CN110150670A - 枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺及优化方法 - Google Patents
枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺及优化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化与种子液制备；(2)菌悬液制备；(3)热诱激预处理与复合抗热保护剂的添加：(3)喷雾干燥制备益生菌菌粉。喷雾干燥过程为：将添加有复合抗热保护剂的枯草芽孢杆菌菌悬液加入到喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，喷雾干燥参数为：入口温度为100℃，进料速率为600ml/h，进风量为80m3/h及出口温度为52℃。本发明还公开了喷雾干燥制备工艺的优化方法。该喷雾干燥制备工艺所制备的枯草芽孢杆菌菌粉的菌体存活率较高，菌体存活率超过95％，且本发明通过优化分析设计对喷雾干燥工艺进行参数的优化，从而通过最优工艺参数的配合，实现高存活率的菌粉的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺及优化方法。
背景技术
益生菌(probiotics)是指具有维持人体内菌群平衡，对人体健康产生有益作用的微生态制剂。口服足量活性益生菌有助于缓解急慢性胃肠炎，治疗腹泄，改善消化，缓解乳糖不耐症等症状，在减少病原菌在肠内定植和生长、提升免疫力、缓解神经发育障碍等方面具有显著功能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种理想的益生菌，能高效分泌胞外蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以及其他益生代谢物，具有有效调节人体肠道菌群平衡、提高生长性能、增强免疫力和安全性高等功能。枯草芽孢杆菌益生菌粉剂中的内生孢子进入肠道后，在肠上部能定植并增殖，并能形成对肠道致病微生物具有拮抗作用的短杆菌肽等多肽类活性成分，对致病菌或内源性感染起到抑菌和预防作用；此外，枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高机体免疫力，枯草芽孢杆菌活菌制剂口服液可作为肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病的治疗，也可用于预防和治疗烧伤面感染，因此，研究枯草芽孢杆菌益生菌粉的制备方法具有非常重要的作用。
目前，微生物菌体的干燥可采用真空冷冻干燥法、喷雾冷冻干燥法、喷雾干燥法和流化床干燥等方法进行。真空冷冻干燥作为目前多数微生物干燥的主要方法，虽然对菌体和菌体内的活性生物大分子保存较完备，也适用于热敏性和对热敏感的微生物，但易受预冻温度、冷冻速度和真空度等因素的影响，耗时较长，费用较高，应用受限；而喷雾冷冻干燥虽能耗低，符合低碳要求，干燥成品呈颗粒状，不需重新粉碎，但同样存在费用较高，应用也受限；流化床干燥以热空气作为流化介质干燥菌体，被干燥的物料在气流中被吹起、翻滚、相互混合和摩擦碰撞，通过传热传质达到菌体干燥的目的，但干燥时间相对较长，当物料停留时间不均匀时，有可能发生未经干燥的物料随产品一起排出床层等异常情况。因此，上述微生物菌体干燥方法均存在不同类型的诟病。喷雾干燥是直接将制备好的菌悬液经过雾化装置喷雾成雾状，在干燥室内与高温空气直接接触进行传热传质，由于枯草芽孢杆菌颗粒小(0.7～0.8×2～3μm)，与热空气接触面巨大，因此干燥时间极短(约5-10s)，物料温度较低，产品分散性和溶解性较好，生产过程简单，设备相对成本较低，特别适用于工业化连续生产。
喷雾过程中热处理和脱水干燥易引起益生菌菌体的细胞膜或胞内生物大分子的热损伤，为了提升益生菌菌体的存活率，除添加抗热保护剂外，对喷雾干燥工艺进行优化也是重要的策略，为了更好的提高喷雾干燥制备工艺所制得的菌粉的菌体存活率，需要对工艺参数进行优化。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺及优化方法，该喷雾干燥制备工艺所制备的枯草芽孢杆菌菌粉的菌体存活率较高，菌体存活率超过了95％，且本发明通过优化分析设计对喷雾干燥工艺进行参数的优化，从而通过最优工艺参数的配合，实现高存活率的菌粉的制备。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，包括如下步骤：
(1)菌种活化与种子液制备：将冷冻保存(-18℃)的枯草芽孢杆菌菌种转接于斜面活化培养基中，37℃的恒温下培养24h；活化完成后，用接种环从斜面活化培养基上刮取两环菌种接种至种子培养基，37℃恒温振荡培养24h，制得种子液；
(2)菌悬液制备：按5％的接种量将种子液接种于发酵罐中，利用发酵培养基37℃恒温培养48h，收集培养至稳定期(36h)的发酵液，离心处理后，弃上清液，沉淀用无菌水洗涤并重新悬浮，上述操作重复多次后，制得菌悬液，菌悬液菌体浓度超过1×108CFU/mL；
(3)热诱激预处理与复合抗热保护剂的添加：将处于稳定期的枯草芽孢杆菌的菌悬液进行热诱激预处理，然后以菌悬液体积为基准，按预定比例加入复合抗热保护剂，充分混匀并溶解；
(4)喷雾干燥制备益生菌菌粉：将添加有复合抗热保护剂的菌悬液加入到喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，制得枯草芽孢杆菌益生菌菌粉，其中，喷雾干燥过程中，入口温度为100℃，进料速率为600ml/h，进风量为80m3/h及出口温度为52℃。
优选的，步骤(1)中的菌种斜面活化和种子培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。
优选的，步骤(2)中的发酵培养基的组成为：冷榨花生粕蛋白胨12g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L，该发酵培养基的pH为7.4。
优选的，所述步骤(3)中的热诱激预处理的温度为55℃，热诱激的时间为10min。
优选的，以菌悬液体积为基准，步骤(3)中加入的复合抗热保护剂的用量为0～20％。
优选的，步骤(3)中加入的复合抗热保护剂包括海藻糖、蔗糖、脱脂奶粉，且三者的用量比为海藻糖：蔗糖：脱脂奶粉＝0.43:0.34:0.23。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺的优化方法，包括以下步骤：
步骤一，单因素试验
选取制备工艺中的复合抗热保护剂用量、喷雾干燥过程的入口温度、进料速率、进风量和出口温度为因素，以菌体存活率为评价指标，分别研究每个因素对菌体存活率影响的显著性，以优选重要影响因素；
步骤二，响应面法优化设计
根据单因素试验中所得的各因素对菌体存活率影响的显著性分析结果，确定进料速率、进风量和出口温度为重要因素，应用中心复合响应面优化试验设计进一步分析该三个因素对菌体存活率的影响；
a、试验方案设计
基于单因素试验结果，针对进料速率、进风量以及出口温度三个因素，选取各因素水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案；
b、序贯分析优选数学模型与模型构建
对步骤a设计的响应面优化设计方案，以菌体存活率为评价指标进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型，再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验设计数据进行拟合，构建回归方程，该回归方程是以进料速率、进风量和出口温度为自变量，以菌体存活率为响应值；
c、模型诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性；
d、基于模型求最优解与模型验证
应用Design Expert优化模块求得回归方程的编码水平最优解，再将编码值转换为实际值，得到喷雾干燥制备工艺的最优参数，然后对模型优化的试验参数进行验证试验，以验证模型的正确性。
优选的，步骤b中的序贯分析所针对的模型包括一阶线性数学模型、二因素交互关系模型、二阶数学模型和三阶数学模型。
优选的，步骤a中，针对进料速率、进风量和出口温度三个因素，每个因素设计5个水平，分别以0，±1，±1.682编码，以菌体存活率为响应值，设计3因素5水平试验。
本发明的有益效果是：
本发明的制备工艺中的喷雾干燥过程首先对菌悬液进行热诱激处理，通过热诱激处理可以增强菌体的耐热性；同时，在喷雾干燥过程中，在菌悬液中加入复合抗热保护剂，进一步提高菌体的耐热性，且复合抗热保护剂是由海藻糖、蔗糖和脱脂奶粉复配而成，三者之间可以起到较好的协同作用；本发明的喷雾干燥过程采用了合理的工艺参数，从而有利于干燥过程的完成，利于菌体的雾化、干燥，保证合理的菌体热接触时间，最终可以制得具有较高菌体存活率的枯草芽孢杆菌益生菌菌粉；本发明通过合理的培养基对菌种进行活化、培养和发酵，并通过喷雾干燥过程中的热诱激处理、复合抗热保护剂的保护以及喷雾干燥工艺参数三者之间的共同配合，最终制得的枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的菌体存活率得到了极大的提高，菌粉的品质得以提高。
本发明的优化方法通过单因素试验优选出进料速率、进风量和出口温度作为喷雾干燥过程的重要工艺参数，然后通过响应面优化技术设计试验方案，再利用序贯分析优选数学模型，并构建回归方程，然后通过回归方程得到最优解，以获得进料速率、进风量和出口温度的最优参数设计，通过该最优参数设计可以为喷雾干燥制备枯草芽孢杆菌益生菌菌粉提供理论与技术支持，有利于喷雾干燥制备工艺的完成，保证枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的最优品质。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺的流程图。
图2为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中单因素试验中的复合抗热保护剂用量对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图。
图3为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中单因素试验中的入口温度对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图。
图4为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中单因素试验中的进料速率对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图。
图5为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中单因素试验中的进风量对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图。
图6为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中单因素试验中的出口温度对枯草芽孢杆菌菌体存活率的影响结果图。
图7为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中残差分析所得的内部t化残差图。
图8为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中残差分析所得的t化残差正态分布概率图。
图9为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中的模型微扰曲线图。
图10至图12为本发明喷雾干燥制备工艺的优化方法中的各交互作用等高线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施方式进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1所示，本发明实施例公开的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，包括如下步骤：
(1)菌种活化与种子液制备：将冷冻保存(-18℃)的枯草芽孢杆菌菌种转接于斜面活化培养基中，37℃的恒温下培养24h；活化完成后，用接种环从斜面活化培养基上刮取两环菌种接种至种子培养基，37℃，120r/min恒温振荡培养24h，制得种子液；
上述步骤中的菌种斜面活化和种子培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，可以培养出活性很好的种子液。
(2)菌悬液制备：按5％的接种量(v/v，即种子液的体积与接种后的发酵培养液体积的比例)将种子液接种于发酵罐中，利用发酵培养基37℃恒温培养48h，收集培养至稳定期(培养36h)的发酵液，4000r/min离心15min，弃上清液，沉淀用无菌水洗涤并重新悬浮，上述操作重复3次后，制得菌悬液，菌悬液菌体浓度超过1×108CFU/mL；
上述步骤中，在进行恒温培养过程中，每间隔2h取出适量发酵液于600nm波长下测定吸光值，以培养时间为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制菌体生长曲线，确定菌体对数生长期和稳定期，以便于收集稳定期的发酵液。收集稳定期的发酵液是因为稳定期细胞比对数生长早、中期菌体热耐受性要好，菌体存活率较高。另外，在该步骤中的发酵培养基的组成为：冷榨花生粕蛋白胨12g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L，该发酵培养基的pH为7.4；利用该发酵培养基可以得到高品质的菌悬液。
(3)热诱激预处理与复合抗热保护剂的添加：将处于稳定期的枯草芽孢杆菌的菌悬液进行热诱激预处理，然后以菌悬液体积为基准，按预定比例加入复合抗热保护剂，充分混匀并溶解；
上述步骤(3)中，热诱激预处理的温度为55℃，热诱激的时间为10min。热诱激处理能提高菌体抗热能力，这是由于热诱激能够诱导菌体产生高度保守热应激蛋白，该热应激蛋白可以作为分子伴侣参与蛋白质合成、折叠、装配、运输和降解等生化过程，激发益生菌逆境下的热抵抗力。热诱激预处理的温度采用55℃，时间采用10min，不仅保证了较好的热诱激作用，又可以最大程度的减少热诱激温度对细胞膜、细胞壁、蛋白质及核糖体的损伤。
上述步骤(3)中，以菌悬液体积为基准，加入的复合抗热保护剂的用量为0～20％(w/v，质量体积比)，且加入的复合抗热保护剂是由海藻糖、蔗糖、脱脂奶粉复配而成，三者的用量比(w:w:w)为海藻糖：蔗糖：脱脂奶粉＝0.43:0.34:0.23。
(4)喷雾干燥制备益生菌菌粉：将添加有复合抗热保护剂的菌悬液加入到喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，制得枯草芽孢杆菌益生菌菌粉，其中，喷雾干燥过程中，入口温度为100℃，进料速率为600ml/h，进风量为80m3/h及出口温度为52℃。
枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的上述喷雾干燥制备工艺的优化方法，包括如下步骤：
在以下的试验中，菌体存活率的计算公式如下：
步骤一，单因素试验
选取制备工艺中的复合抗热保护剂用量、喷雾干燥过程的入口温度、进料速率、进风量和出口温度为因素，以菌体存活率为评价指标，分别研究每个因素对菌体存活率影响的显著性，以优选重要影响因素；
①复合抗热保护剂用量的影响
该单因素试验是在喷雾干燥机的入口温度为80℃，进风量为50m3/h，出口温度为55℃，进料速率为400mL/h的条件下，测定菌体存活率和含水量，以菌体存活率为评价指标，考察复合抗热保护剂用量(0～20％，w/v)对喷雾干燥过程的影响。图2表示复合抗热保护剂用量对菌体存活率和含水量的影响，图2中标注相同字母表示差异不显著(p>0.05)，标注不同字母表示差异显著(0.01<p<0.05)或极显著(p<0.01)；小写字母对应显著性水平α＝0.05，大写字母对应显著性水平α＝0.01，以下相同。
由图2可看出，复合抗热保护剂在一定范围内，随着使用量的增加，喷雾干燥后菌体存活率呈上升趋势；复合抗热保护剂添加量15％与不添加保护剂(0％)相比，菌体存活率存在极显著差异(p<0.01)，菌体存活率达到最高(89.77±0.99％)，比未添加保护剂的对照存活率提高了91.78％，样品含水量为(5.82±0.05)％；复合抗热保护剂进一步增加时，菌体存活率反而下降，且样品含水量进一步增加，达到了(5.98±0.03)％。这主要是由于抗热保护剂添加过量时，喷雾干燥基质中含糖量较高，不利于菌体雾化，且料液黏度较大，干燥过程中水分失去速率较慢，使菌体热接触时间延长，菌体存活率呈下降趋势。因此，后续单因素试验中复合抗热保护剂添加量均设定为15％。
②入口温度的影响
该单因素试验是在复合抗热保护剂添加量为15％，喷雾干燥机的进风量为50m3/h，出口温度为55℃，进料速率为400mL/h条件下，以菌体存活率为评价指标，考察入口温度(60～140℃)对喷雾干燥的影响。由图3可以看出，入口温度60℃、80℃和100℃时，菌体存活率分别为(89.40±0.40)％、(89.15±0.28)％和(89.07±0.61)％，差异不显著(P>0.05)；入口温度为120℃和140℃时，菌体存活率分别为(78.85±0.71)％和(74.26±0.94)％，相比入口温度100℃时分别下降了11.47％和16.63％，菌体存活率差异极显著(p<0.01)。随着入口温度的提高，喷雾干燥菌体粉末的含水量也越低，存在极显著差异(p<0.01)；综合考虑到入口温度对菌体存活率、产品含水率的影响以及喷雾干燥过程温度差，后续单因素试验中喷雾干燥入口温度均为100℃。
③进料速率的影响
该单因素试验是在复合抗热保护剂添加量15％，喷雾干燥机的入口温度100℃，进风量50m3/h，出口温度55℃条件下，以菌体存活率为评价指标，考察进料速率(200～1000ml/h)对喷雾干燥的影响。由图4可看出，在200～600ml/h的进料速率范围内，随着进料速率的增加菌体存活率呈上升趋势，进料速率为600ml/h时，菌体存活率最高(92.31±0.93％)，与其它进料速率存在极显著差异(p<0.01)；进料速率提升至800ml/h和1000ml/h时，菌体存活率分别下降至(82.77±0.97)％和(73.69±1.40)％；研究还发现，随着进料速率提升，喷雾干燥产品的含水量呈线性上升趋势，表明进料速率较大时，产品干燥不完全。因此，进料速率宜选择600ml/h较好。鉴于进料速度对产品存活率有显著影响，其为重要因素，因此选定作为响应面因素进行进一步优化。
④进风量的影响
该单因素试验是在复合抗热保护剂添加量15％，喷雾干燥机的入口温度100℃，进料速率600mL/h，出口温度55℃条件下，以菌体存活率为评价指标，考察进风量(30～110m3/h)对喷雾干燥的影响。由图5可以看出，进风量在30～90m3/h范围内，随着进风量增加，菌体存活率呈上升趋势，主要是由于进风量增加，菌体干燥效果更好，喷雾干燥过程水分移除速率加快，有利于菌体干燥。进风量在30～90m3/h范围内，菌体存活率有极显著差异(p<0.01)；进风量90m3/h和110m3/h差异不显著(p>0.05)；进风量为90m3/h时，菌体存活率最高(92.33±0.57％)。因此，进风量选择90m3/h较好。鉴于进风量对菌体存活率有显著影响，为重要因素，选定作为响应面因素进行进一步优化。
⑤出口温度的影响
该单因素试验是在在复合抗热保护剂添加量15％，喷雾干燥机的入口温度100℃，进料速率600mL/h，进风量90m3/h条件下，以菌体存活率为评价指标，考察出口温度(50～70℃)对喷雾干燥的影响。由图6可看出，随着出口温度的提高，菌体存活率呈显著下降趋势；出口温度为50℃和55℃时菌体存活率差异不显著(p>0.05)，分别为93.36±0.58％和93.2±0.56％；随着温度的进一步提高，菌体存活率呈显著下降趋势；与出口温度55℃相比，存在极显著性差异(p<0.01)，特别是出口温度70℃(75.09±0.81％)，相比55℃时菌体存活率下降了19.43％。喷雾干燥温度64℃以下可引起细胞膜亚细胞结构损伤，超过65℃可引起细胞壁和蛋白质等细胞结构和生物大分子损伤，甚至引发核糖体不可逆损伤。因此，出口温度不宜过高。随着出口温度的提高，喷雾干燥后菌粉含水量呈显著下降趋势，除65℃和70℃之间喷雾干燥后菌粉含水量差异不显著(p>0.05)外，其它温度间差异均极显著(p<0.01)；综合考虑菌体存活率和含水量，选择出口温度为55℃较好。鉴于出口温度对菌体存活率有显著影响，为重要因素，选定作为响应面因素进行进一步优化。
步骤二，响应面法优化设计
根据单因素试验中所得的各因素对菌体存活率影响的显著性分析结果，确定进料速率、进风量和出口温度为重要因素，应用中心复合响应面优化试验设计进一步分析该三个因素对菌体存活率的影响。
a、试验方案设计
基于单因素试验结果，针对进料速率、进风量以及出口温度三个因素，选取各因素水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案。
具体的，针对进料速率、进风量和出口温度三个因素，每个因素设计5个水平，即±r(上下星号臂)，±1(上下水平点)和0(N＝3)。本试验星号臂r＝1.682，以菌体存活率(％)为响应值，试验因素水平和编码如表1所示。
表1中心复合响应面优化设计因素水平与编码
说明:r＝1.682，x为编码值，X为实际试验值，j代表不同的因素。X0＝(X-1j+X+1j)/2，X-1j为下水平实际试验值，X+1j为上水平实际试验值；变化区间Δj＝(Xrj-X0)/r，Xrj为上星号臂对应的实际试验值，编码线性变换xj＝(Xj-X0)/Δj。
具体的试验安排与试验结果(含模型预测值)如表2所示。
表2中心复合响应面优化试验设计结果(含模型预测值)
b、序贯分析优选模型与模型构建
对步骤a设计的响应面优化设计方案，以菌体存活率为评价指标进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型，再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验设计数据进行拟合，构建回归方程，该回归方程是以进料速率、进风量和出口温度为自变量，以菌体存活率为响应值；各数学模型构建的序贯分析结果如表3所示。
表3数学模型构建的序贯分析
说明：**表示差异极显著(p<0.01)；*表示差异显著(0.01<p<0.05)；ns表示差异不显著(p>0.05)。
由表3可看出，一阶线性数学模型与二因素交互关系模型均不显著(p>0.05)，且失拟项显著(p<0.05)，说明数据拟合效果差，需用更高阶数学模拟进行数据拟合；由表3可看出，二阶数学模型极显著(p<0.01)，失拟项不显著(p＝0.7731>0.05)，说明用二阶数学模型进行数据拟合和结果预测是可行性，不会造成数据失真。模型AdjR2＝0.9757，说明模型可解释总变异97.57％，仅有2.43％变异无法用模型解释。三阶数学模型不显著(p>0.05)，失拟项不显著(p＝0.7249>0.05)，不宜用于数据拟合，且三阶数学模型回归方程较为复杂，应用受限。因此选定二阶数学模型，并对表2数据进行二阶多元非线性回归拟合可求出回归方程，即：
y＝96.74+0.39x1-0.33x2-3.16x3+0.44x1x2+1.53x1x3-0.060x2x3-3.59x1 2-0.089x2 2-3.04x3 2。该回归方程是以进料速率(X1)、进风量(X2)以及出口温度(X3)为自变量，以菌体存活率为响应值。
c、模型诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性；
其中，该数学分析方法包括方差分析、残差分析、微扰曲线分析和交互作用分析。
1.方差分析
步骤b所确定的二阶数学模型的方差分析与回归分析结果如表4所示。
表4模型方差分析与回归分析表
由表4可看出，模型极显著(p<0.01)；模型信躁比是评价和应用模型进行数据拟合和结果预测受干扰的程度，数值越大，表明模型越抗干扰，常要求SNR>4。本模型SNR＝24.29>>4，说明模型噪音小，可靠性较高；模型变异系数(C.V)是衡量模型精密度和可靠性的重要评价指标，数值越小表示模型精密度越高，本模型C.V＝0.84％，数值较小，表明模型精密度和准确度均较高。各阶系数显著性分析发现，一次项X3、交互作用项X1X3及二次项X1 2，X3 2影响极显著(p<0.01)，X1、X2、X1X2、X2X3和X2 2影响不显著(p>0.05)。该结果表明，所确定的二阶数学模型是可靠的，各阶系数的显著性分析也与所构建的回归方程中的各项系数值的相对大小是一致的。
2.残差分析
残差分析是基于模型无法解释全部变异的理论基础上进行的。模型选择合适，残差呈随机均匀分布且呈正态概率分布。由图7和图8可看出，模型内部t化残差呈随机独立均匀分布且符合正态概率分布，说明模型残差是符合要求的。
3.微扰曲线分析
微扰曲线可在响应面优化曲面特定区域比较各试验因素对响应值的影响。如曲线陡直，则表明该因素对响应值敏感，若曲线平缓，则表明对响应值影响不敏感。由图9可以看出，因素X3(出口温度)对菌体存活率最敏感，为最重要因素，其次为X1(进料速率)，因素X2(进风量)曲线较为平缓，为最不重要因素，与上述方差分析中因素的显著性分析结果完全一致。
4.交互作用项影响分析
其它因素保持在中心水平时，观察两个因素交互作用对响应值的影响可得到其等高线图(图10至图12)。等高线图呈圆形表示因素间交互作用不明显，椭圆形则表示交互作用显著。由图10至图12可以看出，X1X3等高线图为椭圆形，影响极显著(p<0.01)，交互作用项X1X2和X2X3影响不显著(p>0.05)。与方差分析中所得的交互作用项的显著性分析结果一致。
d、基于模型求最优解与模型验证
应用Design Expert优化模块求得回归方程的编码水平最优解，即x1＝-0.12，x2＝-1，x3＝-0.54，经转换可得到因素实际水平为进料速率为592.87ml/h，进风量为78.11m3/h和出口温度为51.79℃。为操作方便，将优化后的喷雾干燥条件修约为进料速率600ml/h，进风量80m3/h和出口温度52℃，优化条件下验证试验结果为96.64±1.43％，与模型预测理论值97.8248％比较接近，偏差为-1.21％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化与种子液制备：将冷冻保存的枯草芽孢杆菌菌种转接于斜面活化培养基中，37℃的恒温下培养24h；活化完成后，用接种环从斜面活化培养基上刮取两环菌种接种至种子培养基，恒温振荡培养24h，制得种子液；
(2)菌悬液制备：按5％的接种量将种子液接种于发酵罐中，利用发酵培养基37℃恒温培养48h，收集培养至稳定期的发酵液，离心处理后，弃上清液，沉淀用无菌水洗涤并重新悬浮，上述操作重复多次后，制得菌悬液，菌悬液菌体浓度超过1×108CFU/mL；
(3)热诱激预处理与复合抗热保护剂的添加：将处于稳定期的枯草芽孢杆菌的菌悬液进行热诱激预处理，然后以菌悬液体积为基准，按预定比例加入复合抗热保护剂，充分混匀并溶解；
(4)喷雾干燥制备益生菌菌粉：将添加有复合抗热保护剂的菌悬液加入到喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，制得枯草芽孢杆菌益生菌菌粉，其中，喷雾干燥过程中，入口温度为100℃，进料速率为600ml/h，进风量为80m3/h及出口温度为52℃。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，步骤(1)中的菌种斜面活化和种子培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，步骤(2)中的发酵培养基的组成为：冷榨花生粕蛋白胨12g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L，该发酵培养基的pH为7.4。
4.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，所述步骤(3)中的热诱激预处理的温度为55℃，热诱激的时间为10min。
5.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，以菌悬液体积为基准，步骤(3)中加入的复合抗热保护剂的用量为0～20％。
6.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺，其特征在于，步骤(3)中加入的复合抗热保护剂包括海藻糖、蔗糖、脱脂奶粉，且三者的用量比为海藻糖：蔗糖：脱脂奶粉＝0.43:0.34:0.23。
7.一种枯草芽孢杆菌益生菌菌粉的喷雾干燥制备工艺的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，单因素试验
选取制备工艺中的复合抗热保护剂用量、喷雾干燥过程的入口温度、进料速率、进风量和出口温度为因素，以菌体存活率为评价指标，分别研究每个因素对菌体存活率影响的显著性，以优选重要影响因素；
步骤二，响应面法优化设计
根据单因素试验中所得的各因素对菌体存活率影响的显著性分析结果，确定进料速率、进风量和出口温度为重要因素，应用中心复合响应面优化试验设计进一步分析该三个因素对菌体存活率的影响；
a、试验方案设计
基于单因素试验结果，针对进料速率、进风量以及出口温度三个因素，选取各因素水平，以菌体存活率为响应值，设计试验方案；
b、序贯分析优选数学模型与模型构建
对步骤a设计的响应面优化设计方案，以菌体存活率为评价指标进行各阶模型序贯分析，以优选数学模型，再根据所确定的数学模型，对步骤a中的试验设计数据进行拟合，构建回归方程，该回归方程是以进料速率、进风量和出口温度为自变量，以菌体存活率为响应值；
c、模型诊断分析
利用数学分析方法对所确定的数学模型和所构建的回归方程进行验证与诊断分析，判别该数学模型和回归方程的合理性、抗干扰性、各自变量的显著性以及自变量间的交互作用显著性；
d、基于模型求最优解与模型验证
应用Design Expert优化模块求得回归方程的编码水平最优解，再将编码值转换为实际值，得到喷雾干燥制备工艺的最优参数，然后对模型优化的试验参数进行验证试验，以验证模型的正确性。
8.根据权利要求7所述的一种枯草芽孢杆菌菌粉的喷雾干燥制备工艺的优化方法，其特征在于，步骤b中的序贯分析所针对的模型包括一阶线性数学模型、二因素交互关系模型、二阶数学模型和三阶数学模型。
9.根据权利要求7所述的一种枯草芽孢杆菌菌粉的喷雾干燥制备工艺的优化方法，其特征在于，步骤a中，针对进料速率、进风量和出口温度三个因素，每个因素设计5个水平，分别以0，±1，±1.682编码，以菌体存活率为响应值，设计3因素5水平试验。
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