a solução de reação foi reagida durante 20 minutos a uma temperatura de 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80°C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, ou 99 °C. A quantidade de açúcar reduzido gerada pela reação de hidrólise da enzima foi calculada. Ademais, a atividade de enzima pela qual 1 pmol de açúcar reduzido é gerado durante 1 minuto, foi considerada como 1 U e o valor obtido dividindo-se a atividade de enzima pela quantidade de proteína foi tomada como a atividade específica (U/mg). Ademais, íons cálcicos 0,5 mM ou íons de manganês 0,5 mM foram adicionados à solução de reação e a atividade hidrolítica de PSAfoi medida da mesma maneira descrita acima.

[00167] A Figura 5 mostra os resultados de medição. Na atividade hidrolítica de PSA do AR19G-166RASFS, a Tideai = 90 °C em um pH de 5,5. Ademais, quando os íons cálcicos 0,5 mM ou íons de manganês 0,5 mM foram adicionados ao líquido de reação de enzima-substrato, a Tideai aumentou para 95 °C, de qualquer forma. Em todas as regiões de temperatura, confirmou-se que a adição dos íons cálcicos ou íons de magnésio aprimoraram a atividade hidrolítica de PSA. Particularmente, a atividade hidrolítica de PSA na temperatura ideal foi, aproximadamente, dobrada devido à adição de íons de magnésio e considera-se que isso é devido ao fato de que a adição dos cátions de metal diva-lentes gerou um efeito de estabilização das proteínas enzimáticas. (DEPENDÊNCIA DE PH) [00168] A dependência de pH da atividade hidrolítica de PSA de AR19G-166RASFS foi investigada. Para medir a atividade hidrolítica de PSA, 0,5%, em massa, de PSA foi usado como um substrato; o pH dos respectivos líquidos de reação foi ajustado com o uso de uma solução tampão Mcllvain (um pH de 3 a 8); e a reação de hidrólise realizada a 50 °C, 70 °C ou 90 °C em cada nível de pH foi medida. A Figura 6 mostra os resultados de medição. A atividade hidrolítica de PSA em 50 °C, 70 °C e 90 °C em relação ao nível de pH medido, de fato, do líquido de reação foi medida e plotada.

[00169] Conforme mostrado na Figura 6, o pH ideal da reação de hidrólise de PSA da variante purificada AR19G-166RASFS foi alterado dependendo da temperatura de reação e em 90 °C, o AR19G- 166RASFS exibiu a atividade hidrolítica de PSA mais alta em uma faixa de um pH de 5 a 6,5. Em 50 °C e 70 °C, o pH ideal estava em uma faixa de um pH de 4 a 6. De qualquer maneira, um baixo nível de atividade hidrolítica de PSA foi observado a um nível de pH igual ou superior a 7. (MEDIÇÃO DE ESTABILIDADE DO CALOR COM Q USO DE ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE PSA) [00170] Como um índice em relação à estabilidade do calor das proteínas, uma temperatura de desnaturação térmica ou uma temperatura de fusão (Tm) são frequentemente usadas. Uma temperatura de pré-incubação, em que a atividade de enzima é reduzida e se torna 50% da atividade de enzima de uma seção não tratada devido ao pré-aquecimento (pré-incubação) realizado durante um determinado período de tempo, é aproximadamente igual à temperatura de fusão Tm da proteína e pode ser determinada através da medição da atividade de enzima. De tal maneira, a temperatura de fusão Tm de AR19G-166RA e AR19G-166RASFS foi determinada.

[00171] Especificamente, através da realização do pré-aquecimento durante 40 minutos sob uma condição isenta de substrato e com o uso de uma temperatura T50, em que a atividade hidrolítica de PSA foi reduzida em 50%, como um índice, a estabilidade do calor de variante AR19G-166RASFS foi investigada. Os respectivos dados foram submetidos à aproximação com o uso de uma função logística e a temperatura em que o nível de atividade relativo atingiu 50% na curva aproximada foi considerado como T50.

[00172] A Figura 7 mostra os resultados de medição. Em AR19G-166RA, T50 = 75,6 °C. Por outro lado, na variante AR19G-166RASFS em que três resíduos de aminoácido foram substituídos, T50 = 91,2 °C (no momento em que a atividade de PSA foi medida em 50 °C) ou T50 = 92,0 °C (no momento em que a atividade de PSA foi medida em 70 °C). O AR19G-166RASFS exibiu estabilidade do calor igual ou superior a 15 °C em comparação com AR19G-166RA. (MEDIÇÃO DE ESTABILIDADE DO CALOR ATRAVÉS DO MÉTODO DE DSF) [00173] A fluorimetria de varredura diferencial (DSF) é um dos métodos para medir a desnaturação térmica de proteínas com o uso de um corante fluorescente e um dispositivo de PCR em tempo real e pode ser aplicada a várias proteínas. Os corantes fluorescentes usados para a DSF, tais como o SYPRO Laranja, fluorescem sob uma condição não polar em que os corantes se ligam a um sítio hidrofóbico e são impedidos de fluorescer sob uma condição polar em que os corantes foram dissolvidos em água. Em geral, a estrutura dobrada de proteínas é aberta em uma temperatura de desnaturação térmica das mesmas e os sítios hidrofóbicos na estrutura são expostos à superfície de proteína. Quando o SYPRO Laranja se liga aos sítios hidrofóbicos expostos, devido ao fato de que a luz de excitação tem um comprimento de onda de 470 nm a 480 nm, o corante produz luz fluorescente intensa que tem um pico em um comprimento de onda de, aproximadamente 595 nm. Se a temperatura da proteína solução for aumentada gradativamente em um determinado intervalo e a intensidade de fluorescência for medida, a temperatura de fusão (= ponto de alteração da intensidade de fluorescência) é calculada.

[00174] Especificamente, 2 pl de SYPRO Laranja (fabricado pela Life Technologies) diluíram 100x, 1 pl de proteínas enzimáticas em uma concentração de 1 mg/MI, 5 μΙ de tampão de acetato 200 mM (um pH de 5,5) e 12 μΙ de água purificada foram adicionados a cavidades de uma placa de PCR de 96 cavidades (Multiplate 96 Well PCR Plate MLL-9651, fabricada pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) e o volume de cada cavidade foi ajustado a 20 μΙ. A placa de PCR foi vedada com tiras Optical flat 8-cap (fabricadas pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) e com o uso de um dispositivo de PCR em tempo real (CFX96 Touch Real-Time PCR System, fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.), a temperatura das cavidades foi aumentada para 100 °C a partir de 30 °C por 0,5 °C. Após 30 segundos percorridos a partir de quando a temperatura atingiu uma temperatura-alvo, a intensidade de fluorescência das respectivas cavidades foi, simultaneamente, medida. O SYPRO Laranja foi excitado com um diodo de emissão de luz (LED) que tem uma banda de comprimento de onda de 450 nm a 490 nm, e a luz radiada a partir do SYPRO Laranja foi passada através de um filtro de passagem de banda em uma faixa de 560 nm a 580 nm. A intensidade de fluorescência foi medida com o uso de uma câmera de CCD e a alteração na intensidade de fluorescência foi plotada sob a forma de uma função de temperatura. A temperatura de desnaturação térmica (temperatura de fusão; valor de Tm) foi definida como um valor máximo de "-d(Fluorescência)/dt" mostrado na ordenada do gráfico da diferenciação de primeira ordem (lado inferior da Figura 8) da curva de intensidade de fluorescência como uma função de temperatura. Com o uso do software de análise, o CFX Manager (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) incluído no dispositivo de PCR em tempo real, a análise de dados foi realizada. Ademais, íons cálcicos 3 mM foram adicionados às respectivas soluções de reação e os resultados foram medidos da mesma maneira.

[00175] A Figura 8 mostra a alteração na intensidade de fluorescência do SYPRO Laranja que foi medido através do método de DSF e fez gerada pela desnaturação térmica de cada uma das proteínas en-zimáticas de AR19G-166RA e AR19G-166RASFS. O gráfico no lado superior da Figura 8 são dados realmente medidos e o gráfico no lado inferior da Figura 8 mostra a diferenciação de primeira ordem "-d(Fluorescência)/dt" da curva da alteração na intensidade de fluorescência do gráfico no lado superior da Figura 8. Ademais, através do método de DSF, a temperatura de fusão de cada uma das proteínas enzimáticas foi medida três vezes, independentemente. A Tabela 3 mostra a média das mesmas. TABELA 3 [00176] Na curva de intensidade de fluorescência de DSF das proteínas enzimáticas codificadas por AR19G-166RASFS, os picos foram observados em, aproximadamente, 95 °C e à temperatura de desnatu-ração térmica Tm = 93,0 ± 0,0 (n = 3) (Tabela 3). O valor da temperatura de desnaturação térmica foi próximo à temperatura ideal Tideai > 90 °C da enzima determinada a partir da atividade hidrolítica de PSA ou da meia temperatura de atividade de enzima T50 = 91,2 °C e 92,0 °C.

[00177] Por outro lado, na curva de intensidade de fluorescência de DSF de AR19G-166RA, os picos foram observados em, aproximadamente, 83 °C e o valor de Tm foi de 80,5 ± 0,0 °C (n = 3). Isso mostrou que a estabilidade do calor de AR19G-166RASFS foi aprimorada em 12,5 °C, em comparação com a estabilidade do calor de AR19G-166RA.

[00178] Os íons de metal divalentes são, em geral, conhecidos por estabilizar a estrutura de uma proteína através da ligação à proteína e, assim, aprimoram a termoestabilidade. Em AR19G-166RA, devido à adição de Ca2+ 3 mM, a temperatura de desnaturação térmica, Tm, calculada através de DSF, foi aumentada em 5,2 °C e se tornou 85,7 ± 0,2 °C (n = 3). Em AR19G-166RASFS, devido à adição de Ca2+3 mM, a Tm foi aumentada em 5,2 °C e se tornou 96,0 ± 0,0 °C (n = 3). A temperatura de desnaturação térmica 96.0 °C é o valor mais alto para as celobio-hidrolases conhecido até o presente momento.

[00179] A celulose cristalina recalcitrante é hidrolisada em glicose como um polissacarídeo, principalmente através da cooperação de três tipos de glicosídeo -hidrolases. Uma endoglucanase (celulase ou endo-1,4-p-D-glucanase, EC 3. 2.1. 4) realizada a divagem aleatória da ligação de 1,4-β glicosídeo de uma cadeia de glucanos e gera oli-gossacarídeos que têm comprimentos diversos. Uma celobio-hidrolase como uma exo-glucanase (1,4-p-cellobiosidase ou celobio-hidrolase, EC 3. 2.1. 91) realiza a divagem contínua de uma cadeia de glucanos da extremidade da mesma que é tanto um terminal de redução (CBH que pertence a uma família GH7, por exemplo, TrCel7A ou CBH I) quanto um terminal de não redução (CBH que pertence a uma família GH6; TrCel6A ou CBH II) e gera celobiose. Uma β-glucosidase (β-1,4-glucosidase, EC 3. 2.1.21) hidrolisa a celobiose e gera glicose.

[00180] Para resumir, os resultados acima mostraram que a variante AR19G-166RASFS formada através da substituição de três resíduos de aminoácido em AR19G-166RA é uma variante que foi significativamente aprimorada em termos tanto da temperatura ideal quanto da temperatura de desnaturação térmica. Os resultados também mostraram que a meia temperatura de atividade de enzima T50, em que a atividade hidrolítica de PSA é reduzida em 50% e a temperatura de desnaturação térmica, Tm, determinada por DSF da variante foram 10,5 °C e 12,5 °C, respectivamente. Ou seja, T50 e a Tm de AR19G-166RASFS são altas e isso mostra que a proteína é uma variante que foi significativamente aprimorada em termos de estabilidade do calor.

[00181] Uma grande quantidade de enzimas celulase superter-moestáveis que funcionam em uma temperatura igual ou superior a 80 °C foi separada de microrganismos que sobrevivem em um ambiente extremo, tal como uma ventilação hidrotérmica. Entretanto, conside-rando-se a celobio-hidrolase que exerce a maior influência sobre a efi- cácia de hidrólise, uma enzima que tem uma termoestabilidade suficiente não foi obtida. Consequentemente, até o presente momento, um líquido de mistura de enzima super-termoestável que degrada e hidro-lisa a biomassa de lignocelulose em uma alta temperatura que é igual ou superior a 80°C não foi preparada. Se o AR19G-166RASFS de ce-lobio-hidrolase que tem um grau extremamente alto de termoestabilidade for usado, é possível prepara um líquido de mistura de enzimas que possibilite que as lignoceluloses sejam hidrolisadas por enzimas a uma high temperatura.

Claims (13)

1. Método para obter seletivamente uma variante natural de uma enzima que tem atividade caracterizado pelo fato de que compreende: (1) uma etapa de detectar uma sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases de DNA metagenômico de microbiota ambiental; (2) uma etapa de obter pelo menos um clone de PCR que inclui a sequência de ORF que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de ORF ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através de deleção, substituição, ou adição de pelo menos um resíduo de amino-ácido em uma sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF, através da realização de clonagem de PCR em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um ini-ciador projetado com base na sequência de ORF; (3) uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de base para cada clone de PCR obtido na etapa (2); e (4) uma etapa de selecionar uma variante natural de uma enzima que tem atividade através da medição da atividade de enzima de proteínas codificadas por cada clone de PCR obtido na etapa (2).

2. Método para fabricar uma variante de uma enzima que tem atividade caracterizado pelo fato de que compreende: (1) uma etapa de detectar uma sequência de ORF de uma proteína que tem atividade de enzima a partir de um banco de dados de genoma que inclui sequências de bases determinadas para uma porção de DNAs metagenômicos da microbiota ambiental; (2) uma etapa de obter pelo menos um clone de PCR que inclui a sequência de ORF que tem um comprimento completo, uma sequência parcial da sequência de ORF ou uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que é formada através de deleção, substituição, ou adição de pelo menos um aminoácido em uma sequência de aminoácidos codificado pela sequência de ORF, através da realização de clonagem de PCR em pelo menos um DNA metagenômico da microbiota ambiental através do uso de um iniciador projetado com base na sequência de ORF; (3) uma etapa de determinar uma sequência de base e uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de base para cada clone de PCR obtido na etapa (2); (4) a etapa de medir a atividade de enzima de proteínas codificadas por cada clone de PCR obtido na etapa (2); (5) uma etapa de investigar a relação entre uma diferença de sequências de aminoácidos codificadas pela sequência de ORF e a atividade de enzima após as etapas (3) e (4); e (6) uma etapa de fabricar uma variante aprimorada em termos da atividade de enzima gerando-se a deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ORF, com base na relação entre a diferença das sequências de aminoácidos e a atividade de enzima que é obtida na etapa (5).

3. Método para fabricar uma variante de uma enzima, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o DNA metagenômico da microbiota ambiental é um DNA metagenômico derivado de solo de alta temperatura e a enzima é uma enzima termoestável que exibe atividade de enzima a uma temperatura pelo menos igual ou superior a 70°C.

4. Método para fabricar uma variante de uma enzima, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a enzima é celuiase.

5. Celobio-hidrolase super-termoestável caracterizada pelo fato de que compreende: um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que inclui (A) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:1, (B) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através de deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos representada através da SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a se-rina na 414a posição são excluídas) e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5 ou (C) um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (neste documento, na sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posição é a serina) que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

6. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende: um domínio que codifica um domínio de catalisador de celobio-hidrolase que inclui (a) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:1, (b) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos formada através da deleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 (neste documento, a serina na 88a posição, a fenilalanina na 230a posição e a serina na 414a posição são excluídas) e tem ativida- de de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, (c) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos (no presente documento, na sequência de aminoácidos, a 88a posição é a serina, a 230a posição é a fenilalanina e a 414a posição é a serina) que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, (d) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que tem identidade de sequência igual ou superior a 80% com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e tem uma atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5, ou (e) uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que é uma sequência de base de um polinucleotídeo hibridizado com um polinucleotídeo que consiste na sequência de base representada por SEQ ID NO: 2 sob condições rígidas e tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5.

7. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 6, foi incorporado e que pode expressar um polipeptídeo que tem atividade de celobio-hidrolase sob condições de pelo menos uma temperatura de 80 °C e um pH de 5,5 em uma célula hospedeira.

8. Transformante caracterizado pelo fato de que é no qual o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 7, foi introduzido.

9. Transformante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é um microrganismo eucariota.

10. Método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de produzir uma celobio-hidrolase super-termoestável no transformante, conforme definido nas reivindicações 8 ou 9.

11. Mistura de celulase caracterizada pelo fato de que compreende: a celobio-hidrolase super-termoestável, conforme definido na reivindicação 5, ou a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada através do método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável, conforme definido na reivindicação 10; e pelo menos um outro tipo de celulase.

12. Método para fabricar um produto de degradação de celulose caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de produzir um produto de degradação de celulose colocando-se um material que contém celulose em contato com a celobio-hidrolase super-termoestável, conforme definido na reivindicação 5, com o transformante, conforme definido na reivindicação 8 ou 9, ou com a celobio-hidrolase super-termoestável fabricada através do método para fabricar uma celobio-hidrolase super-termoestável, conforme definido na reivindicação 10.

13. Método para fabricar um produto de degradação de celulose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: uma etapa de colocar o material que contém celulose em contato com pelo menos um outro tipo de celulase.