KR101776924B1

KR101776924B1 - 신규의 효소를 이용한 말토오스의 생산방법

Info

Publication number: KR101776924B1
Application number: KR1020150139878A
Authority: KR
Inventors: 심재훈; 전혜연; 이혜원; 최혜정
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2015-10-05
Publication date: 2017-09-08
Also published as: KR20170040634A

Abstract

락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-III 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소를 이용한 말토오스의 생산방법에 관한 것으로, 기존 공정보다 저온인 30℃에서도 반응이 가능하기 때문에 에너지를 절감할 수 있고, 본 발명의 효소(LBA)는 탄수화물 가수분해 효소 패밀리(GH family, GH) 13에 속하는 알파 아말라아제이나, 기질을 비환원성 말단부터 말토오스 단위로 가수분해하는 베타 아밀라아제와 유사한 특성을 지니기 때문에, 직접적으로 말토오스를 생산할 수 있다.

Description

신규의 효소를 이용한 말토오스의 생산방법 {Method for production of maltose with novel enzyme}

본 발명은 신규의 효소를 이용한 말토오스의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-III 균주로부터 유래한 효소를 이용한 말토오스의 생산방법을 제공한다.

말토오스(엿당, G2)는 엿기름(맥아, 질금)을 뜻하는 말트(malt)에서 유래하였으며, 맥아당이라고도 한다. 말토오스는 두 개의 포도당이 α-1,4-결합으로 이어진 환원성 이당류이다.

말토오스는 인체에 대해 동화작용이 강하고, 영양적 가치가 높은 말토올리고당(maltooligosaccharide) 중 하나인데, 자연계에서는 보통 발아종자에 함유되어 있다. 이러한 말토오스는 식품, 약학, 생물 의학, 정제 화학 등의 산업분야에서 널리 사용되고 있다.

말토오스의 생산을 위해 기존에는 증자법을 주로 사용하였다. 증자법은 전분에 액화효소인 내열성 알파 아밀라아제를 첨가하여 90~100℃에서 증자와 동시에 반응시켜 액화시킨 후, 액화전분에 각종 말토오스 생성효소(베타 아밀라아제)를 첨가하여 24~72시간 반응시키는 2단계 '증자액화-당화공정'을 의미한다.

하지만, 상기와 같은 기존의 공정은 증자 및 농축과정에서 다량의 에너지가 소모되며, 당화시간이 긴 단점이 있다. 따라서, 이를 해결할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구된다 할 수 있다.

대한민국 특허공개범호 제10-1998-0002268호 (공개일자 1998. 03. 30)에는, 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus Stearothermophilus) KCTC 0144BP로부터 분리한 말토오스생성 아밀라제 유전자로, 10% SDS-PAGE로 측정한 분자량이 약 62000 Da이고, 아이소일렉트릭 포커싱(isoelectric focusing; IEF)에 의해 측정한 등전점이 약 4.0이고, 풀루란에 작용하여 주로 판노오스를 생성하고, 전분을 분해하여 주로 말토오스를 생성하며, β-사이클로덱스트린을 분해하는 말토오스생성 아밀라제 유전자가 기재되어 있다.

본 발명에서는 기존의 증자 및 농축과정에서 다량의 에너지가 소모되며, 당화시간이 긴 단점을 극복하고자, 낮은 온도에서도 반응 진행이 가능한 새로운 효소를 발굴하고, 이를 바탕으로 새로운 말토오스 생산방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 말토오스의 생산방법을 제공한다. α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물의 일 예로는 아밀로오스(amylose)가 있고, 또한, 전분이 있을 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물은, 일 예로 α-1,6 글루코사이드 결합도 갖고 있는 것일 수 있다. α-1,4 글루코사이드 결합 외에 α-1,6 글루코사이드 결합을 갖는 화합물은 일 예로 아밀로펙틴(amylopectin)이 있다.

본 발명에서는 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-III 균주로부터 클로닝한 효소(alpha-amylase, LBA)가, 상대적으로 고부가가치 소재인 말토오스(엿당)를 전분으로부터 저온 (30℃)에서 고수율로 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.

통상적으로 전분으로부터 말토오스를 생산하기 위해서는 고온에서 수행되는 액화공정과 그 이어 수반되는 당화공정이 함께 수행되어야 하는데, 본 발명의 LBA 효소는 저온에서 액화 및 당화 공정을 모두 수행할 수 있다. 저온에서 액화 반응이 가능하다는 것은 기존 공정 대비 에너지 절감 효율이 높다는 것을 의미하는데 이로부터 본 발명은 높은 생산성을 확보할 수 있다.

또한, 본 발명의 LBA 효소는 전분가수분해물로부터 말토오스를 생산하는 당화 공정도 함께 수행 가능하기 때문에 2개의 효소를 사용할 필요가 없다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 LBA 효소 하나만을 사용하여도 말토오스 생산이 가능하다는 장점이 있다. 이는 공정의 단순화를 가져오고, 효소 사용에 대한 비용 절감 효과를 가져오기 때문에, 말토오스 생산의 생산성 향상에 이바지 할 수 있다.

한편, 본 발명의 효소(LBA)는 종래의 효소 (베타 아말리아제)와 다르게 말토트리오스도 분해가 가능하기 때문에, 말토오스를 고순도로 생산할 수 있다. 즉, 종래의 효소를 이용할 경우, 말토트리오스를 분해하지 못하기 때문에, 생성물 중에는 말토오스 외에 말토트리오스도 존재하게 된다. 하지만, 본 발명의 효소(LBA)는 말토트리오스도 분해하여 말토오스를 생산할 수 있기 때문에, 말토오스를 고순도로 생산할 수 있는 것이다.

한편, 본 발명은 말토트리오스를 함유하는 기질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 말토트리오스(maltotriose)로부터 말토오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 말토오스의 생산방법을 제공한다.

한편, 본 발명의 말토오스 생산방법에 있어서, 상기 반응은, 10~50℃의 온도에서 수행하는 것이 좋다. 본 발명 효소가 상대적으로 낮은 온도에서도 높은 활성을 나타내기 때문에 굳이 많은 에너지를 소비하여 높은 온도에서 반응을 유도할 필요가 없다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-III로부터 유래한 효소 (서열번호 1의 아미노산 서열, LBA)를 이용할 경우, 기존 공정보다 저온인 30℃에서도 반응이 가능하기 때문에 에너지를 절감할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 효소(LBA)는 탄수화물 가수분해 효소 패밀리(GH family, GH) 13에 속하는 알파 아말라아제이나, 기질을 비환원성 말단부터 말토오스 단위로 가수분해하는 베타 아밀라아제와 유사한 특성을 지니기 때문에, 직접적으로 말토오스를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 효소(LBA)는 식물로부터 유래한 효소인 일반적인 베타 아밀라아제가 가수분해할 수 없는 말토트리오스(maltotriose, 포도당 3개로 이루어진 당)를 가수분해 할 수 있는 특이성이 있기 때문에, 고순도로 말토오스를 생산할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에서 제조한 인서트 DNA (lpst -c0146, 본 발명 LBA 효소의 유전자)가 삽입된 재조합 벡터의 맵이다.
도 2는 정제된 본 발명 LBA 효소의 전기영동 사진이다. 도 2에서 'S: 표준용액, lane 1: 세포 추출물, lane 2: 가용성 부분, lane: 정제된 본 발명 효소 (LBA)'를 나타낸다.
도 3은 본 발명 LBA 효소의 기질 분해 패턴을 보여주는 TLC 사진이다. 도 3에서, 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: 말토오스, lane 2: 말토트리오스, lane 3: 말토테트라오스, lane 4: 말토헵타오스, lane 5: 알파-CD, lane 6: 베타-CD, lane 7: 감마-CD, lane 8: 아밀로오스, lane 9: 아밀로펙틴, lane 10: 가용성 전분; a: 반응 전, b: 반응 후'를 나타낸다.
도 4는 본 발명 LBA 효소의 pNPG5(기질)에 대한 분해 패턴을 보여주는 사진이다. 도 4에서, 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: pNPG5 컨트롤, lane 2: LBA 반응 30분, lane 3: LBA 반응 1시간, lane 4: LBA 반응 2시간, lane 5: LBA 반응 3시간, lane 6: LBA 반응 4시간, lane 7: LBA 반응 12시간'을 나타낸다.
도 5-A는 본 발명 LBA 효소의 반응 최적 온도를 확인한 실험 결과이다. 도 5-B는 본 발명 LBA 효소의 반응 최적 pH를 확인한 실험 결과이다.
도 6-A는 본 발명 LBA 효소와 기존 베타 아말라아제의 기질 가수분해 패턴을 보여준다. 도 6-A에서 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: 말토트리오스, lane 2: 말토펜타오스, lane 3: 말토헥사오스; a: 반응 전, b: LBA 반응 후, c: 베타 아밀라아제 반응 후'를 나타낸다. 도 6-B, C는 본 발명 효소 LBA 및 기존 베타 아말라아제 처리시 말토오스의 생산 순도를 보여주는 결과이다. 도 6-B, C에서 'B: LBA 반응, C: 베타 아밀라아제 반응; a: 이소아밀라아제 처리한 가용성 전분, b: 1시간 반응 c: 7시간 반응 d: 12시간 반응'을 나타낸다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum subsp . plantarum ) ST-III로부터 본 발명 LBA 효소 (서열번호 1의 아미노산 서열)의 생산]

1) 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction; PCR )

락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-III 균주 (KCTC 3015)로부터 본 발명 LBA 효소(서열번호 1의 아미노산 서열을 가짐)의 유전자(서열번호 2의 핵산 서열을 가짐)를 증폭하고자 하였다.

멸균수(sterilized water) 37.5 μL, 10× EX Taq 버퍼 5 μL, dNTP 4 μL, 정방향 프라이머(forward primer) 1 μL, 역방향 프라이머(reverse primer) 1 μL, DNA (KCTC 3015, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III) 1 μL, EX Taq 0.5 μL 혼합물(total 50 μL)을, 하기 표 1의 프라이머(primer)를 사용하여 98℃에서 1분 동안 실시한 후, 98℃에서 10초 (denaturation), 55℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 1분 21초 (elongation)의 조건으로 PCR (30 cycles)을 실시하였다.

정방향 프라이머(Forward primer)	5'- GTC GAC AGC ACG CGA TAC GCA AAC G -3'
역방향 프라이머(Reverse primer)	5'- CTC GAG ATT GGA CTG GTC AGC AAC -3'

2) 중합효소연쇄반응의 정제

상기의 PCR 반응 후, PCR 혼합물에 5배 부피만큼의 BNL 버퍼를 넣고 볼텍싱(vortexing)하였다. 이후, BNL 버퍼의 1.5배 부피만큼인 이소프로판올(isopropanol)을 넣고, 여러 번 피펫팅(pipetting) 하여 섞어 주었다. 이것을 스핀컬럼(spin column)에 옮겨 담고 11,323×g으로 1분간 원심분리 하여 하층액을 버렸다. 워싱버퍼(washing buffer)를 700 μL 넣고 11,323×g으로 1분간 원심분리 하여 하층액을 버렸다. 이후, 아무것도 넣지 않은 상태로 다시 11,323×g으로 1분간 다시 한 번 원심분리하였다. 새로운 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 스핀컬럼(spin column) 윗부분을 옮겨 담고 멸균수(sterilized water) 30 μL를 넣고 1분간 방치한 뒤, 다시 11,323×g으로 1분간 원심분리하였다. 생산된 PCR 산물 (lpst -c0146)의 농도를 나노드랍(nanodrop)으로 측정하였는데, 215.1 ng/μL이었다.

3) 제한효소처리(Restrict enzyme treatment)

상기에서 PCR 산물로 수득된 DNA (lpst -c0146) 28 μL, Sal I 2 μL, Xho I 2 μL, 1×H 버퍼 5 μL, 멸균수(sterilized water) 13 μL의 혼합물을 37℃에서 2시간 반응시켰다. 벡터(vector)로는 pTKNd119를 사용하여 같은 방법으로 제한효소 반응시켰다. 그 후, pTKNd119 벡터(vector)에만 CIAP 1 μL 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

4) 젤 추출(Gel extraction)

상기에서 제한효소 처리를 한 인서트(insert; lpst-c0146), 벡터(vector; pTKNd119)에 각각 5 μL씩 로딩 버퍼(loading buffer)를 넣고 0.5×TBE 버퍼, 1.2% 아가로스 젤(agarose gel)를 사용하여 50 V로 전기영동하였다. 전기영동하여 나타난 밴드를 잘라서 멸균된 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 담고 무게를 쟀다. 젤 무게의 3배 부피만큼의 BNL 버퍼를 넣고, 55℃의 히팅블럭(heating block)에서 2~3번 볼텍싱(voltexing) 하면서 10분 동안 녹여주었다. 여기에 젤 무게의 1배 부피만큼의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 피펫팅(pipetting) 해 주었다. 각각을 스핀컬럼(spin column)에 옮겨 담고, 11,323×g으로 1분간 원심분리한 뒤, 하층액은 버렸다. 워싱버퍼(washing buffer) 700 μL를 넣고 11,323×g으로 1분 원심분리한 뒤 하층액을 버리고 한 번 더 원심분리하였다. 이후, 스핀컬럼(spin column)의 윗 부분을 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 옮겨서 멸균수(sterilized water) 30 μL를 넣고 1분간 기다린 후 다시 11,323×g으로 1분 원심분리해 주었다. 농도를 측정한 결과 인서트(insert)는 32.0 ng/μL, 벡터(vector)는 153.6 ng/μL이 나왔다.

5) 라이게이션 (Ligation) 및 형질전환(transformation)

라이게이션(ligation; 실험군), 셀프 라이게이션(self-ligation; 대조군) 두 가지를 준비하였다. 라이게이션(ligation)할 때는 인서트(insert)와 벡터(vector)의 농도는 세 배 이상 차이가 나야한다. 우선 실험군인 라이게이션 혼합물에는 인서트 DNA 6 μL (192.0 ng/μL), 4배 희석한 벡터(38.4 ng/μL) 1 μL, 멸균수 0 μL, 리가아제(ligase) 7 μL를 넣어주었다. 대조군인 셀프 라이게이션 혼합물에는 4배 희석한 벡터 1 μL, 인서트 DNA 대신 멸균수 6 μL, 리가아제(ligase) 7 μL를 넣어주었다. 상기에서 준비한 라이게이션 혼합물, 셀프 라이게이션 혼합물을 16℃에서 30분 동안 재조합 벡터로 각각 제조하였다 (도 1 참조). 도 1은 본 발명에서 제조한 인서트 DNA (lpst -c0146, 본 발명 LBA 효소의 유전자)가 삽입된 재조합 벡터의 맵이다.

그 후, CaCl₂법을 이용하여 대장균 (E.coli; MC1061)에 상기 재조합 벡터로 형질전환하였다. 그 방법은 각 라이게이션, 셀프 라이게이션 혼합물에 컴피턴트 세포(competent cell; MC1061)를 200 μL씩 넣고, 얼음 30분 42℃ 2분, 얼음 2분 한 후 LB 배지 800 μL 첨가 후 37℃ 1시간 동안 회복기를 거쳤다. 그 후, 5,000×g, 1분 동안 원심분리하여 상층액 800 μL 버리고, 나머지 200 μL를 취해 카나마이신(kanamycin) 고체배지(LBK)에 도말한 후 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.

6) 세포파쇄 및 정제

라이게이션된 벡터(실험군)가 삽입된 대장균을 1 L의 카나마이신 액체배지(LBK)에 접종하고, 진탕배양기(shaking incubator)에서 30℃, 20시간 동안 150 rpm으로 교반하여 키운 후, 원심분리기 (5,420×g, 20분)를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 다시 pH 6.0의 50 mM Citric-NaOH 완충용액에 재부유한 후 초음파로 세포파쇄를 실시하였다. 세포파쇄로부터 수득된 조효소액을 원심분리(5,420×g, 20분)하여 상층액을 취하고, 이를 Ni-NTA 컬럼에 흡착시킨 후 본 발명 LBA 효소를 수득하였다.

SDS-PAGE를 통하여 확인해 본 결과, 다른 밴드는 보이지 않는 것으로 보아 순수한 LBA만 정제된 것을 확인할 수 있다(49.9 kDa). 도 2는 정제된 본 발명 LBA 효소의 전기영동 사진이다 (도 2 참조). 도 2에서 'S: 표준용액, lane 1: 세포 추출물, lane 2: 가용성 부분, lane: 정제된 본 발명 효소 LBA'를 나타낸다.

[ 실시예 2: 본 발명 효소 ( LBA )의 특성 분석]

1) LBA의 기질별 반응시험

LBA의 최적 기질과 가수분해 양상을 알아보기 위해 각각의 1% 기질 {말토오스(maltose; G2), 말토트리오스(maltoriose; G3), 말토테트라오스(maltotetraose; G4), 말토헵타오스(maltoheptaose; G5), 알파-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin; alpha-CD), 베타-사이클로텍스트린(β-cyclodextrin; beta-CD), 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin; gamma-CD), 아밀로오스(amylose), 아밀로펙틴(amylopectin), 가용성 전분(soluble starch)}과 pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액에 LBA 효소 0.8 unit/mg을 넣고, 30℃에서 12시간 동안 반응하여 TLC(thin layer chromatography) 분석을 수행하였다.

TLC 결과, LBA는 기질을 말토오스 단위로 가수분해하며, 알파-CD, 베타-CD, 감마-CD는 가수분해하지 못하는 것으로 나타났다 (도 3 참조). 도 3은 본 발명 LBA 효소의 기질 분해 패턴을 보여주는 TLC 사진이다. 도 3에서, 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: 말토오스, lane 2: 말토트리오스, lane 3: 말토테트라오스, lane 4: 말토헵타오스, lane 5: 알파-CD, lane 6: 베타-CD, lane 7: 감마-CD, lane 8: 아밀로오스, lane 9: 아밀로펙틴, lane 10: 가용성 전분; a: 반응 전, b: 반응 후'를 나타낸다.

또한, 1% pNPG5와 pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액에 효소 0.8 unit/mg을 넣고 30℃에서 반응한 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 12시간 반응의 시간 마다 샘플링(sampling) 하고 이를 5분간 끓여 반응정지하였다. TLC로 확인한 결과, 반응 초반부터 G2와 pNPG3가 생산되는 것으로 나타나, LBA는 기질을 비환원성 말단부터 가수분해함을 확인할 수 있었다 (도 4 참조). 도 4는 본 발명 LBA 효소의 pNPG5(기질)에 대한 분해 패턴을 보여주는 사진이다. 도 4에서, 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: pNPG5 컨트롤, lane 2: LBA 반응 30분, lane 3: LBA 반응 1시간, lane 4: LBA 반응 2시간, lane 5: LBA 반응 3시간, lane 6: LBA 반응 4시간, lane 7: LBA 반응 12시간'을 나타낸다.

2) LBA 효소의 최적 온도 및 pH 확인 실험

DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)를 이용하여 본 발명 LBA 효소의 최적 온도 및 pH를 확인하고자 하였다.

① 최적 반응 온도 확인

기질{(0.5% 가용성 전분(showa, Japan)}, 완충용액(50 mM NaOAC pH6.0), LBA 효소 0.8 unit/mg을 넣고 10~50℃의 온도에서 반응한 후 5분마다 샘플링(sampling)하였다. 샘플과 DNS용액의 비율이 1:3이 되게 혼합하여 이를 5분 동안 끓여 ELISA 리더 기기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 실험을 한 온도에서 3번 이상씩 실험하여 표준편차를 계산하였다.

실험결과, LBA 효소는 30℃에서 역가가 가장 높음을 확인할 수 있었다 (도 5-A 참조). 도 5-A는 본 발명 LBA 효소의 반응 최적 온도를 확인한 실험 결과이다.

② 최적 반응 pH 확인

기질{(0.5% 가용성 전분(showa, Japan)}, 완충용액(50 mM Citric-NaOH pH 2.5-4, 50 mM NaOAC pH 4-6), LBA 효소 0.8 unit/mg을 넣고 30℃의 온도에서 반응한 후 5분마다 샘플링(sampling)하였다. 샘플과 DNS용액의 비율이 1:3이 되게 혼합하여 이를 5분 동안 끓여 ELISA 리더 기기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 실험을 한 pH에서 3번 이상씩 실험하여 표준편차를 계산하였다.

실험결과, LBA 효소는 pH 3.0에서 역가가 가장 높음을 확인할 수 있었다 (도 5-B 참조). 도 5-B는 본 발명 LBA 효소의 반응 최적 pH를 확인한 실험 결과이다.

3) LBA 효소의 비역가 (specific activity) 측정

각 0.5% 기질{말토트리오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose), 말토펜타오스(maltopentaose), 글리코겐(glycogen), 감자 전분(potato starch), 옥수수 전분(corn starch), 가용성 전분(soluble starch, 아밀로오스(amylose), 아밀로펙틴(amylopectin)}과 pH 3.0의 50 mM Citric-NaOH 완충용액에 LBA 효소 0.8 unit/mg을 넣고 30℃에서 반응시키며, 3분, 6분, 9분, 12분, 15분에 샘플링하여 샘플과 DNS의 비율이 1:3이 되게 하였다. 이를 5분 동안 끓인 후 ELISA 리더 기기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 실험을 한 기질당 3번 이상씩 실험하여 표준편차를 구했으며 결과는 표 2와 같았다.

기질	비역가(specific activity) (U/mg)
말토펜타오스(maltopentaose)	3.15±0.110
가용성 전분(soluble starch)	2.88±0.002
말토테트라오스(maltotetrose)	2.29±0.108
말토트리오스(maltotriose)	2.03±0.049
글리코겐(glycogen)	1.40±0.001
감자 전분(potato starch)	0.0360±0.0044
옥수수 전분(corn starch)	0.0305±0.0015
아밀로오스(amylose)	0.0191±0.0007
아밀로펙틴(amylopectin)	0.0145±0.0002

실험결과, LBA 효소는 말토펜타오스(maltopentaose)에서 3.15±0.110 U/mg으로 가장 우수한 비역가를 나타냄을 확인할 수 있었다.

4) LBA 효소의 반응성 ( k _cat / K _m ) 측정 (Kinetic study)

각 기질{글리코겐(glycogen), 감자 전분(potato starch), 옥수수 전분(corn starch), 아밀로오스(amylose), 아밀로펙틴(amylopectin)}에 50 mM Citric-NaOH pH 3.0, LBA 효소 0.8 unit/mg을 넣고 30℃에서 반응시키며 3분, 6분, 9분, 12분, 15분, 18분마다 샘플링하고 5분 동안 끓여 반응정지 한다. 각 기질은 다양한 농도별로 실험하였다.

샘플의 분석은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)를 이용하여 분석하였다. LBA 효소 반응액을 증류수로 50배 희석하여 박막여과필터(0.45 ㎛)로 여과한 후, 20 μL를 기기에 주입하였고, 유속은 분당 1 mL로 하였다. HPAEC 분석은 다이오넥스(Dionex)사의 'GP40 그래디언트펌프'와 'ED40 전기화학적 검출기' 및 카보팩-컬럼(Carbo-PacPA1)을 이용하여 시행하였다. A 용매로는 150 mM의 수산화나트륨(NaOH)용액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 아세트산 나트륨(Na-acetate)을 녹인 것을 B 용매로 하여, 6분 후에 B 용매가 10%에서 22%가 되도록 직선적으로 농도를 높여 주었다. 표 3은 이에 대한 결과이다.

기질	k _cat/K _m(mL/mg·min)
글리코겐	0.888
감자 전분	0.912
옥수수 전분	0.498
아밀로오스	1.164
아밀로펙틴	0.714

실험결과, k _cat/K _m (mL/mg·min)는 글리코겐: 0.888 mL/mg·min, 감자 전분: 0.912 mL/mg·min, 옥수수 전분: 0.498 mL/mg·min, 아밀로오스: 1.164 mL/mg·min, 아밀로펙틴: 0.714 mL/mg·min를 나타내었다.

5) LBA와 기존 식물 유래 베타 아밀라아제(plant origin β-amylase)의 비교

신규 효소 LBA와 기존의 베타 아밀라아제(시판 중인 일반 효소 - beta amylase from barley, Sigma-Aldrich Co.)의 비교를 위해, 각 0.5 % 기질(말토트리오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스)에, LBA의 경우에는 pH 3.0의 50 mM Citric-NaOH 완충용액과 효소 0.8 unit/mg를 섞어 30℃에서 12시간 반응하고, 베타 아밀라아제의 경우에는 pH 5.0의 50 mM NaOAC 완충용액과 효소 0.8 unit/mg를 섞어 20℃에서 12시간 반응하였다. 그 후 5분간 끓여 반응정지시킨 후 TLC 하였다 (도 6-A 참조). 도 6-A는 본 발명 효소 LBA와 기존 베타 아말라아제의 기질 가수분해 패턴을 보여준다. 도 6-A에서 'S: G1-G7 표준용액, lane 1: 말토트리오스, lane 2: 말토펜타오스, lane 3: 말토헥사오스; a: 반응 전, b: LBA 반응 후, c: 베타 아밀라아제 반응 후'를 나타낸다.

실험결과, 기존 베타 아밀라아제는 G6와 G5를 말토오스단위로 가수분해하지만, G3는 가수분해하지 못함을 확인하였다. 하지만, LBA 경우에는 G6와 G5를 말토오스 단위로 가수분해할 뿐만 아니라, G3 역시 가수분해하는 특성이 확인되었다.

또한, 각 효소를 사용하여 말토오스 생산 시 순도 비교를 하기 위하여, 0.5% 가용성 전분을 50 mM NaOAC pH 4.0, 40℃에서 4시간 동안 이소아밀라아제(isoamylase)를 0.2 unit/mg 넣어 효소 처리한 뒤, 각 효소의 양은 0.5 unit/mg로 하여, LBA는 50 mM Citric-NaOH pH 3.0, 30℃에서 반응하였고, 베타 아밀라아제는 50 mM NaOAC pH 5.0, 20℃에서 반응하였다. 1시간, 7시간, 12시간 후 샘플링하여 5분간 끓여 반응정지시켰다.

이후, LBA 효소와 베타 아밀라아제 반응액을 증류수로 50배 희석하여 박막여과필터(0.45 ㎛)로 여과한 후, 20 μL를 기기에 주입하였고, 유속은 분당 1 mL로 하였다. HPAEC 분석은 다이오넥스(Dionex)사의 'GP40 그래디언트펌프'와 'ED40 전기화학적 검출기' 및 카보팩-컬럼(Carbo-PacPA1)을 이용하여 시행하였다. A 용매로는 150 mM의 수산화나트륨(NaOH)용액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 아세트산 나트륨(Na-acetate)을 녹인 것을 B 용매로 하여, 16분 후에 B 용매가 10%에서 40%가 되도록 직선적으로 농도를 높여 주었다 (도 6-B, C 참조). 도 6-B, C는 본 발명 효소 LBA 및 기존 베타 아말라아제 처리시 말토오스의 생산 순도를 보여주는 결과이다. 도 6-B, C에서 'B: LBA 반응, C: 베타 아밀라아제 반응; a: 이소아밀라아제 처리한 가용성 전분, b: 1시간 반응 c: 7시간 반응 d: 12시간 반응'을 나타낸다.

실험 결과, LBA는 G3를 가수분해하기 때문에 G2의 그래프만을 확인할 수 있지만, 기존 베타 아밀라아제는 G3를 가수분해하지 못하여 G3의 그래프도 확인할 수 있었다.

상기의 결과에 의해, 본 발명의 LBA를 이용할 경우, 기존의 베타 아밀라아제에 비해, 고순도로 G2 생산이 가능하다는 점을 확인할 수 있었다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Method for production of maltose with novel enzyme <130> AP-2015-0165 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III (KCTC 3015) <400> 1 Met Ala Arg Asp Thr Gln Thr Gln Leu Arg Asn Glu Met Ile Tyr Ser 1 5 10 15 Val Phe Val Arg Asn Tyr Ser Glu Ala Gly Asn Phe Ala Gly Val Thr 20 25 30 Ala Asp Leu Gln Arg Ile Lys Asp Leu Gly Thr Asp Ile Leu Trp Leu 35 40 45 Leu Pro Ile Asn Pro Ile Gly Glu Val Asn Arg Lys Gly Thr Leu Gly 50 55 60 Ser Pro Tyr Ala Ile Lys Asp Tyr Arg Gly Ile Asn Pro Glu Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Leu Ala Asp Phe Lys Ala Leu Thr Asp Arg Ala His Glu Leu Gly 85 90 95 Met Lys Val Met Leu Asp Ile Val Tyr Asn His Thr Ser Pro Asp Ser 100 105 110 Val Leu Ala Thr Glu His Pro Glu Trp Phe Tyr His Asp Ala Asp Gly 115 120 125 Gln Leu Thr Asn Lys Val Gly Asp Trp Ser Asp Val Lys Asp Leu Asp 130 135 140 Tyr Gly His His Glu Leu Trp Gln Tyr Gln Ile Asp Thr Leu Leu Tyr 145 150 155 160 Trp Ser Gln Phe Val Asp Gly Tyr Arg Cys Asp Val Ala Pro Leu Val 165 170 175 Pro Leu Asp Phe Trp Leu Glu Ala Arg Lys Gln Val Asn Ala Lys Tyr 180 185 190 Pro Glu Thr Leu Trp Leu Ala Glu Ser Ala Gly Ser Gly Phe Ile Glu 195 200 205 Glu Leu Arg Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Leu Ser Asp Ser Glu Leu Tyr 210 215 220 Gln Ala Phe Asp Met Thr Tyr Asp Tyr Asp Val Phe Gly Asp Phe Lys 225 230 235 240 Asp Tyr Trp Gln Gly Arg Ser Thr Val Glu Arg Tyr Val Asp Leu Leu 245 250 255 Gln Arg Gln Asp Ala Thr Phe Pro Gly Asn Tyr Val Lys Met Arg Phe 260 265 270 Leu Glu Asn His Asp Asn Ala Arg Met Met Ser Leu Met His Ser Lys 275 280 285 Ala Glu Ala Val Asn Asn Leu Thr Trp Ile Phe Met Gln Arg Gly Ile 290 295 300 Pro Leu Ile Tyr Asn Gly Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Gln Pro Ser 305 310 315 320 Leu Phe Asp Arg Asp Thr Met Val Ala Asp Arg His Gly Asp Val Thr 325 330 335 Pro Leu Ile Gln Lys Leu Val Thr Ile Lys Gln Leu Pro Leu Leu Arg 340 345 350 Ala Ala Asp Tyr Gln Leu Ala Val Val Glu Glu Gly Ile Val Lys Ile 355 360 365 Thr Tyr Arg Ala Ala Gly Glu Ala Leu Thr Ala Trp Ile Pro Leu Lys 370 375 380 Gly Gln Val Thr Ala Val Ala Thr Lys Leu Ala Ala Gly Ser Tyr Gln 385 390 395 400 Asn Leu Leu Thr Asp Gly Pro Thr Glu Val Val Asp Gly Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Gly Gln Pro Val Leu Ile Lys Tyr Val Thr Asn Thr Ala Val 420 425 430 Thr Lys Val Ala Asp Gln Ser Asn 435 440 <210> 2 <211> 1323 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III (KCTC 3015) <400> 2 atggcacgcg atacgcaaac gcaattacgc aatgagatga tttactcagt ctttgttaga 60 aactactcag aagctggtaa ttttgctggc gtaactgctg acttacaacg aattaaggat 120 ttaggaaccg atattttgtg gctactgcca atcaatccga tcggtgaggt caaccgtaag 180 gggacacttg gttcgccata tgcaatcaag gactaccgtg ggatcaatcc ggaatacggg 240 actttagctg actttaaagc actcacggat agggcgcatg aattaggaat gaaagtgatg 300 ttagacattg tctataatca cacttcgcct gattcagtct tagcaaccga acatccagag 360 tggttttatc acgacgcgga tggtcagttg acgaataagg tcggcgactg gagtgacgtt 420 aaagacttag actatggtca ccatgagttg tggcagtatc aaatcgacac actcttgtat 480 tggagccagt ttgtggacgg ttaccgttgt gatgttgcgc cattagtgcc acttgatttc 540 tggcttgaag cgcggaaaca ggttaatgcg aagtacccgg aaacgttatg gttagcggag 600 tcagccggca gtggttttat tgaggaactg cggtcacaag gctacacggg tctgtctgac 660 agtgaacttt atcaagcttt tgatatgaca tacgattacg acgtcttcgg tgattttaaa 720 gattactggc aaggacgcag tacggtcgaa cggtatgttg acttgttaca acgccaagat 780 gccactttcc ctggtaatta tgtcaagatg cgcttcttgg aaaatcatga taatgcacgc 840 atgatgagct tgatgcacag caaagctgaa gccgttaata acttgacctg gatcttcatg 900 caacgtggta ttccgttaat ctataacggg caagaatttt tggccgaaca ccaaccatca 960 ttgttcgatc gggacaccat ggttgcagat cgtcatgggg acgtgacacc actgattcaa 1020 aagctagtga ctattaagca actaccatta ctgcgtgctg cggactacca attggcagtc 1080 gtagaagaag gtatcgttaa gattacttac cgtgcggctg gcgaagcgtt aacagcctgg 1140 attccgttaa aaggtcaggt cacagcagtt gcgactaagc tagcagctgg tagctatcaa 1200 aatctgttaa cagatggtcc tactgaagtt gtggatggca agctgacagt tgatggtcaa 1260 ccagtattaa ttaaatatgt caccaatacg gcggtgacta aagttgctga ccagtccaat 1320 tag 1323

Claims

α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물을 함유하는 기질에 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-Ⅲ 균주 유래의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하여 반응시켜 상기 기질의 비환원성 말단부터 가수분해하는 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물은,
α-1,6 글루코사이드 결합도 갖고 있는 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 α-1,4 글루코사이드 결합을 갖는 화합물은,
아밀로오스(amylose)인 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 α-1,4 글루코사이드 결합 외에 α-1,6 글루코사이드 결합도 갖고 있는 화합물은,
아밀로펙틴(amylopectin)인 것을 특징으로 말토오스의 고순도 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 화합물은,
전분인 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법
말토트리오스를 함유하는 기질에 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) ST-Ⅲ 균주 유래의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하여 반응시켜 상기 기질의 비환원성 말단부터 가수분해하여 말토트리오스로부터 말토오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법.
제1항 또는 제6항에 있어서,
상기 반응은,
10~50℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 말토오스의 고순도 생산방법.