CN104480042A - 一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌c3活菌制剂的制备方法 - Google Patents

一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌c3活菌制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌((Bacillus subtilis))C3(CGMCC No.9713)活菌制剂的制备方法，适用于畜禽水产养殖业中饲用功能性活菌制剂等饲料添加剂及微生态制剂的生产。本发明利用筛选自果园土壤中的抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩和冷冻干燥等工序制备而成的高活菌数的活菌制剂。本发明通过对发酵培养基和发酵条件的优化，利用全自动发酵罐发酵，使C3菌株的活菌数量达7.9×1010CFU/mL以上。本发明制备的活菌制剂价格低廉，活菌含量高，可作为禽畜饲料添加剂，具有提高生长速度、节省饲料用量、减少生病率等特点。

Description

一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的制备方法，适用于畜禽水产养殖业功能性微生态制剂和食品防腐剂的生产。
背景技术
微生物饲料添加剂，作为一种“绿色”添加剂，对促进动物生长发育，提高免疫力、防病治病，逐渐替代农用化学物质，取代激素和抗生素，可解除大量抗生素使用和滥用所造成的对人体严重的毒副作用，生产出绿色食品。
枯草芽孢杆菌为农业部发布《饲料添加剂品种目录(2013)》(中华人民共和国农业部公告第2045号)中可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种之一。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)广泛分布在土壤及腐败的有机物中。在枯草芽孢杆菌菌体生长过程中，产生枯草菌素等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进肠道菌群生长，并产生有机酸类，降低肠道pH，间接抑制其他致病菌生长；枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用；枯草芽孢杆菌能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性；刺激动物免疫器官生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。可作为饲料添加剂广泛应用于禽畜饲料中，是一种较理想的具有广大开发前景的微生态制剂。
本发明涉及的枯草芽孢杆菌C3对单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白边青霉生长有抑制作用，其中对单核细胞增生李斯特菌有较强的抑菌活性，效价为640AU/mL。将枯草芽孢杆菌C3添加到家禽畜牧饲料中，可提高禽畜对单核细胞增生李斯特菌的抗性。此外，试验研究表明，该菌还能分泌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用，提高饲料利用率。
微生态制剂是采用有益微生物，经培养、发酵、干燥、加工等工艺制成含有活菌的活菌制剂或包含菌体及其代谢产物的制剂。在枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备过程中，高产活菌量的发酵培养基的配方是关键，直接影响枯草芽孢杆菌的发酵时间、活菌数量和生产成本。
目前，国内申请枯草芽孢杆菌活菌制剂制各方法的专利较多，大多用于生物防治领域，如发明专利CN103421722A公开了“一株荔枝内生枯草芽孢杆菌及其生物制剂与应用”，该专利报道枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉病的优异生防作用；如发明专利CN103352020A公开了“一种枯草芽孢杆菌的微生物制剂制备 方法及其应用”，该专利报道了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)EDR4的菌株能够应用在油菜菌核病的防治中。
枯草芽孢杆菌在动物饲料领域的微生态制剂相关专利报道不多，且主要集中在饲料营养方面。专利CN104012756A公开了“禽用高表达蛋白酶枯草芽孢杆菌微生态制剂及其制备方法”，该发明是由吐温80、豆油、聚丙烯酸钠、水和枯草芽孢杆菌制备而成，枯草芽孢杆菌在上述溶液中的浓度为106～1012个/ml，该制剂在禽类肠道体内有效降解饲料中的蛋白质，大幅度提高禽类生长速度和肉料比，防止出现过料拉稀等现象。另一篇专利CN103911323A公开了“地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制剂及制备”，该发明以豆粕、麸皮和玉米粉为基质，以益生菌地衣芽孢杆菌BL-09、枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-10混合分阶段进行固态发酵制备的益生菌制剂。CN102660534A公开了“枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用”，该发明是枯草芽孢杆菌发酵后与载体混合后经离心喷雾干燥即制成枯草芽孢杆菌制剂，经口服途径(饮水或拌料)饲喂肉禽后，具有改善消化功能，提高饲料转化率，促进生长的作用。
但关于抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌的活菌制剂制备方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
所述方法中，所提供的枯草芽孢杆菌是：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C3，分离筛选自北京农学院果园土壤，已于2013年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所内，保藏号为：CGMCC No.7913。在牛肉膏蛋白胨培养基上，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C3的菌落大小为3～5mm，灰白色、不透明、表面干燥、边缘不整齐，菌体细胞呈长杆状，短链状排列，中生芽孢，G+好氧菌。
所述方法中，将甘油冷冻管保种的枯草芽孢杆菌C3菌株接种于5mL的C3菌株种子培养基中，于37℃，160r/min摇床培养16～20h，如此活化2～3代，得到种子液；将活化好的种子液以2％的接种量接种至盛有50mL种子培养基250mL的三角瓶中，于37℃，160r/min摇床培养12h，得到扩大培养液。
上述方法中，枯草芽孢杆菌C3种子培养基配方为(质量体积浓度，W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，1％NaCl，0.15％KH2PO4，0.15％MgSO4·7H2O，pH自然。
所述方法中，在上述试验结果基础上，采用单因素多水平试验进行发酵条件的优化，优化后的发酵条件为：pH自然，发酵时装液量50mL/250mL三角瓶， 接种量3％，温度37℃，160r/min，培养12h。
所述方法中，在上述试验结果基础上，采用正交试验对发酵培养基培养进行进一步优化，优化后的发酵培养基配方为：1％葡萄糖，1％酵母浸粉，0.5％NaCl，0.2％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，蒸馏水1000mL，pH自然。
所述方法中，将上述优化后的2L发酵培养基装入5L自动发酵罐进行高密度发酵，接种量为3％，控制发酵温度37℃，发酵液pH自然，搅拌转速190r/min，发酵时间12h，得到枯草芽孢杆菌C3发酵液。
上述方法中，5L自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为BIOF6005GBN。
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离心机将2L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心15～20min，弃上清液，收集得到菌泥。
所述方法中，立式高速冷冻离心机由湘仪离心机仪器有限公司提供，型号为GL-21M。
所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有11％～13％麦芽糊精和4％～2％脱脂奶粉冻干保护剂中，混合均匀后，得到枯草芽孢杆菌C3菌泥与冻干保护剂的混合物。
所述方法中，将上述混合物于-30℃低温冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.14mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。
所述方法中，采用小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的活菌数量可达到1011CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。
上述方法得到的抗单增李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的制备方法，以及专用生产菌株属于本发明保护范围。
具体实施方式
下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。
实施例1、抗单增李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的制备
1、菌种的活化和扩大培养
将甘油冷冻管保种的枯草芽孢杆菌C3菌株接种于5mL的C3菌株种子培养基中，于37℃，160r/min摇床培养16～20h，如此活化2～3代，得到种子液；将活化好的种子液以2％的接种量接种至盛有50mL种子培养基250mL的三角瓶中，于37℃，160r/min摇床培养12h，得到扩大培养液。
枯草芽孢杆菌C3种子培养基配方为(W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，1％NaCl，0.15％KH2PO4，0.15％MgSO4·7H2O，pH自然。
2、发酵条件和发酵培养基配方的单因素试验
(1)发酵条件的确定
1)pH的确定
将种子培养基的pH分别调为6.5，7.0，7.5和自然(不调pH)，经121℃灭菌后，将扩大培养液按2％的接种量分别移种至上述不同pH的种子培养基中，于37℃发酵12h后，采用营养琼脂培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，结果见表1。
表1不同pH对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表1可知，不同的初始pH对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量从大到小对应的pH依次是：自然＞7.5＞7.0＞6.5，以pH自然时，活菌数较高，达3.25×109CFU/mL，为pH7.0的2.28倍，故确定pH为自然。
2)装液量的确定 
在上述试验较优的pH为自然的种子培养基的基础上，250mL摇瓶中装液量为40mL、50mL、60mL、70mL，以上述同样条件发酵、计数，结果见表2。
表2不同摇瓶装液量对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表2可知，不同的初始摇瓶装液量对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量从大到小对应的装液量依次是：50mL＞70mL＞60mL＞40mL，以初始摇瓶装液量为50mL时，活菌数较高，达6.6×109CFU/mL，为摇瓶装液量60mL的11.5倍，故确定摇瓶装液量为50mL。
3)接种量的确定 
在上述试验较优的pH为自然和摇瓶的装液量为50mL的种子培养基的基础上，研究1％、2％、3％、4％不同摇瓶接种量对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响，以上述同样条件发酵、计数，结果见表3。
表3不同摇瓶接种量对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表3可知，不同的初始摇瓶接种量对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量从大到小对应的接种量依次是：3％＞2％＞1％＞4％，以初始摇瓶接种量为3％时，活菌数较高，达4.8×109CFU/mL，为摇瓶接种量4％的14.1倍，故确定接种量为3％。
(2)发酵培养基配方的单因素试验
1)发酵培养基碳源的优化
在上述发酵条件单因素研究的基础上，确定了pH自然、摇瓶装液量60mL和接种量为3％，研究葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖四种不同碳源(每种用量均为1％)对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响，以上述同样条件发酵、计数，结果见表4。
表4不同碳源对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表4可知，不同的碳源对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量从大到小对应的装液量依次是：葡萄糖＞麦芽糖＞蔗糖＞乳糖，以葡萄糖为碳源时，活菌数较高，达8.55×109CFU/mL，为蔗糖的34倍，故确定碳源为葡萄糖。
2)发酵培养基氮源的优化
在确定了pH自然、摇瓶装液量60mL、摇瓶接种量为3％和葡萄糖为碳源的基础上，研究了蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨和酵母浸粉(每种用量均为1％)四种不同氮源对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响，以上述同样条件发酵、计数，结果见表5。
表5不同氮源对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表5可知，不同的氮源对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量的从大到小对应的装液量依次是：酵母浸粉＞胰蛋白胨＞蛋白胨＞大豆蛋白胨，以酵母浸粉为氮源时，活菌数较高，达2.71×109CFU/mL，为大豆蛋白胨的8.74倍，故确定氮源为酵母浸粉。
3)发酵培养基无机盐的优化
在确定了pH自然、摇瓶装液量60mL、摇瓶接种量为3％和葡萄糖为碳源和酵母浸粉为氮源的基础上，研究了NaCl、CaCl2、KCl三种不同无机盐(用量为1％)对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响，以上述同样条件发酵、计数，结果见表6。
表6不同无机盐对枯草芽孢杆菌C3活菌数量的影响
由表6可知，不同的无机盐对枯草芽孢杆菌C3活菌数量有明显影响。活菌数量的从大到小对应的无机盐依次是：NaCl＞KCl＞CaCl2，以NaCl为无机盐时，活菌数较高，达1.1×109CFU/mL，为CaCl2的5.5倍，故确定无机盐为NaCl。
3、正交试验优化枯草芽孢杆菌C3发酵培养基配方
根据单因素多水平试验结果，选择0.5％、1％、1.5％、2％的葡萄糖，0.5％、1％、1.5％、2％的酵母浸粉，0.5％、1％、1.5％、2％的NaCl，0.05％、0.1％、0.15％、0.2％的KH2PO4，0.05％、0.1％、0.15％、0.2％MgSO4·7H2O，设计五因素四水平[L16(45)]正交试验，以上述同样条件发酵、计数，结果见表7。
表7不同发酵培养基配方的正交试验
由表7极差分析可知，对发酵液的活菌数影响因素的顺序为：RA＞Pc＞RB＞RE＞RD，即影响大小依次为：葡萄糖、NaCl、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、；由K值直观分析得出发酵培养基配方的最优组合为A2B2C1D4E4，即优化发酵培养基的最终配方：1％葡萄糖，1％酵母浸粉，0.5％NaCl，0.2％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O，蒸馏水1000mL，pH自然。由表7可知，优化发酵培养基后，活菌数较高，达6.7×1010CFU/mL。
4、高密度发酵验证试验
将2L优化后的发酵培养基加入5L自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌系统于121℃灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将枯草芽孢杆菌C3菌株的扩大培养液按3％的接种量移种至发酵罐中，控制发酵温度为37℃，搅拌转速为190r/min，pH自然，发酵时间12h，得到活菌数在7.9×1010CFU/mL以上的发酵液。
5、离心浓缩与加入保护剂
将2L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心15～20min，弃上清液，收集得到菌泥。将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有11％～13％麦芽糊精和4％～2％脱脂奶粉冻干保护剂中，混合均匀后，得到枯草芽孢杆菌C3菌泥与冻干保护剂的混合物。
6、预冻和冻干 
将上述混合物于-30℃低温冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.14mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。
采用小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的活菌数量可达到1011CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。此种活菌制剂活菌含量高，可作为禽畜饲料添加剂，提高生长速度、节省饲料用量、减少生病率等特点。它不仅有增强禽畜消化功能的效果，而且具有调节禽畜的肠道菌群平衡作用，同时枯草芽孢杆菌在肠道内产生的细菌素可抑制某些致病菌尤其是单增李斯特菌的生长繁殖。
实施例2、抗单增李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的稳定性检验
1、抗单增李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌数量的检测方法
称取25g含枯草芽孢杆菌C3的冻干活菌制剂，放入225mL灭菌生理盐水中，采用拍击式匀质器以8000～10000r/min的速度处理1min，充分振荡后，制成10-1的均匀稀释液。再以9mL灭菌生理盐水做10倍递增稀释至10-11，取10-9～10-11的稀释液各1mL置于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46℃的营养琼脂培养基约15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀，每个稀释度 3次重复。同。同时将营养琼脂培养基注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱中培养(48±2)h，待菌落长出后即可计数。其平板菌落计数结果显示，每1g冻干活菌制剂的活菌数量为(1.0～5.0)×1011CFU，见表8所示。
2、抗单增李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3冻干活菌制剂的活菌保质期试验
将副干酪乳杆菌KL1-Liu益生菌夹心饼干置于常温下，每隔2个月采用平板菌落计数法检测益生菌巧克力中副干酪乳杆菌KL1-Liu的活菌数量，检测方法同上述(5)的操作步骤。其平板菌落计数结果见表8。
表8枯草芽孢杆菌C3的冻干活菌制剂活菌保质期检测结果
由表8可见，枯草芽孢杆菌C3活菌制剂在常温下放置12个月，活菌数仍可保持在1011CFU/g以上。
本专利所属项目1：北京市教委面上项目“枯草芽孢杆菌C3细菌素的研究及其对低温肉制品安全控制”
项目编号：KM201410020010
项目起止时间：2014年1月1月-2016年12月31日
项目负责人：熊利霞
本专利所属项目2：科技部“十二五”国家高技术研究发展计划(863)项目子课题“畜产品病原菌安全控制技术”
项目编号：2012AA101606-05
项目起止时间：2012年1月1月-2015年12月31日
项目负责人：张红星
本专利所属项目3：科技部国家科技重大专项“抗病转基因羊新品种培育”子课题“抗病转基因羊扩繁体系的建立/抗病转基因羊抗病、生产性能及安全评价”
项目编号：2013ZX08008-005
项目起止时间：2013年1月1月-2013年12月31日
项目负责人：刘慧
本专利所属项目4：“十二五”农村领域国家科技计划课题“动物源食品HACCP体系建设及致病菌高通量检测技术”
项目编号：2012BAD28B02-01
项目起止时间：2012年1月1日-2015年12月31日
项目负责人：孔保华。

Claims (2)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)C3 CGMCC No.7913。
2.一种抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂的制备方法，其特征在于：发酵培养基配方为：1％葡萄糖、1％酵母浸粉、0.5％NaCl、0.2％KH2PO4、0.2％MgSO4·7H2O，蒸馏水1000mL，pH自然；将活化、扩大培养的枯草芽孢杆菌C3以3％接种量移种到2L发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行高密度发酵，控制发酵温度37℃，发酵液pH自然，搅拌转速190r/min，发酵时间12h，得到枯草芽孢杆菌C3发酵液；将2L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心15～20min，弃上清液，收集得到菌泥；将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有11％～13％麦芽糊精和4％～2％脱脂奶粉冻干保护剂中，混合均匀后，得到枯草芽孢杆菌C3菌泥与冻干保护剂的混合物；将上述混合物于-30℃低温冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用6LLABCONCO真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.14mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到抗单核细胞增生李斯特菌的枯草芽孢杆菌C3活菌制剂。
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