JP2015168614A - Glp−1分泌促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者らは、上記以外にも下記するように種々の新知見を得て、さらに鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
[1]20(S)−プロトパナキサジオール 20−O−β−d−グルコピラノシド(M1)を含有することを特徴とするGLP−1分泌促進剤。
[2]M1が、薬用人参の発酵生産物に含有されていることを特徴とする前記[1]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[3]M1が、薬用人参の酵素処理物に含有されていることを特徴とする前記[1]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[4]薬用人参が、ウコギ科薬用人参である前記[2]又は[3]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[5]ウコギ科薬用人参が、オタネニンジン(Panax ginseng C.A. Meyer)である前記[4]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[6]薬用人参の発酵生産物が、薬用人参の乳酸菌発酵物である前記[2]、[4]又は[5]のいずれか一項に記載のGLP−1分泌促進剤。
[7]乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である前記[6]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[8]乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株 (受託番号:FERM BP−10123)である前記[6]又は[7]に記載のGLP−1分泌促進剤。
[9]医薬組成物、食品組成物、又は飼料組成物である前記[1]〜[8]のいずれか一項に記載のGLP−1分泌促進剤。
本発明のGLP−1分泌促進剤は、20(S)−プロトパナキサジオール 20−O−β−d−グルコピラノシド(M1)を含有することを特徴とする。
本発明のGLP−1分泌促進剤は、20(S)−プロトパナキサジオール 20−O−β−d−グルコピラノシド(M1)以外の成分を含んでもよい。
本発明において、GLP−1分泌促進剤とは、GLP−1の分泌を促進する効果を有する剤をいう。
薬用人参の大きさは、特に限定されないが、例えば、平均長径が0.2mm以下に裁断、粉砕、抽出、ペースト状化されることが好ましい。
前記発酵は、例えば、薬用人参を含有する培地を常法により減菌処理した後、該培地に微生物を接種し、発酵する方法が好ましく挙げられる。
培地中の窒素源の濃度は、微生物が生育できる通常の濃度であればよく、特に限定されない。培養開始時の窒素源の濃度は、通常は、約0.05〜10重量%が好ましく、約0.1〜5重量%がより好ましい。
pH緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、炭酸カルシウム等が好ましく挙げられる。
薬用人参の使用量は、特に限定されず、薬用人参の種類、形状、乾燥状態、及び培養条件等に応じて適宜選択され得る。薬用人参/培地全量の重量比は、好ましくは、約1/100〜50/100であり、より好ましくは、約5/100〜20/100であり、さらに好ましくは、約10/100〜15/100である。
本発明において、薬用人参の重量比の測定に使用する薬用人参は、内温約100〜180℃で約1〜6時間乾燥させた薬用人参に換算したものであることが好ましい。
前記培地は、上述した薬用人参以外の成分や添加剤を含んでも良い。
前記培地としては、溶媒抽出物を使用せず、例えばペースト状等の流動性又は粘性を有する前記薬用人参、人参茶などを薬用人参加工品として単独で使用することもできる。ペースト、薬用人参加工品等は市販品を使用してもよい。
前記微生物としては、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidphilus)、ラクトバチルス・ガセリ(L.gasseri)、ラクトバチルス・マリ(L.mali)、ラクトバチルス・プランタラム(L.plantarum)、ラクトバチルス・ブヒネリ(L.buchneri)、ラクトバチルス・カゼイ(L.casei)、ラクトバチルス・ジョンソニー(L.johnsonii)、ラクトバチルス・ガリナラム(L.gallinarum)、ラクトバチルス・アミロボラス(L.amylovorus)、ラクトバチルス・ブレビス(L.brevis)、ラクトバチルス・ラムノーザス(L.rhamnosus)、ラクトバチルス・ケフィア(L.kefir)、ラクトバチルス・パラカゼイ(L.paracasei)、ラクトバチルス・クリスパタス(L.crispatus)などのラクトバチルス属の乳酸菌;ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptcoccus thermophilus)などのストレプトコッカス属の乳酸菌;ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)などのラクトコッカス属の乳酸菌;ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B.longum)、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(B.adolescentis)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B.infantis)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B.breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム(B.catenulatum)などのビフィドバクテリウム属の乳酸菌;バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属細菌;サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyses cerevisiae)、トルラスポラ・デルブルエッキー(Torulaspora delbrueckii)、キャンジダ・ケフィアなどのサッカロマイセス属酵母;トルラスポラ属酵母;キャンジダ属酵母などが挙げられる。なかでも、ラクトバチルス属の乳酸菌、ストレプトコッカス属の乳酸菌、ラクトコッカス属の乳酸菌、ビフィドバクテリウム属の乳酸菌、サッカロマイセス属酵母等が好ましい。
また、発酵時間は、前記培地の組成、該培地の微生物の接種量、前記発酵温度等に応じて適宜設定され得るが、例えば、約2〜21日が好ましく、約7〜14日がより好ましい。発酵は、好気条件下で行ってもよく、嫌気条件下で行っても良い。発酵後は、さらに常法により加熱減菌することが好ましい。
薬用人参の発酵生産物は、薬用人参を発酵させて得られた発酵物(発酵液)そのもの、該発酵物を常法により加工したもの、該発酵物を常法により精製したものを含む。これらの加工方法としては、例えば、希釈、濃縮、乾燥、溶媒による抽出等が挙げられる。精製方法としては、例えば、ろ過、遠心分離等が挙げられる。
酵素処理に使用する酵素としては、例えば、β―グルコシダーゼ、α―アラビノシダーゼ、α―ラムノシダーゼ、α―ガラクトシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、キシラナーゼ、ラクターゼ、α―アミラーゼ、β―アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等が挙げられる。これらは1種単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。酵素は、好ましくは、β―グルコシダーゼ、α―アラビノシダーゼ、α―ラムノシダーゼ等であり、より好ましくは、β―グルコシダーゼ等である。これらは1種単独で又は2種以上を組合せて使用することができる。
薬用人参の酵素処理物は、薬用人参を酵素処理させて得られた処理物そのもの、該処理物を常法により加工したもの、該処理物を常法により精製したものを含む。これらの加工方法及び精製方法としては、上記した発酵生産物を加工及び精製する手段にしたがって行なわれて良い。
本発明のGLP−1分泌促進剤を医薬組成物として用いる場合には、本発明のGLP−1分泌促進剤と製薬学的に許容される製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが好ましい。医薬組成物の形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤(糖衣錠もしくは腸溶錠等のコーティング錠又は多層錠を含む)、散剤もしくは顆粒剤等の経口固形製剤の形態をとっていてもよいし、経口液体製剤の形態をとっていてもよいし、注射剤や点滴剤、坐剤等の非経口製剤の形態をとっていてもよい。これら製剤は、自体公知の方法により製造することができる。
物としては、例えば、賦形剤(例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロー
ス等)、結合剤(例えば、デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロー
ス液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等)、崩壊剤(例えば、デ
ンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等)、界面活性剤(例え
ば、ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等)、増粘剤(例えば、ヒド
ロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコール等)等が挙げられるが、これらに限定されない。錠剤又は顆粒剤は、
コーティング剤(例えば、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ、酢酸フタル酸
セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カ
ルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等)等で剤皮を
施してもよい。カプセル剤は、ハードカプセルの他、マイクロカプセル又はソフトカプセ
ル等であってもよい。固形製剤は、従来公知の方法により製造することができる。
(例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール等)、分散又は増粘剤(例えば
、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等)、乳化剤(例えば、グリセリン
脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等)、溶解補助剤(例えば、アラビアゴム、ポリ
ソルベート80等)、pH調整剤(例えば、クエン酸、クエン酸三ナトリウム等)、防腐
剤(例えば、パラオキシ安息香酸エステル類等)等を配合してもよい。
(実施例1)
<M1の作製>
ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)を、前培養培地(組成:グルコース30g/L、酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L)20mLに1白金耳植菌し、28℃にて48時間静置培養した。培養後の培養液2mLを、新たな前培養培地120mLに植菌し、28℃にて48時間静置培養した。
オタネニンジン(側根)粉末130g/L、酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g
/L、炭酸カルシウム10g/L)1Lに植菌し、28℃で10日間発酵した。得られた
培養液を、水酸化ナトリウムでpH5.0に調整し、次いで、噴霧乾燥することにより、
オタネニンジンの発酵生産物を得た。
NCI−H716細胞(ヒト腸管由来細胞株;ATCC社より購入)は37℃、5% CO2存在下で培養し、継代用培地としてRPMI1640(10%ウシ胎児血清、50 Units/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシン含有;Invitrogen社製)を使用した。マトリゲル(90 μL/well;BD社製)でコーティングした24ウェルプレートに細胞を5×105個/ウェルとなるようにDMEM培地(10%ウシ胎児血清、50 Units/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシン含有、高グルコース;Invitrogen社製)に懸濁して添加した。2日間培養後、KRBバッファー(Krebs−Ringer bicarbonate、0.2% BSA含有)に前記のM1を50μMとなるよう添加したものに培地を交換し、さらに2時間培養した。その後、培養上清をマイクロチューブに回収し、セリンプロテアーゼ阻害剤としてphenylmethylsulphonyl fluoride (50μg/mL、Sigma社製)を添加した。また、細胞はセルリカバリーソリューション(BD社製)を用いて回収し、RIPA(radioimmune precipitation assay)バッファーで細胞抽出物を作製した。培養上清および細胞抽出物は、測定に使用するまで−70℃以下で保存した。
培養上清中に分泌されたGLP−1の濃度を、「GLP−1, Active form Assay Kit」(IBL社製)を使用し、ELISA法で測定した。また、細胞抽出物中のタンパク質濃度を、BCAプロテインアッセイキット(Thermo社製)を用いて測定し、GLP−1分泌量をタンパク質濃度で標準化し、被験物質無添加(=対照)を1として表した。結果を図1に示す。
実施例1においてM1をジンセノシドRb1(和光純薬工業社製)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行ない、細胞培養及びGLP−1分泌量の測定を実施した。GLP−1分泌量の測定結果を図1に示す。これらの結果から、M1が、ジンセノシドRb1と比較して優れたGLP−1分泌促進作用を有することがわかった。
<オタネニンジンの発酵生産物>
(実施例2)
ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)を、前培養培地(組成:グルコース30g/L、酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L)20mLに1白金耳植菌し、28℃にて48時間静置培養した。培養後の培養液2mLを、新たな前培養培地120mLに植菌し、28℃にて48時間静置培養した。
オタネニンジン(側根)粉末130g/L、酵母エキス10g/L、大豆ペプチド5g/L、炭酸カルシウム10g/L)1Lに植菌し、28℃で10日間醗酵した。得られた培養液を、水酸化ナトリウムでpH5.0に調整し、次いで、噴霧乾燥することにより、オタネニンジンの発酵生産物145gを得た。
HPLC測定条件
上記オタネニンジンの発酵生産物の抽出物を50%エタノールに溶解させて試料溶液とし、HPLC分析に供した。分離カラムにYMC−Pack ODS−A (I.D. 250×4.6mm、 S−5μm、 12nm;YMC社製)を使用し、紫外吸光光度計(SPD−M10Avp;Shimadzu社製)で解析した。既知の濃度の標準溶液と比較することで、試料溶液中のM1とプロトパナクサジオール系人参サポニン(ジンセノシドRb1、Rb2、Rc、Rd)の含有量を算出した。結果を表1に示す。
(比較例2)
オタネニンジンの乾燥根をミルで粉砕し、直径約0.2mmの粉末状にした。このオタネニンジン粉末5gに対して50%エタノールを100mL添加し、室温で約1時間撹拌してオタネニンジンに含有される成分を抽出した。ろ紙でろ過した後、ろ液をロータリーエバポレーターに供して溶媒を除去し、少量の蒸留水を加えて再懸濁させた後に凍結乾燥し、オタネニンジン抽出物を得た。実施例2においてオタネニンジンの発酵生産物の抽出物をオタネニンジン抽出物に変更した以外は実施例2と同様の方法を用いて、得られたオタネニンジン抽出物中のM1、ジンセノシドRb1、Rb2、Rc、Rdの含有量を、HPLCで測定し、算出した。結果を表1に示す。また、被験物質としてM1の代りにオタネニンジン抽出物を使用した以外は実施例1と同様の方法を用いて細胞培養し、GLP−1分泌量を測定した。結果を図2に示す。図2中に示すオタネニンジン抽出物の濃度は、該抽出物中のM1、ジンセノシドRb1、Rb2、Rc及びRdの含有量の合計濃度を示す。
図2の結果から、実施例2のオタネニンジンの発酵生産物は、比較例2のオタネニンジン抽出物と比較して、優れたGLP−1分泌促進作用を有することがわかった。
実施例2において、オタネニンジンの発酵生産物の抽出溶媒(50%エタノール)を90%メタノールに変更した以外は実施例2と同様の方法を用いてオタネニンジンの発酵生産物の抽出物を作製し、オタネニンジンの発酵生産物中のM1とジンセノシドRb1、Rb2、Rc、Rdの含有量を算出した(表1)。また、該発酵物を使用して細胞培養し、GLP−1分泌量を測定した(図3)。
オタネニンジン粉末に添加する抽出溶媒(50%エタノール)を90%メタノールに変更した以外は比較例2と同様の方法を用いてオタネニンジン抽出物を作製し、該抽出物中のM1とジンセノシドRb1、Rb2、Rc、Rdの含有量を算出し(表1)、該抽出物を使用して細胞培養し、GLP−1分泌量を測定した(図3)。
Claims (9)
- 20(S)−プロトパナキサジオール 20−O−β−d−グルコピラノシド(M1)を含有することを特徴とするGLP−1分泌促進剤。
- M1が、薬用人参の発酵生産物に含有されていることを特徴とする請求項1に記載のGLP−1分泌促進剤。
- M1が、薬用人参の酵素処理物に含有されていることを特徴とする請求項1に記載のGLP−1分泌促進剤。
- 薬用人参が、ウコギ科薬用人参である請求項2又は3に記載のGLP−1分泌促進剤。
- ウコギ科薬用人参が、オタネニンジン(Panax ginseng C.A. Meyer)である請求項4に記載のGLP−1分泌促進剤。
- 薬用人参の発酵生産物が、薬用人参の乳酸菌発酵物である請求項2、4又は5のいずれか一項に記載のGLP−1分泌促進剤。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である請求項6に記載のGLP−1分泌促進剤。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株 (受託番号:FERM BP−10123)である請求項6又は7に記載のGLP−1分泌促進剤。
- 医薬組成物、食品組成物、又は飼料組成物である請求項1〜8のいずれか一項に記載の
GLP−1分泌促進剤。
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