CN113832121A

CN113832121A - 一种粘细菌裂解多糖单加氧酶及其基因工程菌和应用

Info

Publication number: CN113832121A
Application number: CN202111189035.0A
Authority: CN
Inventors: 朱红惠; 周晓丽; 徐志强; 李月秋
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-10-12
Also published as: CN113832121B

Abstract

本发明公开了一种粘细菌裂解多糖单加氧酶及其基因工程菌和应用。粘细菌裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第27‑164位氨基酸序列所示。裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A可与传统纤维素酶协同作用，提高微晶纤维素和木质纤维素的降解效率。NeLPMO10A可与木聚糖酶协同作用，提高木聚糖的降解效率。NeLPMO10A可与几丁质酶协同作用，提高几丁质的降解效率。

Description

一种粘细菌裂解多糖单加氧酶及其基因工程菌和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A及其基因工程菌、以及其在多糖和生物质降解中的应用。

背景技术

木质纤维素和几丁质作为地球上储量最丰富的可再生生物质资源，是生物燃料、材料和化学品的重要原材料。然而，这些生物质并不能直接利用，需要先降解为可发酵糖，即糖化。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素及木质素构成，其中，纤维素是葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键线性连接形成的聚合物，多条糖链之间通过氢键相互作用形成结晶区域。主要由木聚糖和其他杂多糖构成的半纤维素贯穿于木质素和纤维素纤维之间，三者交联形成牢固的抗降解屏障。几丁质的单链由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成，链与链之间通过大量氢键作用进一步形成致密的结晶结构。这些生物质复杂的组成和结晶结构使得水解酶不容易接近并降解糖苷键，进而导致酶催化生物质糖化的低效率和高成本。裂解多糖单加氧酶是铜离子依赖的氧化酶，可以作用于纤维素和几丁质等结晶多糖，通过氧化作用断裂糖苷键，为水解酶提供更多的结合位点，因而与水解酶协同作用，极大地促进生物质的糖化效率。

粘细菌是具有分解复杂有机质能力的“高等原核生物”，是蕴含着丰富新颖酶资源的难培养细菌。然而，由于粘细菌分离培养困难等原因，目前对粘细菌来源的酶，特别是裂解多糖单加氧酶的研究很少。因此，粘细菌来源的新型裂解多糖单加氧酶具有重要研究价值。

发明内容

本发明旨在提供一种粘细菌来源的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A及其应用。

本发明所述的粘细菌裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A，其特征在于：该裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第27-164位氨基酸序列所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第79-492位碱基序列所示。

具体的，所述裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A来自于粘细菌Nannocystis exedensATCC 25963。包括205个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(具体为MVSGRTGARRVGLALGLAGLPATALAHITLLEPAPRHDQQKLGPCGAGTDDARGEVVSTFRPGQTITVRWQETVPHPGYFRISFDDEGQDAFVDPPEAGQSGDPAVVLVDLVADKDGRQTYEQAVTLPDVRCDRCTLQLVQVMTDKAPYGDGNDLYYQCADLVLSDDAPETSESPAADDASGGCRTGSAGPLALVLVLGRRRRRA)，N端26个氨基酸为信号肽，成熟的NeLPMO10A的理论分子量为19kDa。

进一步的，本发明所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A还涵盖在：所使用的蛋白为表现出裂解多糖单加氧酶活性的NeLPMO10A的突变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除。

本发明还公开了一种包含上述裂解多糖单加氧酶基因的重组载体pET22b-nelpmo10a。

本发明还公开了一种包含上述重组载体pET22b-nelpmo10a的重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/nelpmo10a。

本发明所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A是由重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/nel pmo10a发酵培养诱导表达、纯化回收获得。

本发明还提供裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与纤维素酶系协同降解微晶纤维素和/或木质纤维素中的应用。

本发明还提供裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与几丁质酶协同降解几丁质中的应用。

本发明还提供裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与木聚糖酶协同降解木聚糖中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A及其应用具有以下优势：

裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A可与传统纤维素酶协同作用，提高微晶纤维素和木质纤维素的降解效率。将商品纤维素酶新仰韶LEKenzyme-80与NeLPMO10A按1:1的比例混合，分别可以将商品酶降解微晶纤维素、玉米秸秆和甘蔗渣的还原糖产量提高至188％，138％和128％，表明该酶在木质纤维素生物质资源化利用等工业中具有很大的应用潜力和经济效益。

NeLPMO10A可与木聚糖酶协同作用，提高木聚糖的降解效率。将商品木聚糖酶(源叶生物S10108)与NeLPMO10A按1:1的比例混合，可以使商品酶降解玉米芯来源木聚糖的还原糖产量提高至118％。

NeLPMO10A可与几丁质酶协同作用，提高几丁质的降解效率。将商品几丁质酶(源叶生物S10178)与NeLPMO10A按1:1的比例混合，可以使商品酶降解虾壳来源几丁质的还原糖产量提高至138％。

附图说明

图1：纯化后NeLPMO10A蛋白的SDS-PAGE分析，其中，M，分子量marker；1，纯化的NeLPMO10A；

图2：NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解微晶纤维素，其中，下方线为不添加NeLPM O10A；上方线为添加NeLPMO10A；

图3：NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解玉米秸秆，其中，白色为不添加NeLPMO10A；灰色为添加NeLPMO10A；

图4：NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解甘蔗渣，其中，白色为不添加NeLPMO10A；灰色为添加NeLPMO10A。

具体实施方式

下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：重组载体pET22b-nelpmo10a的构建

首先根据原始核苷酸序列(SEQ ID No.2，具体为gtggttagcggacggacgggcgcgagacgggtcgg cctggcgctgggcctggcgggcctgcccgcgacggcgctggcgcacatcaccctgctcgagccggcgccgcgccatgatcagcagaagctcgggccctgcggtgccggcaccgacgacgcgcgcggcgaggtggtgagcacgttccgaccggggcagacgatcacggtgcgctggcaggagacggtgccgcaccccgggtacttccgcatcagcttcgacgacgaggggcaggacgcgttcgtcgatccgcccgaggccggccagagcggcgatccggcggtcgtgctggtcgatctggtagcggacaaggacggccggcagacgtacgagcaggcggtgacgctgccggacgtgcgctgcgaccgctgcacgctgcagctcgtgcaggtgatgacggacaaggcgccgtacggggacggcaacgacctctactatcaatgcgcggacctcgtgctcagcgacgacgcgcccgagacgagcgaatcgcctgccgccgacgacgcgagcggaggctgccgcaccggttcggcgggtccgctggcgctggtgctggtgctcggccggcggcgccggcgagcctag)以大肠杆菌表达宿主进行密码子优化，由金唯智公司合成经优化后的裂解多糖单加氧酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3，具体为atggttagcggacggacgggcgcgagacgggtcggcctggcgctgggcctggcgggcctgcccgcgacggcgctggcgcatattaccctgctggaaccggcgccgcgccatgatcagcagaaactgggcccgtgcggcgcgggcaccgatgatgcgcgcggcgaagtggtgagcacctttcgcccgggtcagaccattaccgtgcgctggcaagaaaccgtgccgcatccgggctattttcgcattagctttgatgatgaaggccaagatgcgtttgtggatccgccggaagcgggtcagagcggcgatccggcggtggtgctggtggatctggtggcggataaagatggccgtcagacctatgaacaagcggtgaccctgccggatgtgcgctgcgatcgctgcaccctgcagctggtgcaagtgatgaccgataaagcgccgtatggcgatggcaacgatctgtattatcagtgcgcggatctggtgctgagcgatgatgctcccgagacgagcgagagcccggcggctgatgacgcgagtggtggctgtcgcactggcagcgctggcccgttagcactcgtgctggtgctgggccgccgccgccgccgcgcgtag)，将上述裂解多糖单加氧酶编码基因使用上游引物5’-CTGCCCAGCCGGCGATGGCCCATATTACCCTGCTGGAACC-3’和下游引物5’-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGCACCAGATCCGCGCACT-3’进行PCR扩增。将载体pET22b使用上游引物5’-CACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTA-3’和下游引物5’-GGCCATCGCCGGCTGGGCAGCGAGGAGCAGCAGA-3’进行PCR扩增。然后分别进行回收，用

HD Cloning Kit将回收后的编码基因片段与pET22b载体进行连接，得到重组载体pET22b-nelpmo10a，将重组载体pET22b-nelpmo10a转化至克隆宿主E.co li DH5α，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID No.3相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组质粒pET22b-nelpmo10a。

实施例2：大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/nelpmo10a的构建

从E.coli DH5α提取质粒pET22b-nelpmo10a，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氨苄(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落进行测序验证，测序验证正确的为含有裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A的基因工程菌BL21(DE3)/nelpmo10a。

实施例3：NeLPMO10A酶蛋白的制备

基因工程菌BL21(DE3)/nelpmo10a接种至含有氨苄(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃180rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃震荡培养4h。5500g离心10min收集菌体，用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体3次。用细胞裂解缓冲液(蔗糖20％，m/V；30mM Tris-HCl，pH8.0)重悬菌体，加入终浓度为1mM的PMSF，室温下轻微混匀10min。于4℃10000g离心10min收集沉淀，弃上清。用预冷的ddH₂O充分重悬沉淀，冰浴下轻微混匀10min。于4℃10000g离心10min收集上清，即为周质空间蛋白粗提液。用孔径0.22μm水系膜过滤后，用Ni²⁺亲和层析柱进行蛋白纯化，用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液，然后用10kDa的超滤管置换为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，并进行浓缩。利用SDS-PAGE检验蛋白的纯度，利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度。纯化的蛋白按摩尔比1:3加入硫酸铜溶液，于4℃静置30min，进行铜离子饱和。利用PD MidiTrap G-25除盐柱去除多余的铜离子，得到NeLP MO10A酶蛋白，SDS-PAGE图如图1所示。

实施例4：NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解微晶纤维素

反应体系包含50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，10mg/mL的微晶纤维素，1mM抗坏血酸，NeLPMO10A与商品纤维素酶(LEKenzyme-80)按蛋白质质量比为1:1的比例组合，总蛋白浓度为0.3mg/mL。于37℃，1000rpm震荡孵育，间隔一定时间取样，利用DNS比色法检测还原糖的量。以不添加NeLPMO10A的作为对照酶蛋白。

结果如图2所示，从图2可以看出，相比于单独的纤维素酶，NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解微晶纤维素，可以将商品酶降解微晶纤维素的还原糖产量提高至188％。

实施例5：NeLPMO10A与商品纤维素酶协同降解预处理的农作物秸秆

1、秸秆的预处理

玉米秸秆和甘蔗渣分别粉碎，过60目筛。按固液比1:3的比例加入10％(w/v g/ml)的Na OH，80℃孵育90min，利用去离子水洗涤至pH中性，自然晾干。

2、酶活力检测

反应体系包含50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，40mg/mL预处理的秸秆(或甘蔗渣)，1mM抗坏血酸，NeLPMO10A与商品纤维素酶(LEKenzyme-80)按蛋白质质量比为1:1的比例组合，总蛋白浓度为0.3mg/mL。于37℃，1000rpm震荡孵育，间隔一定时间取样，利用DNS比色法检测还原糖的量。以不添加NeLPMO10A的作为对照。

结果如图3和图4所示，将商品纤维素酶新仰韶LEKenzyme-80与NeLPMO10A按1:1的比例混合，可以将商品酶降解玉米秸秆和甘蔗渣的还原糖产量提高至138％和128％，表明该酶在木质纤维素生物质资源化利用等工业中具有很大的应用潜力和经济效益。

实施例6：NeLPMO10A与商品几丁质酶协同降解几丁质

反应体系包含50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，10mg/mL虾壳来源的几丁质，1mM抗坏血酸，NeLPMO10A与商品几丁质酶按蛋白质质量比为1:1的比例组合，总蛋白浓度为0.3mg/mL。于37℃，1000rpm震荡孵育，间隔一定时间取样，利用DNS比色法检测还原糖的量。以不添加NeLPMO10A的作为对照。

将商品几丁质酶(源叶生物S10178)与NeLPMO10A按1:1的比例混合，可以使商品酶降解虾壳来源几丁质的还原糖产量提高至138％。

实施例7：NeLPMO10A与商品木聚糖酶协同降解木聚糖

反应体系包含50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，10mg/mL玉米芯来源的木聚糖，1mM抗坏血酸，NeLPMO10B与商品木聚糖酶按蛋白质质量比为1:1的比例组合，总蛋白浓度为0.3mg/mL。于37℃，1000rpm震荡孵育，间隔一定时间取样，利用DNS比色法检测还原糖的量。以不添加NeLPMO10A的作为对照。

将商品木聚糖酶(源叶生物S10108)与NeLPMO10A按1:1的比例混合，可以使商品酶降解玉米芯来源木聚糖的还原糖产量提高至118％。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种粘细菌裂解多糖单加氧酶及其基因工程菌和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 粘细菌(Nannocystis exedens)

<400> 1

Met Val Ser Gly Arg Thr Gly Ala Arg Arg Val Gly Leu Ala Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Gly Leu Pro Ala Thr Ala Leu Ala His Ile Thr Leu Leu Glu

20 25 30

Pro Ala Pro Arg His Asp Gln Gln Lys Leu Gly Pro Cys Gly Ala Gly

35 40 45

Thr Asp Asp Ala Arg Gly Glu Val Val Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Thr Ile Thr Val Arg Trp Gln Glu Thr Val Pro His Pro Gly Tyr Phe

65 70 75 80

Arg Ile Ser Phe Asp Asp Glu Gly Gln Asp Ala Phe Val Asp Pro Pro

85 90 95

Glu Ala Gly Gln Ser Gly Asp Pro Ala Val Val Leu Val Asp Leu Val

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Arg Gln Thr Tyr Glu Gln Ala Val Thr Leu Pro

115 120 125

Asp Val Arg Cys Asp Arg Cys Thr Leu Gln Leu Val Gln Val Met Thr

130 135 140

Asp Lys Ala Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Asp Leu Tyr Tyr Gln Cys Ala

145 150 155 160

Asp Leu Val Leu Ser Asp Asp Ala Pro Glu Thr Ser Glu Ser Pro Ala

165 170 175

Ala Asp Asp Ala Ser Gly Gly Cys Arg Thr Gly Ser Ala Gly Pro Leu

180 185 190

Ala Leu Val Leu Val Leu Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ala

195 200 205

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 粘细菌(Nannocystis exedens)

<400> 2

gtggttagcg gacggacggg cgcgagacgg gtcggcctgg cgctgggcct ggcgggcctg 60

cccgcgacgg cgctggcgca catcaccctg ctcgagccgg cgccgcgcca tgatcagcag 120

aagctcgggc cctgcggtgc cggcaccgac gacgcgcgcg gcgaggtggt gagcacgttc 180

cgaccggggc agacgatcac ggtgcgctgg caggagacgg tgccgcaccc cgggtacttc 240

cgcatcagct tcgacgacga ggggcaggac gcgttcgtcg atccgcccga ggccggccag 300

agcggcgatc cggcggtcgt gctggtcgat ctggtagcgg acaaggacgg ccggcagacg 360

tacgagcagg cggtgacgct gccggacgtg cgctgcgacc gctgcacgct gcagctcgtg 420

caggtgatga cggacaaggc gccgtacggg gacggcaacg acctctacta tcaatgcgcg 480

gacctcgtgc tcagcgacga cgcgcccgag acgagcgaat cgcctgccgc cgacgacgcg 540

agcggaggct gccgcaccgg ttcggcgggt ccgctggcgc tggtgctggt gctcggccgg 600

cggcgccggc gagcctag 618

<210> 3

<211> 618

<212> DNA

<213> 粘细菌(Nannocystis exedens)

<400> 3

atggttagcg gacggacggg cgcgagacgg gtcggcctgg cgctgggcct ggcgggcctg 60

cccgcgacgg cgctggcgca tattaccctg ctggaaccgg cgccgcgcca tgatcagcag 120

aaactgggcc cgtgcggcgc gggcaccgat gatgcgcgcg gcgaagtggt gagcaccttt 180

cgcccgggtc agaccattac cgtgcgctgg caagaaaccg tgccgcatcc gggctatttt 240

cgcattagct ttgatgatga aggccaagat gcgtttgtgg atccgccgga agcgggtcag 300

agcggcgatc cggcggtggt gctggtggat ctggtggcgg ataaagatgg ccgtcagacc 360

tatgaacaag cggtgaccct gccggatgtg cgctgcgatc gctgcaccct gcagctggtg 420

caagtgatga ccgataaagc gccgtatggc gatggcaacg atctgtatta tcagtgcgcg 480

gatctggttc tgagcgatga tgctcccgag acgagcgaga gcccggcggc tgatgacgcg 540

agtggtggct gtcgcactgg cagcgctggc ccgttagcac tcgtgctggt gctgggccgc 600

cgccgccgcc gcgcgtag 618

Claims

1.粘细菌裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第27-164位氨基酸序列所示。

2.编码权利要求1所述的粘细菌裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第79-492位碱基序列所示。

4.一种包含权利要求2所述的基因的重组载体pET22b-nelpmo10a。

5.一种包含权利要求4所述的重组载体pET22b-nelpmo10a的重组大肠杆菌工程菌株。

6.权利要求1所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与纤维素酶系协同降解微晶纤维素和/或木质纤维素中的应用。

7.权利要求1所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与几丁质酶协同降解几丁质中的应用。

8.权利要求1所述的裂解多糖单加氧酶NeLPMO10A在与木聚糖酶协同降解木聚糖中的应用。