JPWO2012077322A1 - 環状構造保有分岐状グルカンの工業的製造方法 - Google Patents

Abstract

環状構造を有する分岐状グルカンを工業的に製造する方法を提供すること。環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法であって、該方法は、（１）５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程；および（２）該混合液の温度を８５℃以上１２９℃以下に上昇させる工程を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法。

Description

本発明は、環状構造保有分岐状グルカンを工業的に高い収率で得るための製造方法に関する。言い換えると、本発明は、非環状グルカン副生物（すなわち、還元末端を有する副生物）の生成が少ない、環状構造保有分岐状グルカンを工業的に高い収率で得るための製造方法に関する。

澱粉にブランチングエンザイムを作用させることによって製造される環状構造保有分岐状グルカンは、還元末端を有さず、天然の未修飾澱粉と比較して、水に対する溶解度が高く、その溶液の粘度が低く、天然の未修飾澱粉では観察される老化が起きにくいという優れた性質を有している。環状構造保有分岐状グルカンは、澱粉の代替物質として有用な物質として開発され、利用されている。

環状構造保有分岐状グルカンは、ワキシーコーンスターチなどの澱粉をその澱粉の糊化開始温度以上の温度に加熱することにより澱粉を溶解した後、ブランチングエンザイムが反応できる温度まで澱粉溶解液を冷却し、その後この澱粉溶解液にブランチングエンザイムを添加して作用させることにより製造することができる（特許文献１）。しかしながら、この方法では、冷却途中で澱粉溶解液が餅状となり流動性が確保できない。例えば、特許文献１の０１１９段落の実施例１においては、少量のワキシーコーンスターチ（５ｇ）を４０ｍｌの緩衝液に懸濁して、１００℃で糊化させて、５０℃に放冷した後にブランチングエンザイムを作用させるという、実験室レベルの少量スケールでの実験が記載されている。特許文献１の０１１９段落にはその詳細な手順の説明は省略されているが、このような実験室レベルの実験においては、反応チューブに薬さじをさし込んで、流動性のない澱粉溶解液（すなわち、ゲル）を無理やり攪拌するなどの工業的には実用的でない作業工程が、酵素と基質との混合のために必要であり、実際、特許文献１に記載の発明の発明者らは、その０１１９段落の実験を行った際に、無理やり攪拌をするという作業を行った。このような高濃度の澱粉溶解液に流動性がないことは、ＴＡＫＡＴＡら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，１１９−１２３，１９９７の図２からも明らかである。そのため、この方法で環状構造保有分岐状グルカンを工業的に製造しようとすると、澱粉溶解液に流動性がないため、澱粉溶解液を反応槽へと輸送するパイプのつまりを生じ、酵素反応を行うための澱粉溶解液を反応槽へと輸送することができない。

そのため、環状構造保有分岐状グルカンを工業的に製造する場合には、澱粉の懸濁液に微弱なα−アミラーゼを加えてからその懸濁液をその澱粉の糊化開始温度以上の温度に加熱して、澱粉の溶解と澱粉の部分的加水分解による澱粉の低分子化とを同時に進行させることにより、流動性を確保した澱粉糊化液を作製し、その後、この澱粉糊化液にブランチングエンザイム（本明細書中ではＢＥとも記載する）を添加して作用させる方法が採られる（特許文献２）。しかしながら、このような熱糊化と加水分解とを併用する方法では澱粉の加水分解が起こり、その結果、還元末端を有する非環状グルカンが生成される。そのため、この方法では、還元末端を有さない環状構造保有分岐状グルカンと還元末端を有する非環状グルカンとの混合物しか得ることが出来なかった。還元末端を有さない環状構造保有分岐状グルカンはアミノ酸やタンパク質と加熱しても着色しないが、還元末端を有する非環状グルカンは、アミノ酸やタンパク質と加熱すると着色するという欠点を有する。さらに、この混合物から還元末端を有さない環状構造保有分岐状グルカンを工業的に単離することは極めて困難である。

このような欠点のない、高い純度であってかつ還元末端を有さない環状構造保有分岐状グルカンを工業的なスケールで製造する方法は、今まで知られていなかった。すなわち、還元末端を有するグルカンが副生しない環状構造保有分岐状グルカンの製造方法、つまりαアミラーゼを使用せずに環状構造保有分岐状グルカンを工業的に製造する方法が知られていなかった。

尚、特許文献３には、生澱粉を用いて高度分岐グルカンを製造する方法が記載されている。しかし、特許文献３は高度に分岐したグルカンを製造することを目的としており、この高度に分岐したグルカンには還元末端があり、還元末端を有さないグルカンを製造することは目的としていない。さらに、特許文献３に記載の生成物には還元糖が含まれる。

特許第３１０７３５８号公報 特開平１０−１１７６７１号公報 特開２００４−１６１９９８号公報

本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、非環状グルカン（すなわち、還元末端を有する副生物）が副生しない、環状構造保有分岐状グルカンを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、澱粉をあらかじめ加熱糊化させるのではなく、糊化開始温度以下の澱粉懸濁液にＢＥを添加し、その後糊化開始温度以上に澱粉懸濁液の温度を上昇させることにより、α−アミラーゼによる加水分解反応を併用することなく反応混合液の流動性を確保した状態で環状構造保有分岐状グルカンを製造可能であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。さらに、α−アミラーゼを併用しない当該反応工程において、その反応温度が少なくとも８０℃を超える場合、環状グルカンの収率が大きく向上することを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、環状構造保有分岐状グルカンの製造法に関している。環状構造保有分岐状グルカンとは、分岐状グルカン構造の一部が環を形成しているグルカンをいう。「環状構造保有分岐状グルカン」と「環状構造を有する分岐状グルカン」とは交換可能に使用される。ここで、「分岐状グルカン構造の一部が環を形成している」とは、グルカンにおける糖鎖が環状構造と、α−１，６結合およびα−１，４結合に基づく少なくとも１つの分岐状構造とを有し、かつその環状構造を構成する糖鎖中に少なくとも１つのα−１，６結合が存在している構造を意味する。ＢＥによる環状構造保有グルカンの生成の模式図を図２に示す。図２中の１は、基質である澱粉中のアミロペクチンの構造を簡略化して記載している。アミロペクチンは、多数の分岐がある部分が比較的長い直鎖状部分によってつながっているような構造をしている。ＢＥはこの直鎖状部分に作用してα−１，４−結合を切断し、還元末端をアミロペクチン上の別の場所にα−１，６−結合で結合させる。その結果、種々の構造の環状構造分岐状グルカンが形成される。得られる環状構造分岐状グルカンの構造の例を図２中の２〜４に示す。ＢＥの作用機構に起因して、本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、還元末端を有さない。

本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、通常の分岐状グルカンの還元末端部分に相当する部分がその分岐状グルカン上にα−１，６結合で結合した構造を有するということができる。また、本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、少なくとも１つのα−１，６結合を有する環状構造に分岐状構造が結合したものということもできる。

本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法であって、該方法は、
（１）５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程；および
（２）該混合液の温度を８５℃以上１２９℃以下に上昇させる工程
を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法。
（項目２）
前記工程（１）における調製時の混合液の温度が０〜６７．５℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ３０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記工程（１）における調製時の混合液の温度が１５〜６７．５℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ３０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記工程（１）における調製時の混合液の温度が２０〜５０℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ４０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記工程（１）における調製時の混合液の温度が２０〜４０℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ５０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１０秒間以上７２時間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１秒間以上２０秒間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１秒間以上２０秒間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して５０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記工程（２）の後に、前記混合液から不溶物を除去する工程をさらに包含する、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記工程（２）において、前記ブランチングエンザイムが活性を有する項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記ブランチングエンザイムがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ブランチングエンザイムまたはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ブランチングエンザイムである項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

特許文献１（日本国特許第３１０７３５８公報）の方法で製造される従来の環状構造保有分岐状グルカン（環状クラスターデキストリン（ＣＣＤ）ともいう）を含有する反応混合液には、純粋な環状構造保有分岐状グルカン以外に、α−アミラーゼ反応によって生成された直鎖状グルカンならびに非環状分岐状グルカン（α−アミラーゼの作用でクラスター単位になったためにＢＥの環状化作用を受けることが出来なくなったもの）が混在している。

これに対し、α−アミラーゼを使用しない本願においては、純粋な環状構造保有分岐状グルカンのみが生成する。このことから、生成される環状構造保有分岐状グルカン含有液の還元力は完全にゼロである。さらに、得られる環状構造保有分岐状グルカンは老化しない。また、実施例にあるように、重量平均分子量が従来のＣＣＤより小さい傾向がある。この傾向も本発明の方法においてα−アミラーゼを使用しないことに由来する。

本発明の２ステップ反応法の実施形態では、本発明の方法に従って、比較的少ない酵素量で環状構造保有分岐状グルカンを製造することができる。

本発明の方法は、従来デキストリンの製造にしか利用できなかった瞬時連続反応法を利用することができるため、新たな設備投資が不要であるという利点を有する。

図１は、本発明の方法における反応混合液の温度変化とＢＥの添加タイミングの例を示す図である。図１の（Ａ）は、２ステップ反応法の温度変化の一例である。図１の（Ｂ）は、２ステップ反応法とＢＥ瞬時連続反応法との中間の方法での温度変化の一例である。図１の（Ｃ）は、ＢＥ瞬時連続反応法の温度変化の一例である。 図２は、ＢＥによる環状構造保有分岐状グルカンの生成の模式図を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．材料
本発明の方法においては、基質である澱粉粒およびブランチングエンザイムを使用する。

１．１ 澱粉粒
本明細書中では、用語「澱粉粒」とは、結晶構造を有する澱粉分子をいう。澱粉粒は、未処理の澱粉粒であってもよく、未処理の澱粉粒を化学修飾または物理処理することによって得られる澱粉粒であってもよい。食品として分類される酵素処理澱粉を使用することが好ましい場合には、使用される澱粉粒は、代表的には、植物から得られた未処理の澱粉粒であり、例えば、糊化過程を経ていない澱粉粒が挙げられるがこれに限定されない。また、本発明において使用する澱粉粒としては、水中に懸濁した状態での加熱により澱粉粒が破裂することにより懸濁液が流動性を失うという特性を示す澱粉粒が使用可能である。本発明において使用する澱粉粒は、好ましくは、アミロペクチン含量が高い。

植物は、アミロプラスト内に澱粉分子を顆粒として（すなわち、大きな結晶として）貯蔵する。この顆粒は澱粉粒と呼ばれる。澱粉粒内では、澱粉分子どうしが水素結合などによって結合している。そのため、澱粉粒はそのままでは水に溶けにくく、消化もされにくい。澱粉粒を水とともに加熱すると膨潤し、分子がほぐれてコロイド状になる。この変化は「糊化」と呼ばれる。澱粉粒の大きさおよび形態は、その澱粉粒が得られた植物によって異なる。本発明においては、市販されている澱粉粒を使用することが可能である。植物などから澱粉粒を精製するなどの方法により澱粉粒を調製して本発明に使用してもよい。

本明細書中では用語「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。本発明で使用する澱粉としては、アミロペクチン含量の高いものが最も好ましい。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。

澱粉粒の状態では澱粉分子どうしが強く結合しているため、酵素が作用しにくい。食品として扱われる酵素処理澱粉を得るための特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、植物から単離または精製されているが、酸処理、化学修飾処理および熱処理を受けていないものである。本明細書中では、用語「未処理」の澱粉粒とは、天然で生成される澱粉粒であって、自然状態で共存している他の成分（例えば、タンパク質、脂質など）から澱粉粒を分離するために必要な処理以外の処理が施されていない澱粉粒をいう。したがって、植物などから不純物を除去して澱粉を精製する工程などの、澱粉粒を調製する方法における各工程は、本明細書中においては、澱粉粒の処理には含まれない。澱粉粒としては、通常市販されている澱粉粒であればどのような澱粉粒でも使用され得る。

本発明で使用される澱粉粒は、糊化処理を施されていない澱粉である。本発明で使用される澱粉粒は、天然の結晶構造を少なくとも一部保持しており、酵素が作用しにくい。本発明で使用される澱粉粒は、例えば、３０℃の水に澱粉粒を加えることにより４０重量％の水懸濁液を作製し、この懸濁液を１００℃にて１０分間加熱した後６０℃に冷却した場合に得られる溶液の流動性がないものであることが好ましい。なお、「溶液の流動性がない」とは、例えば容量１００ｍｌのガラスビーカーに１０分間加熱済みの５０ｇの溶液（６０℃）を入れ、そのビーカーを反転させて溶液サンプルの下側が開放された状態で６０℃にて１分間放置した場合に、入れた溶液の２０重量％以上（すなわち、１０ｇ以上）の溶液がビーカー中に残ることをいう。溶液の流動性がないと、溶液に酵素を均一に拡散させることが困難である。本明細書において、「溶液に流動性がある」とは、例えば容量１００ｍｌのガラスビーカーに溶液を入れ、そのビーカーを反転させたときに重力によって１分間以内に全体の８０％以上の溶液が流れ落ちる状態を指す。この状態の溶液であれば酵素を添加して攪拌することにより、澱粉を溶液中に均一に分散することができる。流動性がある溶液は通常のデキストリン製造工程中のラインを詰まらせることはない。

別の特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、未処理の澱粉粒に対して化学修飾または物理処理を行うことによって処理された澱粉粒であってもよい。化学修飾された澱粉粒の例としては、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉およびリン酸化モノエステル化リン酸架橋澱粉が挙げられる。「アセチル化アジピン酸架橋澱粉」とは、澱粉を無水酢酸および無水アジピン酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理した後、無水酢酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンおよび無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム」とは、澱粉を無水オクテニルコハク酸でエステル化して得られたものをいう。「酢酸澱粉」とは、澱粉を無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基（カルボキシル基ともいう）の分析を行った場合にカルボキシ基が１．１％以下であるものをいう。ただし、カルボキシ基の量がこの範囲にあっても「漂白澱粉」は「酸化澱粉」の定義には含まれない。「漂白澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基の分析を行った場合にカルボキシ基が０．１％以下であるものであって、厚生労働省告示４８５号記載の酸化澱粉の「確認試験（３）」による試験結果が陰性でかつ粘度等の澱粉の性質に生じた変化が酸化によるものでないことを合理的に説明できるものをいう。カルボキシ基の量が０．１％以下であっても粘度等の澱粉の性質が天然澱粉から変化しているものは酸化澱粉に分類され、日本では食品としては取り扱われず、食品添加物として取り扱われる。「ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化し、酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「ヒドロキシプロピル澱粉」とは、澱粉を酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。「リン酸化澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化して得られたものをいう。「リン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化し、トリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。

物理処理された澱粉粒の種類の例としては、湿熱処理澱粉および熱抑制澱粉が挙げられる。

本発明において使用される澱粉粒の種類は、地上澱粉であっても地下澱粉であってもよい。地下澱粉の例としては、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、わらび澱粉などが挙げられる。地上澱粉の例としては、小麦澱粉、コーンスターチ（例えば、ハイアミロースコーンスターチ、ノーマルコーンスターチおよびワキシーコーンスターチ）、米澱粉（例えば、もち米澱粉および粳米澱粉）、豆類澱粉（例えば、緑豆澱粉、エンドウ豆澱粉、小豆澱粉およびソラマメ澱粉）、アマランサス澱粉などが挙げられる。また、例えばこんにゃくいも澱粉のように、主成分のグルコマンナンを分離した後に残る副産物として得られる澱粉粒であってもよい。本発明において使用される澱粉粒は、好ましくはワキシーコーンスターチのようなモチトウモロコシ澱粉もしくはモチゴメ澱粉である。別の実施形態では、本発明において使用される澱粉粒は、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉またはノーマルコーンスターチである。澱粉粒中のアミロペクチン含量は、一般に約４０重量％〜約１００重量％である。澱粉粒中のアミロペクチン含量が約５０重量％以上、特に約６０重量％以上の場合に、本発明の方法が特に好適に使用される。澱粉粒として化工澱粉を使用する場合には、モチトウモロコシ澱粉、モチゴメ澱粉、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉またはノーマルコーンスターチの、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉またはリン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉を使用することが好ましい。物理処理澱粉を使用する場合には、モチトウモロコシ澱粉、はモチゴメ澱粉、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉またはノーマルコーンスターチの、湿熱処理澱粉または熱抑制澱粉であることが好ましい。

本発明において使用される澱粉の平均重合度は、好ましくは約１×１０^３以上であり、より好ましくは約５×１０^３以上であり、さらに好ましくは約１×１０^４以上であり、最も好ましくは約２×１０^４以上である。本発明において使用される澱粉の平均重合度は、好ましくは約１×１０^７以下であり、より好ましくは約３×１０^６以下であり、さらに好ましくは約１×１０^６以下であり、最も好ましくは約３×１０^５以下である。

本発明において使用される澱粉粒は、なるべく不純物を含まないことが好ましい。原料として使用する澱粉粒中の不純物の含有量は、好ましくは約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下、さらに好ましくは約１重量％以下である。

１．２ ブランチングエンザイム
ブランチングエンザイム（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカン：１，４−α−Ｄ−グルカン ６−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、ＥＣ ２．４．１．１８；本明細書中では、ＢＥとも記載する）は、α−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成する酵素である。ＢＥは当該分野において１，４−α−グルカン分枝酵素、枝作り酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。ＢＥは、動物、植物、糸状菌、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒している。

ＢＥは、好ましくは、耐熱性ＢＥである。耐熱性ＢＥとは、反応至適温度が４５℃以上であるＢＥをいう。

ブランチングエンザイム活性は、代表的には、アミロースとヨウ素との複合体の６６０ｎｍにおける吸光度の減少として測定され、ＢＥがα−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成し、アミロースの直鎖状部分を減少させる作用に基づく。

ＢＥのブランチングエンザイム活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される。ＢＥのブランチングエンザイム活性は、例えば、以下のようにして測定される。まず、５０μＬの基質液（０．１２％（ｗ／ｖ）アミロース（ＴｙｐｅＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））に５０μＬの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、そのＢＥの反応至適温度で行う。１０分間ＢＥを作用させた後、１ｍＬの０．４ｍＭ塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、１ｍＬのヨウ素液を添加し、よく混合した後、６６０ｎｍの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に０．４ｍＭ塩酸溶液を添加したものを同時に調製する。基質液は、１００μＬの１．２％（ｗ／ｖ）アミロースＴｙｐｅＩＩＩ溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、さらに７００μＬの蒸留水を添加してよく混合することにより調製する。ただし、緩衝液のｐＨは、そのＢＥの反応至適ｐＨに合わせる。ヨウ素液は０．１２５ｍＬのストック溶液（２．６重量％Ｉ_２、２６重量％ＫＩ水溶液）に０．５ｍＬの１規定塩酸を混合し、蒸留水で６５ｍＬとすることにより調製する。酵素液のＢＥ活性は以下の計算式により求める。

また、このＢＥ活性から、基質１ｇあたりのＢＥ活性を計算することができる。

本明細書においては、ＢＥの活性としては、原則として上記の式によって算出されたＢＥ活性を用いる。したがって、単に「活性」と呼ぶ場合は上記の式によって算出された「ＢＥ活性」を表し、単に「単位」、あるいは「Ｕ」と示す場合は、上記の式によって算出されたＢＥ活性の「単位」、あるいは「Ｕ」を意味する。

ＢＥの反応至適温度は、好ましくは、約４５℃以上であり、約９０℃以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＢＥ活性の測定を温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約４５℃以上であり、約５０℃以上であり、さらに好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上である。好ましい反応至適温度に上限はない。しかし、実際のＢＥの反応至適温度には上限があり、例えば、約９０℃以下、約８５℃以下、約８０℃以下、約７５℃以下などであり得る。

本発明の方法においては、ＢＥを澱粉粒に作用させる際の温度においてＢＥがブランチングエンザイム活性を有することが好ましい。例えば、反応を８５℃において行う場合には、ＢＥは８５℃においてブランチングエンザイム活性を有することが好ましく、反応を９０℃において行う場合には、ＢＥは９０℃においてブランチングエンザイム活性を有することが好ましく、反応を９５℃において行う場合には、ＢＥは９５℃においてブランチングエンザイム活性を有することが好ましく、反応を１００℃において行う場合には、ＢＥは１００℃においてブランチングエンザイム活性を有することが好ましい。

この場合、特定の温度において「ブランチングエンザイム活性を有する」とは、その特定の温度においてＢＥを作用させること以外は上記のブランチングエンザイム活性の測定と同じ方法で測定を行った場合にＢＥ活性が検出されることをいう。本発明において使用する場合、ブランチングエンザイムを作用させる温度での混合液中のＢＥ活性は、好ましくは約１０Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約２０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約３０Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは約４０Ｕ／ｍＬ以上であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｍＬ以上である。ＢＥの熱変性による凝集が多すぎない限り、この特定の温度でのＢＥ活性は高いほど好ましく、上限は特にないが、例えば、１０，０００，０００Ｕ／ｍＬ以下、１，０００，０００Ｕ／ｍＬ以下、１００，０００Ｕ／ｍＬ以下、１０，０００Ｕ／ｍＬ以下、１，０００Ｕ／ｍＬ以下などであり得る。

ＢＥは、好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来である。ＢＥは、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌由来である。ＢＥは、好ましくは、Ａｎａｅｒｏｂｒａｎｃａ属に属する細菌由来である。ＢＥは、好ましくは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来である。

ＢＥは、より好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し、さらにより好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し、最も好ましくはＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓまたはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓに由来する。なお、最近では、好熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と記載されることも多い。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと同一の細菌を指す。

本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。

本明細書において配列（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。

本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｋ．およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ ４．５ Ｓ ＲＮＡ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。

Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書中では、「天然の」ＢＥは、もともとＢＥを産生する細菌から単離されたＢＥだけでなく、天然のＢＥと同じアミノ酸配列を有する、遺伝子組換えによって得られるＢＥをも包含する。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０およびｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ， Ｍ． Ｊ． Ｅ． Ｃ．ら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２００３、２１巻、ｐ１９９−２０７に記載される。

Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ．Ｌ．ら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１．５７（５−６）：ｐ．６５３−９および特表２００２−５３９８２２号公報に記載される。

これらの天然のＢＥの塩基配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体が天然に存在し得ることは公知である。本発明の方法においては、例示した配列を有するＢＥ以外にも、ＢＥ活性を有する限り、このような、天然に存在する改変体および天然のＢＥに対して人工的に変異を導入した改変体も用い得る。例えば、ＷＯ２０００／０５８４４５号公報および特許文献３には、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥの改変体が記載されている。改変体ＢＥは、改変を導入する前のＢＥと同等以上の活性を有することが好ましい。例えば、本発明で用いられるＢＥのアミノ酸配列は、ある実施形態では、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（好ましくは１または数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。当業者は、所望の性質を有するＢＥを容易に選択することができる。あるいは、目的とするＢＥをコードする遺伝子を直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。

特定の実施形態では、本発明で使用されるＢＥは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＢＥ活性を有する。本発明で使用されるＢＥは、特に好ましくは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＢＥ活性を有する。

本発明の方法において使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒（すなわち、基質）に対して、代表的には約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約５，０００Ｕ／ｇ基質以上である。本発明の方法において使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒に対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。ＢＥの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、目的の環状構造保有分岐状グルカンの収率が低下する場合がある。

本発明の方法を２ステップ反応法で行う場合には、好ましくは、使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒（すなわち、基質）に対して、代表的には約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約５，０００Ｕ／ｇ基質以上であり；本発明の方法において使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒に対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。

本発明の方法を瞬時連続反応法で行う場合には、好ましくは、最初に使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒（すなわち、基質）に対して、代表的には約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１０，０００Ｕ／ｇ基質以上であり；本発明の方法において最初に使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒に対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約２００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。

本発明の方法を瞬時連続反応法で行う場合であって、最初のＢＥ添加後、８５℃から１３０℃での澱粉粒の糊化後に反応混合液をある程度冷却し、その後ＢＥを再度添加して作用させる場合、２回目に使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒（すなわち、基質）に対して、代表的には約１０Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり；この場合の２回目に使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の澱粉粒に対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約１０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。

本発明で使用する酵素には、澱粉内のα−１，４−グルコシド結合またはα−１，６グルコシド結合を加水分解するエンド型のアミラーゼ類の酵素活性が検出されないかまたはその活性が極めて低いことが好ましく、検出されないことが最も好ましい。

本願発明に用いる酵素は、精製酵素、粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、支持体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）等、当業者に周知の方法が使用され得る。

２．本発明の製造法
本発明の製造法は、環状グルカンの製造方法であって、該方法は、
（１）５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程；および
（２）該混合液の温度を８５℃以上１２９℃以下に上昇させる工程
を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法である。

本発明の製造法においては、まず、反応混合液を調製する。反応混合液は、例えば、適切な溶媒に、ＢＥと、基質（すなわち、澱粉粒）とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応混合液は、ＢＥを含む溶液と、基質（すなわち、澱粉粒）を含む懸濁液とを混合することによって調製してもよい。例えば、本明細書中で「２ステップ反応法」と呼ぶ方法では、澱粉懸濁液にＢＥを添加して混合液を得ることにより反応混合液を調製してもよく、ＢＥと澱粉粒と溶媒（例えば水）とを混合することにより反応混合液を調製してもよい。例えば、従来のデキストリン生産用の瞬時連続反応法の施設を利用して生産を行う場合には、ＢＥを含む溶液と澱粉粒を含む溶液とを別々の配管から供給し、配管内で合流させることによって混合し、反応混合液を形成することができる。

この反応混合液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。反応混合液のｐＨは、使用するＢＥが活性を発揮し得るｐＨであれば任意に設定され得る。反応混合液のｐＨは、使用するＢＥの至適ｐＨ付近であることが好ましい。反応混合液のｐＨは、代表的には約２以上であり、好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上であり、特に好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約６以上であり、最も好ましくは約６．５以上である。反応混合液のｐＨは、代表的には約１３以下であり、好ましくは約１１以下であり、さらに好ましくは約１０以下であり、特に好ましくは約９以下であり、特に好ましくは約８以下であり、最も好ましくは約７．５以下である。１つの実施形態では、反応混合液のｐＨは、代表的には、使用するＢＥの至適ｐＨの±３以内であり、好ましくは至適ｐＨの±２以内であり、さらに好ましくは至適ｐＨの±１以内であり、最も好ましくは至適ｐＨの±０．５以内である。

５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液の調製時のこの混合液の温度は、０℃以上でかつ澱粉の糊化開始温度以下である。澱粉の糊化開始温度は、使用する澱粉粒を得た植物、その植物の収穫時期、その植物の栽培地などによって異なり得る。一般に、通常のトウモロコシ澱粉の糊化開始温度は約７０．７℃であり、ワキシーコーンスターチ（すなわち、モチトウモロコシ澱粉）の糊化開始温度は約６７．５℃であり、コメ澱粉の糊化開始温度は約７３．５℃であり、馬鈴薯澱粉の糊化開始温度は約６２．６℃であり、タピオカ澱粉の糊化開始温度は約６８．４℃であり、そして緑豆澱粉の糊化開始温度は約７１．０℃である。

澱粉の糊化開始温度は、アミログラフによって測定され得る。糊化開始温度の測定方法は、「澱粉科学の事典」の１９４頁〜１９７頁に記載される。

５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液の調製時のこの混合液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変動し得るが、例えば、約０℃以上であり、好ましくは約１０℃以上であり、さらに好ましくは約１５℃以上であり、特に好ましくは約２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液の調製時のこの混合液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変動し得るが、例えば、約６７．５℃以下であり、好ましくは約６０℃以下であり、さらに好ましくは約５０℃以下であり、特に好ましくは約４０℃以下であり、最も好ましくは約３５℃以下である。

ＢＥと澱粉粒とを含む混合液が調製されると、ＢＥが澱粉粒に作用して澱粉粒が徐々に分解される。ＢＥと澱粉粒とを含む混合液の温度は、（１）昇温の前に所定の時間の間、約７５℃以下としてもよく、、あるいは（２）直ちに高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上、かつ約１２９℃以下の温度）まで昇温してもよい。昇温の前に所定の時間の間、約７５℃以下の温度とすることにより反応させる場合には、ＢＥの量が少なめでもよい。高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上かつ約１２９℃以下の温度）まで直ちに昇温する場合は、ＢＥが作用する時間が短くなるので、澱粉粒の量に対して使用するＢＥの量を増加させることが好ましい。（１）の場合を「ＢＥ２ステップ反応法」といい、（２）の場合を「ＢＥ瞬時連続反応法」という。

「ＢＥ２ステップ反応法」の場合、混合液調製時の温度よりも高い温度でかつ約７５℃以下の温度で反応を行う。この反応の際の温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、特に好ましくは約４５℃以上であり、最も好ましくは約５０℃以上である。この反応の際の温度は、約７５℃以下であればよく、例えば、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下などであり得る。また、この反応の際の温度は、一定の温度であってもよく、徐々に上昇してもよい。

「ＢＥ２ステップ反応法」の場合、最初のＢＥを添加した時点から高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上、かつ約１２９℃以下）に温度を昇温するまでの時点の時間（反応時間）は、任意に設定される。この反応時間は、例えば、約１秒間以上、約１０秒間以上、約１分間以上、約５分間以上、約１０分間以上、約２０分間以上、約３０分間以上、約４０分間以上、約５０分間以上、または約１時間以上であり得る。この反応時間は、例えば、約７２時間以下、約６０時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約３０時間以下、約２４時間以下、約１２時間以下、約８時間以下、または約６時間以下であり得る。任意に設定された時間内にさらにＢＥを添加してもよい。特定の実施形態では、例えば（１）および（２）の両方の反応をタンク内で行ってもよい。別の特定の実施形態では、例えば（１）の反応をタンク内で行い、（２）の昇温反応のみをジェットクッカーで行ってもよい。

「ＢＥ瞬時連続反応法」の場合、混合液調製後、極めて短い時間で高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上、かつ約１２９℃以下の温度）まで昇温される。混合液を調製した後、目的の温度までの昇温が完了するまでにかかる時間は、例えば、約１秒間以上、約２秒間以上、約３秒間以上、約４秒間以上または約５秒間以上であってよく、例えば、約６０秒間以下、約５０秒間以下、約４０秒間以下、約３０秒間以下または約２０秒間以下であってよい。

本発明の方法においては、混合液を調製した後、混合液の温度が高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上、かつ約１２９℃以下の温度）に昇温される。この温度においてもＢＥは澱粉粒中の澱粉に作用し、澱粉粒を分解する。さらに、この温度においては、澱粉が完全に糊化するため、ＢＥが澱粉に対して、より作用しやすくなる。しかし、反応温度が高くなるとＢＥが失活しやすいため、耐熱性が高いＢＥを使用することが好ましい。

昇温温度は、約８０℃以上または約８５℃以上で、かつ１２９℃以下であることが好ましい。昇温温度は、例えば、約８０℃以上、約８１℃以上、約８２℃以上、約８３℃以上、約８４℃以上、約８５℃以上、約８６℃以上、約８７℃以上、約８８℃以上、約８９℃以上、約９０℃以上、約９５℃以上、約１００℃以上であり得る。昇温温度は、好ましくは約１２５℃以下であり、さらに好ましくは約１２０℃以下であり、なおさらに好ましくは約１１５℃以下であり、特に好ましくは約１１０℃以下であり、最も好ましくは約１０５℃以下である。昇温温度が９０℃より高いとＢＥが失活する割合が増えるので、この段階で酵素を追加添加することが好ましい。さらに、昇温温度が１００℃を超えると装置が耐圧構造である必要がある。さらに、昇温温度が高すぎる場合、例えば、１３０℃以上ではグルカン鎖の熱分解が起こる場合がある。昇温温度が低すぎる場合には、反応効率が低下しやすく、収率が低下しやすい。

「ＢＥ２ステップ反応法」では、最初のステップで、澱粉粒を少しずつ溶解させながら、ＢＥの環状化反応でクラスター単位に分解していき、これをある程度の時間継続して、澱粉粒を小さくして行く。これだけでは収量が上がらないため、途中で昇温させて澱粉を溶解し、すべての澱粉をクラスター単位に分解することが好ましい。このようにすることにより、澱粉が部分的に分解されて分子量が小さくなっているため（量が減っているため）、昇温時に澱粉溶液は流動性を保つことができる。

上記のように、本発明においては、「ＢＥ瞬時連続反応法」を行ってもよい。そのような実施形態では、「瞬時連続反応法」と同様の施設を使用して本発明の方法を行うことができる。従来の「瞬時連続反応法」は、アミラーゼにより生澱粉を部分分解して分子量分布の異なるデキストリンを工業生産するために採用されている方法である。この方法では、澱粉懸濁液（例えば約３０℃）とアミラーゼ溶液（例えば約３０℃）との２液を配管内で混合後、その混合液と高圧蒸気をさらに配管内で混合することにより、酵素混合後１０秒程度の滞留時間で１００℃以上に昇温することができる。その後、この混合液を約１２０℃まで昇温して澱粉を完全に溶解した後、溶解液を大気圧下に放出して１００℃程度まで温度を下げた後、熱交換器で約７０℃まで温度が下げられる。この方法では、１２０℃以上まで極めて短時間に昇温するため、蒸気を投入して澱粉が溶解し始めるとともに酵素反応が始まり、かつ数秒程度で酵素失活が起こるため、部分加水分解の程度（つまりデキストリンの分子量）を、アミラーゼの添加量で厳密に制御できるという利点がある。しかし、この施設でアミラーゼを添加しないで澱粉懸濁液を加熱すると、澱粉懸濁液が流動性を失ってしまい、配管内に詰まってしまう。

ところが、本発明の方法では、アミラーゼの代わりにＢＥを使用することにより、予想外にも、澱粉懸濁液が流動性を保つことができ、澱粉が配管内に詰まってしまうという問題を回避することができる。本発明において反応効率を上げるためには、昇温工程終了後、液温を下げ、ブランチングエンザイムを再度添加する必要があるが、既存の製造ラインが利用できるというメリットも大きい。本発明においてＢＥ瞬時連続反応法を行う場合には、反応混合液の温度を高温（例えば、約８０℃以上または約８５℃以上、かつ約１２９℃以下の温度）に昇温させて澱粉の糊化とＢＥの作用とを行った後に、反応混合液の温度をＢＥが作用できる温度（例えば、約１００℃以下、約９０℃以下、約８０℃以下、または約７５℃以下など）に下げ、さらにＢＥを添加してＢＥを澱粉に作用させることが好ましい。

ＢＥ瞬時連続反応法においてＢＥを追加する場合、本発明の製造方法は、例えば、以下の通りであり得る：
環状構造保有分岐状グルカンの製造方法であって、
（１）５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつＢＥを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にＢＥを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程、
（２）該混合液の温度を例えば約６０秒間以下の時間で高温（例えば、約８０℃以上、約８５℃以上または約９５℃以上でかつ１２９℃以下）に上昇させる工程、
（３）該混合液の温度をＢＥが作用できる温度（例えば約１００℃以下、約９０℃以下、約８０℃以下、または約７５℃など）に下げ、さらにＢＥを添加することにより澱粉に作用させる工程
を含む、方法。

本発明の方法における反応混合液の温度変化とＢＥの添加タイミングの例を図１に示す。図１の（Ａ）は、２ステップ反応法の温度変化の一例である。図１の（Ｂ）は、２ステップ反応法とＢＥ瞬時連続反応法との中間の方法での温度変化の一例である。図１の（Ｃ）は、ＢＥ瞬時連続反応法の温度変化の一例である。

本発明の「ＢＥ２ステップ反応法」と「ＢＥ瞬時連続反応法」とは、糊化開始温度以下でＢＥを加え、その後昇温するという共通点がある。どちらも昇温後に澱粉溶液が流動性を失うという課題を回避するための発明であることも共通である。

本発明の方法においては、いずれの工程においても、反応混合液が流動性を維持していることが好ましい。

本発明の方法において得られる産物は、下記の「４．本発明の方法により得られる環状構造保有分岐状グルカン」に記載のような分岐頻度および重量平均重合度を有するものとなる。

本発明の方法全体を通しての反応時間は、反応温度、反応液中の澱粉濃度、反応により生産されるα−グルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約５時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、または約２４時間以上であり得る。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約１００時間以下、より好ましくは約７２時間以下、さらにより好ましくは約３６時間以下、最も好ましくは約２４時間以下である。なお、本発明の方法全体を通しての「反応時間」とは、最初のＢＥを添加した時点から反応終了時までの時間である。連続生産方式の場合は、原料を投入してＢＥと混合された時点から、反応後の反応混合液が出てくるまでの時間である。

本発明の方法においては、グルカン鎖に作用して還元末端を有する副生成物を生じるような酵素（本明細書中では「還元末端生成酵素」とも呼ぶ）を反応混合液に添加してはならない。還元末端生成酵素の例としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デキストリナーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソアミラーゼ、グリコーゲンデブランチングエンザイムなどが挙げられる。なぜなら、これらの酵素によって澱粉または生成物の環状構造保有分岐状グルカンが分解されてしまったり、還元末端を有する直鎖状グルカンが生成されてしまうからである。さらに、サイクロデキストリン生成酵素も本発明の方法では添加しないことが好ましい。サイクロデキストリン生成酵素が存在すると低分子量の環状構造が生成されて反応効率が下がるからである。また、サイクロデキストリン生成酵素が存在するとα−１，６−結合を含まない環状構造を有する分岐状グルカンが生成されてしまい、本願の目的とするα−１，６−結合を含む環状構造を有する分岐状グルカンと分離することが極めて困難となるからである。

加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、反応混合液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。反応混合液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。

本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、ＢＥを反応混合液に追加してもよい。

このようにして、環状構造保有分岐状グルカンを含有する溶液が生産される。本発明の方法においては、反応終了後、不溶物を除去してもよい。反応終了後、反応混合液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間または１００℃より高温でまたは１０分間よりも長時間にわたって加熱することによって反応混合液中の酵素を失活させてもよい。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応混合液は、そのまま保存されてもよいし、生産された環状構造保有分岐状グルカンを単離するために処理されてもよい。

本発明の方法は、工業的規模での生産に好適である。特に、配管設備を使用する工業的生産に好適である。工業的規模とは、基質として使用する澱粉粒の重量が、バッチ式の場合１つのバッチあたり約１００ｋｇ以上であること、および連続生産方式の場合、１分間当り約５ｋｇ以上であることをいう。

バッチ式の場合の製造規模は、基質として使用する澱粉粒の重量が１つのバッチあたり、例えば、約２００ｋｇ以上、約５００ｋｇ以上、約８００ｋｇ以上、約１トン以上、約２トン以上、約３トン以上、約４トン以上、または約５トン以上などであり得る。製造規模に特に上限はない。例えば、基質として使用する澱粉粒の重量が１つのバッチあたり、例えば、約１,０００トン以下、約２００トン以下、約５０トン以下、約２０トン以下、約１０トン以下、約９トン以下、約８トン以下、約７トン以下、または約６トン以下などであり得る。

連続生産方式の場合、基質として使用する澱粉粒の重量が１分間当り、例えば、約１０ｋｇ以上、約５０ｋｇ以上、約１００ｋｇ以上、または約５００ｋｇ以上などであり得る。製造規模に特に上限はない。例えば、基質として使用する澱粉粒の重量が１分間当り、例えば、約１０トン以下、約５トン以下、約３トン以下、約２トン以下、約１トン以下、約９００ｋｇ以下、約８００ｋｇ以下、約７００ｋｇ以下、または約６００ｋｇ以下などであり得る。

本発明の製造方法は、このような大規模での設備に好適に適用可能である。

３．環状構造保有分岐状グルカンの精製
生産された環状構造保有分岐状グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、水に不溶のグルカン、ＢＥ、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。

有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。

有機溶媒を用いない精製方法の例としては、環状構造保有分岐状グルカン生産反応後、水に溶解している環状構造保有分岐状グルカンを沈澱させずに、例えば（１）各種ろ過助剤や活性炭を反応液に添加した後に各種ろ過機器を用いたろ過法、（２）各種ろ過機器にあらかじめ各種ろ過助剤をコーティングしたろ過法、（３）それらろ過法を組み合わせたろ過法、（４）限外ろ過膜を用いた膜分画、もしくは（５）クロマトグラフィーに供することにより、水に不溶のグルカン、ＢＥ、無機塩類などを除去する方法がある。ろ過を行う場合は必要に応じて反応液に凝集剤を添加することもありうる。

精製に使用され得るろ過助剤の例としては、珪藻土、パーライト、セルロースなどが挙げられる。ろ過機器の例としてはフィルタープレス、デカンタ型遠心分離機、真空脱水機、ベルトプレス、スクリュープレス、多重円板脱水機などが挙げられる。

精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１×１０^３〜約１×１０^４、好ましくは約５×１０^３〜約５×１０^４、より好ましくは約１×１０^４〜約３×１０^４の限外濾過膜（例えば、ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。

クロマトグラフィーに使用され得る支持体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用支持体、配位子交換クロマトグラフィー用支持体、イオン交換クロマトグラフィー用支持体および疎水クロマトグラフィー用支持体が挙げられる。

本願発明の方法で、原料の澱粉粒からの本願グルカンの収率は非常に高く、ほぼ１００％である。場合によっては、環状構造のみを有する低分子量グルカンも生産されるが、これらは、例えば、セファデックスなどを用いるゲル濾過により、容易に、目的の分岐構造を有する環状グルカンから分離され得る。

本明細書においては、収率は、以下の式によって求められる：
収率（重量％）＝｛（生成された環状構造保有分岐状グルカンの重量（ｇ））／（使用した澱粉粒の重量（ｇ））｝×１００

４．本発明の方法により得られる環状構造保有分岐状グルカン
本発明の方法によって製造されるグルカンは、高度に分岐した分岐状グルカンのうちの一部の鎖が環状構造を形成する構造を有していると考えられる。そのため、本発明のグルカンを、「環状構造保有分岐状グルカン」という。

本発明の環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度は、α−１，６分岐の割合によって示される。α−１，６分岐の割合は例えば約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上などであり得る。α−１，６分岐の割合に上限はないが、例えば、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約８％以下などであり得る。

分岐頻度は、以下の式によって計算される：
分岐頻度（％）＝｛（分岐数）／（分子全体のグルコース単位数）}×１００

本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約３万以上であり、さらに好ましくは約５万以上であり、特に好ましくは約１０万以上である。本発明の環状構造保有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約５０万以下であり、さらに好ましくは約３０万以下であり、特に好ましくは約２０万以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中の環状構造部分の平均重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中の環状構造部分の平均重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐構造部分の平均重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐構造部分の平均重合度は、好ましくは約４×１０^３以下であり、より好ましくは約３×１０^３以下であり、さらに好ましくは約２×１０^３以下であり、さらにより好ましくは約１×１０^３以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの重合度は、最大の重合度（ＤＰ_ｍａｘ）のものと最小の重合度（ＤＰ_ｍｉｎ）のものとの重合度の比（ＤＰ_ｍａｘ/ＤＰ_ｍｉｎ）が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、好ましくは、分岐グルカン構造の一部が環を形成している。ここで、環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして分岐構造部分とは、該環状構造部分に結合した非環状構造部分である。この分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上であり、好ましくは約２０以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約２００以上であり、さらに好ましくは約４００以上であり、最も好ましくは約６００以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約５×１０^３以下であり、より好ましくは約４×１０^３以下であり、さらに好ましくは約３×１０^３以下であり、最も好ましくは約２×１０^３以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中の分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約２個以上であり、より好ましくは約８個以上であり、さらに好ましくは約２０個以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約８００個以下であり、より好ましくは約６００個以下であり、さらに好ましくは約４００個以下である。

本発明で得られる環状構造保有分岐状グルカンにおいては、α−１，６−グルコシド結合の数とα−１，４−グルコシド結合の数との比（「α−１，６−グルコシド結合の数」：「α−１，４−グルコシド結合の数」）は、好ましくは１：４〜１：１×１０^３であり、より好ましくは１：５〜１：１×１０^３であり、さらに好ましくは１：１０〜１：１×１０^３であり、さらに好ましくは１：２０〜１：１００である。

α−１，６−グルコシド結合は、本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。

グルカンのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物であるため、その分子量は数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｎは、その系の全質量を、その系に含まれる分子の個数で割ったものである。すなわち数分率による平均である。一方、Ｍｗは重量分率による平均である。完全に均一な物質であれば、Ｍｗ＝Ｍｎとなるが、高分子は一般に分子量分布を有するためＭｗ＞Ｍｎとなる。したがって、Ｍｗ／Ｍｎが１より大きいほど、分子量の不均一度が大きい（分子量分布が広い）ということになる。

Ｍｎは、分子の個数を評価することにより、決定できる。すなわち、アミロースなどにおいては、還元性末端数を測定することにより決定できる。還元性末端数の測定は、例えばＴａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６．１７８：ｐ．１６００−１６０６に記載されるＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法により決定できる。Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲルろ過クロマトグラフィー（ＭＡＬＬＳ法）によっても、決定できる。Ｍｗは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。

本明細書においては、基質の分子量は主として数平均分子量（Ｍｎ）で評価し、生成物グルカンの分子量は主として重量平均分子量（Ｍｗ）で評価している。生成物においては、環状化反応が起こった場合、還元末端数評価法では、Ｍｎを正しく評価できないためである。非常に巨大な分子の分子量を評価する場合、相対的に還元末端数が少なく、正確なＭｎ評価が行いにくいためでもある。さらに、ＭＡＬＬＳ法によるＭｎ評価法は、ゲルろ過による分画が完全であることを前提としており、分画が不完全であると正確なＭｎ評価ができないためでもある。

（副生物）
本発明の方法で製造されるグルカンは、その製造の際に副生する非環状グルカン（すなわち、還元末端を有するグルカン）が少ない。

本発明の方法は、副生物が少ないという利点を有する。そのため、出発物質の澱粉に比べて還元末端の量を増やさずに調製物を得ることができる。そもそも澱粉は、その還元末端が極めて少ないため、本発明の方法で得られるグルカンは、その還元末端が極めて少ない。

本明細書中で、「還元力のない」あるいは「還元力を有さない」とは、還元末端の量が、澱粉と同程度以下であることをいう。

より具体的には、本発明の方法で得られるグルカンを含む乾燥調製物（例えば、グルカン含有粉末またはグルカン精製物）の還元末端の量は、改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．，３５，ｐｐ．３４８−３５０（１９８３））にしたがって測定した場合に検出限界以下である。好ましくは、この乾燥調製物の還元末端の量は、グルコースの還元力に換算して約０．０１重量％以下（すなわち、乾燥調製物１ｋｇの還元力がグルコース０．１ｇの還元力以下）であり、さらに好ましくは約０．００１重量％以下であり、最も好ましくは約０．０００１重量％以下である。

（環状構造を有することの確認）
本発明の製造法により得られる環状構造保有分岐状グルカンが、環状構造を有することの確認は、エキソ型のグルコアミラーゼを用いて行い得る。

エキソ型グルコアミラーゼは、澱粉などのグルカンの非還元末端から順次α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素である。速度は遅いが、非還元末端からα−１，６−グルコシド結合を加水分解し得ることが知られている。環状構造を有しないアミロースおよびアミロペクチンは、エキソ型グルコアミラーゼによって完全にグルコースにまで分解される。しかし、分子内に環状構造を有するグルカンは、その非環状構造部分（すなわち、分岐状構造部分）のみがグルコアミラーゼにより分解され、環状構造部分は、グルコアミラーゼでは分解を受けない物質（以下、グルコアミラーゼ耐性成分という）として残る。

このグルコアミラーゼ耐性成分（環状構造部分）が、α−１，６−グルコシド結合を有するか否かは、α−１，６−結合を切断する枝切り酵素に対する感受性によって決定することができる。

α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンは、枝きり酵素とグルコアミラーゼの併用で、グルコースにまで完全に分解される。

他方、α−１，６−グルコシド結合を有しない（α−１，４−グルコシド結合のみを有する）環状構造のグルカンは、枝切り酵素およびエキソ型グルコアミラーゼの併用によって分解されない。この環状グルカンは、エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼを併用することにより完全にグルコースまで分解され得る。

これらの性質を利用することにより、グルカンの環状構造部分、非環状（分岐状）構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量することが可能となる。

本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐状グルカンが、環状構造を有していることは、以下の（１）から（６）の性質で確認され得る。

（１）還元性末端数は、原料（澱粉など）と比較して増加しない。すなわち、還元末端を検出することができない。上記還元末端数の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ９４：２０５−２１３（１９８１）の改変パークジョンソン法により行い得る。

（２）エキソ型アミラーゼであるグルコアミラーゼを作用させると、グルコアミラーゼ耐性成分が残る。その成分は脱リン酸化酵素（シグマ社）を作用させた後にさらにグルコアミラーゼを作用させても分解されない。

（３）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。

（４）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。

（５）（４）のエンド型α−アミラーゼによる加水分解により、イソマルトシルマルトース（ＩＭＭ）を生じる。α−１，６−グルコシド結合を有するグルカンにエンド型α−アミラーゼを作用させた場合の最小のリミットデキストリンは、ＩＭＭである（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｍｚｙｍｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ｐ４０−４５（１９８８））との記載と一致する。

（６）上記グルコアミラーゼ耐性成分の分子量をレーザーイオン化ＴＯＦ−ＭＳ装置（島津社製）で分析すると、得られた分子量の値は、環状グルカンの理論値に一致し、非環状のグルカンの理論値に一致しない。

環状構造部分の確認のために用いる、前記グルコアミラーゼ耐性成分の検出は、次のように行い得る。例えば、上記反応で生成したグルカンにグルコアミラーゼを添加し、例えば、約４０℃で一夜反応させる。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去した後、１０倍量のエタノールを添加し、残存する多糖を遠心分離による沈澱として回収する。この操作をもう一度繰り返して、グルコアミラーゼ耐性成分を得る。ただし、２回目のグルコアミラーゼの処理時間は、短時間（例えば、１から２時間）で十分である。

本願発明で使用する原料が一部リン酸基により修飾されている澱粉などの場合には、グルコアミラーゼ耐性成分の検出には前処理が必要である。例えば、反応生成物を１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．３ｍＭのＺｎＣ１_２を含む）に溶解し、脱リン酸化酵素を添加して反応させた後、１０倍量エタノールを添加し、沈澱を回収する。この沈殿に上記の方法を適用して、グルコアミラーゼ耐性成分を得ることができる。

グルコアミラーゼ耐性成分の平均重合度および構成成分は、上記（１）から（５）に記載のように、グルコアミラーゼ耐性成分と糖の加水分解酵素とを反応させて生じた糖を分析することによって、決定し得る。加水分解は、グルコアミラーゼ単独、グルコアミラーゼとイソアミラーゼとの組み合わせ、あるいはグルコアミラーゼとα−アミラーゼとの組み合わせが挙げられる。反応は、例えば、グルコアミラーゼ耐性成分を０．２％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、上記分解酵素をそれぞれ適当量加えて、３０−４５℃で適当な時間（例えば１時間）反応させる。このグルコアミラーゼ耐性成分分解物を、Ｄｉｏｎｅｘ社製の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ１００）にかけ、分析する。溶出は、例えば、流速：１ｍｌ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ、４５分−８５０ｍＭ、４７分−８５０ｍＭの条件で行う。この分析により、グルコアミラーゼ耐性成分の平均重合度、および分解により生じる糖が決定され得る。

５．本発明の方法により得られるグルカンの用途
本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、澱粉の種々の用途に使用され得、特に、腹膜透析、糖尿病患者用の食事、輸液、飲食用組成物、食品添加用組成物、接着用組成物において、および澱粉の老化防止剤として、使用され得る。これら用途において、本願発明のグルカンは、それぞれの用途に適した濃度となるように使用され得る。本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、分子量が腹膜透析に適切な範囲にあり、還元糖をほとんどまたは全く含まないため、特に腹膜透析に適している。

本発明の方法においては、グルコースおよび低分子量のマルトオリゴ糖がほとんどまたは全く生成されないため、高度の精製をすることなく、グルコースおよびマルトオリゴ糖などの非環状グルカン副生物（すなわち、還元末端を有する副生物）を含まない環状構造保有分岐状グルカンを得ることができる。グルコースおよびマルトオリゴ糖を含まない環状構造保有分岐状グルカンは、体液中に急激に吸収されることがなく、血糖値を急激に上昇させることがないため、腹膜透析、糖尿病患者用の食事および輸液において特に有用である。

環状構造保有分岐状グルカンは、既存の澱粉などの上記原料と比較して、水に対する溶解度が非常に高く、溶解した糊液の粘度が低く、通常の澱粉では観察される老化が起こらないという優れた性質を有する。さらに、環状構造保有分岐状グルカンまたはその誘導体は、反応性が低いため、タンパク質やアミノ酸と混合して加熱したとき、既存の水飴およびデキストリンと比較して、着色しにくいという優れた性質を有している。

このように、環状構造保有分岐状グルカンは、水に対する溶解度が非常に高いため、粉末化基剤、コーヒー、醤油、たれ、麺類のつゆ、ソース、ダシの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、ゼリー、キャラメル、ガム、チョコレート、クッキー、クラッカー、アイスクリーム、シャーベット、ジュース、粉末ジュース、入浴剤、飲み薬、粉末薬、塗料、接着剤、増粘剤、糊料などに、好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、老化が起こらないため、和生菓子、洋生菓子、冷凍食品、冷蔵食品、餅、おにぎりなどに好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンまたはその誘導体は、溶解した糊液の粘度が低いため、生物崩壊性プラスチックの原料や、澱粉からサイクロデキストリンなどを製造する際の中間物質、澱粉加工工業における原料などに好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、良好な接着性を有し、接着用組成物として好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、環状構造を除けば、通常の澱粉と同じ基本的構造を持つことから、生体内の酵素により容易にグルコースに分解されることができるため、消化性に優れている。そのため、スポーツ飲料、スポーツ食品などにも使用され得る。

以下に実施例をあげて本願発明を説明するが、本願発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。

（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ（ＡｑＢＥ）の製造）
特開２００８−９５１１７の製造例１に記載された組換えプラスミドｐＡＱＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同特許文献に示された方法により配列番号２のアミノ酸配列を有するＡｑＢＥを含む酵素液を得た。

（製造例２：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥ（ＲｈＢＥ）の製造）
特開２００８−９５１１７の製造例５に記載された組換えプラスミドｐＲＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同特許文献に示された方法により配列番号４のアミノ酸配列を有するＲｈＢＥを含む酵素液を得た。

（比較例１：環状構造を有する分岐状グルカンの製造の試み（１））
市販のワキシーコーンスターチ５ｇを１００ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、この懸濁液を９０℃に加熱したところ、澱粉は速やかに糊化が起こり、この懸濁液は流動性のまったくない硬い餅状に変化した。製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６００Ｕ／ｇ基質）を９０℃のこの流動性を持たないゲル状の懸濁液に添加したが、環状構造を有するグルカンは製造されなかった。

（比較例２：環状構造を有する分岐状グルカンの製造の試み（２））
市販のワキシーコーンスターチ５ｇを１００ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、この懸濁液を８０℃に加熱したところ、澱粉糊化が起こり、この懸濁液は流動性のない餅状に変化した。製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６００Ｕ／ｇ基質）を８０℃のこの流動性を持たないゲル状の懸濁液に添加したが、環状構造を有するグルカン生産物は製造されなかった。

（比較例３：環状構造を有する分岐状グルカンの製造（３））
市販のワキシーコーンスターチ１ｇを１００ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６００Ｕ／ｇ基質）を添加して反応混合液を得て、この反応混合液を攪拌しながら７０℃で１６時間反応させた。次いで反応混合液を１００℃で１０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約０．２８ｇを得た。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１３８ｋＤａであることが示された。

このグルカンの構造決定は、下記の実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造および分岐状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。

しかしながら、この製造法では、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約２８％であり、非常に低かった。

（比較例４：環状構造を有する分岐状グルカンの製造（４））
市販のワキシーコーンスターチ５ｇを１００ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で１０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約０．３５ｇを得た。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１５７ｋＤａであることが示された。

このグルカンの構造決定は、下記の実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造および分岐状構造を有し、出発物質の澱粉と比較して還元末端の数が増加しなかったことが確認できた。

しかしながら、この製造法では、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約３５％であり、非常に低かった。

（比較例５：環状構造を有する分岐状グルカンの製造（５））
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を除去し、上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約１．１ｇを得た。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１１９ｋＤａであることが示された。

このグルカンの構造決定は、下記の実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造および分岐状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。

しかしながら、この製造法では、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約２２％であり、非常に低かった。

（実施例１：第２ステップの反応温度を８５℃にした環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．１５ｍｌ（６０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で６時間反応させた後、８５℃に昇温し１時間反応させた。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。さらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約４４ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８８％であった。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

グルカンの重量平均分子量は、多角度レーザー光散乱光度計（ワイアットテクノロジー社製、ＤＡＷＮ ＤＳＰ）と示差屈折計（昭和電工（株）製、Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工（株）製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０６ＭＨＱ）を用いて調べた。分岐グルカンの粉末２０ｍｇを１０ｍｌの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径０．４５μｍの膜でろ過して濾液を得た。得られたろ液のうちの１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入し測定した。このグルカンの重量平均分子量は１１１ｋＤａであることが示された。

このグルカンの構造決定は、特許第３１０７３５８の実施例３に記載された方法に従って行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認された。さらに、非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。グルカンの非還元末端数は、上述のグルカンにイソアミラーゼを作用させた後の還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．，３５，ｐｐ．３４８−３５０（１９８３））を用いて調べることにより求めた。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例２：第２ステップの反応温度を１００℃にした環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液２．５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で６時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＡｑＢＥ酵素液２．５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約３９ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７８％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１６４ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例３：１０％澱粉濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造（1））
市販のワキシーコーンスターチ１００ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で１６時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約７６ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７６％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１７１ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例４：１０％澱粉濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造（２））
市販のワキシーコーンスターチ２ｇを１９．５ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液０．５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２４時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約１．６ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８０％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量３１４ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例５：２０％澱粉濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ４ｇを１９ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液１ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２４時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約３ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７５％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量２９４ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例６：３０％澱粉濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ６ｇを１８．５ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液１.５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２４時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約５ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８３％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量３２４ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しないことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例７：第１ステップの反応温度が６５℃の環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ１００ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら６５℃で６時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。さらに、ＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに６５℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約８１ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８１％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１４１ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例1同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例８：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥ（ＲｈＢＥ）を利用した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例２で得たＲｈＢＥ酵素液２.５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら６５℃で６時間反応させた後、１００℃まで昇温し２０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＲＢＥ酵素液２.５ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに６５℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約４１ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８２％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１４０ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例９：ＢＥ瞬時連続反応法（９５℃）による環状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５０ｍＬ（５０，０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら速やかに９５℃に上昇させて９５℃で５分間保持しワキシーコーンスターチを液化した後、７０℃に温度を下げてＡｑＢＥ酵素液１ｍＬ（１０００Ｕ／ｇ基質）をさらに添加して１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約３９ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７８％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１３９ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例１０：ＢＥ瞬時連続反応法（１００℃）による環状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、この懸濁液に製造例２で得たＲｈＢＥを５０，０００Ｕ／ｇ基質を５０℃で添加した。懸濁液を攪拌しながら速やかに１００℃に上昇させて加熱し１００℃で５分間保持しワキシーコーンスターチを液化した後、７０℃に温度を下げてＲｈＢＥを１０００Ｕ／ｇ基質を添加して１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約３７ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７４％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１４１ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例１１：ノーマルコーンスターチ１０％澱粉濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のノーマルコーンスターチ１００ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２時間反応させた後、１２０℃まで昇温し６０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約７９ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約７９％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１８８ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例１２：馬鈴薯デンプン１０％濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販の馬鈴薯澱粉１００ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２時間反応させた後、１２０℃まで昇温し６０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＡｑＢＥ酵素液６ｍｌ（１２００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約８１ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８１％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量２０６ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

（実施例１３：タピオカ澱粉１０％濃度で製造した環状構造を有する分岐状グルカンの製造）
市販のタピオカ澱粉１００ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、５０℃のこの懸濁液に製造例１で得たＡｑＢＥ酵素液５ｍｌ（１０００Ｕ／ｇ基質）を添加した。懸濁液を攪拌しながら７０℃で２時間反応させた後、１２０℃まで昇温し６０分間保持した。この時反応混合液は透明度が高くかつ充分な流動性を保持していた。ＡｑＢＥ酵素液６ｍｌ（１２００Ｕ／ｇ基質）を添加してさらに７０℃で１６時間反応させた。反応混合液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約８２ｇを得た。すなわち、環状構造を有する分岐状グルカンの収率は約８２％であった。実施例１と同様の方法で調べた結果、重量平均分子量１３６ｋＤａであることが示された。この方法では、粉末グルカンの焦げや色づきなど、最終製品の品質上問題となることは起きなかった。

このグルカンの構造決定は、実施例１同様の方法で行い、このグルカンが確かに環状構造を有し、還元末端が出発物質の澱粉から増加しなかったことが確認できた。さらに、実施例１と同様に非還元末端数を求めることにより、このグルカンが分岐を有することも確認された。したがって、生成されたグルカンは、環状構造保有分岐状グルカンであった。

比較例１〜５および実施例１〜１３の結果を以下の表１に示す。なお流動性×は、容量１．５ｍｌのプラスチックチューブに酵素処理直後の溶液を入れて直ちにそのチューブを反転させて溶液の下側が開放された状態で最終酵素反応の温度にて１０分間放置した場合に、入れた溶液の２０重量％以上の溶液がチューブ中に残ることを示し、それより少ない溶液が残った場合を流動性○と示す判定は、流動性が×であるかあるいは生成物の収率が４０％未満である場合を判定ＮＧ（不適）とし、そうでない場合を判定○（好適）とした。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明の方法では、還元力のない環状構造保有分岐状グルカンを高い収率で製造することが可能になり、工業的製造プロセスの効率の点で有利である。

また、本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐グルカンは、腹膜透析、糖尿病患者用の食事、輸液、飲食用組成物、食品添加用組成物、接着用組成物において、および澱粉の老化防止剤として有用である。例えば、グルコースおよびマルトオリゴ糖のような還元糖を含まないことにより、体液中に急激に吸収されることがなく、血糖値を急激に上昇させることがないため、腹膜透析、糖尿病患者用の食事および輸液において特に有用である。

配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号４：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥのアミノ酸配列。

Claims (11)

1. 環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法であって、該方法は、
   （１）５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ブランチングエンザイムを含む混合液を調製して該澱粉粒中の澱粉にブランチングエンザイムを作用させる工程であって、該調製時の該混合液の温度が０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下である、工程；および
   （２）該混合液の温度を８５℃以上１２９℃以下に上昇させる工程
   を包含し、該方法においては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびαトランスグルコシダーゼのいずれも該混合液に添加しない、方法。
2. 前記工程（１）における調製時の混合液の温度が０〜６７．５℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ３０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（１）における調製時の混合液の温度が１５〜６７．５℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ３０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
4. 前記工程（１）における調製時の混合液の温度が２０〜５０℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ４０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより昇温して前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
5. 前記工程（１）における調製時の混合液の温度が２０〜４０℃であり、その後、前記工程（２）の前に該調製時の混合液の温度よりも高くかつ５０〜７５℃の範囲の温度に該混合液の温度を昇温することにより前記澱粉粒中の澱粉に前記ブランチングエンザイムを作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
6. 前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１０秒間以上７２時間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
7. 前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１秒間以上２０秒間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
8. 前記工程（１）で混合液を調製した後、前記工程（２）の温度の上昇が完了するまでが１秒間以上２０秒間以下の時間で行われ、該工程（２）の後、前記混合液の温度を０℃〜１００℃に低下させ、次いでブランチングエンザイムを添加して５０℃〜１００℃で作用させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
9. 前記工程（２）の後に、前記混合液から不溶物を除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
10. 前記工程（２）において、前記ブランチングエンザイムが活性を有する請求項１に記載の方法。
11. 前記ブランチングエンザイムがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ブランチングエンザイムまたはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ブランチングエンザイムである請求項１に記載の方法。

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