CN108660170B

CN108660170B - 一种酶法降解褐藻多糖生成deh的方法

Info

Publication number: CN108660170B
Application number: CN201810498473.7A
Authority: CN
Inventors: 秦慧民; 毛淑红; 李玉; 路福平; 朱张亮
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tiankeda Tianjin Science Park Co ltd
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108660170A

Abstract

本发明提供了一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，分别克隆来源于黄杆菌属(Flavobacterium phragmitis)的褐藻多糖裂解酶Flph(GenBank:WP_091498571.1)和褐藻寡糖酶Flphalx(GenBank:WP_091498561.1)的基因，构建表达载体并分别在大肠杆菌宿主中表达，纯化蛋白得到Flph和Flphalx两种重组酶，将两种重组酶按一定比例复配，以褐藻酸钠为底物转化生成褐藻寡糖和DEH(4‑deoxy‑L‑erythro‑5‑hexoseulose uronic acid)，DEH转化率可以达到85％以上。

Description

一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种利用基因工程菌降解褐藻多糖生产褐藻寡糖及DEH的方法。

背景技术

褐藻多糖主要是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物，故又称褐藻胶。褐藻多糖的聚合方式有三种：由β-D-甘露糖醛酸构成的均聚物(PloyM)、α-L-古罗醛酸构成的均聚物(PloyG)和由β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗醛酸组成的MG随机交替片段(PloyMG)。基于褐藻酸的化学稳定性、高粘度和易于形成凝胶的特性，褐藻酸盐被广泛用于食品添加剂、稳定剂和凝胶材料。

褐藻多糖降解后产生的褐藻寡糖有诸多生物学功能，如抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、抗自由基氧化、抗炎症、调节免疫以及促进生长作用，广泛应用于医药领域、食品领域、日用化工、饲料领域和农业领域。褐藻寡糖有多重方法制备，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法，用酶降解法取代传统的物理、化学法获取褐藻寡糖，是先从海藻中提取褐藻多糖，再利用褐藻多糖裂解酶通过降解反应制备褐藻寡糖，酶降解法具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已经成为生产褐藻寡糖的主要方式。

褐藻多糖裂解酶的作用方式是以β-消除方式催化降解褐藻胶，在寡糖的非还原端C4,5之间形成不饱和双键，并产生一个非还原末端为4-deoxy-L-erythro-5-hexoseuloseuronic acid(DEH)的结构，DEH被降解为2-keto-3-deoxy-D-gluconate(KDG)后进入Entner-Doudoroff途径产生两分子的丙酮酸，随后转化为两分子的乙醇，因此利用酶法降解褐藻多糖制造生物能源乙醇来缓解化石能源及降低环境污染具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是利用基因工程和发酵工程生成褐藻寡糖的工艺方法，通过构建基因工程重组菌，以最大限度利用褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶生产褐藻寡糖和DEH(4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid)。

本发明技术方案概述如下：

本发明提供了一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，包括步骤如下：

a、分别克隆来源于黄杆菌属(Flavobacterium phragmitis)的褐藻多糖裂解酶Flph(GenBank:WP_091498571.1)和褐藻寡糖酶Flphalx(GenBank:WP_091498561.1)的基因；

b、分别构建Flph和Flphalx的表达载体；

c、分别在大肠杆菌宿主细胞中化转和表达含有Flph和Flphalx基因的表达载体，并纯化重组蛋白；

d、将重组菌表达的Flph和Flphalx两种重组酶按一定比例复配，以褐藻酸钠为底物转化生成褐藻寡糖和DEH。

所述褐藻多糖裂解酶Flph和褐藻寡糖酶Flphalx的基因的碱基序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。

所述表达载体为pET-28a。

所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

优选的，Flph和Flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:1-1:5复配为酶液。

更优选的，Flph和Flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:4复配为酶液。

优选的，步骤d是在PBS缓冲液反应体系含有0.15M NaCl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠，加入Flph与Flphalx蛋白浓度比例为1:1-1:5复配的总浓度100-300μg/mL的酶液，于30℃过夜反应。

本发明有益效果：

本发明利用了Flph只能利用褐藻多糖生产褐藻寡糖，不能生产DEH，而Flphalx不仅可以利用褐藻多糖生产褐藻寡糖，而且可以利用褐藻寡糖生产DEH，本发明构建了Flph与Flphalx两种酶的重组菌并通过对两种酶进行复配来生产DEH，利用褐藻酸钠得到的DEH转化率可以达到85％以上，得到的DEH可以进一步用来生产生物能源乙醇，缓解化石燃料和环境压力，本发明较其他单一酶反应的催化效率更高，操作可控，更适于工业化应用。

附图说明

图1A：Flphalx蛋白镍亲和层析SDS-PAGE验证图。其中，Line1：上清；Line2：沉淀；Line3：流穿液；Line4：溶前；Line5：Elution；Line6：溶后。

图1B：Flph蛋白镍亲和层析SDS-PAGE验证图。其中，Line1：上清；Line2：沉淀；Line3：流穿液；Line4：Wash；Line5：溶前；Line6：溶后；Line7：Elution。

图2：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶作用后产物TLC鉴定。其中，Line1：底物褐藻酸盐；Line2：Flphalx反应液；Line3：Flph：反应液。

图3：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶作用后产物HPLC鉴定图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶重组工程菌的构建

(1)提取黄杆菌属(Flavobacterium phragmitis)基因组，基因组提取方法参照OMEGA公司生产的细菌DNA提取试剂盒(货号：D3350-01)说明书。

(2)PCR扩增Flph和Flphalx基因

引物(5’-3’)Flphalx-F：GGAATTCCATATGAAGAATTTTTTAGCGCTTAATC，

引物(5’-3’)Flphalx-R：CCCAAGCTTCTAATACATCATTTTCTGCTTTAAATTTTG，

采用PCR方法扩增出Flphalx约2,300bp的基因片段。

引物(5’-3’)Flph-F：GGAATTCCATATGGATTTAAAATTTTCAAAAATTTC，

引物(5’-3’)Flph-R：CCCAAGCTTCTAATGAGACACTTGAAGGTCGTATA，

采用PCR方法扩增出Flph约860bp的基因片段。

PCR反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

PCR反应条件：

PCR反应结束后，取2μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，观察结果并纯化回收约860bp处(Flph)和2,300bp处(Flphalx)的PCR产物。

(3)DNA纯化回收

采用OMEGA公司的小量DNA纯化回收试剂盒(货号：D2000-02)，具体操作步骤如下：

1)向PCR产物中加入3-5倍体积的buffer CP，充分混匀，室温静置2min。

2)将上述混合溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，13,000r/min离心1min，弃滤液。

3)向吸附柱中加入700μL DNA Wash buffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。

4)向吸附柱中加入500μL DNA Wash buffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。

5)13,000r/min离心2min，除去吸附柱漂洗液。将吸附柱放入一个干净的EP管中置于室温放置10分钟，彻底晾干。

6)向吸附膜中间位置悬空滴加30～50μL的ddH₂O，室温放置2min。12,000r/min离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。

7)用琼脂糖凝胶电泳检测回收成功。

(4)酶切反应

将纯化后的PCR扩增产物用Nde I和Hind III双酶切，然后分别和经过同样双酶切后的pET-28a质粒连接。

PCR产物的酶切反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

载体质粒的酶切反应体系(50μL)：

在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入各试剂：

37℃反应2h，琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物。

(5)参照OMEGA公司的胶回收纯化试剂盒(货号：D2500-02)说明书将酶切产物纯化回收。

(6)连接、转化

通过琼脂糖电泳确定基因与载体的浓度，调整两者的倍数使载体与目的基因的摩尔比为1:1-2:1，连接反应体系如下：

目的基因 3μL

载体 1μL

Solution I 4μL；

16℃反应6h或者过夜。

将连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热击90s，立即冰浴5min；加入500μL LB复苏液，37℃，220r/min复苏培养40-60min；4,000r/min离心5min，沉淀用200μL LB培养基悬浮，混合涂布于含有Amp的抗性平板上，待菌液充分吸收后，37℃倒置培养12～16h至出现单菌落；挑取单菌落，提取质粒DNA，做酶切鉴定。

(7)阳性克隆重组质粒的筛选与鉴定

参照OMEGA公司的快速质粒提取试剂盒(货号：D6943-02)提取质粒，将质粒按照下列体系酶切验证重组质粒：

37℃反应4h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并将验证正确的阳性克隆送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

(8)将重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃过夜培养。挑取单克隆于含氨苄霉素的LB的液体培养基中培养，分别获得褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的基因重组菌株。

实施例2：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的蛋白表达与纯化

褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的蛋白表达：挑取两重组菌单菌落，分别接入到5mL含Amp抗性的LB液体培养基，于37℃，220r/min培养过夜。按照1％的接种量接种到200ml的摇瓶中，37℃，220r/min培养约2h，在OD＝600nm处测定菌液吸光度值，当菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，16℃，160r/min，诱导培养16h。4℃5,000r/min,15min收集菌体。

褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的纯化：用Lysis Buffer(20mM Tirs-HCl 20mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)悬浮细胞，混匀后加入200μL溶菌酶和300μL PMSF，混匀后倒入烧杯中冰浴20min。细胞悬液超声破碎20min(超声2.5s，间隔3.0s)。将破碎液4℃，12,000r/min离心30min，将上清液与用Lysis Buffer平衡好的Ni-NTA superflow结合1h，使混合的样品流经纯化柱，用Wash Buffer(20mM Tirs-HCl 20mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)洗去杂质蛋白,再用Elution Buffer(20mM Tirs-HCl 500mM咪唑500mM NaCl pH＝7.4)溶出目的蛋白，最后通过SDS-PAGE验证，鉴定得到的目的蛋白高纯度高达95％以上，结果如图1所示，然后将褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶用PBS将Elution Buffer透析去除，通过超滤浓缩分别得到褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶。

实施例3：TLC鉴定褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的产物

在1mL反应体系中加上0.15M NaCl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠以及分别添加适量的褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶，于30℃过夜反应。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，用玻璃点样毛细管点在距薄层层析板上(TLC Silica gel 60F₂₅₄，Germany)下端1cm处不同位置，展开剂为正丁醇：醋酸：水(2:1:1，v:v:v)，层析缸展开剂高度要低于样品线，当液面到达距离上端1cm，取出硅胶板，挥发掉展开剂，喷上显色剂(茴香醛：甲醇：H₂SO₄＝1：15：2)，121℃加热10min，结果如图2所示，Flph只能降解褐藻多糖生成褐藻寡糖，Flphalx的降解产物既有褐藻寡糖也有DEH(4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid)。

实施例4：HPLC鉴定褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的产物

在1mL反应体系中加上0.15M NaCl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠以及添加适量的褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶，于30℃下过夜反应。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，将反应液稀释合适浓度到液相小瓶中，采用HPLC对产物进行定性分析，测定条件为：

色谱仪：Agilent1200；

检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)

进样：Agilent自动进样器；进样量10μL；

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,AgelaTechnologies,China)；柱温40℃；

流动相：80％乙腈；流速1mL/min。

结果如图3所示，褐藻二糖和DEH在柱子中得到很好的保留和分离。

实施例5：复合酶转化褐藻多糖生成DEH

在1mL PBS缓冲液反应体系中包含0.15M NaCl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠，按照Flph与Flphalx蛋白浓度比例为1:1-1:5复配酶液，酶浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒测定(北京索莱宝，货号：PC0020)，于30℃过夜反应。结果显示DEH的转化率达到85％以上，其中1:4复配时(Flph与Flphalx蛋白浓度别为50μg/mL和200μg/mL)转化率最高可达95％以上。

实施例6：生产DEH放大反应

参照实施例5中的复配酶比例，在3L摇瓶中按照1L的反应液添加8.7g NaCl、1.5g的褐藻酸钠，以及按照Flph与Flphalx蛋白浓度比例为1:2添加到反应液中，用PBS缓冲液补足到1L，在30℃摇床上设定一个转速，过夜反应，测定转化率，DEH转化率达到87％以上。

实施例7：DEH产物的纯化

(1)将反应液中的酶煮沸5min使其变性，12,000rpm离心5min去除蛋白质沉淀；

(2)将上一步的上清液用真空冷冻干燥剂干燥，重悬于95％的乙醇中溶解DEH，离心后与褐藻寡糖分离；

(3)将溶解于乙醇中的DEH用氮吹仪吹干，即可得到DEH，收率可达90％以上。

虽然本发明已以较佳实施公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法

<141> 2018-05-23

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2304

<212> DNA

<213> 黄杆菌属(Flavobacterium phragmitis)

<400> 1

atgaagaatt ttttagcgct taatctggcc tttttgctat tctcttttgt ggcgactggc 60

aaagacatta taaaagtaaa aaacgaagca gaattaaaaa cagccatatc aagtgcaaaa 120

cctggagatg aaataatttt atctaatggt atctggaaaa atattcaaat taaatttgac 180

agcaaaggaa ctaaagacaa tcctataaca ttacgagctg aaacttctgg aaaagtaagc 240

attgaggggg gatccgattt aaaaattggg ggctcatatt tagttataag aggattgtac 300

tttcgtaacg gttatacacc atcaaaatct gtaattgatt ttcatattga ttcgagtaaa 360

attgcaaaca actgtatcgt tacagattgt gtaattgaag actttactca attgaaccgt 420

gttcgctcag atcattggat tgaattttgg ggaagacata acgaactatc caattcctat 480

ttgtctggaa agtcaaatca gggtcctacc attatggtta ttttagaagg aaatgaacag 540

attaacaatt accacaaaat aattaataac cattttggac cacgtccccg aaagggagga 600

cctcatggcg aaactattca aattggagat agcggtactt caatggctcc ttcctatact 660

actgttgagc acaatttatt tgaaagatgt gatggtgaag ttgaaatcat atcgaataaa 720

tcaaacaata atatttaccg aaataatatc ttttataaat ctgaaggctc tttggttttg 780

cgacatggaa actactgtac catagatagc aatatattta ttggagatga gaattctgat 840

tttatgggcg gtattcgtct aattaataca ggacattgga ttaccaacaa ttatttttat 900

aaaataaaag gaagcgaatt ccgcagtgca ttggcagtaa tgaatggagt tcctaaatct 960

ccacagaacc gttacaatca agttacagat gccgttgtag cttataatac ttttgttgat 1020

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aattctagtg acgctaaagc accaataaaa gcttacgata aaattgatgg cattttattt 1200

aaaaacaaca tcattaacac agactacgaa agcaaatcgg agcctaaaga attgcagaaa 1260

aacagcttta ccttaaataa acaatcggac tggctttatg ttccaacagc aaattacaca 1320

gacgtttata atggttttga ttttgaaact attgcaaaag acatctttgg aaatgacaga 1380

agtactaaaa actccgttgg atcgatggtt tttcctgtgg ataaaaacaa aggacagatt 1440

aataaaaagg actttggaac aagctggttt tctaatgaag cacaggttgc tactccaaaa 1500

acaatacaag taaacacaca aaaagaactt atcaaagcgc tttctgaagc ttcttcaaat 1560

accattattg aactaaaaag tggcacttat aaaataaatg aatctctgaa aattgataaa 1620

accatcacaa ttcaatcaaa agataaaaaa aacaaagcca ttttggaata taatggagca 1680

aacaatactg ctgctttttt aatgttgcca aaaggaaact taatgctaaa tgctgtaatt 1740

cttaaaggaa ataataatca aaacgccttt actaccaaag aaaaagaaat gtctgcggct 1800

tataatctaa aaatagcaaa cagtgaaata agtcaatttg attatgtttt aaagacatac 1860

aaagattctt tttcagacac aatcgctatt gataattcca taataaaaaa ctgtaagaac 1920

gcaataaatc tagccgcaga aaacgacgat ttaggagaat acaacgcaga gtttttattc 1980

attaccaatt ctaaattcga caatatttct aataacattt tggattatta cagaggcggt 2040

tatgatgaat ctactattgg tggcaattta gtttttgaca acaattctgt tattaattct 2100

ggaaaattag aaacaagtgg gacgttatta aagttgcagg gaattgtaaa tgttactatt 2160

tcaaacaata ttttcagcaa caatgctgta aaaacaattg ctgttttatg gggagaaaaa 2220

gaacaaaaag aaagcaataa caaaattgac aattcgggag aatttagaac cgaacaaaat 2280

ttaaagcaga aaatgatgta ttag 2304

<210> 2

<211> 867

<212> DNA

<213> 黄杆菌属(Flavobacterium phragmitis)

<400> 2

atggatttaa aattttcaaa aatttcactt tttgcttcac tggtatttat aacaatgggt 60

tatagtcagg atcaaaagaa caagaaaaat gtcgctaata ttgatttgtc tcattggacg 120

ttaactactc cagcacaaga tccaaagaaa cctggaaaaa catttgattt aaattatcct 180

gaaatatttg attttgcctc aaatgaaaca gcaaaaaagt atatgtatga ggatgcaaaa 240

gacaaatcga ttgtttttta tgcttttcca tctggagttt caactgctaa cagtcatttt 300

tcaagatcag aattgagaga gacgatggaa attggcaata aaaatgtaaa ctggactttt 360

gcgcaaggcg gttacttcaa aggaacatat gccattgaag acgtttctaa agaagctgat 420

ggaaaataca gcagagttat tattgctcag attcatggaa tattaacaga cagccagcaa 480

gaattaattg gacaaaaaga taaaaatgca gcaccgattc tgaaaatctt ctgggatcag 540

ggaaaaataa gagtaaaaac aaaagtgctt aagaatcaaa atgcttcctt aaaagatatg 600

cttcctgcaa cagcttgggg cgatgataag gggagagatt ttaaagaaaa aatagacttc 660

aatactaaat tcactcttga gattaaagta tctgatggaa gattggaagt aatcatgaat 720

ggttcagaat catttgttta tgaagatatc aatatcaaaa aatggggtgt ttttgaaaac 780

tatttcaaag caggaaacta ttttcagtct actaacgcga atacgtttgc taaagtaaaa 840

atatacgacc ttcaagtgtc tcattag 867

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggaattccat atgaagaatt ttttagcgct taatc 35

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cccaagcttc taatacatca ttttctgctt taaattttg 39

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggaattccat atggatttaa aattttcaaa aatttc 36

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cccaagcttc taatgagaca cttgaaggtc gtata 35

Claims

1.一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，包括步骤如下：

a、分别克隆来源于黄杆菌属（Flavobacterium phragmitis）的褐藻多糖裂解酶Flph和褐藻寡糖酶Flphalx的基因；所述褐藻多糖裂解酶Flph和褐藻寡糖酶Flphalx的基因的碱基序列分别如 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示；

b、分别构建Flph和Flphalx的表达载体；

c、分别在大肠杆菌宿主细胞中转化和表达含有Flph和Flphalx基因的表达载体，并纯化重组蛋白；

d、将重组菌表达的Flph和Flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:1-1:5复配，以褐藻酸钠为底物转化生成褐藻寡糖和DEH。

2.如权利要求1所述的一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，其特征在于，所述表达载体为pET-28a。

3.如权利要求1所述的一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

4.如权利要求1所述的一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，其特征在于，所述 Flph和Flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:4复配为酶液。

5.如权利要求1所述的一种酶法降解褐藻多糖生成DEH的方法，其特征在于，步骤d是在含有0.15 M NaCl的PBS缓冲液反应体系中，加入0.15 % （w/v）的褐藻酸钠，加入Flph与Flphalx蛋白浓度比例为1:1-1:5复配的总浓度100-300 μg/mL的酶液，于30 ℃过夜反应。