KR20230009274A - 유산균 발효된 산조인을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산조인 추출물은 유산균 발효를 통해서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대 및 글리신(glycine)의 함량 증대가 나타났다. 또한, 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인함으로서, 수면 촉진 및 개선에 도움을 줄 수 있는 다양한 건강가공식품에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

유산균 발효된 산조인을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물 및 이의 제조 방법{Composition for promoting and improving sleep containing lactic acid bacteria fermented Zizyohus jujuba Miller and manufacturing method thereof}
본 발명은 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것이다.
국민건강보험공단 자료에 따르면 국내 수면장애 환자가 2014년부터 2018년 연평균 8%의 증가세를 보이고 있으며 2019년은 13%의 증가세로 수면장애 진료환자만 64만명에 달하고 있다. 2020년 코로나 19 사태로 인한 스트레스와 불안 등 정신적 요인과 더불어 생활패턴의 변화, 활동량 감소로 수면 장애 환자 문제는 급속한 증가세를 보이고 있다.
수면제로는 흔히 벤조디아제핀(benzodiazepine) 계열의 약물, 비-벤조디아제핀(non-benzodiazepine) 계열의 약물 또는 벤조디아제핀 수용체 작용제(benzodiazepine receptor agonists)와 같은 진정작용이 있는 항우울약이 처방된다. 하지만 이러한 약물들은 장기간 사용 시 내성, 의존성이 형성되어 일상생활에 어려움을 호소하게 되는 문제점이 있으며, 추가적으로 인지적 장애나 우울 등 다른 질병을 발생시키는 위험요인이 되기도 한다.
따라서, 많은 이들이 수면문제를 경험함에도 불구하고 부작용과 내성, 의존성 등에 대한 우려로 관련 솔루션을 취하지 못하고 있다. 급성불면증 환자의 약 40%가 만성불면증으로 전환되기에 수면문제는 조기진단과 대처가 중요하며, 부작용, 내성, 의존성에 대한 우려가 없는 천연 수면 솔루션을 개발하는 것이 시급한 실정이다.
산조인(Zizyphus Seed)는 갈매나무과(Rhamnaceae)의 산조(Zizyphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H. F. Chou)의 씨이다. 납작한 원형 또는 타원형을 띄며, 길이 5~9 mm, 폭 5~7 mm, 두께 3 mm이다. 적자색 혹은 자갈색을 띄며, 한쪽면은 평탄하고 다른 면은 돌기되어 있으며 중간에는 1 줄의 융기한 세로 줄 무늬가 있다. 한쪽 끝은 오목하고 선형인 배꼽점이 있고, 다른 끝에는 튀어나온 작은 합점이 있다.
산조인의 약리활성은 항염증 작용, 간보호 작용, 기억력 개선 및 항불안 활성 작용, 위염/위 궤양의 항산화 작용, 항암작용을 한다. 또한 중추신경 약리 효능이 있으며 로타로드 테스트(rota-rod test)에서 유의성 있게 지구력 시간 (endurance time) 감소와 티오펜탈 나트륨(thiopental sodium)으로 유도된 수면 실험에서 유의성 있게 개시시간(onset time)을 감소시켜 기존 한방적으로 쓰였던 진정작용, 수면 촉진 및 개선효과가 확인되었다.
산조인의 성분으로는 주주보사이드 A (jujuboside A), 주주보사이드 A2 (jujuboside A2), 주주보사이드 B (jujuboside B), 베툴린(betulin), 베툴린산 (betulinic acid), 스피노신(spinosin), 이소스피노신(isospinosin), 니코티플로린(nicotiflorin), 6"'-p-쿠마로일스피노신(6"'-p-coumaroylspinosin), 호베트리코사이드 C (hovetrichoside C), 다우코스테롤(daucosterol), 부틸 β-D-프룩토푸라노사이드(butyl β-D-fructofuranoside), 마그노플로린 (magnoflorine), 지지푸스 사포닌 Ⅲ (zizyphus saponin Ⅲ), 우르솔산(ursolic acid), 포몰산(pomolic acid), 아데노신(adenosine), 알피톨산(alphitolic acid) 등이 있으며 기존 효능연구 및 성분연구의 결과로 통상적으로 산조인의 활성지표성분은 스피노신(spinosin), 베툴린산(betulinic acid), 주주보사이드 A (jujuboside A)로 설정한다. 중추신경계에 대한 작용만을 고려한다면, 플라보노이드 C-글리코사이드(flavonoid C-glycoside)인 스피노신(spinosin)만을 지표성분으로 삼아도 무방하다(출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 생약연구원).
산조인은 앞서 언급한 바와 같이, 주로 한약재로 사용되며 지방유(약 31.8%)를 함유하고 있다. 특성상 약한 기름 냄새와 특이한 산미를 포함하여 섭취 시 호불호가 갈리고 있어 기능성 성분은 유지하거나 더 증대시키되 소비자 기호에 맞는 음료로의 개발이 필요한 실정이다. 기존에는 단맛을 띄는 용안육, 감초와 같은 한약재를 함께 달여 음용했으나, 이는 일반인이 한약재 활용 식품에 대해 가지고 있는 통상적인 맛에 대한 인식을 벗어나지 못하는 실정이며 식품으로서의 상용화를 위해서는 추가적으로 관능적 개선이 필요한 상황이다.
발효(fermentation)란 효소작용에 의하여 유기물에서 화학적 변화가 일어나는 대사과정을 말한다. 미생물이나 효소를 이용하여 원재료에 존재하지 않았던 여러 특성들과, 새로운 물질들의 생성이 이루어진다. 발효식품의 기능으로는 소화성 증대, 수용성 단백질 증가, 생체이용률(bioavailability) 증가, 항산화 활성의 증가, 영양성분의 합성 및 면역기능의 개선등이 있다. 발효를 통해 획득할 수 있는 저분자 물질들로부터 특수한 생리적 기능을 기대할 수 있다.
본 발명에서, 유산균 발효된 산조인 추출물이 수면 촉진 및 개선 효과가 있는지에 대하여 연구한 결과, 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대를 확인하였으며, 또한 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0110390호 (공개일자: 2019.09.30)
(Waldman, S.A., Terzic, A. Pharmacology and Therapeutics. Saunders, pp 849-855, 2009).
본 발명자들은 수면 촉진 및 개선에 유산균 발효된 산조인 추출물을 사용할 수 있는지 연구하였고, 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대를 확인하였으며, 또한 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과을 가짐을 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 수면 촉진 및 개선용 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 식품을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대를 나타내었다.
상기 스피노신(spinosin)은 중추신경계에 작용하는 대표적인 산조인의 활성지표성분으로 본 발명의 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물에서 스피노신(spinosin)의 함량 증대로 수면 촉진 및 개선 효과를 기대할 수 있다.
상기 글리신(glycine)은 아미노산 중 비대칭 탄소원자를 가지지 않은 유일한 물질이다. 글리코콜(glycocoll) 또는 아미노아세트산이라고도 하며 단백질의 가수분해물에서 추출된다. 인체에서 합성되는 글리신의 양은 매일 약 2.5 g으로 제한되어있으며, 외부 식품으로부터 섭취해줘야 한다. 글리신은 수면개선, 강박증, 정신분열증, 뇌졸중 회복에 효과가 있으며, 구체적으로는 렘(rapid eye movement, REM) 수면 동안 근육움직임의 억제를 매개한다는 것이 확인되었다. 본 발명의 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물에서 글리신(glycine)의 함량 증대로 수면 촉진 및 개선 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 C1-C4의 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 혼합물, 예를 들어, 30%의 에탄올과 70%의 물, 70%의 에탄올과 30%의 물 또는 100%의 물을 추출용매로 하여 추출되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "추출물"은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다.
상기 추출물은 열수 추출법, 용매 추출법, 냉침 추출법, 환류 추출법 및 초음파 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 있어서, 산조인 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 산조인 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 "발효물"은 산조인 추출물에서 유산균을 배양하여 수득한 발효액, 농축 발효액, 발효액의 건조물, 발효 여과액, 농축 발효 여과액, 또는 발효 여과액의 건조물의 형태로 이용할 수 있으며, 상기 유산균을 포함하는 것 또는 발효한 후 유산균을 제거한 발효 여액일 수 있다. 또한 상기 발효물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 또는 고체일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 볶은 산조인을 추출용매로 추출하여 액상 산조인 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 액상 산조인 추출물을 멸균하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 멸균한 액상 산조인 추출물에 유산균을 접종하여 발효하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (a)에서, 볶은 산조인을 추출용매로 추출한 후 필터링(filtering)하여 분무 건조(spray drying)를 통해 분말화하여 이를 정제수에 희석시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 식품은 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘을 더 포함할 수 있다.
상기 홉(humulus lupulus)은 길이 6~12 m의 삼과 한삼덩굴속의 식물로 유럽과 아시아 등지에 분포한다. 맥주의 원료로 주로 사용되며 8세기 후반부터 독일 등지에서 재배되기 시작했다. 홉 수확자들이 작업 중 졸음이 유발된다는 점에서 착안되어 최면작용이 있음이 밝혀졌으며 독일 위원회 E는 홉을 신경증, 불면증 치료로 사용을 허용했다. 홉의 주요 활성 성분 중에서 알파 고미산(α-bitteracid, humulones) 및 베타산(β-acid, lupulones)이 진정효과와 항우울효과를 발생시키며, 잔토휴몰(xanthohumol)이 GABA 수용체에 결합한다고 알려져 있다.
상기 L-테아닌(L-theanine)은 주로 녹차, 홍차, 버섯 등의 식품에 포함되어 있으며 식약청과 FDA가 인정한 안전한 기능성 원료이다. 임상시험 연구결과, 스트레스로 인한 긴장완화효과가 입증되었다. 그 작용기전은 흥분성 신호 전달체계인 글루타메이트(glutamate)를 억제시키고, 정신적 이완 상태의 뇌파(α파) 발생 증가로 알려져 있다.
상기 마그네슘은 천연 진정제라 불리며 항 스트레스 무기질로 정신의 흥분을 가라앉히는 작용을 한다. 300종 이상의 효소체계의 보조인자(cofactor)이기도 하며 근육을 이완시키는 작용을 하고, GABA 생성 필요 영양소이기도 하다.
본 발명의 수면 촉진 및 개선용 조성물에 상기 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘을 더 포함하여 보다 우수한 수면 촉진 및 개선 효과가 있는 다양한 건강가공식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 식품은 필수 성분으로서 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클 로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산조인 추출물은 유산균 발효를 통해서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대가 나타났으며, 부가적으로 항산화능의 증대 및 폴리페놀 함량의 증대도 나타났다. 또한 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인함으로서, 수면 촉진 및 개선에 도움을 줄 수 있는 다양한 건강가공식품에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 유산균에 의한 발효 전 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 유산균에 의한 12시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 유산균에 의한 24시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 유산균에 의한 48시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 ″％″는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
[실시예] 유산균 발효된 산조인 추출물의 제조
1 단계: 산조인 추출물의 제조 단계(실시예 1 내지 3)
실시예 1
볶은 산조인을 30%의 에탄올과 70%의 물로 상온에서 3시간 추출하였다. 상기 추출액을 필터링(filtering)하여 분무 건조(spray drying)를 통해 분말화하여 이를 25%의 농도로 정제수에 희석시켜 액상 산조인 추출물을 수득하였다.
실시예 2
볶은 산조인을 70%의 에탄올과 30%의 물로 상온에서 3시간 추출하였다. 상기 추출액을 필터링(filtering)하여 분무 건조(spray drying)를 통해 분말화하여 이를 25%의 농도로 정제수에 희석시켜 액상 산조인 추출물을 수득하였다.
실시예 3
볶은 산조인을 100%의 물로 80~100℃에서 3시간 동안 열수 추출하여 액상 산조인 추출물을 수득하였다.
상기 실시예 1 내지 3 중 실시예 2를 선택하여 다음 2 단계를 실시하였다.
2 단계: 산조인 추출물의 멸균 단계
상기 1 단계에서 수득한 액상 산조인 추출물을 121℃에서 15분간 멸균하였다.
3 단계: 유산균 배양 단계
락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)를 각각 121℃에서 15분간 멸균된 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 이를 원심분리(4℃, 20000 rpm, 15분)를 이용하여 PBS 완충용액(buffer)로 2회 세척하였다.
4 단계: 유산균 발효된 산조인 추출물의 제조단계
상기 3 단계에서 세척한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)를 정제수에 푼 뒤 혼합하여 유산균 혼합액을 제조한 후, 상기 2 단계에서 멸균한 산조인 추출물 대비 상기 유산균 혼합액을 1%로 접종한 후 37℃에서 12시간 내지 48시간 발효하여 유산균 발효된 산조인 추출물을 제조하였다. 발효시간 조건별(0시간, 12시간, 24시간, 48시간)로 유산균 발효된 산조인 추출물 샘플을 채취하여 분석하였다.
[실험예 1] 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 아미노산 종류별 및 스피노신 함량 분석
상기 발효시간 조건별(0시간, 12시간, 24시간, 48시간) 유산균 발효된 산조인 추출물 샘플을 채취하여 글리신(glycine)을 포함한 아미노산 종류별 및 스피노신(spinosin) 정량 분석을 위해 LC-MS 장비를 이용한 전처리 및 조건을 확립하였으며 추출 공정 및 함량 분석의 최적의 조건을 확인하였다. 분석은 서울대학교 농생명과학공동기기원(nicem)에 위치한 크로마토그래피실에서 진행하였다.
글리신(glycine)을 포함한 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석조건으로는, Dionex Ultimate 3000 (Thremo Dionex, USA)을 사용하였으며 컬럼(column)은 Inno C-18 컬럼(Youngjinbiochrom, Koera 4.6*250, 5 um), 컬럼의 온도는 40℃, 주입량(injection volume)은 0.5 μL이었다. 이동상으로는 40 mM 인산나트륨(sodium phosphate)과 아세토니트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol)을 혼합하여 이용하였으며 각각 266~450 nm에서 검출하였다(도 1 내지 도 4).
상기 HPLC 분석조건으로 아미노산 종류별 함량에 대한 분석은 하기 표 1에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
(함량 단위) mg/L mg/L mg/L mg/L
Aspartic acid 88.43 88.90 85.94 91.02
Glutamic acid 7.24 8.28 5.47 5.61
Asparagine 475.63 474.41 458.98 434.17
Serine 19.68 19.61 17.42 16.60
Glutamine 1.03 1.02 0.90 0.82
Histidine 4.99 4.82 4.00 3.92
Glycine 5.93 6.03 6.00 6.99
Threonine 15.80 15.62 13.50 10.67
Citrulline 1.54 2.14 2.47 2.80
Arginine 56.09 51.62 47.29 44.91
Alanine 18.69 19.62 17.69 15.69
GABA 32.78 32.71 32.39 31.88
Tyrosine 6.00 6.07 4.70 3.22
Valine 18.68 19.55 17.49 17.75
Phenylalanine 8.03 8.98 6.75 5.73
Isoleucine 6.95 7.30 6.41 5.89
Ornitnine 2.32 3.01 2.98 3.54
Leucine 9.39 10.25 8.29 7.94
Lysine 4.55 4.01 3.20 2.30
Proline 1335.49 1317.94 1061.08 1295.30
아미노산 종류별 함량 분석결과, 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에서는 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 글리신(glycine)의 함량 증대가 나타났다.
스피노신(spinosin) 함량에 대한 HPLC 분석조건으로는, Ultimate 3000 HPLC (Thermo Dionex, USA)을 사용하였으며 컬럼(column)은 Inno C-18 컬럼(Youngjinbiochrom, Koera 4.6*250,5 um), 컬럼의 오븐 온도는 45℃, 주입량 (injection volume)은 10 μL이었다. 이동상으로는 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 메탄올(methanol)을 이용하였으며 335 nm에서 검출하였다.
상기 HPLC 분석조건으로 스피노신(spinosin) 함량에 대한 분석은 하기 표 2에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
Spinosin 함량(mg/L) 19.06 19.29 20.17 20.05
스피노신(spinosin) 함량 분석결과, 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 12시간 내지 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신 함량의 증대가 나타났다.
[실험예 2] 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 항산화 효과 확인
발효 전 산조인 추출물 및 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH 시험법을 이용하여 활성산소 소거율을 측정하였다.
시험관에 농도별로 준비된 시료 용액 100 μL를 넣고, 100 μL의 에탄올과 50 μL의 0.5 mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)/에탄올 용액을 첨가하여 25℃의 실온에서 30분 동안 방치한 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거율(%)은 하기의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 기준 물질로는 항산화제인 아스코르빈산(ascorbic acid)을 사용하였다.
라디칼 소거율(%)=(B-A)/B × 100
A: 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도
B: 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도
발효시간(hr) 0 12 24 48
평균(mean) 52.04819 51.16466 48.59438 53.25301
표준편차(stdev) 0.481928 1.452461 0.139121 0.417362
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 항산화능이 증대된 것으로 나타났다.
[실험예 3] 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content, TPC) 분석 확인
총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법(Folin O. and Denis W., 1912, J Biol chem. 12:239-249)에 따라 실시하였다. 메탄올에 희석한 25 μL의 시료에 75 μL의 메탄올과 25 μL의 폴린-시오칼투 페놀 시약(Folin-Ciocalteu phenol reagent)을 첨가하여 6분간 실온에서 반응시킨 후, 포화용액 Na2Co3 100 μL를 첨가하여 혼합하고, 90분간 실온에서 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 갈릭산(gallic acid)을 사용하여 표준 검량선을 작성하였으며, 추출물의 총 폴리페놀 함량을 μg GAE(gallic acid equivalent)/mL로 나타내었다. 표준물질은 갈릭산(gallic acid)을 각각 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50 및 100 mg/mL로 제조하여 처리한 후 흡광도와 농도와의 관계를 나타내는 표준곡선을 만들어 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content)을 하기 표 4에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
평균(mean) 2742.006 2654.874 2742.006 2829.138
표준편차(stdev) 65.349 78.53972 78.53972 75.45853
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 총 폴리페놀 함량의 증대가 나타났다.
[제조예] 유산균 발효된 산조인 추출물 혼합 발효음료 제조
본 발명의 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 발효음료를 제조하였다. 바람직하게는 본 발명의 액상 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물(홉 10 kg으로부터 추출된 추출물 1 kg) 1 g, 글리신 2 g, L-테아닌 250 mg, 비타민 B6 0.6 mg, 비타민 B12 0.0012 mg, 마그네슘 200 mg, 합성과일향 0.4~1 mg, 감미료 1~3 g, 캐모마일 추출물 0.001~1 g, 타트체리 추출물 0.001~1 g, 감태추출물 0.001~1 g, 미강추출물 0.001~1 g, 발레리안 추출물 0.001~1 g, 레몬밤 추출물 0.001~1 g을 혼합하여 발효음료를 제조하였다.
[실험예 4] 본 발명의 발효된 산조인 추출물 혼합 발효음료에 대한 수면장애 개선 평가
평소에 수면장애로 불편을 겪고 있는 대상자 84명을 모집 후 최근 6개월간 신경계 관련 약품 및 건강기능식품을 복용한 경험이 있는 사람을 제외하고 무작위적으로 10명을 선발하였다.
정제수 110 mL에 합성과일향 1 mg, 감미료 3 g을 혼합하여 대조군 음료를 제조하였다. 실험군 음료는 상기 제조예의 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료를 의미한다.
이번 실험에서 최종 10명을 5명씩 2그룹으로 나누어 그룹 1은 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료(실험군 음료) 110 mL를 일주일 동안 잠자리에 들기 30분 전 섭취하게 하고 그 이후 일주일 동안은 대조군 음료을 일주일 동안 동일한 방법으로 섭취하였으며 그룹 2는 일주일 동안 대조군 음료를 먼저 섭취하고 그 이후 일주일 동안 상기의 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료(실험군 음료)를 섭취하였다. 무엇이 실험군 음료인지 평가자가 알 수 없도록 설계하였으며, 매일 수면 일지를 기록하고 숙면 효과에 대한 문답은 일주일 단위로 실시하였다. 문답은 일반적으로 수면장애의 평가 기준으로 활용되는 한국판 피츠버그 수면의 질 지수(PSQI-K)를 반영하여 간이적으로 설문을 작성해 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 5 내지 표 9에 나타내었다.
입면 시간(/10명)
일주일 평균값 실험군 대조군
15분 이내 2 1
15분 ~ 30분 5 2
30분 ~ 2시간 3 6
2시간 이상 0 1
수면 시간(/10명)
실험군 대조군
4시간 이하 0 2
4시간 ~ 7시간 5 7
7시간 이상 5 1
수면 방해 빈도(/10명)
실험군 대조군
지난 한주동안 없었다. 3 2
한 주에 1회~2회 5 4
한 주에 3회 이상 2 4
수면의 질(/10명)
실험군 대조군
수면 만족도 4.1 2.7
낮 시간 기능 저해 빈도(/10명)
실험군 대조군
지난 한주동안 없었다. 4 2
한 주에 1회~2회 5 5
한 주에 3회 이상 1 3
본 발명의 발효된 산조인 추출물 혼합 발효음료에 대한 수면장애 개선 평가를 실시한 결과, 상기 표 5 내지 표 9에서 확인되는 바와 같이 수면 촉진 및 개선 효과가 우수한 것으로 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매인 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  5. 다음의 단계를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법:
    (a) 볶은 산조인을 추출용매로 추출하여 액상 산조인 추출물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득한 액상 산조인 추출물을 멸균하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 멸균한 액상 산조인 추출물에 유산균을 접종하여 발효하는 단계.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식품은 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 식품.
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