CN102018217A - 一种含双歧杆菌的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种含双歧杆菌的组合物及其应用，其特点是所述含双歧杆菌的组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成，其中含双歧杆菌的组合物的组分：双歧杆菌为0.01～10％，低聚糖为10～50％，维生素为0.01～10％，金属元素为0.01～10％，其余为辅料。本发明给出的含双歧杆菌的组合物具有辅助降血脂和抗氧化的功能，可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食品、保健品和药品领域。

Description

一种含双歧杆菌的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种双歧杆菌制品，特别是涉及一种含双歧杆菌的组合物及其应用，属于双歧杆菌制品制备技术领域，本发明制得的含双歧杆菌的组合物具有辅助降血脂和抗氧化的功能，可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食品、保健品和药品领域。

背景技术

衰老是生命周期中随时间进展而表现出机体功能不断恶化直到死亡的复杂动态过程。在此过程中，机体的代谢发生变化，各个系统都相应的出现退行性改变，导致与衰老相关的慢性病的发病率和死亡率出现上升趋势。如果机体内一种或几种脂类代谢失调致使血中的一种或者几种脂质成分出现明显异常，就会引发高脂血症，它是一种发病率高、潜在危害严重的慢性疾病，随着社会经济的发展，人们生活水平的提高和方式的改变，以及人口老龄化，高脂血症引发的动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾病患病率在全球范围内居于首位，成为威胁人类生命和健康最突出的卫生问题之一。

双歧杆菌是1899年在法国巴斯德研究所由Tisser.H博士首次从健康的母乳哺育婴儿的粪便中发现并分离出来的，是人体肠道内重要的生理性细菌。经研究证实，双歧杆菌可以显著降低血清胆固醇和三酯酰甘油含量，具有降血脂、降血压及预防心、脑血管疾病的作用。能够明显增加体内超氧化物歧化酶的含量及其生物活性，有效促进机体内超氧化自由基发生歧化、封闭和降解，加速体内自由基的清除，从而增强机体的抗氧化能力，延缓机体衰老。基于双歧杆菌的抗氧化、提高免疫力、降低胆固醇及其临床功效的肯定，国内外研究者相继开发出多种双歧杆菌食品和微生态药品，通过外源方式增加人体肠道中双歧杆菌数量，促进人体健康。

虽然双歧杆菌制品的开发层出不穷，但在众多制品中存在的最为关键的问题是产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降。研究发现，双歧杆菌在人体内的存活和增殖能力对其益生作用有着重要影响，要获得所期望的治疗效果，双歧杆菌必须达到足够的数量，以确保进入人体后有足够的活菌发挥保健功能。然而，由于双歧杆菌对营养条件要求较高，对氧极为敏感，对低pH值的抵抗力差，导致进入市场的产品中双歧杆菌的数量急剧下降。另外，双歧杆菌对人体产生有益效果，必须在通过胃环境后仍有大量的存活菌到达肠道并定殖于肠粘膜上。但在胃酸和胆盐环境中，双歧杆菌菌数会很快下降，使得最终在人体内没有足够的双歧杆菌发挥作用。因此，如何提高产品中双歧杆菌活菌数量，确保其在人体肠道内定殖而发挥疗效已成为我们亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性双歧杆菌及其制备方法，解决目前双歧杆菌制品中存在的产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降的问题。

本发明的另一目的在于提供一种含双歧杆菌的组合物及其应用，特别是在辅助降血脂和抗氧化方面的应用。

本发明给出的技术解决方案是：这种含双歧杆菌的组合物，其特点是所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成。

为更好的完成本发明的目的，所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比计，双歧杆菌为0.01～10％，低聚糖为10～50％，维生素为0.01～10％，金属元素为0.01～10％，其余为辅料。

为更好的完成本发明的目的，所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213、长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌CICC 6070中的一种。

上述双歧杆菌中的婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213均由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC6071、青春双歧杆菌CICC 6070均由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物菌种保藏管理中心保藏，属于现有的双歧杆菌菌种。

为更好的完成本发明的目的，所述低聚糖为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖等中的一种或多种。

为更好的完成本发明的目的，所述维生素为维生素A、维生素B₁、B₂、B₆、B₁₂、维生素C、维生素D、维生素E等中的一种或多种。

为更好的完成本发明的目的，所述金属元素为锌、铁、钙、镁等中的一种或多种。

为更好的完成本发明的目的，所述辅料为麦芽糊精、乳糖、淀粉等中的一种或多种。

用于本发明的双歧杆菌的制备方法如下：

A、高密度培养

(1)菌种活化：无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上，在36～38℃条件下厌氧培养24～48小时，连续活化2～3代，即得活化菌种。

其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下：胰蛋白胨5.0g、酵母提取物10.0g、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、L～半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至1000mL，调节pH6.8～7.0，121℃灭菌20min。其中盐溶液的成分为：氯化钙0.2g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠10.0g、磷酸氢二钾1.0g、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。

(2)种子培养：将活化菌种按5％～10％的接种量接入液体培养基中，在36～38℃条件下厌氧培养20～28小时，作为种子培养物。

(3)发酵培养：将种子培养物按5％～10％的接种量接入液体培养基中，在36～38℃条件下进行发酵罐高密度培养。

(4)发酵终止：培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌高密度发酵液。

2、双层包埋

(1)离心浓缩：将双歧杆菌高密度发酵液在4℃、6000～8000r/min的条件下离心10～20min，无菌水洗涤2～3次，取下层沉淀即为活性菌泥。

(2)添加保护剂：按1∶4～1∶10(V_保护剂/V_发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀，制备菌悬液。

其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下：脱脂奶粉8～12g、蔗糖8～12g、谷氨酸钠0.5～1.5g、山梨醇0.5～1.5g，加水定容至100mL，加热搅拌使其溶解，然后115℃灭菌15min。

(3)I层包埋：按1∶1～1∶5(V_{I层包埋液}/V_保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬液中，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀。

其中，用于本发明的I层包埋液为蛋白质溶液，至少为酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黄磷蛋白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白等中的一种

(4)II层包埋：按1∶1～1∶5(V_{II层包埋液}/V_保护剂)的比例将II层包埋液加入上述混合液中，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀。

其中，用于本发明的II层包埋液为为胶质溶液，至少为κ-卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、木薯淀粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种。

3、冷冻干燥

将经双层包埋的双歧杆菌置于-70℃冰箱中预冻2～6h后，在冷阱温度-45～-55℃，真空度0.1～10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。

本发明给出的含双歧杆菌的组合物的剂型为胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式。

本发明给出的含双歧杆菌的组合物的应用是作为辅助降血脂和抗氧化的食品、保健品、药品等应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)高密度培养使菌体密度较传统培养方式有显著提高，从而达到减少培养体积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提高在市场上的竞争力。

(2)双层包埋的外层胶体在酸性环境中不溶解，保护菌体安全通过胃部，不受胃酸及胆盐的破坏。到达肠道后外层胶体溶解，暴露出内层蛋白质，协助菌体黏附在肠壁绒毛上而在肠道内定殖，同时提供营养，促进菌体增殖。

(3)真空冷冻干燥技术在低温、低压下进行，基本隔绝空气，有效抑制产品发生理化性质改变，可以较好地保存活性物质，并赋予产品良好的稳定性，便于长期贮存。

(4)低聚糖不易被人体胃肠道消化吸收，作为双歧杆菌的增殖因子，能有效地促进其生长繁殖，抑制腐败菌生长。

具体实施方案

下面实施例对本发明作进一步说明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1：双歧杆菌菌粉的制备

1、高密度培养

(1)菌种活化：无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上，在37℃条件下厌氧培养48小时，连续活化3代，即得活化菌种。

其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下：胰蛋白胨5.0g、酵母提取物10.0g、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、L～半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至1000mL，调节pH6.8～7.0，121℃灭菌20min。其中盐溶液的成分为：氯化钙0.2g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠10.0g、磷酸氢二钾1.0g、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。

(2)种子培养：将活化菌种按5％的接种量接入液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养24小时，作为种子培养物。

(3)发酵培养：将种子培养物按5％的接种量接入液体培养基中，在37℃条件下进行发酵罐高密度培养。发酵过程主要参数控制为：

pH控制：接种后NaOH调节培养基初始pH至7.0，发酵期间流加NaOH维持pH≥5.0；

葡萄糖控制：发酵期间监测培养基中葡萄糖浓度，流加葡萄糖维持葡萄糖含量≥4g/L。

(4)发酵终止：培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌高密度发酵液。

2、双层包埋

(1)离心浓缩：将双歧杆菌高密度发酵液在4℃、6000r/min的条件下离心15min，无菌水洗涤2次，取下层沉淀即为活性菌泥。

(2)添加保护剂：按V_保护剂/V_发酵液＝1∶8的比例在活性菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，无菌条件下200r/min搅拌15min至均匀，制备菌悬液。

其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下：脱脂奶粉10g、蔗糖10g、谷氨酸钠1.0g、山梨醇1.0g，加水定容至100mL，加热搅拌使其溶解，然后115℃灭菌15min。

(3)I层包埋：按V_{I层包埋液}/V_保护剂＝1∶2的比例将I层包埋液加入菌悬液中，无菌条件下200r/min搅拌15min至均匀。

其中，用于本发明的I层包埋液为5％的大豆分离蛋白溶液。

(4)II层包埋：按V_{II层包埋液}∶V_保护剂＝1∶2的比例将II层包埋液加入上述混合液中，无菌条件下200r/min搅拌15min至均匀。

其中，用于本发明的II层包埋液为0.04％的κ-卡拉胶和0.06％的魔芋胶的胶体混合溶液。

3、冷冻干燥

将经双层包埋的双歧杆菌置于-70℃冰箱中预冻4h后，在冷阱温度-50℃，真空度0.1～10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉，活菌数可达1.0×10¹¹cfu/g以上。

实施例2：组合物配方

组合物各组分按上表用量进行混合，制成胶囊剂，0.25g/粒，每次4粒，每日2次；制成冲剂，1g/包，每次1包，每日2次。

实施例3：对高脂血症模型大鼠血脂水平的影响

动物分组及给药：雄性SD大鼠50只，体重190～220g，随机分为5组，即正常对照组、高脂模型组、组合物低、中、高剂量组，每组10只。除正常对照组外，大鼠按每100g体重给予高脂饲料10g(1.5％胆固醇、10％猪油、0.3％胆盐、10％蛋黄粉、0.2％甲基硫氧嘧啶，78％普通饲料)，喂饲15d，通过体重及血脂检测确认高脂血症模型建立成功后，每日对组合物低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予0.10、0.25、0.50g/kg的组合物，对正常对照组和阴性对照组大鼠灌胃给予等量蒸馏水，连续30d，每周根据体重变化调整给药剂量。末次给药后禁食12h，不限饮水，眼眶取血，检测胆固醇各项血脂指标，比较给药前后各项指标的差异。

结果判定：在血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇三项指标检测中血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该受试样品辅助降血脂功能动物实验结果阳性。

(1)组合物对大鼠体重的影响

各组大鼠体重的变化(g，x±s，n＝10)

与空白组比较*P＜0.05

由上表可见，各剂量组大鼠体重增值与空白对照组相比均无显著性差异，表明该组合物对大鼠的体重生长无明显影响。

(2)对高脂血症模型大鼠血脂水平的影响

对高脂血症模型大鼠血脂水平的影响(x±SD，n＝10)mmoL/L

与阴性对照组相比，*P＜0.05，△P＜0.01

由上表可见，组合物低、中、高剂量组的大鼠血清TC、TG、LDL-C含量较阴性对照组显著降低(P＜0.01)，HDL-C含量略高于阴性对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，表明该组合物对实验性高脂血症大鼠有明显的降血脂作用，其作用效果体现在对大鼠血清TC、TG、LDL-C含量的升高有明显抑制作用。

实施例4：对小鼠抗氧化功能的影响

动物分组及给药：BALB/C雄性近交小鼠50只，18～22g/只，随机分为6组，即空白对照组、模型组、组合物低、中、高剂量组，每组10只。组合物低、中、高剂量组分别灌胃给予0.10、0.25、0.50g/kg的组合物，每日1次，空白对照组、模型组给予相同剂量的蒸馏水，小鼠自由进食和饮水，每周称重，按体重调整给药剂量。给药同时，模型组、组合物各剂量组分别每日颈背部皮下注射D-半乳糖(100mg/kg)，空白对照组皮下注射相同剂量的生理盐水。造模及给药6周后处死动物进行各项指标的测定。

结果判定：抗氧化酶活性任一指标和过氧化脂质含量指标均为阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。

(1)组合物对小鼠体重的影响

各组小鼠体重的变化(g，x±s，n＝10)

与空白组比较*P＜0.05

由上表可见，各剂量组小鼠体重增值与空白对照组相比均无显著性差异，表明该组合物对小鼠的体重生长无明显影响。

(2)组合物对小鼠抗氧化功能的影响

组合物对小鼠抗氧化功能的影响(x±SD，n＝10)

与模型对照组相比，*P＜0.05，△P＜0.01

由上表可见，模型组与空白对照组相比，MDA、SOD、GSH-Px均存在显著性差异(P＜0.01)，表明造模成功。与模型组相比，组合物各剂量组MDA均有一定下降，SOD、GSH-Px均有一定程度升高，且呈一定的量效关系。低剂量组可降低小鼠MDA含量，提高SOD、GSH-Px活力(P＜0.05)，中、高剂量组SOD、GSH-Px活力显著高于模型组(P＜0.01)，MDA含量显著低于模型组(P＜0.01)，表明该组合物可降低D-半乳糖致衰小鼠血清和肝脏中MDA含量，提高机体中两种主要抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，且呈一定的量效关系，从而能延缓由于注射D-半乳糖引起小鼠体内的拟衰老变化。

Claims (14)

1.一种含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成。

2.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比计：双歧杆菌为0.01～10％，低聚糖为10～50％，维生素为0.01～10％，金属元素为0.01～10％，其余为辅料。

3.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213、长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌CICC 6070中的一种。

4.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述低聚糖至少为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖等中的一种。

5.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述维生素至少为维生素A、维生素B₁、B₂、B₆、B₁₂、维生素C、维生素D、维生素E中的一种。

6.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述金属元素至少为锌、铁、钙、镁中的一种。

7.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述辅料至少为麦芽糊精、乳糖、淀粉中的一种。

8.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌的制备方法为：

A、高密度培养

(1)菌种活化：无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上，在36～38℃条件下厌氧培养24～48小时，连续活化2～3代，即得活化菌种；

(2)种子培养：将活化菌种按5％～10％的接种量接入液体培养基中，在36～38℃条件下厌氧培养20～28小时，作为种子培养物；

(3)发酵培养：将种子培养物按5％～10％的接种量接入液体培养基中，在36～38℃条件下进行发酵罐高密度培养；

(4)发酵终止：培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌高密度发酵液；

B、双层包埋

(1)离心浓缩：将双歧杆菌高密度发酵液在4℃、6000～8000r/min的条件下离心10～20min，无菌水洗涤2～3次，取下层沉淀即为活性菌泥；

(2)添加保护剂：按1∶4～1∶10(V_保护剂/V_发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀，制备菌悬液；

(3)I层包埋：按1∶1～1∶5(V_{I层包埋液}/V_保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬液中，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀；

(4)II层包埋：按1∶1～1∶5(V_{II层包埋液}/V_保护剂)的比例将II层包埋液加入上述混合液中，无菌条件下150～250r/min搅拌15～30min至均匀；

C、冷冻干燥

将经双层包埋的双歧杆菌置于-70℃冰箱中预冻2～6h后，在冷阱温度-45～-55℃，真空度0.1～10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。

9.根据权利要求8所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于双歧杆菌培养基的配制方法如下：

胰蛋白胨5.0g、酵母提取物10.0g、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至1000mL，调节pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。其中盐溶液的成分为：氯化钙0.2g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠10.0g、磷酸氢二钾1.0g、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。

10.根据权利要求8所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于冷冻干燥保护剂的配制方法如下：

脱脂奶粉8～12g、蔗糖8～12g、谷氨酸钠0.5～1.5g、山梨醇0.5～1.5g，加水定容至100mL，加热搅拌使其溶解，然后115℃灭菌15min。

11.根据权利要求8所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于I层包埋液为蛋白质溶液，至少为酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黄磷蛋白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白中的一种。

12.根据权利要求8所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于II层包埋液为胶质溶液，至少为κ-卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、木薯淀粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种。

13.根据权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物，其特征在于该组合物的剂型为胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂形式。

14.权利要求1所述的含双歧杆菌的组合物的用途，其特征在于作为辅助降血脂和抗氧化的食品或保健品或药品应用。