CN106906260B - 一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法 - Google Patents

一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法 Download PDF

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Abstract

混合菌发酵法生产黄腐酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD平板培养基上30℃培养活化；（2）一级种子培养：配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；（3）二级种子培养，（4）扩大发酵，(5)黄腐酸的提取，本发明的有益效果是降低了成本，减少了环境的污染，混合菌发酵法采用了多种菌体的协同作用，充分的发挥了培养液的作用，很大程度地提高了黄腐酸的转化率。

Description

一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，更具体地涉及一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法。
背景技术
碱法制浆是利用碱性化学药剂的水溶液处理植物纤维原料，而将原料中的木素溶出，使纤维从其中分离成为纸浆的方法。碱法制浆后，约有50％的纤维原料和绝大部分碱性物质溶解于蒸煮液中，成为黑液，黑液废水中含有聚戊糖、木素、硫酸盐皂和碱类物质，所以废水呈黑色。由于脱色困难、排入水体严重消耗溶解氧，用一般方法难以处理。
目前，制浆企业黑液转化为腐植酸，一般包括两种，一是将制浆黑液加入碱液，使黄腐酸沉淀下来再利用物理方法进行分离干燥；二是将制浆黑液利用微生物进行培养，得到含量更多的黄腐酸。
秸秆是成熟农作物茎叶（穗）部分的总称。通常指小麦、水稻、玉米、薯类、油菜、棉花、甘蔗和其它农作物（通常为粗粮）在收获籽实后的剩余部分。
专利号为201110058374.5的国家发明专利公开了一种利用稻草生产黄腐酸的方法，该法公开了利用碱环境软化处理秸秆，在利用微生物发酵生产黄腐酸。
专利号为200810013841.0的国家发明专利公开了一种碱法草浆黑液为原料的黄腐酸肥料及其制备方法，利用了碱法制取黄腐酸，这种方法提取的是草浆黑液已有的黄腐酸，但是草浆黑液依旧存在大量的有机物，这种方法转化利用率和黄腐酸产量都比较低；
专利号为201210119891.3的国家发明专利公开了利用复合微生物将制浆黑液转化为含黄腐酸和氨基酸粉体的方法，该方法采用了复合微生物的方法对草浆黑液进行进一步的转化，使得黄腐酸含量较高，而且得到了副产物菌体氨基酸粉体，草浆黑液有机物残留量很少。但是该方法由于只利用了草浆黑液的碳源，菌体前期生长过于缓慢，生长周期较长，转换率较低。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种能够利用混合微生物之间协同作用，利用草浆黑液的碱性环境处理秸秆，再利用菌菇渣内的碳源来提高混合菌种的生长速度，高效转化草浆黑液和秸秆的有机物来制备黄腐酸，能够有效的解决利用碱液处理秸秆浪费资源，草浆黑液直接提取黄腐酸产率较低、直接采用草浆黑液做发酵液菌种生长过慢转换率较低的问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：混合菌发酵法生产黄腐酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD 平板培养基上30℃培养活化；
（2）一级种子培养 ：按照菌菇渣（300-400）g/L、玉米粉（4-8）g/L、蔗糖（1.0-1.5）g/L、NaCl 15g/L、MgSO4·7H2O 8g/L、KH2PO4 6g/L、(NH4)2HPO4 4.5g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于 1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm 下发酵24h；
（3）二级种子培养：按照菌菇渣（300-400）g/L、玉米粉（1-5）g/L、蔗糖（0.5-1）g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液；
（4）扩大发酵：机械破碎秸秆后，按照秸秆: 制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，24～48h后捞出；再按照秸秆: 制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，按照菌菇渣（300-400）g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L，配制成发酵液，按照2-4％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到100L的发酵液罐中，按照发酵液质量的0.01-0.02%在发酵液罐中流加20%CoQ乙醇溶液，流加时间4-6h，停止流加CoQ后，流加NaOH,加大送氧量，控制发酵液PH在7-8，发酵10-15h后停止流加NaOH，继续发酵1-3h,带pH降低至4.0，停止发酵。
(5) 黄腐酸的提取：在步骤(4)中发酵液，用浓硫酸调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。
进一步地，所述菌菇渣为平菇、杏鲍菇、金针菇或白玉菇菇渣中的一种或二种以上的混合物。
进一步地，所述的二级种子培养的枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的接种量之比为4-6：6-7：5-6。
进一步地，所述CoQ能够替换成其他还原性辅酶。
进一步地，所述的菌菇渣采用酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆粕水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一种或二种以上的混合物。
进一步地，所述的黄腐酸的提取工艺中的分离方式采用：离心机或板式过滤器或膜过滤器。
本发明的有益效果是：利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应后，与菌菇渣作为发酵原料生产黄腐酸，减少了氧化钙的使用，降低了成本，减少了环境的污染；所述的混合菌发酵法采用了两级的种子培养，二级种子培养中采用了玉米粉和菌菇渣作为天然碳源，为菌种生长提供了过度环境，并添加了多种辅酶，使菌体能够快速适应环境并迅速的增殖；所述的混合菌发酵法采用了多种菌体的协同作用，充分的发挥了培养液的作用，很大程度地提高了黄腐酸的转化率。
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
实施方案一：
（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD 平板培养基上30℃培养活化；
（2）一级种子培养 ：按照鲍菇菌菇渣300g/L、玉米粉1g/L、蔗糖0.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于 1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm 下发酵24h；
（3）二级种子培养：按照杏鲍菇菌菇渣300g/L、玉米粉1g/L、蔗糖0.5g/L、NaCl10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制二级种子液，自然pH 值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6h，得相应的发酵种子液；
（4）扩大发酵：机械破碎秸秆后，按照秸秆: 制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，48h后捞出；再按照秸秆: 制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，在制浆黑液添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，按照杏鲍菇菌菇渣300g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L，配制成发酵液，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到100L的发酵液罐中，发酵16h；
(5) 黄腐酸的提取：在步骤(4)中发酵液，用浓硫酸调至pH值为1.8，静置1h，板式过滤器过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。
实施方案二：
（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD 平板培养基上30℃培养活化；
（2）一级种子培养 ：按照平菇菌菇渣400g/L、玉米粉5g/L、蔗糖1g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于 1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm 下发酵24h；
（3）二级种子培养：按照平菇菌菇渣400g/L、玉米粉5g/L、蔗糖1g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制二级种子液，自然pH 值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵8h，得相应的发酵种子液；
（4）扩大发酵：机械破碎秸秆后，按照秸秆: 制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，48h后捞出；再按照秸秆: 制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，在制浆黑液添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，按照平菇菌菇渣400g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L，配制成发酵液，按照4％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到100L的发酵液罐中，发酵24h；
(5) 黄腐酸的提取：在步骤(4)中发酵液，用浓硫酸调至pH值为2.2，静置3h，膜过滤器过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。
实施实例三：
（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD 平板培养基上30℃培养活化；
（2）一级种子培养 ：按照金针菇菌菇渣350g/L、玉米粉3g/L、蔗糖0.8 g/L、NaCl10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于 1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm 下发酵24h；
（3）二级种子培养：按照金针菇菌菇渣350g/L、玉米粉3g/L、蔗糖0.8 g/L、NaCl10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制二级种子液，自然pH 值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵7h，得相应的发酵种子液；
（4）扩大发酵：机械破碎秸秆后，按照秸秆: 制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，48h后捞出；再按照秸秆: 制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，在制浆黑液添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，按照金针菇菌菇渣350g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L，配制成发酵液，按照3％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到100L的发酵液罐中，发酵20h；
(5) 黄腐酸的提取：在步骤(4)中发酵液，用浓硫酸调至pH值为2.0，静置2h，卧式离心机分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。
为了更加详细地描述本发明的产品优势，特以本发明一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法--采用多菌种混合发酵制浆黑液和秸秆复合反应物生产的黄腐酸与现有技术Ⅰ--生化黄腐酸菌肥复配工艺优化及应用研究生产的黄腐酸，即西北大学硕士学位论文《生化黄腐酸菌肥复配工艺优化及应用研究生产的黄腐酸》中所述的方法进行生产黄腐酸，以及现有技术Ⅱ--国家发明专利201110058374.5，利用稻草生产黄腐酸的方法生产的黄腐酸进行对比，试验结果如下：
表1 本工艺与现有技术Ⅰ和现有技术Ⅱ对比
试验组 转化率 能耗 环境污染 成本
本法 33% 低 低 低
现有技术Ⅰ 17% 低 低 高
现有技术Ⅱ 28% 高 高 中
以上数据分析可知：
（1）本法与现有技术Ⅰ对比可知：本发明工艺和现有技术Ⅰ生产的黄腐酸，均采用了菌渣作为天然碳源，实现了废物的利用，本法的黄腐酸转化率达到了33%，高于现有技术Ⅰ公开的17%的转化率；本发明与现有技术Ⅰ均未使用大规模的化学处理方式，对环境均未造成较高的污染，由于现有技术Ⅰ只是用了菌渣作为碳源，相对于本发明秸秆的复合使用成本较高；
（2）本发明与现有技术Ⅱ对比可知：本发明工艺不仅采用了秸秆作为天然碳源，实现了废物的利用，而且采用了菌渣和秸秆复合反应物作为天然碳源，减少了无机碳源的使用，降低了生产成本；而现有技术Ⅱ采用了氧化钙，为化学处理方式处理秸秆，对环境造成较高的污染，而本发明巧妙地利用了草浆黑液的碱性环境处理秸秆，真正实现了废物的多次利用和低污染，同时本发明的黄腐酸转化率达到了33%，高于现有技术Ⅱ公开的28%的转化率；
因此，本工艺生产的黄腐酸与现有技术的黄腐酸在转化率、成本和环境污染上均具有显著性的优势。
为了进一步详细地描述本发明的复合菌种混合发酵的显著进步，特以本发明采用混合菌发酵生产黄腐酸的方法和相同工艺采用单一菌种发酵生产黄腐酸的方法进行对比，
1.本发明采用混合菌，即枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉混合发酵生产黄腐酸，此试验组为A1,对黄腐酸含量进行测定；
2.采用单一菌种热带假丝酵母，进行发酵生产黄腐酸，此试验组为A2,对黄腐酸含量进行测定；
3.采用单一菌种枯草芽孢杆菌，进行发酵生产黄腐酸，此试验组为A3,对黄腐酸含量进行测定；
4.采用单一菌种黑曲霉，进行发酵生产黄腐酸，此试验组为A4,对黄腐酸含量进行测定；试验结果如下：
表2 复合菌种混合发酵和单一菌种发酵对比
试验组 菌种 种子罐 辅酶添加 转化率
A1 混合菌种 二级 是 32.6%
A2 热带假丝酵母 二级 是 15%
A3 枯草芽孢杆菌 二级 是 18%
A4 黑曲霉 二级 是 10%
以上数据分析可知：相同工艺的混合菌种发酵比单一菌种发酵在黄腐酸转化率上具有显著性优势，这与复合菌种对于纤维素的降解具有协同作用有关，纤维素的降解给黄腐酸的转换提供了能量和原料，从而促进了黄腐酸的转化。
综上所述：本发明采用混合菌种发酵利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应，与菌菇渣作为发酵原料生产黄腐酸，减少了氧化钙的使用，降低了成本，真正实现了废物的多次利用和低污染，减少了环境的污染；混合菌发酵法采用了两级的种子培养，二级种子培养中采用了玉米粉和菌菇渣作为天然碳源，为菌种生长提供了过度环境，并添加了多种辅酶，使菌体能够快速适应环境并迅速的增殖；混合菌发酵利用了多种菌体的协同作用，充分的发挥了培养液的作用，很大程度地提高了黄腐酸的转化率。

Claims (5)

1.一种混合菌发酵法生产黄腐酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌株发酵：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉分别接种于YPD 平板培养基上30℃培养活化；
（2）一级种子培养 ：按照菌菇渣（300-400）g/L、玉米粉（4-8）g/L、蔗糖（1.0-1.5）g/L、NaCl 15g/L、MgSO4·7H2O 8g/L、KH2PO4 6g/L、(NH4)2HPO4 4.5g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于 1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm 下发酵24h；
（3）二级种子培养：按照菌菇渣（300-400）g/L、玉米粉（1-5）g/L、蔗糖（0.5-1）g/L、NaCl10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L、KH2PO4 3g/L、(NH4)2HPO4 2g/L，配制二级种子液，自然pH 值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液；
（4）扩大发酵：机械破碎秸秆后，按照秸秆: 制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，24～48h后捞出；再按照秸秆: 制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H3PO4或HNO3，调PH至中性，按照菌菇渣（300-400）g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 4g/L，配制成发酵液，按照2-4％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到100L的发酵液罐中，发酵16-24小时停止发酵；并在发酵过程中添加辅酶；
(5) 黄腐酸的提取：在步骤(4)中发酵液，用浓硫酸调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌菇渣为平菇、杏鲍菇、金针菇或白玉菇中的一种或多种。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二级种子培养的枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的接种量之比为4-6：6-7：5-6。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的菌菇渣能够替换成酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆粕水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一种或多种。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄腐酸的提取工艺中的分离方式采用：离心机或板式过滤器或膜过滤器。
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CN1467180A (zh) * 2002-07-12 2004-01-14 陈五岭 微生物发酵甜高粱秸秆生产生化黄腐酸复合生物菌肥方法
CN102650109A (zh) * 2012-04-23 2012-08-29 刘彦坤 利用复合微生物将制浆黑液转化为含黄腐酸和氨基酸粉体的方法
CN105331669A (zh) * 2015-10-22 2016-02-17 山东大学 利用工业化生产食用菌废弃菌渣发酵提取黄腐酸的新方法

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