CN110305793A - 枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂及其配方的优化方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂及其配方的优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂，包括以下组分：海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉，且以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的添加比例为4％‑12％，蔗糖的添加比例为3％‑7％，脱脂奶粉的添加比例为2％‑8％，且海藻糖的最佳添加比例为9.0％，蔗糖的最佳添加比例为5.0％，脱脂奶粉的最佳添加比例为6.8％。本发明还公开了枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法，包括如下步骤：(1)单一抗热保护剂的优化筛选；(2)复合抗热保护剂组分添加比例的响应面法试验设计与优化。该枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂应用于喷雾干燥技术以制作枯草芽孢杆菌菌粉时，可较好的实现对枯草芽孢杆菌的抗热保护，极大的提高菌体存活率，菌体存活率可到95％以上。

Description

枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂及其配方的优化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂及其配方的优化方法。
背景技术
益生菌(probiotics)是指具有维持人体内菌群平衡，对人体健康产生有益作用的微生态制剂。口服足量活性益生菌有助于缓解急慢性胃肠炎、治疗腹泄、改善消化，缓解乳糖不耐症等症状，在减少病原菌在肠内定植和生长、提升免疫力、缓解神经发育障碍等方面具有显著功能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是益生菌的重要来源之一，其活菌制剂口服液可用于肠炎、支气管炎和腹泻等疾病治疗和预防。近年来，益生菌固态制剂因储存运输便利、质量控制好及生产便捷而受到广泛关注，然而，关于高生物活性和高存活率的固态制剂的保存研究鲜见。喷雾干燥由于受热时间短、料温低和生理活性物质活性损失小而广泛应用于益生菌菌体干燥，具有干燥时间极短，产品分散性和溶解性好，生产过程简单，设备成本低等优点，特别适用于工业化连续生产。研制高活性益生菌固态制剂的关键就是抗热保护剂的选择与使用，保护剂的使用能减轻喷雾干燥热损伤和脱水干燥对益生菌亚细胞结构与胞内生物大分子及细胞器的破坏。因此，针对枯草芽孢杆菌复合抗热保护剂的研究显得极为重要。
常用抗热保护剂有低聚糖、糖醇、蛋白质、多肽和多糖等。低聚糖等小分子保护剂为多羟基化合物，具有很好的亲水性，可与细胞膜磷脂或蛋白质极性基团形成氢键或水化层，保护细胞膜、细胞器膜及胞内生物大分子结构的完整性，而蛋白质等大分子保护剂则主要通过“包埋”形成天然“隔热屏障”，两种保护剂的保护机制不同，可联合使用。研究表明，单一保护剂相比未添加保护剂能增强益生菌菌体热耐受性，复合保护剂抗热保护效果则更好。目前，抗热保护剂以单一抗热保护剂应用较多，而现有抗热保护剂所达到的抗热保护效果不理想，复合抗热保护剂的应用较少，特别是针对枯草芽孢杆菌抗热保护剂的研究较少，不能很好的提高枯草芽孢杆菌的菌体存活率，对枯草芽孢杆菌益生菌的生产形成一定的制约。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂及其配方的优化方法，通过优化分析方法得到复合抗热保护剂的组分和最佳配比，该枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂应用于喷雾干燥技术以制备枯草芽孢杆菌菌粉时，可较好的实现对枯草芽孢杆菌的抗热保护，极大的提高菌体存活率，菌体存活率可达到95％以上。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂，包括以下组分：海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉，且以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的添加比例为4％～12％，蔗糖的添加比例为3％～7％，脱脂奶粉的添加比例为2％～8％。
优选的，以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的最佳添加比例为9.0％，蔗糖的最佳添加比例为5.0％，脱脂奶粉的最佳添加比例为6.8％。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的配方的优化方法，包括以下步骤：
(1)单一抗热保护剂的优化筛选
选取多种糖类保护剂和多种蛋白质类保护剂作为抗热保护剂，以菌体存活率为评价指标，对每种抗热保护剂针对的菌体存活率最高的组和不加任何保护剂的对照组进行均数差异多重比较，以对单一抗热保护剂进行优选；
(2)复合抗热保护剂组分添加比例的响应面法试验设计与优化
根据单一抗热保护剂的优选结果，选择海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉联用作为复合抗热保护剂，并利用中心复合响应面优化技术对海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉的添加量进行配比优化，包括如下步骤：
a、试验设计安排
针对海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例三个因素，选取参数水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案；
b、优选数学模型及构建数学模型
以步骤a的试验设计方案中的菌体存活率数据为评价参数进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型；再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验数据进行多元非线性回归拟合以构建回归方程，该回归方程是以海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例为自变量，以菌体存活率为响应值；该回归方程最高阶为二阶，含交互作用项及一次项；
c、回归方程验证与诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性；
d、基于回归方程计算最优解
将所构建的回归方程分别对各自变量求偏导数，并令其等于零，联立可得到三元一次方程组，通过规划求解可求出该回归方程的编码水平最优解，再将编码值转换为实际值，得到海藻糖的最佳添加比例、蔗糖的最佳添加比例以及脱脂奶粉的最佳添加比例；
e、复合抗热保护剂优化组合验证
对优选的枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂最优配方及组成配比进行验证试验，并将验证试验结果与模型预测理论值进行对比分析，确定复合抗热保护剂对枯草芽孢杆菌益生菌的保护效果。
优选的，步骤b中的序贯分析所针对的模型包括一阶线性数学模型、二因素交互关系模型、二阶数学模型和三阶数学模型。
优选的，步骤c中的数学分析方法包括方差分析、残差分析和降维分析。
优选的，步骤a中，针对海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例三个因素，每个因素设计5个水平，分别以0，±1，±1.682编码，以菌体存活率为响应值，设计3因素5水平试验。
本发明的有益效果是：本发明通过单一抗热保护剂的优化筛选步骤优选出海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉联用作为复合抗热保护剂，通过响应面法优化设计得到每个因素的添加范围，通过响应面优化技术的序贯分析优选数学模型且构建回归方程，然后通过回归方程得到最优解，以获得海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉三者相对于菌悬液体积的各自最佳添加量，最终获得本发明的枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的最优配方。本发明的枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂中的各组分之间通过其合理的配比可以起到较好的协同作用，其应用于喷雾干燥技术以制作枯草芽孢杆菌益生菌菌粉时，可较好的实现对枯草芽孢杆菌的抗热保护，极大的提高菌体存活率，有利于喷雾干燥技术的制备过程，保证枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的质量和生理功能。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法的流程图。
图2为本发明枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法中单一抗热保护剂的优化筛选步骤所得的单一抗热保护剂对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图表。
图3为本发明枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法中残差分析所得的内部t化残差图(A)和内部t化残差正态分布概率图(B)。
图4至图6为本发明枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法中降维分析所得的各交互作用响应面图。
图7至图9为本发明枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法中降维分析所得的各交互作用等高线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施方式进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明公开的一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂，包括以下组分：海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉，且添加量是以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准来计算所添加的抗热保护剂的质量，海藻糖的添加比例(w/v)为4％～12％，蔗糖的添加比例(w/v)为3％～7％，脱脂奶粉的添加比例(w/v)为2％～8％。
上述枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂中，以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的最佳添加比例为9.0％，蔗糖的最佳添加比例为5.0％，脱脂奶粉的最佳添加比例为6.8％。
枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂应用于喷雾干燥工艺制备枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的过程为：将冷冻保存(-18℃)的枯草芽孢杆菌菌种转接于斜面活化培养基中，37℃恒温培养24h；活化完成后，用接种环从斜面刮取两环菌种接种至种子培养基(装瓶量100mL/250mL)，37℃，120r/min恒温振荡培养24h；按5％(v/v)接种量将种子液接种于发酵罐中，37℃，120r/min恒温培养至稳定期(36h)；4000r/min离心15min，弃上清液，沉淀用无菌水洗涤并重新悬浮，上述操作重复3次，菌体浓度超过1.0×108CFU/mL；菌悬液于55℃热诱激10min，并按预定百分比例(w/v，以菌悬液体积为基准)加入抗热保护剂，充分混匀后再进行喷雾干燥制备菌粉。喷雾干燥条件为：进风温度90℃、进料速率500mL/h、通风量60m3/h、出口温度为50℃。在以下的试验中，以菌体存活率为评价指标来获得复合抗热保护剂的最优配方，菌体存活率的计算公式为：
在以下的试验中，菌体存活率均是通过同样的喷雾干燥工艺条件获得。
本发明实施例公开了该枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的配方的优化方法，包括如图1所示的步骤。
步骤一，单一抗热保护剂的优化筛选
考察了糖类和蛋白质类抗热保护剂对菌体存活率的影响，以未添加抗热保护剂的菌体存活率作对照，结果如图2所示；其中，糖类保护剂包括海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、麦芽糖和蔗糖，蛋白质类保护剂包括脱脱奶粉、乳清粉、大豆蛋白和蛋清粉。
在该试验中，保护剂用量(配比)为质量与体积之比，以菌悬液体积为基准进行添加；该试验中的数据处理采用(n＝3)，即利用算数平均值±标准差的方式进行处理，采用SPSS Statistics25进行单因素方差分析，选用LSD检验进行均值多重比较，显著性水平选用α＝0.05；p<0.05为差异显著，p>0.05为差异不显著。均数多重比较仅比较了每种单一保护剂所对应的菌体存活率最高的一组与没有添加保护剂的对照组的差异显著性；图1中，字母相同者表示两者之间差异不显著(p>0.05)，不同字母表示两者之间差异显著(p<0.05)。
由图2可看出，糖类保护剂与对照相比均存在显著性差异(p<0.05)，说明糖类保护剂对菌体有较好的抗热保护作用，特别是海藻糖(8％)和蔗糖(5％)，其菌体存活率分别为80.92±0.17％和80.29±0.46％，两者差异不显著(p<0.05)，但与其它糖类保护剂存在显著性差异(p<0.05)。甘露醇(8％)、山梨醇(8％)和麦芽糖(5％)之间菌体存活率差异不显著(p<0.05)，与乳糖组(5％)有显著性差异(p<0.05)；蛋白质类抗热保护剂与对照组相比也存在显著性差异(p<0.05)，以脱脂奶粉(5％)菌体存活率最高(81.36±0.23％)；乳清粉(5％)、大豆蛋白(5％)和蛋清粉(5％)之间差异不显著(p>0.05)，但与脱脂奶粉(8％)组均有显著性差异(p<0.05)；糖类保护剂与蛋白质类保护剂相比，脱脂奶粉(5％)与海藻糖(8％)和蔗糖(5％)差异不显著(p>0.05)。总体来说，蛋白质抗热保护剂保护效果相对较好。
糖类和蛋白质类抗热保护剂联用对益生菌菌体能起到更好的抗热保护，具有不同的保护机制不同。糖类物质主要通过结构中的羟基与细胞膜、细胞器膜或蛋白质极性基团形成众多氢键或在蛋白质表面形成水化层，从而保护细胞(器)膜及蛋白质生物大分子的结构稳定性。海藻糖化学结构中的羟基可以极性基团形成氢键，代替极性基团周围丢失的水分子，形成水化层，维持生物大分子天然结构与细胞(器)膜的完整性；糖类保护剂还可起到渗透保护；蛋白质类保护剂则主要通过“包埋”在菌体表面形成“隔热屏障”，实现抗热保护。脱脂奶粉多孔结构可使菌体干燥过程中失水更容易。鉴于脱脂奶粉、蔗糖和海藻糖组菌体存活率相对较高，且糖类与蛋白质类保护剂的抗热保护机制不同，为充分发挥复合抗热保护剂的保护效果，选择海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉联用作为复合抗热保护剂，以进一步提高菌体抗热保护效果。
步骤二，复合抗热保护剂组分添加比例的响应面法试验设计与优化
根据单一抗热保护剂的优选结果，选择海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉联用作为复合抗热保护剂，并利用中心复合响应面优化技术对海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉的添加量进行配比优化，包括如下步骤：
a、试验设计安排
针对海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例三个因素，选取参数水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案。
具体地，针对海藻糖的配比、蔗糖的配比以及脱脂奶粉的配比三个因素，每个因素设计5个水平，即±r(上下星号臂)，±1(上下水平点)和0(本试验中心点设置6个)。本试验星号臂r＝1.682，研究海藻糖(X1)、蔗糖(X2)和脱脂奶粉(X3)三者的配比对菌体存活率的影响，试验因素水平与编码如表1所示。
表1中心复合响应面优化设计因素水平与编码
说明:r＝1.682，x为编码值，X为实际试验值，j代表不同因素。X0＝(X-1j+X+1j)/2，X-1j为下水平实际试验值，X+1j为上水平实际试验值；变化区间Δj＝(Xrj-X0)/r，Xrj为上星号臂对应的实际试验值，编码线性变换xj＝(Xj-X0)/Δj。
具体的试验安排与试验结果(含模型预测值)如表2所示。
表2中心复合响应面优化试验设计结果(含预测值)
b、优选数学模型及构建数学模型
以步骤a的试验设计方案中的菌体存活率数据为评价参数进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型；再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验数据进行多元非线性回归拟合以构建回归方程，该回归方程是以海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例为自变量，以菌体存活率为响应值(因变量)；各数学模型构建的序贯分析结果如表3所示。
表3数学模型构建的序贯分析
说明：**表示差异极显著(p<0.01)；*表示差异显著(0.01<p<0.05)；ns表示差异不显著(p>0.05)。
由表3可看出，一阶线性数学模型显著性分析为显著(p<0.05)、二因素交互关系模型不显著(p>0.05)，但模型失拟项均极显著(p<0.01)，说明用这两个数学模型进行数据拟合效果较差，需要用更高阶数学模拟进行数据拟合。二阶数学模型显著性分析为极显著(p<0.01)，失拟项不显著(p＝0.8351>0.05)，说明用二阶数学模型进行数据拟合和结果预测是可行性，不会造成数据失真。模型AdjR2＝0.9901，说明模型可解释总变异的99.01％。三阶数学模型不显著(p>0.05)，不宜用于数据拟合，且三阶数学模型回归方程较为复杂，应用受限。因此，选择二阶非线性回归方程对数据进行拟合。对表2数据进行拟合，可求出影响因素的一次、二次及交互效应关联方程(回归方程)，即：y＝94.22+6.53x1+3.80x2+2.01x3-3.56x1x2+0.22x1x3-2.09x2x3-8.01x1 2-5.32x2 2-0.89x3 2，该回归方程是以海藻糖的配比(X1)、蔗糖的配比(X2)以及脱脂奶粉的配比(X3)为自变量，以菌体存活率为响应值。
c、回归方程验证与诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性。
其中，该数学分析方法包括方差分析、残差分析和降维分析。
①方差分析
步骤b所确定的二阶数学模型的方差分析与回归分析结果如表4所示。
表4数学模型方差分析与回归分析表
说明：**表示差异极显著(p<0.01)；*表示差异显著(0.01<p<0.05)；ns表示差异不显著(p>0.05)。
由表4可看出，模型极显著(p<0.01)。模型信躁比(SNR)是评价和应用模型进行数据拟合和评价结果预测受干扰的程度，常要求SNR>4。本模型SNR＝45.497>>4，说明模型抗干扰较好；模型变异系数(C.V)是衡量模型精密度和可靠性的重要评价指标，数值越小表示模型精密度越高，本模型C.V＝1.27％，表明模型可靠。各阶系数显著性分析发现，模型一次项X1，X2，X3，交互作用项X1X2，X2X3以及二次项X1 2，X2 2影响极显著(p<0.01)，交互项X1X3影响不显著(p>0.05)，二次项X3 2影响显著(0.01<p<0.05)。该结果表明，所确定的二阶数学模型是可靠的，各阶系数的显著性分析也与所构建的回归方程中的各项系数值的相对大小是一致的。
②残差分析
残差分析是诊断数学模型正确与否的重要评价手段，是基于模型无法解释全部变异理论基础上进行的。若模型选择合适，残差呈随机均匀分布。由图3可看出，预测值残差呈随机分布，方差齐性符合要求。合理模型还要求残差要呈正态概率分布。由图3还可看出，残差分布呈正态性且相互独立。残差分析的结果表明，所确定的二阶数学模型是合理的。
③降维分析(交互作用分析)
观察两因素交互作用对响应值的影响可采用降维分析(DRA)，即其它因素保持在零水平情况下，观察两个因素交互作用对响应值的影响并得到其响应面图和等高线图。如图4至图6为响应面图，如图7至图9为等高线图。等高线图能直观反映因素交互作用对响应值的影响，圆形表示因素间交互作用不明显，椭圆形则表示交互作用显著。响应面图的曲线越陡，说明交互作用越明显。由各响应面图和等高线图可以看出，交互作用项X1X2，X2X3影响极显著(p<0.01)，而X1X3影响不显著(p>0.05)，与方差分析中所得的交互作用项的显著性分析结果一致。
d、基于回归方程计算最优解
将所构建的回归方程分别对各自变量求偏导数，并令其等于零，联立可得到三元一次方程组，通过规划求解可求出该回归方程的编码水平最优解，即x1＝0.41，x2＝0.02，x3＝1.00，再将编码值转换为实际值，即对应因素实际水平为海藻糖8.9758％、蔗糖5.0238％及脱脂奶粉6.78％。
e、复合抗热保护剂优化组合验证
对优选的枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂最优配方及组成配比进行验证试验，并将验证试验结果与模型预测理论值进行对比分析，确定复合抗热保护剂对枯草芽孢杆菌益生菌的保护效果。
为操作方便，将各保护剂添加量修约为海藻糖9.0％、蔗糖5.0％和脱脂奶粉6.8％。最优条件下验证试验菌体存活率为95.24±0.84％(n＝3)，与模型预测值96.7621％接近，偏差为-1.57％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂，其特征在于，包括以下组分：海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉，且以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的添加比例为4％～12％，蔗糖的添加比例为3％～7％，脱脂奶粉的添加比例为2％～8％。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂，其特征在于，以枯草芽孢杆菌的菌悬液的体积为基准，海藻糖的最佳添加比例为9.0％，蔗糖的最佳添加比例为5.0％，脱脂奶粉的最佳添加比例为6.8％。
3.一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂配方的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)单一抗热保护剂的优化筛选
选取多种糖类保护剂和多种蛋白质类保护剂作为抗热保护剂，以菌体存活率为评价指标，对每种抗热保护剂针对的菌体存活率最高的组和不加任何保护剂的对照组进行均数差异多重比较，以对单一抗热保护剂进行优选；
(2)复合抗热保护剂组分添加比例的响应面法试验设计与优化
根据单一抗热保护剂的优选结果，选择海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉联用作为复合抗热保护剂，并利用中心复合响应面优化技术对海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉的添加量进行配比优化，包括如下步骤：
a、试验设计安排
针对海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例三个因素，选取参数水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案；
b、优选数学模型及构建数学模型
以步骤a的试验设计方案中的菌体存活率数据为评价参数进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型；再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验数据进行多元非线性回归拟合以构建回归方程，该回归方程是以海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例为自变量，以菌体存活率为响应值；该回归方程最高阶为二阶，含交互作用项及一次项；
c、回归方程验证与诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性；
d、基于回归方程计算最优解
将所构建的回归方程分别对各自变量求偏导数，并令其等于零，联立可得到三元一次方程组，通过规划求解可求出该回归方程的编码水平最优解，再将编码值转换为实际值，得到海藻糖的最佳添加比例、蔗糖的最佳添加比例以及脱脂奶粉的最佳添加比例；
e、复合抗热保护剂优化组合验证
对优选的枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂最优配方及组成配比进行验证试验，并将验证试验结果与模型预测理论值进行对比分析，确定复合抗热保护剂对枯草芽孢杆菌益生菌的保护效果。
4.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的配方的优化方法，步骤b中的序贯分析所针对的模型包括一阶线性数学模型、二因素交互关系模型、二阶数学模型和三阶数学模型。
5.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的配方的优化方法，其特征在于，步骤c中的数学分析方法包括方差分析、残差分析和降维分析。
6.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌复合抗热保护剂的配方的优化方法，其特征在于，步骤a中，针对海藻糖的添加比例、蔗糖的添加比例以及脱脂奶粉的添加比例三个因素，每个因素设计5个水平，分别以0，±1，±1.682编码，以菌体存活率为响应值，设计3因素5水平试验。
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