CN103937716B - 人源发酵乳杆菌grx07及其应用 - Google Patents
人源发酵乳杆菌grx07及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株对慢性酒精性肝损伤有保护作用的人源发酵乳杆菌grx07及其应用。本发明的发酵乳杆菌grx07菌株是从江苏如皋长寿村人群肠道中分离的益生菌菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC？No.8874。本发明的发酵乳杆菌grx07具有显著体外抗氧化能力和抑制致病菌能力，并能显著降低慢性酒精性肝损大鼠血脂，血清内毒素水平；降低肝脏炎性因子的表达，缓解肝脏炎症反应；增加肝脏抗氧化特异蛋白Nrf2表达量，降低肝细胞凋亡百分数，因而对慢性酒精性肝损伤有显著保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株对慢性酒精性肝损伤有保护作用的人源发酵乳杆菌grx07及该菌株在发酵乳制品及功能性食品或药品方面的应用。
技术背景
由于长期大量饮酒所致的慢性肝脏疾病是造成人类肝脏损伤的重要原因之一，而在我国，随着人民生活水平的提高，酗酒者增多，长期酗酒也成为继病毒性肝炎后导致肝损伤的第二大病因。酒精性肝损伤初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。因此探寻酒精性肝病的发病机制和防治干预措施具有十分重要的意义。
酒精性损伤的发病机制较为复杂，其主要原因是乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物以及由此引起的代谢紊乱，也与内毒素、活性氧自由基、炎性因子等的损伤作用有关。具体为：（1）乙醛的毒性作用。乙醇在肝细胞中代谢成乙醛时形成的乙醛蛋白加合物不但会改变蛋白质的结构，影响其功能，也会引起自身免疫反应。（2）内毒素。长期大量摄入酒精会导致肠道菌群失调，肠道通透性增加，使内毒素大量进入血液，并可激活Kupffer细胞产生炎性因子，导致肝脏炎症反应。（3）活性氧自由基的损伤。乙醇代谢生成大量活性氧自由基，损害细胞DNA、蛋白质和磷脂，加剧肝损伤。（4）炎性因子的损伤。炎性因子诱发的炎症反应在酒精性肝损伤的发展中发挥了十分重要的作用。
目前，对酒精性肝损伤的防治措施也多基于其发病机制，如戒酒、营养治疗、抗氧化剂、抗内毒素制剂等。药物治疗也多基于抗氧化作用从而改善酒精所致的氧化应激，但药物的摄入可能进一步加重肝脏负担，并且存在一定的不良反应和毒副作用。寻找更为安全有效的干预措施就尤为迫切。
益生菌具有广泛的生理活性，如益生菌可调节肠道菌群，降低内毒素含量；可有效清除自由基，增强机体的抗氧化能力；可增强机体免疫力。益生菌的这些生理活性提示人们其对酒精性肝损伤的缓解可能有一定作用。而且，应用于人类的益生菌一般要来自于健康人体本身，以确保其安全性。但目前有关人源益生菌缓解酒精性肝损伤的研究报道相对较少，而市场上相关的功能性食品更是鲜见。因此，利用人源益生菌及其产品来缓解酒精性肝损伤具有重要的研究意义和广阔的市场前景。
本发明人针对酒精性肝损伤的发病机制，从江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得的益生菌中筛选具有显著抗氧化和抑菌活性的益生菌，并研究其对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用，从而获得本发明益生菌，并对其应用加以研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有抗氧化和抑制致病菌能力，并对慢性酒精性肝损伤具有保护作用的人源益生菌——发酵乳杆菌grx07。
下面详细地描述本发明。
本发明涉及一株人源发酵乳杆菌grx07，该菌株已于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，保藏号：CGMCCNo.8874。
本发明还公开了所述的发酵乳杆菌grx07在制备具有保肝作用发酵乳制品、功能性食品或药品中的应用。所述保肝作用是对慢性酒精性肝损伤的保护作用。
所述的发酵乳杆菌grx07的功能特性如下：
本发明的发酵乳杆菌grx07具有较高的体外抗氧化活性：菌体浓度为1.0×109cfu/mL的发酵乳杆菌grx07发酵液的羟自由基清除率为67.165%、DPPH自由基清除率为89.656%、还原能力A700nm值为2.752。
本发明的发酵乳杆菌grx07对致病菌具有较强的抑制能力：发酵乳杆菌grx07的发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有中度抑菌作用以上，抑菌圈直径分别为21.40mm、21.50mm、19.50mm。
本发明的发酵乳杆菌grx07对慢性酒精性肝损伤具有保护作用：动物实验结果表明，本发明的发酵乳杆菌grx07能显著降低慢性酒精性肝损伤大鼠ALT、AST水平；显著降低大鼠血脂、血清内毒素含量；改善大鼠氧化应激状态和炎症反应；增强大鼠肝脏抗氧化蛋白Nrf2的表达量；减少肝细胞凋亡百分数，对慢性酒精性肝损伤具有明显的保护作用，甚至优于保肝药物东宝甘泰。
附图说明
图1为发酵乳杆菌grx07的菌落形态图。
图2为发酵乳杆菌grx07革兰氏染色的菌体形态图。
图3为发酵乳杆菌grx07的生长曲线图。
图4为发酵乳杆菌grx07对大鼠血清ALT、AST含量的影响。注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05。
图5为发酵乳杆菌grx07对大鼠血清TC、TG含量的影响。注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05。
图6为发酵乳杆菌grx07对大鼠血清SOD活性的影响。注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05。
图7为发酵乳杆菌grx07对大鼠血清内毒素含量的影响。注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05。
图8为流式细胞术检测肝细胞Nrf2蛋白表达。A：空白组；B：模型组；C：药物组；D：grx07组。
图9为流式细胞术检测肝细胞凋亡百分率。A：空白组；B：模型组；C：药物组；D：grx07组。
具体实施方式
1、益生菌的分离及纯化
本发明所用的益生菌来源于新鲜、一星期内未服用抗生素的江苏如皋长寿村人群的黄软大便。
样品采集后，用灭菌竹签挑取粪便内部中心粪便样品放入运输培养基中，再加入1mL灭菌液体石蜡密封后，冷藏，2天内对样品进行分离。
在无菌操作台上用无菌样品稀释液将采集的样品稀释至相应稀释度后从试管中取0.5mL稀释液，接种于改良MRS培养基的灭菌培养皿中，置于厌氧罐中于37℃培养48h。观察并记录菌落形态和革兰氏染色菌体形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的益生菌进一步进行平板划线纯化，共获得30株益生菌，加脱脂乳作为保护剂进行真空冷冻干燥后，置于-80℃保藏。
2、益生菌发酵液抗氧化活性比较
益生菌在MRS液体培养基中37℃培养24h，传2代后，6000r/min，4℃离心10min，取上清液，并用上清液将菌体浓度调整为1.0×109cfu/mL，即得到益生菌发酵液。益生菌在生长代谢过程中产生的抗氧化活性成分可存在于其代谢产物、菌体表面或胞内。而益生菌的发酵液包含了益生菌代谢产物和活性菌体，因此，通过测定益生菌发酵液的抗氧化活性，可较快且简便地对益生菌的抗氧化能力进行初步评价。
对72株益生菌发酵液清除自由基能力以及还原能力进行了测定，结果见表1。
表1益生菌发酵液抗氧化能力
| 菌株 | ·OH清除率（%） | DPPH·清除率（%） | 还原能力（A700nm） |
| 1 | 33.87±0.06 | 45.32±0.07 | 1.69±0.03 |
| 3 | 43.70±0.05 | 62.35±0.33 | 1.26±0.02 |
| 5 | 20.02±0.02 | 51.25±0.05 | 1.19±0.04 |
| 6 | 30.18±0.02 | 42.75±0.02 | 1.30±0.04 |
| 6' | 46.07±0.06 | 44.29±0.04 | 1.33±0.01 |
| 8 | 37.38±0.01 | 49.63±0.12 | 1.38±0.01 |
| 12 | 22.93±0.03 | 38.71±0.01 | 1.27±0.02 |
| 22 | 48.93±0.01 | 50.61±0.15 | 1.06±0.01 |
| 23 | 40.54±0.03 | 59.91±0.01 | 1.22±0.03 |
| 25 | 41.03±0.01 | 37.87±0.06 | 1.30±0.05 |
| 1.12.8 | 67.17±0.23 | 89.65±0.29▲ | 2.75±0.12 |
| 1.12.12 | 46.47±0.01 | 47.22±0.07 | 1.29±0.07 |
| 2B | 16.12±0.02 | 46.71±0.11 | 1.38±0.03 |
| ab13 | 47.83±0.03 | 43.07±0.15 | 0.88±0.02 |
| ac6 | 52.56±0.05 | 18.84±0.03 | 0.65±0.01▼ |
| ac8 | 46.25±0.01 | 34.98±0.07 | 0.77±0.03 |
| ad7 | 51.54±0.03 | 63.83±0.01 | 2.03±0.04 |
| ae13 | 52.43±0.02 | 62.27±0.10 | 1.96±0.02 |
| ap10 | 57.43±0.12 | 49.75±0.03 | 1.37±0.03 |
| ap16 | 57.79±0.01 | 65.14±0.08 | 2.19±0.07 |
| C6 | 54.39±0.06 | 68.99±0.07 | 2.09±0.03 |
| C8' | 53.39±0.01 | 71.54±0.01 | 1.93±0.64 |
| C14 | 35.79±0.10 | 73.13±0.02 | 1.37±0.16 |
| d2 | 25.05±0.02 | 34.20±0.05 | 1.17±0.05 |
| d5 | 54.46±0.01 | 70.26±0.01 | 1.65±0.01 |
| d9 | 56.45±0.03 | 39.65±0.02 | 1.64±0.04 |
| f2 | 24.10±0.02 | 55.27±0.08 | 1.48±0.03 |
| f5 | 58.85±0.03 | 80.34±0.07 | 1.88±0.03 |
| f7 | 55.30±0.01 | 67.63±0.09 | 2.03±0.01 |
| f8 | 39.93±0.01 | 49.25±0.02 | 1.61±0.08 |
| f9 | 59.69±0.02 | 65.70±0.14 | 2.28±0.04 |
| f10 | 56.60±0.05 | 62.04±0.03 | 2.17±0.12 |
| f11 | 56.36±0.06 | 57.54±0.11 | 2.07±0.09 |
| f18 | 57.91±0.07 | 63.92±0.06 | 2.25±0.07 |
| g3 | 13.22±0.03▼ | 38.56±0.02 | 1.54±0.07 |
| g8 | 46.96±0.03 | 30.65±0.01 | 1.22±0.07 |
| g15 | 34.39±0.02 | 54.14±0.07 | 1.38±0.03 |
| i12 | 52.27±0.02 | 64.09±0.04 | 2.35±0.05 |
| k2 | 32.44±0.04 | 44.01±0.01 | 1.51±0.01 |
| 抗N42 | 44.95±0.01 | 56.12±0.03 | 1.43±0.06 |
| 抗P6 | 46.68±0.03 | 55.05±0.18 | 1.30±0.04 |
| N4 | 39.57±0.05 | 55.76±0.07 | 1.44±0.02 |
| N9 | 58.04±0.01 | 76.52±0.09 | 2.17±0.08 |
| O2 | 56.96±0.03 | 74.83±0.12 | 1.71±0.07 |
| O9 | 40.88±0.02 | 44.34±0.08 | 1.63±0.04 |
| O18 | 44.35±0.01 | 64.83±0.01 | 1.18±0.06 |
| q12 | 65.40±0.01 | 76.64±0.03 | 1.69±0.07 |
| R3 | 58.56±0.03 | 79.65±0.29 | 1.95±0.02 |
| 双ao7 | 29.11±0.01 | 30.29±0.09 | 1.30±0.01 |
| 双ac7 | 54.34±0.04 | 68.12±0.02 | 2.37±0.03 |
| 双C6 | 67.58±0.11 | 55.05±0.05 | 2.00±0.03 |
| 双C6' | 67.46±0.01 | 74.84±0.12 | 2.74±0.03 |
| 双C7 | 43.38±0.02 | 47.52±0.06 | 1.11±0.04 |
| 双J10 | 64.21±0.01 | 74.21±0.14 | 1.66±0.03 |
| 双K1 | 57.55±0.02 | 71.43±0.02 | 2.06±0.22 |
| 双M5 | 62.66±0.01 | 66.16±0.01 | 2.20±0.04 |
| 双P7 | 29.92±0.03 | 46.20±0.01 | 1.69±0.01 |
| 双W1 | 62.78±0.02 | 73.53±0.03 | 2.30±0.04 |
| 双W5 | 60.85±0.02 | 76.75±0.57 | 2.36±0.12 |
| T1 | 35.04±0.01 | 59.85±0.05 | 1.54±0.06 |
| T4 | 56.14±0.03 | 54.95±0.13 | 1.84±0.04 |
| grx07 | 69.93±0.01▲ | 85.28±0.14 | 2.85±0.03▲ |
| W2 | 58.86±0.01 | 64.90±0.10 | 2.15±0.03 |
| W3 | 59.69±0.01 | 75.15±0.03 | 2.48±0.08 |
| W12 | 56.57±0.03 | 79.29±0.03 | 2.36±0.06 |
| W14 | 37.75±0.04 | 58.55±0.04 | 1.28±0.01 |
| W15 | 53.46±0.01 | 76.96±0.05 | 2.35±0.06 |
| W16 | 50.75±0.02 | 68.29±0.06 | 2.40±0.02 |
| W18 | 56.36±0.02 | 75.34±0.08 | 2.06±0.02 |
| W19 | 47.63±0.01 | 17.54±0.06▼ | 0.86±0.01 |
| W20 | 55.09±0.05 | 70.06±0.02 | 2.04±0.02 |
| X3 | 42.80±0.01 | 30.20±0.07 | 0.81±0.10 |
| BB12 | 61.99±0.03 | 80.03±0.03 | 1.73±0.01 |
注：▼、▲分别表示同一列数据中的最低值和最高值。
由表1可知，72株益生菌发酵液对羟自由基均具有一定的清除能力，清除率的范围为13%～70%，其中grx07发酵液清除羟自由基能力最强，为69.93%；而g3最弱，仅相当于GRX07GRX07的18.9%。羟自由基清除率超过60%的菌株共有9株，占所有菌株的12.5%；而清除率在40%～60%之间的菌株共有45株，占所有菌株的62.5%，由此说明大多数菌株发酵液羟自由基清除率均大于40%。
3、益生菌发酵液SOD活性比较
SOD是清除超氧阴离子的最主要的酶，机体内维持一定水平的SOD对维持机体氧化还原平衡状态非常重要。研究表明，大多数益生菌具有SOD活性。将初步筛选出的35株益生菌按3%的接种量接入MRS液体培养基中，37℃培养，分别测定培养18h、24h和30h的SOD活性，结果如表2所示。
表2益生菌的SOD活性
实验前期对这35株菌的生长曲线进行了测定，发现这些菌株大多数均在培养18h后进入稳定期，因此选择了培养18h、24h和30h三个时间点测定其SOD活性。由表2可知，35株益生菌均具有SOD活性，但不同菌株之间差异非常大。菌株1.12.8在发酵30h时SOD活性最高，达到了56.99U/mL；而双W5在培养18h时的SOD活性最低，仅有0.20U/mL，仅相当于1.12.8的0.35%。从不同培养时间来看，培养18h时，双K1的SOD活性最高，达到51.67U/mL，其次为grx07，活性为51.24U/mL；培养24h时，1.12.8的SOD活性最高，达到56.84U/mL，其次为grx07，活性为53.25U/mL；培养30h时，1.12.8的SOD活性最高，为56.99U/mL，其次为f11，活性为52.24U/mL。部分菌株不同培养时间SOD活性差异较大，如双W5，在培养18h时，SOD活性仅有0.20U/mL，随着培养时间的延长，SOD活性显著升高，在培养30h时，SOD活性已达到19.81U/mL。
综合考虑不同培养时间的SOD活性，选择最高SOD活性超过40U/mL的15株菌，用于进一步研究其不同组分的抗氧化活性。
4、益生菌不同组分对·OH清除能力比较
对15株益生菌不同组分的羟自由基清除能力进行了测定，结果见表3。
表3益生菌对·OH的清除率
由表3可知，15株益生菌不同组分均有一定的羟自由基清除能力。其中，发酵上清液组分中羟自由基清除能力最强的是菌株GRX07，达到了56.42%。
5、益生菌不同组分抗脂质过氧化能力比较
对15株益生菌不同组分的抗脂质过氧化进行了测定，结果见表4。
表4益生菌对抗脂质过氧化的抑制率
由表4可知，15株菌不同组分均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中，发酵上清液中对DPPH自由基清除能力最强的为菌株f9，达到了58.63%；菌体中对DPPH自由基清除能力最强的为菌株GRX07，为44.91%。
6、益生菌不同组分的还原能力比较
对15株益生菌不同组分的还原能力进行了测定，结果见表5。
表5益生菌的还原能力
| 菌株 | 还原能力（A700nm） |
| 发酵上清液 | 菌体 | 胞内提取物 | |
| 空白培养基对照 | 0.28±0.03 | ||
| 双C6' | 2.59±0.05 | 0.092±0.003 | 0.079±0.002 |
| W3 | 2.36±0.03 | 0.052±0.001 | 0.024±0.001 |
| f9 | 2.24±0.06 | 0.043±0.001 | 0.027±0.001 |
| W2 | 1.95±0.05 | 0.041±0.001 | 0.029±0.001 |
| R3 | 1.85±0.02 | 0.037±0.001 | 0.025±0.003 |
| O2 | 1.62±0.06 | 0.078±0.003 | 0.068±0.001 |
| GRX07 | 2.52±0.04 | 0.117±0.004 | 0.092±0.004 |
| W12 | 1.91±0.03 | 0.041±0.004 | 0.027±0.001 |
| q12 | 1.60±0.05 | 0.088±0.004 | 0.038±0.006 |
| 1.12.8 | 2.50±0.01 | 0.074±0.001 | 0.044±0.001 |
| 双J10 | 1.59±0.06 | 0.043±0.005 | 0.033±0.001 |
| 双K1 | 1.96±0.14 | 0.041±0.002 | 0.028±0.001 |
| W15 | 2.13±0.06 | 0.047±0.002 | 0.033±0.008 |
| f11 | 1.93±0.02 | 0.039±0.004 | 0.027±0.001 |
| f18 | 1.98±0.02 | 0.044±0.001 | 0.029±0.001 |
| BB12 | 1.69±0.03 | 0.109±0.004 | 0.142±0.007 |
由表5可知，15株益生菌的不同组分均具有一定还原能力。其中，发酵上清液组分中，菌株双C6’的还原能力最强；菌体液组分中，菌株GRX07的还原能力最强；胞内提取物组分中，菌株GRX07的还原能力较强。
7、益生菌菌体液、发酵上清液的抑菌活性
采用牛津杯法，测定了15株益生菌菌体液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性，结果发现15株益生菌菌体液均无抑菌圈，初步认为这15株益生菌菌体没有抑菌活性。15株益生菌发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性测定结果见表6。
表6益生菌抑菌结果（mm）
| 菌株 | 金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | 沙门氏菌 |
| 双C6' | 16.53±2.78 | 13.83±0.76 | 14.17±1.04 |
| W3 | 19.83±2.02 | 13.17±0.29 | 14.57±1.26 |
| f9 | 18.53±1.41 | 18.87±1.48 | 18.17±0.42 |
| W2 | 15.15±0.07 | 13.17±0.29 | 14.33±0.58 |
| R3 | 16.33±0.58 | 15.57±0.58 | 14.67±2.52 |
| O2 | 17.90±2.17 | 17.05±0.58 | 16.30±0.51 |
| GRX07 | 21.40±1.53 | 21.50±1.24 | 19.50±1.84 |
| W12 | 18.17±2.08 | 13.08±1.71 | 15.67±0.58 |
| q12 | 16.58±0.87 | 12.33±2.83 | 15.33±1.04 |
| 1.12.8 | 21.85±0.71 | 23.85±0.92 | 20.91±1.17 |
| 双J10 | 19.15±1.73 | 18.63±0.92 | 18.90±0.45 |
| 双K1 | 18.33±1.53 | 19.07±0.87 | 17.17±0.71 |
| W15 | 16.67±2.89 | 15.13±1.83 | 15.17±0.29 |
| f11 | 18.39±2.52 | 12.53±0.71 | 15.67±2.31 |
| f18 | 20.53±2.04 | 12.67±0.58 | 16.67±2.25 |
| BB12 | 19.53±0.71 | 18.33±0.76 | 20.01±0.41 |
| MRS液体培养基 | - | - | - |
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(8mm)，“-”表示没有抑菌效果。
由表6可知，15株益生菌发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌这3种致病菌均有一定抑制能力，而MRS液体培养基则不具有抑菌活性，表明发酵上清液中发挥抑菌作用的是益生菌的代谢产物。这15株菌对金黄色葡萄球菌均具有较高的抑菌活性，除了菌株W2，其余菌株对金黄色葡萄球菌均为中度抑制以上。相较金黄色葡萄球菌，这15株菌总体对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用较弱，对大肠杆菌中度抑制以上的菌株只有6株，对沙门氏菌具有中度抑制作用的菌株有7株。同一株益生菌对不同致病菌的抑菌活性并无一致性，如f18对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较好抑制作用，尤其是对金黄色葡萄球菌高度抑制，但对大肠杆菌却只有低度抑制作用。按照判断标准，选择对3种致病菌的抑菌圈均>16mm的菌株，分别为f9、O2、GRX07、1.12.8、双J10、双K1，进一步研究不同处理因素对其抑菌活性的影响。
8、发酵上清液pH对抑菌活性的影响
将益生菌发酵上清液调整pH后，测定其对大肠杆菌的抑制活性，结果见表7。
表7pH调节对益生菌抑菌活性的影响
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(8mm)。
由表7可知，经调节pH后，6株菌对大肠杆菌仍有一定抑制作用，且随着pH的降低，抑菌圈直径增大，抑菌作用增强，表明低pH是产生抑菌效果的一个必要条件；而当pH调整为6.0后，抑菌活性显著降低，如双K1的抑菌活性已是非常微弱；但大部分菌株仍具有一定的抑菌效果，尤其是菌株GRX07，表明产生抑菌效果的物质不仅仅是有机酸。
9、发酵上清液蛋白酶处理对抑菌活性的影响
6株菌发酵上清液经不同蛋白酶处理后的抑菌活性见表3-4。
表8蛋白酶处理对益生菌抑菌活性的影响
注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(8mm)。
从表8可知，经3种蛋白酶处理后，6株菌的抑菌活性均有所降低。其中，6株菌的代谢产物经胰蛋白酶处理后抑菌效果下降明显，特别是菌株GRX07、双K1和1.12.8。6株菌的抑菌物质对蛋白酶K和胃蛋白酶的敏感性则有较大差异，菌株f9、O2、双J10经蛋白酶K和胃蛋白酶处理后，抑菌活性变化不大，而菌株GRX07、1.12.8经蛋白酶K和胃蛋白酶处理后，抑菌活性明显降低，说明1.12.8菌株代谢产物中的抑菌物质对蛋白酶敏感，已经排除了对热敏感的大分子蛋白质，由此表明抑菌物质中可能存在小分子热稳定多肽类细菌素。
10、对人工胃液、人工肠液和胆盐的耐受性的测定
作为性能优良的益生菌，要在人体发挥作用，必须要能够耐受人体的胃液和肠液，并在通过胃肠道后仍能保证活菌数在1×106cfu/mL以上时才能发挥生物活性。胃液pH值通常为3.0左右，正常人体的小肠胆汁盐含量在0.03%-0.30%之间；食物通过胃肠道的时间一般为2h左右。益生菌grx07对人工胃液、人工肠液和胆盐的耐受性结果分别见表9、表10和表11。
表9益生菌在不同pH值人工胃液中的活菌数及存活率
由表9可知，grx07对pH2.0和pH3.0的人工胃液具有良好的耐受能力。
表10益生菌在人工肠液中的活菌数及存活率
由表10可知，益生菌对人工肠液都有较好的耐受性，在仍处于中培养3h后，活菌数都在109fu/mL以上。其中，1.12.8在人工肠液中3h的存活率达到了50%以上。
表11益生菌在不同胆盐浓度中的活菌数及存活率
由表11可知，grx07益生菌对胆盐有一定的耐受性，而正常人体小肠中的胆汁酸盐含量在0.03%-0.3%范围内波动，所以grx07在高胆盐浓度的人体小肠中应该也具有较好的耐受性和存活率。
11、对抗生素敏感性的测定
随着益生菌的广泛应用，益生菌的安全性问题也逐渐引起人们关注。益生菌可能携带耐药基因，在适应中可能产生耐药性，因此有必要对其耐药性进行评价以初步验证其安全性。采用K-B法对益生菌grx07进行抗生素敏感性测定，结果见表12。
表12益生菌对常见抗生素的敏感性
| 抗生素种类 | 简称 | 含量（μg/片） | 抑菌圈（mm） |
| 呋喃妥因 | 呋 | 300 | 14.07±0.57 |
| 庆大霉素 | 庆 | 10 | 14.75±0.93 |
| 妥布霉素 | 妥 | 10 | 7.00±0.00 |
| 阿米卡星 | 丁 | 30 | 7.00±0.00 |
| 青霉素G | 青 | 10 | 28.11±0.47 |
| 苯唑西林 | 苯 | 1 | 8.50±0.50 |
| 氯霉素 | 氯 | 30 | 21.50±3.04 |
| 万古霉素 | 万 | 30 | 7.00±0.00 |
| 四环素 | 四 | 30 | 19.00±2.18 |
| 环丙沙星 | 环 | 5 | 7.00±0.00 |
| 头孢拉定 | Ⅵ | 30 | 18.30±1.54 |
| 头孢唑啉 | Ⅴ | 30 | 17.63±1.27 |
| 头孢哌酮 | 必 | 75 | 17.97±0.95 |
| 新霉素 | 新 | 30 | 14.00±2.29 |
| 磺胺异恶唑 | SIZ | 300 | 9.00±0.46 |
| 头孢呋辛 | 西 | 30 | 12.50±2.18 |
| 头孢曲松 | 菌 | 30 | 9.50±0.43 |
| 哌拉西林 | 氧 | 100 | 22.33±2.52 |
| 利福平 | 利 | 5 | 19.43±0.55 |
| 头孢噻肟 | 肟 | 30 | 7.00±0.00 |
| 卡那霉素 | 卡 | 30 | 7.00±0.00 |
| 红霉素 | 红 | 15 | 16.33±1.53 |
| 诺氟沙星 | 氟 | 10 | 9.05±0.37 |
| 链霉素 | 链 | 10 | 7.00±0.00 |
注：因为药敏纸片直径约为7mm，所以抑菌圈为7.00±0.00mm表示无抑菌圈。
由表12可知，GRX07对妥布霉素、阿米卡星、万古霉素、环丙沙星、头孢噻肟、卡那霉素、链霉素具有耐受性，无抑菌圈。
12、益生菌的鉴定
12.1益生菌API鉴定结果
利用API50CHL系列鉴定试验条对益生菌进行鉴定，结果如表13所示。
表13API50CHL系统鉴定结果
| 序号 | 项目 | GRX07 | 序号 | 项目 | GRX07 |
| 0 | CTRL | - | 25 | ESC | + |
| 1 | GLY | - | 26 | SAL | + |
| 2 | ERY | - | 27 | CEL | + |
| 3 | DARA | - | 28 | MAL | + |
| 4 | LARA | - | 29 | LAC | + |
| 5 | RIB | + | 30 | MEL | - |
| 6 | DXYL | + | 31 | SAC | - |
| 7 | LXYL | - | 32 | TRE | + |
| 8 | ADO | - | 33 | INU | - |
| 9 | MDX | - | 34 | MLZ | - |
| 10 | GAL | - | 35 | RAF | - |
| 11 | GLU | + | 36 | AMD | - |
| 12 | FRU | + | 37 | GLYG | - |
| 13 | MNE | + | 38 | XLT | + |
| 14 | SBE | + | 39 | GEN | + |
| 15 | RHA | - | 40 | TUR | + |
| 16 | DUL | + | 41 | LYX | + |
| 17 | INO | - | 42 | TAG | + |
| 18 | MAN | - | 43 | DFUC | + |
| 19 | SOR | + | 44 | LFUC | - |
| 20 | MDM | + | 45 | DARL | + |
| 21 | MDG | - | 46 | LARL | - |
| 22 | NAG | - | 47 | GNT | - |
| 23 | AMY | + | 48 | 2KG | - |
| 24 | ARB | + | 49 | 5KG | + |
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性
将表13中的实验结果提交至梅里埃公司的数据库进行在线比对，GRX07鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum），同源性为99.3%。
12.216SrDNA序列鉴定
采用法国梅里埃公司生产的API系列鉴定试剂条对菌株grx07进行API鉴定。菌株grx07的DNA的提取参照文献（张洁,徐桂花,尤丽琴.16SrDNA序列分析法鉴定乳酸菌[J].农产品加工：创新版,2009,4(1):47-49,69），以基因组DNA作为模板，采用50μl反应体系进行PCR扩增，引物为T1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQIDNO.1）、T2（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，SEQIDNO.1），由上海生物工程公司合成。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，64℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸8min。PCR扩增产物委托上海生工生物工程公司进行测序。将测序结果提交到NCBI数据库进行BLAST在线比对以得出结果。
API鉴定结果表明菌株grx07为发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum），同源性为99.3%；16SrDNA序列鉴定结果表明菌株grx07与多株发酵乳杆菌的16SrDNA序列同源性为98%，结合API鉴定结果，可将菌株grx07鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）。
13、发酵乳杆菌grx07的生物学特性研究
将活化3代后的发酵乳杆菌grx07在MRS固体培养基上进行平板划线，发现可形成明显的菌落，其菌落直径在0.5～2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，表面湿润光滑，具体见附图1。
挑取单菌落进行革兰氏染色，发现发酵乳杆菌grx07革兰氏染色阳性，菌体较短，成单或成对，两端圆形，不形成芽孢，具体见附图2。
将活化3代后的发酵乳杆菌grx07按3%的接种量接种到新鲜MRS液体培养基中，混匀并精确吸取300μL菌液到培养板上，放入微生物自动生长曲线分析仪中，参数设置为37℃培养48h，每1h读取一次数据。以OD600值为纵坐标，时间为横坐标作图，即为发酵乳杆菌grx07在MRS培养基中的生长曲线。由生长曲线图可知，发酵乳杆菌grx07在培养3h后进入对数生长期，在15h后进入稳定期，之后菌数一直较为稳定，具体见附图3。
14、发酵乳杆菌grx07对慢性酒精性肝损伤的保护作用
14.1发酵乳杆菌grx07的培养
将发酵乳杆菌grx07在MRS液体培养基中活化3代后的菌液于6000r/min离心10min收集菌体，并用灭菌生理盐水清洗菌体2次，在菌体沉淀中加入10%的灭菌脱脂乳作为冻存保护剂，调整其菌数为1.0×109mL-1，混匀后用MRS固体培养基确认活菌数。按每日需要量分装，于-80℃保存。使用前37℃水浴30min。
14.2动物分组及慢性酒精性肝损伤模型的建立
Wistar大鼠，40只，雄性140～160g，由扬州大学比较医学中心提供。许可证：SCXK(苏)2007-0001。采用标准配方杆状饲料饲养大鼠于扬州大学标准化动物房内，湿度40%～50%，室温23±2℃，自然光照，自由采食和饮水。
大鼠适应性饲养一周后，随机分为4组，每组10只，分别为：空白组，模型组，药物组，发酵乳杆菌grx07组。采取一天两次的灌胃方式：上午灌胃酒精，下午灌胃发酵乳杆菌grx07菌液或药物，两次灌胃间隔8h。
慢性酒精性肝损伤模型的建立：酒精灌胃按酒精浓度递增法，浓度按30%～35%～40%～45%逐渐增加，在2周内增至40%，持续灌胃6周，之后增至45%直至实验结束。药物组采用东宝甘泰（含东宝甘泰0.06g/mL）。所有样品均按0.1mL/10g.d剂量灌胃，实验时间为10周。
具体分组及处理见表14。
表14动物分组及处理
14.3发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏指数的影响
肝脏指数为肝脏与体重的比值，可一定程度反映实验动物的营养状态及肝脏的健康状态。末次灌胃后，禁食不禁水12h，取肝脏，计算各组大鼠的肝脏指数，结果如表15所示。
表15发酵乳杆菌grx07对大鼠肝指数的影响
| 组别 | 肝指数(%) |
| 空白组 | 2.83±0.13 |
| 模型组 | 3.11±0.17a |
| 药物组 | 3.00±0.15a |
| grx07组 | 2.91±0.13b |
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
由表4可知，模型组的肝指数明显高于空白组且具有显著性差异（P<0.05），发酵乳杆菌grx07的干预能使肝指数有所下降，显著低于模型组（P<0.05），与空白组无显著差异；药物组与模型组无显著差异。
14.4发酵乳杆菌grx07对大鼠血清ALT和AST水平的影响
AST和ALT主要存在于肝细胞胞浆内，当肝脏遭受损伤时，肝细胞内的转氨酶可进入血液中，引起血液中ALT和AST的升高，因此常用ALT和AST水平来反映肝细胞损伤以及判断损伤程度。血清中ALT和AST的水平是反映乙醇所致肝损伤最敏感的指标。且在酒精性肝损伤中，AST较ALT敏感，能反映肝损伤程度。
末次灌胃后，禁食不禁水12h，摘眼球取血，将所取血液于4℃静置30min后，4℃，3000r/min离心15min，取上清即为血清。采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中ALT和AST水平，结果如图4所示：与空白组相比，模型组大鼠血清中的ALT和AST含量明显升高，与空白组有显著差异（P<0.05），说明酒精对肝脏损伤较为严重；在灌胃东宝甘泰和发酵乳杆菌grx07后，ALT和AST均有不同程度改善，尤其是AST含量显著降低，说明发酵乳杆菌grx07和药物均能有效抑制酒精性肝损伤大鼠血清转氨酶的升高，从而改善酒精对肝脏的损伤程度。
14.5发酵乳杆菌grx07对大鼠血清TC和TG含量的影响
长期大量摄入酒精后，影响肝脏对脂类的代谢能力，脂肪酸的分解受到抑制而合成增加，从而导致脂肪在肝细胞内堆积，形成脂肪肝，使肝脏产生脂肪泡，进而引起血脂水平的升高。酒精诱发的脂肪肝以甘油三酯（TG）沉积为主，此外多数酒精肝患者也存在不同程度的高胆固醇症状，因此测定血清中TG和TC含量也可一定程度反映酒精对肝脏的损伤程度。
采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中TC和TG水平，结果如图5所示：与空白组相比，模型组大鼠的血脂水平显著升高（P<0.05），而灌胃药物、grx07则能使其不同程度的降低。与TC相比，药物对TG的改善效果更为明显，如与模型组相比，药物组TG含量显著降低（P<0.05），而TC含量有所降低，但差异不大。
14.6发酵乳杆菌grx07对大鼠血清SOD含量的影响
SOD是体内重要的抗氧化酶，可以有效清除自由基，保护细胞免受损伤。采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中SOD酶活性，结果如图6所示：与空白组相比，模型组SOD活性显著降低（P<0.05），说明长期大量摄入酒精，大鼠体内的SOD因清除大量自由基和脂质过氧化物而大量消耗。而通过发酵乳杆菌grx07干预后，大鼠血清SOD含量显著高于模型组（P<0.05），甚至超过了空白组水平。药物干预能一定程度提高慢性酒精性肝损伤大鼠血清SOD含量，但与模型组差异不显著。
14.7发酵乳杆菌grx07对大鼠血清内毒素含量的影响
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖成分，会引起严重的炎症级联反应。按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书，采用酶联免疫测定法对大鼠血清中内毒素含量进行了测定，结果如图7所示：与空白组相比，模型组和药物组的内毒素含量显著升高，差异非常显著（P<0.05），内毒素含量分别是空白组的2.83倍和2.44倍，说明长期大量摄入酒精导致了严重的内毒素血症，也从另一面反映了内毒素对酒精性肝损伤的作用。而摄入发酵乳杆菌grx07后，内毒素含量均极大降低（P<0.05），说明益生菌的补充和在肠道的定植能有效抑制有害菌群，使革兰氏阴性菌数量大大减少，所以内毒素含量也随之显著降低。14.8发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏氧化指标的影响
正常状态下，机体内的SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化物共同作用，能有效清除体内自由基和抵抗脂质过氧化反应，使机体维持氧化还原平衡状态。但长期大量摄入酒精促使机体产生过量的自由基，使得肝细胞内的GSH含量显著下降甚至耗竭，也造成SOD和GSH-Px活性随之降低，加剧了自由基对肝脏的损害。
制备大鼠肝脏10%肝匀浆，并于4℃，3000r/min离心15min，取上清即为10%肝匀浆上清液。大鼠10%肝匀浆上清液中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行，结果见表16。
表16发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏氧化指标的影响
| 组别 | MDA | SOD | GSH | GSH-Px |
| (nmol/mgprot) | (U/mgprot) | (mg/gprot) | 酶活力 | |
| 空白组 | 9.77±0.64 | 104.56±20.88 | 6.57±0.81 | 70.82±12.72 |
| 模型组 | 12.24±1.97a | 91.27±6.69a | 3.24±0.64a | 49.42±12.30a |
| 药物组 | 9.34±2.99b | 93.22±5.49a | 5.09±0.47ab | 57.40±7.54ab |
| grx07组 | 9.58±1.54b | 99.12±9.31b | 6.98±0.36b | 68.87±11.72b |
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
由表16可知，长期大量酒精的摄入诱导体内能发挥抗氧化功能的SOD、GSH和GSH-Px含量显著降低，与空白组相比分别降低了12.71%，50.68%和30.22%。而相应的，模型组大鼠肝脏脂质过氧化产物含量则显著升高。药物和发酵乳杆菌grx07的干预则可以显著提高SOD、GSH和GSH-Px含量，降低MDA含量。其中东宝甘泰抗脂质过氧化效果较好，药物组MDA含量甚至低于空白组。grx07组的GSH-Px含量、SOD和GSH含量则明显超过了药物组。
14.9发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏ADH、ATP酶的影响
酒精在体内有三条主要的代谢途径，其中之一就是肝细胞内的ADH通路。ADH活性的降低会影响肝脏对酒精的正常代谢，导致乙醇及其代谢产物在肝脏大量累积而造成肝脏损伤。肝脏中的ATP酶主要存在于线粒体中，脂质过氧化反应可激活磷脂酶C、磷脂酶D分解线粒体膜磷脂，改变其流动性和通透性，使膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase等的脂质微环境失常，影响其功能，并导致ATP减少，从而进一步加剧酒精对肝脏的损伤。大鼠10%肝匀浆上清液中ADH和ATP酶含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行，结果见表17。
表17发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏ADH、ATP酶的影响
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
由表17可知，大鼠长期摄入大量酒精后，肝脏中的ADH水平大大降低，与空白组相比，降低了43.96%。同样的，肝脏中的Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase含量也明显降低，与空白组相比，分别下降了37.21%和69.43%。而药物和发酵乳杆菌grx07的干预则显著提高了肝脏ADH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase含量。grx07组作用效果较好，明显优于药物组。
14.10发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏细胞因子的影响
细胞因子是机体防御系统的重要组成部分，既是免疫反应的产物，又可以增强免疫反应，促进肝细胞损伤。在酒精性肝病的发病机制中，酒精可通过多种途径导致机体巨噬细胞功能异常、脂肪组织的蓄积、氧化应激的产生和内毒素的产生，进而刺激炎性细胞释放各种细胞因子和炎性介质，导致肝细胞损伤及肝脏炎性反应。大鼠10%肝匀浆上清液中细胞因子含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行，结果见表18。
表18发酵乳杆菌grx07对大鼠肝脏细胞因子的影响
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
由表18可知，模型组大鼠肝脏TNF-α、IL-6和VEGF水平较空白组显著升高，表明大鼠长期大量摄入酒精后，肝脏发生了明显的炎症反应，导致了严重的肝损伤。并且，VEGF含量的升高促进了TNF-α和IL-6的释放。通过药物和益生菌干预后，TNF-α、IL-6和VEGF水平有明显降低，其中grx07组降低TNF-α和IL-6水平效果也较好，显著优于药物组。与空白组相比，模型组大鼠肝脏TGF-β1水平显著升高，药物组和益生菌组大鼠肝脏TGF-β1水平与模型组相比则显著降低，其中grx07组效果较好，而药物降低TGF-β1水平的效果则较弱。与空白组相比，模型组大鼠肝脏NF-κB水平显著升高，益生菌组大鼠肝脏NF-κB水平与模型组相比则显著降低，grx07组效果较好；药物组效果则较弱，NF-κB水平与模型组相比无显著差异。
14.11发酵乳杆菌grx07对大鼠肝细胞Nrf2蛋白表达的影响
Nrf2(NF-E2-relatedfactor2)是调节机体和细胞内抗氧化应激反应，维持正常氧化还原平衡的重要转录因子，在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥着重要的作用。
将洗涤并重悬后的肝细胞悬液调整浓度为1×106个/mL，取0.1mL单细胞悬液加入Nrf2单克隆抗体和二抗各1μL，室温避光孵育30min后加入PBS5mL离心洗涤一次，弃上清。上机检测前加入PBS0.1mL，经500目筛网过滤后上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设抗体的本底对照和阴性对照。Nrf2在肝组织中的表达水平以荧光强度（I）表示。
计算公式：I=Log(x-mode)×340
采用流式细胞技术检测了大鼠肝细胞Nrf2蛋白表达的情况，结果如表19和图8所示。
表19发酵乳杆菌grx07对大鼠肝细胞Nrf2蛋白表达的影响
| 组别 | 蛋白荧光强度 |
| 空白组 | 176.74±3.61 |
| 模型组 | 66.61±2.15a |
| 药物组 | 90.84±4.14ab |
| grx07组 | 135.89±5.36ab |
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
结合表19和图8可知，模型组大鼠肝细胞Nrf2的荧光蛋白表达强度明显低于空白组。而灌胃药物和发酵乳杆菌grx07后，都能使大鼠肝细胞Nrf2蛋白表达量明显增高。其中发酵乳杆菌grx07作用效果较好，药物组的Nrf2蛋白表达量相较模型组有所升高，但与发酵乳杆菌grx07组相比，效果较弱。
14.12发酵乳杆菌grx07对大鼠肝细胞凋亡百分数的影响
细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,是细胞在生理或病理信号刺激下启动自身凋亡基因发生的主动自杀行为。研究表明酒精是肝细胞的一种凋亡诱导剂,肝细胞的凋亡在酒精性肝病的发生和发展中起着重要的作用，并且肝细胞的凋亡程度与肝损伤的严重程度密切相关。按照美国BD公司细胞凋亡试剂盒说明书，采用流式细胞技术检测了大鼠肝细胞凋亡百分数，结果如表20和图9所示。
表20发酵乳杆菌grx07对大鼠肝细胞凋亡百分数的影响
| 组别 | 肝细胞凋亡百分数 |
| 空白组 | 6.53±0.73 |
| 模型组 | 23.30±1.69a |
| 药物组 | 15.6±1.51ab |
| grx07组 | 10.47±1.64ab |
注：a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比，P<0.05
结合表20和图9可知，大鼠长期大量摄入酒精后，模型组大鼠肝细胞凋亡百分数大大升高，已高达空白组的3.57倍，差异极显著，说明肝脏受损较严重。而通过药物和发酵乳杆菌grx07干预后可以改善肝细胞凋亡情况，发酵乳杆菌grx07效果较好，优于药物。而相较发酵乳杆菌grx07组，药物组肝细胞凋亡也较为严重，其肝细胞凋亡百分数是空白组的2.39倍，说明药物在保护肝细胞免受酒精损伤方面的作用效果不如发酵乳杆菌grx07。
实施例1：发酵乳杆菌grx07发酵剂的制备
将发酵乳杆菌grx07原始菌种接种于12%的脱脂乳（115℃灭菌20min）中，37℃培养18～24h至凝乳，连续活化两代，作为母发酵剂。将母发酵剂按3%～5%接种量接种于12%的脱脂乳（115℃灭菌20min）中，37℃培养18～24h至凝乳，此时活菌数可达到109～1010cfu/mL，即得到发酵乳杆菌grx07发酵剂。
实施例2：利用发酵乳杆菌grx07制备功能性发酵乳
将预处理后的牛乳加热到60℃左右，加入6%蔗糖，经充分溶解后，在20MPa压力下进行均质。然后经95℃/5min条件下热处理后，冷却至38℃。按5%接种量接入按实施例1制备的发酵乳杆菌grx07发酵剂，在37℃下发酵14-18h至凝乳，冷却后于4℃冷藏，即得到发酵乳杆菌grx07功能性发酵乳。
实施例3：利用发酵乳杆菌grx07制备益生菌乳饮料
将脱脂乳粉制成12%的复原脱脂乳350kg，采用95℃/8～10min热处理后，冷却至37～40℃。按3%～5%接种量接种发酵乳杆菌grx07发酵剂，在37℃培养20～24h，终点酸度控制在155～170°T；加入650kg经90～110℃/5～10s杀菌的糖、稳定剂的混合物（该混合物的组成为0.9%～1.4%的果胶和13.8%～15.4%的蔗糖），混合均匀后20～25MPa均质，然后在72℃/15s条件下热处理，冷却至15～20℃，采用无菌或卫生灌装，即得到1000kg发酵乳杆菌grx07乳饮料。
实施例4：发酵乳杆菌grx07冻干粉的制备
将脱脂乳粉、低聚果糖、酵母粉、蛋白胨和纯净水分别按质量百分比12.0%、2.0%、0.8%、0.7%、84.5%充分混匀后，预热到60～65℃，20～25MPa均质。然后经95℃/20～30min热处理后，冷却至37～40℃。按3%～5%接种量接入按实施例1制备的发酵乳杆菌grx07发酵剂，在37℃培养20～24h，离心，真空冷冻干燥至含水量小于3%，即制得发酵乳杆菌grx07冻干粉。称取1.5g发酵乳杆菌grx07冻干粉与麦芽糊精、低聚果糖等量混合后制成胶囊剂，即得到含发酵乳杆菌grx07的药物组合物。也可将发酵乳杆菌grx07冻干粉压碎成粉末状，并加入适量奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片状产品，用于日常食用或作为保健品。
Claims (4)
1.一株人源发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）grx07，它的保藏号：CGMCCNo.8874。
2.权利要求1所述的人源发酵乳杆菌grx07在制备对慢性酒精性肝损伤具有保护作用的发酵乳制品中的应用。
3.权利要求1所述的人源发酵乳杆菌grx07在制备对慢性酒精性肝损伤具有保护作用的功能食品中的应用。
4.权利要求1所述的人源发酵乳杆菌grx07在制备治疗和预防慢性酒精性肝损伤药物中的应用。
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