CN102093958B - 一种超薄发酵床菌剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种超薄发酵床菌剂的生产方法，属于微生物发酵领域。本发明采用的菌种为米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌，把各菌种进行单一纯培养获得生产用菌种，再把它们混合均匀后接种到曲盘培养发酵，在pH值6.5－7.5，经2-3天发酵后烘干、粉碎、包装即为超薄发酵床菌剂。超薄发酵床菌剂微生物活菌数含量高，真菌活菌总数大于5亿/克，细菌活菌总数大于45亿/克，品种搭配合理，适应性强，配合超薄发酵床技术，基本上不需要对旧猪圈进行改造，新建猪圈的成本也明显降低，建造发酵床的垫料用量少，成本低，能够控制发酵床温度，做到冬暖夏凉，明显克服了现有的发酵床夏季湿热的问题，经使用后的发酵床垫料是优质的生物有机肥。

Description

一种超薄发酵床菌剂的生产方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及的是一种生态养殖用超薄发酵床菌剂的生产方法。

背景技术

发酵床养猪是近年来发展起来的一种生态养猪法，它有效地解决了传统养猪污染环境、劳动强度大、疫病多等缺陷，而且经使用后的发酵床垫料是优质的生物有机肥，因而解决了大量施用化肥所带来的系列问题。但目前所推广的发酵床养猪技术一般都是厚层湿式发酵床，其发酵床垫料厚度一般都在60-100厘米，最薄的发酵床垫料也超过40厘米，这就要求对旧猪圈进行较大的改造，所需的垫料多，成本高，而且厚度较大的垫料中含有较多的水份，微生物会因此发酵而使发酵床温度过高，影响猪只在垫料上生活的舒适性。这主要是因为目前这种厚式发酵床所使用的发酵床菌剂的微生物含量低，微生物品种的搭配不合理，微生物的适应性不强等原因所致。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物含量高、品种搭配合理、适应性强的的超薄发酵床菌剂的生产方法。

本发明的目的是这样实现的：一种超薄发酵床菌剂生产方法，使用菌种为米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌，其特征在于：包括以下步骤：

（1）菌种传代：

米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母的菌种传代，分别采用斜面传代，培养基为马玲薯葡萄糖琼脂(PDA)，培养温度25-30℃，培养时间为48-72小时；

枯草芽孢杆菌、地及芽孢杆菌和糞肠球菌的菌种传代，分别采用斜面传代，培养基为营养琼脂，培养温度为37℃，培养时间为24-48小时；

（2）菌种扩大培养:：

a、米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母的菌种扩大培养：

将步骤（1）的米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母菌种分别接入已灭菌的种子瓶进行培养，培养温度25-30℃，培养时间48-72小时，种子瓶培养基的配方，按质量比计为：

麸皮       1

锯木屑     1

水         1—2

硫酸镁       0.05—0.1

磷酸二氢钾   0.05—0.1

碳酸钙       0.05—0.1 

培养基的灭菌温度121℃,时间为30－40分钟；

b、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和糞肠球菌菌种扩大培养：

将步骤（1）的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和糞肠球菌种分别接入已灭菌的种子瓶进行培养，培养温度30-37℃，培养时间为48-72小时，种子瓶培养基的配方，按质量比计为：

玉米粉     2

豆粕粉     1

锯木屑     7

水         5－6.5

硫酸镁       0.1—0.5

磷酸二氢钾   0.1—0.5

碳酸钙       0.1—0.5 

培养基的灭菌温度121℃,时间为30－40分钟；

（3）菌种混合发酵培养：

先将步骤(2)中经过扩大培养的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌菌种混合均匀，再与培养基混合放入发酵盘中培养发酵, 发酵温度在30-40℃，湿度80-90%，时间为72小时后；

其中步骤（3）中菌种的配比（体积比）为：

米根霉              1

黑曲霉              2

产朊假丝酵母        1

地衣芽孢杆菌        2

枯草芽孢杆菌        2 

糞肠球菌            1

其中步骤（3）中培养基的配方，按质量比计为：

玉米粉                         5-15

麸皮                           5-10

锯木屑或农作物秸杆粉           80-90

硫酸镁                         0.1—0.5

磷酸二氢钾                     0.1—0.5

碳酸钙                         0.1—0.5 

水                             110－130

pH                             6.5－7.5

培养基的灭菌温度121℃,时间为60－120分钟，得到培养物；

 （4）干燥

 将步骤（3）发酵成功的培养物在45℃以下进行干燥，水份降至8%以下，经过粉碎得到超薄发酵床菌剂。  

本发明提供的超薄发酵床菌剂生产方法，采用单一菌株纯培养，曲盘发酵时，将各菌株进行混合培养，其生产的超薄发酵床菌剂微生物活菌数含量高，真菌活菌总数大于5亿/克，细菌活菌数大于45亿/克，品种搭配合理，适应性强，微生物混合到发酵床垫料中后的适应能力强，能很快在发酵床垫料中繁殖快速分解猪的尿液及糞便，不产生臭味。配合超薄发酵床技术，基本上不需要对旧猪圈进行改造，新建猪圈的成本也明显降低，建造发酵床的垫料用量少，成本低，能够控制发酵床温度，做到冬暖夏凉，明显克服了现有的发酵床夏季湿热的问题。

具体实施方式

本发明中使用的微生物米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌具体情况如下：

1、米根霉：拉丁学名为Rhizopus oryzae。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.2686。

米根霉具有以下性质：

菌落疏松或稠密，最初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝匍匐爬行，无色。假根发达，分枝呈指状或根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍弯曲，2－4株成束，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色，长210－2500μm，直径5－18μm,囊轴呈球形或近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径30－200μm．囊托呈楔型。孢子囊呈球形或近球形，老后呈黑色，直径60－250μm．孢囊孢子呈椭圆形、球形或其他形，呈黄灰色，直径5－8μm。有厚垣孢子，其形状、大小不一致，未见接合孢子，该菌于37－40℃能生长。

2、黑曲霉：拉丁学名为Aspergillus niger。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.6477。

黑曲霉具有以下性质：

分生孢子梗自基质中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色。

3、产朊假丝酵母：拉丁学名为Candida utilis。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 2.1180。

产朊假丝酵母具有以下性质：

产朊假丝酵母的细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为（3.5～4.5）μm×（7～13）μm。液体培养不产醭，管底有菌体沉淀。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝；能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸盐。

4、地衣芽孢杆菌：拉丁学名为Bacillus licheniformis。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.265。

地衣芽孢杆菌具有以下性质：

为革兰氏阳性杆菌。细胞形态和排列呈杆状、单生，0．8μm×（1．5～3．5）μm。产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。需氧菌，在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm左右。可液化明胶，水解淀粉，适宜生长的pH 5.5—8.7和温度15——45℃，可利用葡萄糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇产酸，可利用柠檬酸盐。 

5、枯草芽孢杆菌

拉丁学名为Bacillus subtilis。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1414。

枯草芽孢杆菌具有以下性质：

单个细胞0.7～0.8×2～3μm。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

6、糞肠球菌

拉丁学名为Enterococcus faecalis。该菌种购自菌种购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.130。

糞肠球菌具有以下性质：

糞肠球菌又称粪链球菌，粪链球菌菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长,直径0.5-1.0微米,大多数成双或短链状排列,通常不运动。在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，罕见色素。其营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长。能在10℃或45℃ pH 9.6或含6.5%NaCl肉汤培养基中生长，并能耐65℃ 30分钟。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的培养基上生长不需叶酸。

实施案例1:：

一、菌种制备：

1、将砂土管保藏的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母种子转接于马玲薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中,置于30℃条件下培养2天后斜面表面形成大量菌体后再转接于麸皮培养基中。枯草芽孢杆菌、地及芽孢杆菌、糞肠球菌则转接于营养琼脂培养基中，37℃培养24小时备用。

2、三角瓶种子的制作：

1）将麸皮、锯木屑按1：1比例混合，加入微量元素（以培养料质量计）硫酸镁1.5%、磷酸二氢钾1.5%、碳酸钙1.5%，加水使培养料含水量在60﹪，分装入三角瓶中，每瓶装入培养料约2CM厚，塞上棉塞后，放入灭菌锅中，在121℃下灭菌30分钟，趁热摇散，冷却至30℃以下备用。将已备好的麸皮培养基在无菌操作下，在已培养好的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母斜面试管种中用接种环刮取一环种子分别接入三角瓶麸皮培养基中进行纯培养，塞上棉塞，摇匀，置于30℃条件下培养2天后备用。

2）将玉米粉20%、豆粕粉10%、锯木屑70%，加入微量元素（以培养料质量计）硫酸镁2%、磷酸二氢钾1.5%、碳酸钙2%，加水60%，分装入三角瓶中，每瓶装入培养料约2CM厚，塞上棉塞后，放入灭菌锅中，在121℃下灭菌30分钟，趁热摇散，冷却至40℃以下备用。将已备好的培养基在无菌操作下，用已培养好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、糞肠球菌斜面种试管种接于已备好的培养基中，进行纯培养，塞上棉塞，摇匀，置于30℃条件下培养2天后备用。

三、生产培养基的制备：

1、配料：玉米粉10%、麸皮5%、锯木屑85%，加入微量元素（以培养料质量计）硫酸镁2%、磷酸二氢钾2.5%、碳酸钙1%。先将干性培养基按照比例称好，混合均匀后，加水，控制料水比例为1：1.1－1.3，并搅拌均匀，调pH值在7后备用。

2、灭菌：将已经备好的的料装入曲盘中，装料厚度为2厘米，装好后覆上无纺布，放在铁架上，装完后将铁架推入灭菌锅中灭菌，当温度达到121℃时开始计时，灭菌1小时，灭完菌后，待温度下降后从灭菌锅中将铁架推入无菌室中冷却。

四、接种：将已经备好的三角瓶米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌等菌种倒出来打碎混合均匀，各菌种的比例（体积比）为米根霉:黑曲霉:产朊假丝酵母:地衣芽孢杆菌:枯草芽孢杆菌:糞肠球菌=1:2:1:2:2:1，接种量0.5%，撒在培养料表面，再与培养料混合均匀，整个过程要注意无菌操作。

五、培养：将已经接种了发酵盘放入培养室中的培养架上（每层架子的高度在20厘米，前期主要是控制温度，最适温度控制在30℃左右，24小时后开始保湿培养，湿度控制在80-90%，温度控制在30℃左右，上下层发酵盘温差较大时，上下进行调换，72小时后培养料结块紧密，无异味、镜检菌数很多。

六、干燥：将已发酵成功的培养物在45℃以下进行烘干，当水份降至8%以下后即可。

七、粉碎：由于培养料在生长过程中结块较多，用1毫米以下筛孔粉碎机粉碎即可，操作过程中应尽量密封，以减少粉尘对人呼吸道的刺激，也可以减少微生物的损失。

八：取样检测：

1、真菌活菌数检测：用平板测数法检测，所用培养基为北京奥博星葡萄糖马铃薯琼脂培养基，涂平板后置于27℃培养箱中培养，16小时后每2小时数一次平板，检测结果为：真菌活菌数6.8亿/克。

2、细菌活菌数检测：用平板测数法检测，所用培养基为北京奥博星营养琼脂培养基，涂平板后置于37℃培养箱中培养，16小时后每2小时数一次平板。检测结果为56亿/克。

九、包装：使用铝塑复合袋进行包装，每袋200克，可制作10-20平方米发酵床。

十、保存：干燥、避光处常温保存，保质期12个月 

实施案例2：

一、菌种制备:

1、将砂土管保藏的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母种子转接于马玲薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中,置于27℃条件下培养3天后斜面表面形成大量菌体后再转接于麸皮培养基中。枯草芽孢杆菌、地及芽孢杆菌、糞肠球菌则转接于营养琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时备用。

2、三角瓶种子的制作：

1）将麸皮、锯木屑按1：1比例混合，加入加入微量元素（以培养料质量计）硫酸镁1%、磷酸二氢钾1.5%、碳酸钙1%，使其含水量在55﹪，分装入三角瓶中，每瓶装入培养料约4CM厚，塞上棉塞后，放入灭菌锅中，在121℃下灭菌40分钟，趁热摇散，冷却至30℃以下备用。将已备好的麸皮培养基在无菌操作下，在已培养好的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母斜面种用接种环刮取一环种子分别接入三角瓶麸皮培养基中进行纯培养，塞上棉塞，摇匀，置于27℃条件下培养3天后备用。

2）将玉米粉20%、豆粕粉10%、锯木屑70%、微量元素少许，加水55%，分装入三角瓶中，每瓶装入培养料约4CM厚，塞上棉塞后，放入灭菌锅中，在121℃下灭菌40分钟，趁热摇散，冷却至40℃以下备用。将已备好的培养基在无菌操作下，在已培养好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、糞肠球菌斜面中加入无菌水，刮下菌种后接于已备好的培养基中进行纯培养，塞上棉塞，摇匀，置于37℃条件下培养2天后备用。

三、生产培养基的制备：

1、配料：玉米粉10%、麸皮5%、玉米秸杆粉85%，其它微量微量元素少许。先将培养基按照比例称好，混合均匀后，加水，控制料水比例为1： 1.3，并搅拌均匀，调pH值在7.2后备用。

2、灭菌：将已经备好的的料装入不锈钢盘或铝盘中，装料厚度为3厘米，装好后放在铁架上，装完后将铁架推入灭菌锅中灭菌，当温度达到121℃时开始计时，灭菌1小时，灭完菌后，待温度下降后从灭菌锅中将铁架推入无菌室中冷却。

四、接种：将已经备好的三角瓶米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌等菌种倒出来打碎混合均匀，各菌种的比例（体积比）为米根霉:黑曲霉:产朊假丝酵母:地衣芽孢杆菌:枯草芽孢杆菌:糞肠球菌=1:2:1:2:2:1，接种量1%，撒在培养料表面，再与培养料混合均匀，整个过程要注意无菌操作。

五、培养：将已经接种了发酵盘放入培养室中的培养架上（每层架子的高度在30厘米，前期主要是控制温度，最适温度控制在27℃左右，24小时后开始保湿培养，湿度控制在80-90%，温度控制在32℃左右，上下层发酵盘温差较大时，上下进行调换，72小时后培养料结块紧密，无异味、镜检菌菌数很多。

六、干燥：将已发酵成功的培养物在45℃以下进行烘干，当水份降至8%以下后即可。

七、粉碎：由于培养料在生长过程中结块较多，用0.8毫米筛孔粉碎机粉碎即可，操作过程中应尽量密封，以减少粉尘对人呼吸道的刺激，也可以减少微生物的损失。

八：取样检测：

1、真菌活菌数检测：用平板测数法检测，所用培养基为北京奥博星马铃薯葡萄糖琼脂培养基，涂平板后置于27℃培养箱中培养，16小时后每2小时数一次平板，检测结果为：真菌活菌数5.8亿/克。

2、细菌活菌数检测：用平板测数法检测，所用培养基为北京奥博星营养琼脂培养基，涂平板后置于37℃培养箱中培养，16小时后每2小时数一次平板。检测结果为78亿/克。

九、包装：使用铝塑复合袋进行包装，每袋200克，可制作10-20平方米发酵床。

Claims (1)

1.一种超薄发酵床菌剂的生产方法，使用菌种为米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌，其特征在于：包括以下步骤：

（1）菌种传代：

米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母的菌种传代，分别采用斜面传代，培养基为马玲薯葡萄糖琼脂(PDA)，培养温度25-30℃，培养时间为48-72小时；

枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和糞肠球菌的菌种传代，分别采用斜面传代，培养基为营养琼脂，培养温度为37℃，培养时间为24-48小时；

上述菌种中，

米根霉：拉丁学名为Rhizopus oryzae，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.2686；

黑曲霉：拉丁学名为Aspergillus niger，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.6477；

产朊假丝酵母：拉丁学名为Candida utilis，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 2.1180；

地衣芽孢杆菌：拉丁学名为Bacillus licheniformi，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.265；

枯草芽孢杆菌：拉丁学名为Bacillus subtilis，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1414；

糞肠球菌：拉丁学名为Enterococcus faecalis；保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.130；

（2）菌种扩大培养：

a、米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母的菌种扩大培养：

将步骤（1）经传代培养的米根霉、黑曲霉和产朊假丝酵母菌种分别接入已灭菌的种子瓶进行培养，培养温度25-30℃，培养时间48-72小时，种子瓶培养基的配方，按质量比计为：

麸皮       1

锯木屑     1

水         1—2

硫酸镁       0.05—0.1

磷酸二氢钾   0.05—0.1

碳酸钙       0.05—0.1 

培养基的灭菌温度121℃，时间为30－40分钟；

b、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和糞肠球菌菌种扩大培养：

将步骤（1）经传代培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和糞肠球菌种分别接入已灭菌的种子瓶进行培养，培养温度30-37℃，培养时间为48-72小时，种子瓶培养基的配方，按质量比计为：

玉米粉     2

豆粕粉     1

锯木屑     7

水         5－6.5

硫酸镁       0.1—0.5

磷酸二氢钾   0.1—0.5

碳酸钙       0.1—0.5 

培养基的灭菌温度121℃，时间为30－40分钟；

（3）菌种混合发酵培养：

先将步骤(2)中经过扩大培养的米根霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、糞肠球菌菌种混合均匀，再与培养基混合放入发酵盘中培养发酵, 发酵温度在30-40℃，湿度80-90%，时间为72小时后；

其中步骤（3）中菌种的配比，按体积比为：

米根霉              1

黑曲霉              2

产朊假丝酵母        1

地衣芽孢杆菌        2

枯草芽孢杆菌        2 

糞肠球菌            1

其中步骤（3）中培养基的配方，按质量比计为：

玉米粉                         5-15

麸皮                           5-10

锯木屑或农作物秸杆粉           80-90

硫酸镁                         0.1—0.5

磷酸二氢钾                     0.1—0.5

碳酸钙                         0.1—0.5 

水                             110－130

pH                             6.5－7.5

培养基的灭菌温度121℃，时间为60－120分钟，得到培养物；

 （4）干燥

  将步骤（3）发酵成功的培养物在45℃以下进行干燥，水份降至8%以下，经过粉碎得到超薄发酵床菌剂。