JPWO2012077322A1 - 環状構造保有分岐状グルカンの工業的製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(項目1)
環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法であって、該方法は、
(1)5重量%以上50重量%以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が0℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程;および
(2)該混合液の温度を85℃以上129℃以下に上昇させる工程
を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法。
(項目2)
前記工程(1)における調製時の混合液の温度が0〜67.5℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ30〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記工程(1)における調製時の混合液の温度が15〜67.5℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ30〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記工程(1)における調製時の混合液の温度が20〜50℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ40〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記工程(1)における調製時の混合液の温度が20〜40℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ50〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが10秒間以上72時間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して0℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが1秒間以上20秒間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して0℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが1秒間以上20秒間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して50℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記工程(2)の後に、前記混合液から不溶物を除去する工程をさらに包含する、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記工程(2)において、前記ブランチングエンザイムが活性を有する項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記ブランチングエンザイムがAquifex aeolicus由来ブランチングエンザイムまたはRhodothermus obamensis由来ブランチングエンザイムである項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
本発明の方法においては、基質である澱粉粒およびブランチングエンザイムを使用する。
本明細書中では、用語「澱粉粒」とは、結晶構造を有する澱粉分子をいう。澱粉粒は、未処理の澱粉粒であってもよく、未処理の澱粉粒を化学修飾または物理処理することによって得られる澱粉粒であってもよい。食品として分類される酵素処理澱粉を使用することが好ましい場合には、使用される澱粉粒は、代表的には、植物から得られた未処理の澱粉粒であり、例えば、糊化過程を経ていない澱粉粒が挙げられるがこれに限定されない。また、本発明において使用する澱粉粒としては、水中に懸濁した状態での加熱により澱粉粒が破裂することにより懸濁液が流動性を失うという特性を示す澱粉粒が使用可能である。本発明において使用する澱粉粒は、好ましくは、アミロペクチン含量が高い。
ブランチングエンザイム(系統名:1,4−α−D−グルカン:1,4−α−D−グルカン 6−α−D−(1,4−α−D−グルカノ)−トランスフェラーゼ、EC 2.4.1.18;本明細書中では、BEとも記載する)は、α−1,4−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の6位OH基に転移することにより、α−1,6−グルコシド結合を形成する酵素である。BEは当該分野において1,4−α−グルカン分枝酵素、枝作り酵素またはQ酵素とも呼ばれる。BEは、動物、植物、糸状菌、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒している。
本発明の製造法は、環状グルカンの製造方法であって、該方法は、
(1)5重量%以上50重量%以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が0℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程;および
(2)該混合液の温度を85℃以上129℃以下に上昇させる工程
を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法である。
環状構造保有分岐状グルカンの製造方法であって、
(1)5重量%以上50重量%以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつBEを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にBEを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が0℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程、
(2)該混合液の温度を例えば約60秒間以下の時間で高温(例えば、約80℃以上、約85℃以上または約95℃以上でかつ129℃以下)に上昇させる工程、
(3)該混合液の温度をBEが作用できる温度(例えば約100℃以下、約90℃以下、約80℃以下、または約75℃など)に下げ、さらにBEを添加することにより澱粉に作用させる工程
を含む、方法。
生産された環状構造保有分岐状グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、水に不溶のグルカン、BE、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法(T.J.Schochら、J.American Chemical Society,64,2957(1942))および有機溶媒を用いない方法がある。
収率(重量%)={(生成された環状構造保有分岐状グルカンの重量(g))/(使用した澱粉粒の重量(g))}×100
本発明の方法によって製造されるグルカンは、高度に分岐した分岐状グルカンのうちの一部の鎖が環状構造を形成する構造を有していると考えられる。そのため、本発明のグルカンを、「環状構造保有分岐状グルカン」という。
分岐頻度(%)={(分岐数)/(分子全体のグルコース単位数)}×100
本発明の方法で製造されるグルカンは、その製造の際に副生する非環状グルカン(すなわち、還元末端を有するグルカン)が少ない。
本発明の製造法により得られる環状構造保有分岐状グルカンが、環状構造を有することの確認は、エキソ型のグルコアミラーゼを用いて行い得る。
本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、澱粉の種々の用途に使用され得、特に、腹膜透析、糖尿病患者用の食事、輸液、飲食用組成物、食品添加用組成物、接着用組成物において、および澱粉の老化防止剤として、使用され得る。これら用途において、本願発明のグルカンは、それぞれの用途に適した濃度となるように使用され得る。本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、分子量が腹膜透析に適切な範囲にあり、還元糖をほとんどまたは全く含まないため、特に腹膜透析に適している。
特開2008−95117の製造例1に記載された組換えプラスミドpAQBE1を保持する大腸菌TG−1株より、同特許文献に示された方法により配列番号2のアミノ酸配列を有するAqBEを含む酵素液を得た。
特開2008−95117の製造例5に記載された組換えプラスミドpRBE1を保持する大腸菌TG−1株より、同特許文献に示された方法により配列番号4のアミノ酸配列を有するRhBEを含む酵素液を得た。
市販のワキシーコーンスターチ5gを100mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、この懸濁液を90℃に加熱したところ、澱粉は速やかに糊化が起こり、この懸濁液は流動性のまったくない硬い餅状に変化した。製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(600U/g基質)を90℃のこの流動性を持たないゲル状の懸濁液に添加したが、環状構造を有するグルカンは製造されなかった。
市販のワキシーコーンスターチ5gを100mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、この懸濁液を80℃に加熱したところ、澱粉糊化が起こり、この懸濁液は流動性のない餅状に変化した。製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(600U/g基質)を80℃のこの流動性を持たないゲル状の懸濁液に添加したが、環状構造を有するグルカン生産物は製造されなかった。
市販のワキシーコーンスターチ1gを100mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(600U/g基質)を添加して反応混合液を得て、この反応混合液を攪拌しながら70℃で16時間反応させた。次いで反応混合液を100℃で10分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約0.28gを得た。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量138kDaであることが示された。
市販のワキシーコーンスターチ5gを100mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(600U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で10分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約0.35gを得た。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量157kDaであることが示された。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(6000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約1.1gを得た。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量119kDaであることが示された。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液0.15ml(6000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で6時間反応させた後、85℃に昇温し1時間反応させた。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。さらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約44gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約88%であった。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液2.5ml(1000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で6時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。AqBE酵素液2.5ml(1000U/g基質)を添加してさらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約39gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約78%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量164kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ100gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で16時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。AqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加してさらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約76gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約76%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量171kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ2gを19.5mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液0.5ml(5000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で24時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約1.6gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約80%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量314kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ4gを19mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液1ml(5000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で24時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約3gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約75%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量294kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ6gを18.5mlの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液1.5ml(5000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で24時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約5gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約83%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量324kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ100gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液5ml(5000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら65℃で6時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。さらに、AqBE酵素液5ml(5000U/g基質)を添加してさらに65℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約81gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約81%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量141kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例2で得たRhBE酵素液2.5ml(5000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら65℃で6時間反応させた後、100℃まで昇温し20分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。RBE酵素液2.5ml(5000U/g基質)を添加してさらに65℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約41gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約82%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量140kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液50mL(50,000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら速やかに95℃に上昇させて95℃で5分間保持しワキシーコーンスターチを液化した後、70℃に温度を下げてAqBE酵素液1mL(1000U/g基質)をさらに添加して16時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約39gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約78%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量139kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のワキシーコーンスターチ50gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、この懸濁液に製造例2で得たRhBEを50,000U/g基質を50℃で添加した。懸濁液を攪拌しながら速やかに100℃に上昇させて加熱し100℃で5分間保持しワキシーコーンスターチを液化した後、70℃に温度を下げてRhBEを1000U/g基質を添加して16時間反応させた。反応液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約37gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約74%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量141kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のノーマルコーンスターチ100gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で2時間反応させた後、120℃まで昇温し60分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。AqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加してさらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約79gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約79%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量188kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販の馬鈴薯澱粉100gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で2時間反応させた後、120℃まで昇温し60分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。AqBE酵素液6ml(1200U/g基質)を添加してさらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約81gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約81%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量206kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
市販のタピオカ澱粉100gを1Lの30mMクエン酸緩衝液(pH6.7)に懸濁し、50℃のこの懸濁液に製造例1で得たAqBE酵素液5ml(1000U/g基質)を添加した。懸濁液を攪拌しながら70℃で2時間反応させた後、120℃まで昇温し60分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。AqBE酵素液6ml(1200U/g基質)を添加してさらに70℃で16時間反応させた。反応混合液を100℃で20分間加熱した後、6,500rpmで10分間遠心後の上清を孔径0.8μmの膜でろ過した。ろ液に2倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約82gを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約82%であった。実施例1と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量136kDaであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。
配列番号2:Aquifex aeolicus VF5の天然のBEのアミノ酸配列;
配列番号3:Rhodothermus obamensis JCM9785の天然のBEをコードする塩基配列;
配列番号4:Rhodothermus obamensis JCM9785の天然のBEのアミノ酸配列。
Claims (11)
- 環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法であって、該方法は、
(1)5重量%以上50重量%以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が0℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程;および
(2)該混合液の温度を85℃以上129℃以下に上昇させる工程
を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法。 - 前記工程(1)における調製時の混合液の温度が0〜67.5℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ30〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)における調製時の混合液の温度が15〜67.5℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ30〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)における調製時の混合液の温度が20〜50℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ40〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより昇温して前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)における調製時の混合液の温度が20〜40℃であり、その後、前記工程(2)の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ50〜75℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが10秒間以上72時間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して0℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが1秒間以上20秒間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して0℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)で混合液を調製した後、前記工程(2)の温度の上昇が完了するまでが1秒間以上20秒間以下の時間で行われ、該工程(2)の後、前記混合液の温度を0℃〜100℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して50℃〜100℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)の後に、前記混合液から不溶物を除去する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)において、前記ブランチングエンザイムが活性を有する請求項1に記載の方法。
- 前記ブランチングエンザイムがAquifex aeolicus由来ブランチングエンザイムまたはRhodothermus obamensis由来ブランチングエンザイムである請求項1に記載の方法。
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