CN103893215A - 干酪乳杆菌grx12在制备治疗慢性酒精性肝损伤产品中的应用 - Google Patents
干酪乳杆菌grx12在制备治疗慢性酒精性肝损伤产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株人源干酪乳杆菌grx12在慢性酒精性肝损伤方面的应用。本发明的干酪乳杆菌grx12菌株是从江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得的具有显著体外抗氧化能力的益生菌菌株,该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号:CGMCC No.7696。本发明的干酪乳杆菌grx12能显著降低酒精性肝损伤大鼠血脂、血清内毒素水平;降低肝脏炎性因子的表达,缓解肝脏炎症反应,对慢性酒精性肝损伤表现出明显的保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,特别涉及一株对慢性酒精性肝损伤有保护作用的人源干酪乳杆菌grx12在发酵乳制品、功能食品及药品方面的应用。
技术背景
由于长期大量饮酒所致的慢性肝脏疾病是造成人类肝脏损伤的重要原因之一,而在我国,随着人民生活水平的提高,酗酒者增多,长期酗酒也成为继病毒性肝炎后导致肝损伤的第二大病因。酒精性肝损伤初期通常表现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。因此探寻酒精性肝病的发病机制和防治干预措施具有十分重要的意义。
酒精性损伤的发病机制较为复杂,其主要原因是乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物以及由此引起的代谢紊乱,也与内毒素、活性氧自由基、炎性因子等的损伤作用有关。具体为:(1)乙醛的毒性作用。乙醇在肝细胞中代谢成乙醛时形成的乙醛蛋白加合物不但会改变蛋白质的结构,影响其功能,也会引起自身免疫反应。(2)内毒素。长期大量摄入酒精会导致肠道菌群失调,肠道通透性增加,使内毒素大量进入血液,并可激活Kupffer细胞产生炎性因子,导致肝脏炎症反应。(3)活性氧自由基的损伤。乙醇代谢生成大量活性氧自由基,损害细胞DNA、蛋白质和磷脂,加剧肝损伤。(4)炎性因子的损伤。炎性因子诱发的炎症反应在酒精性肝损伤的发展中发挥了十分重要的作用。
目前,对酒精性肝损伤的防治措施也多基于其发病机制,如戒酒、营养治疗、抗氧化剂、抗内毒素制剂等。药物治疗也多基于抗氧化作用从而改善酒精所致的氧化应激,但药物的摄入可能进一步加重肝脏负担,并且存在一定的不良反应和毒副作用。寻找更为安全有效的干预措施就尤为迫切。
益生菌具有广泛的生理活性,如益生菌可调节肠道菌群,降低内毒素含量;可有效清除自由基,增强机体的抗氧化能力;可增强机体免疫力。益生菌的这些生理活性提示人们其对酒精性肝损伤的缓解可能有一定作用。而且,应用于人类的益生菌一般来自于健康人体本身,安全性极高。但目前有关益生菌缓解酒精性肝损伤的研究报道相对较少,而市场上相关的保健食品更是鲜见。因此,利用益生菌及其产品来缓解酒精性肝损伤具有重要的研究意义和广阔的市场前景。
本发明从江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得具有显著体外抗氧化活性的专利益生菌——干酪乳杆菌grx12;该菌株在申请号2013103127847的中国申请专利中已公开,但未揭示在慢性酒精性肝损伤方面的保护作用。
发明内容
本发明的目的是提供干酪乳杆菌在grx12酒精性肝损伤方面的应用,特别是在长期大量摄入酒精所致的慢性酒精性肝损伤治疗与康复中的应用。
本发明所述的干酪乳杆菌是,该菌株已于2013年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus casei,保藏号:CGMCC No.7696。
本发明公开了干酪乳杆菌grx12在制备治疗慢性酒精性肝损伤药物中的应用。
本发明进一步提供了干酪乳杆菌grx12在制备具有缓解酒精性肝损伤功能的发酵乳制品及功能食品中的应用。
本发明的干酪乳杆菌grx12能显著降低酒精性肝损伤大鼠血脂、血清内毒素水平;降低肝脏炎性因子的表达,缓解肝脏炎症反应,对慢性酒精性肝损伤表现出明显的保护作用。
附图说明
图1为干酪乳杆菌grx12对大鼠血清ALT、AST含量的影响。注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05。
图2为干酪乳杆菌grx12对大鼠血清TC、TG含量的影响;注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05
图3为干酪乳杆菌grx12对大鼠血清SOD活性的影响;注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05。
图4为干酪乳杆菌grx12对大鼠血清内毒素含量的影响;注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05。
具体实施方式
1.干酪乳杆菌grx12的培养
将干酪乳杆菌grx12在MRS液体培养基中活化3代后的菌液于6000r/min离心10min收集菌体,并用灭菌生理盐水清洗菌体2次,在菌体沉淀中加入10%的灭菌脱脂乳作为冻存保护剂,调整其菌数为1.0×109mL-1,混匀后用MRS固体培养基确认活菌数。按每日需要量分装,于-80℃保存。使用前37℃水浴30min。
2.动物分组与慢性酒精性肝损伤模型的建立
Wistar大鼠,40只,雄性140~160g,由扬州大学比较医学中心提供。许可证:SCXK(苏)2007-0001。采用标准配方杆状饲料饲养大鼠于扬州大学标准化动物房内,湿度40%~50%,室温23±2℃,自然光照,自由采食和饮水。
大鼠适应性饲养一周后,随机分为4组,每组10只,分别为:空白组,模型组,药物组,干酪乳杆菌grx12组。采取一天两次的灌胃方式:上午灌胃酒精,下午灌胃益生菌液或药物,两次灌胃间隔8h。
慢性酒精性肝损伤模型的建立:酒精灌胃按酒精浓度递增法,浓度按30%~35%~40%~45%逐渐增加,在2周内增至40%,持续灌胃6周,之后增至45%直至实验结束。药物组采用东宝甘泰(含东宝甘泰0.06g/mL)。所有样品均按0.1mL/10g.d剂量灌胃,实验时间为10周。
具体分组及处理见表1。
表1动物分组及处理
3.干酪乳杆菌grx12对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用
3.1干酪乳杆菌grx12对大鼠主要脏器指数的影响
脏器指数为脏器与体重的比值,可一定程度反映实验动物的营养状态及脏器的健康状态。酒精对脏器造成的影响中,对肝脏的影响尤为明显。末次灌胃后,禁食不禁水12h,取肝脏、脾脏、肾脏和心脏,计算各组大鼠的脏器指数。大鼠主要脏器指数见表2。
表2大鼠主要脏器指数
组别 | 肝指数(%) | 心指数(%) | 脾指数(%) | 肾指数(%) |
空白组 | 2.83±0.13 | 0.35±0.02 | 0.19±0.04 | 0.69±0.05 |
模型组 | 3.11±0.17a | 0.35±0.04 | 0.18±0.03 | 0.70±0.03 |
药物组 | 3.00±0.15a | 0.37±0.04 | 0.17±0.02 | 0.70±0.05 |
grx12组 | 2.83±0.08b | 0.34±0.02 | 0.17±0.03 | 0.69±0.06 |
注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05
由表2可知,模型组大鼠肝指数较空白组显著增加(P<0.05),说明长期大量的酒精摄入造成了肝脏肿胀,变大。而通过益生菌grx12干预后,可改善酒精对肝脏造成的损伤,使其恢复至正常水平。
从表2也可知,模型组的心指数、脾指数和肾指数与空白组均无显著差异;grx12组与空白组、模型组相比,也无显著差异。
3.2干酪乳杆菌grx12对大鼠血清ALT和AST水平的影响
AST和ALT主要存在于肝细胞胞浆内,当肝脏遭受损伤时,肝细胞内的转氨酶可进入血液中,引起血液中ALT和AST的升高,因此常用ALT和AST水平来反映肝细胞损伤以及判断损伤程度。血清中ALT和AST的水平是反映乙醇所致肝损伤最敏感的指标。且在酒精性肝损伤中,AST较ALT敏感,能反映肝损伤程度。末次灌胃后,禁食不禁水12h,摘眼球取血,将所取血液于4℃静置30min后,4℃,3000r/min离心15min,取上清即为血清。采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中ALT和AST水平,结果如图1所示。
由图1可知,与空白组相比,模型组大鼠血清中的ALT和AST含量明显升高,与空白组有显著差异(P<0.05),说明酒精对肝脏损伤较为严重;在灌胃东宝甘泰和益生菌grx12后,ALT和AST均有不同程度改善,尤其是AST含量显著降低,说明益生菌grx12和药物均能有效抑制酒精性肝损伤大鼠血清转氨酶的升高,从而改善酒精对肝脏的损伤程度。
3.3干酪乳杆菌grx12对大鼠血清TC和TG水平的影响
长期大量摄入酒精后,影响肝脏对脂类的代谢能力,脂肪酸的分解受到抑制而合成增加,从而导致脂肪在肝细胞内堆积,形成脂肪肝,使肝脏产生脂肪泡,进而引起血脂水平的升高。酒精诱发的脂肪肝以甘油三酯(TG)沉积为主,此外多数酒精肝患者也存在不同程度的高胆固醇症状,因此测定血清中TG和TC含量也可一定程度反映酒精对肝脏的损伤程度。采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中TC和TG水平,结果如图2所示。
由图2可知,与空白组相比,模型组大鼠的血脂水平显著升高(P<0.05),而灌胃药物、grx12则能使其不同程度的降低,其中益生菌grx12效果较好,与空白组无显著差异。与TC相比,药物对TG的改善效果更为明显,如与模型组相比,药物组TG含量显著降低(P<0.05),而TC含量有所降低,但差异不大。3.4干酪乳杆菌grx12对大鼠血清SOD含量的影响
SOD是体内重要的抗氧化酶,可以有效清除自由基,保护细胞免受损伤。采用日立7020型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中SOD酶活性,结果如图3所示。
由图3可知,与空白组相比,模型组SOD活性显著降低(P<0.05),说明长期大量摄入酒精,大鼠体内的SOD因清除大量自由基和脂质过氧化物而大量消耗。而通过益生菌grx12干预后,大鼠血清SOD含量显著高于模型组(P<0.05),甚至超过了空白组水平。药物干预能一定程度提高慢性酒精性肝损伤大鼠血清SOD含量,但与模型组差异不显著。
3.5干酪乳杆菌grx12对大鼠血清内毒素含量的影响
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖成分,会引起严重的炎症级联反应。按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书,采用酶联免疫测定法对大鼠血清中内毒素含量进行了测定,结果如图4所示。
由图4可知,与空白组相比,模型组和药物组的内毒素含量显著升高,差异非常显著(P<0.05),内毒素含量分别是空白组的2.83倍和2.44倍,说明长期大量摄入酒精导致了严重的内毒素血症,也从另一面反映了内毒素对酒精性肝损伤的作用。而摄入益生菌grx12后,内毒素含量均极大降低(P<0.05),grx12组血清内毒素含量甚至略低于空白组。说明益生菌的补充和在肠道的定植能有效抑制有害菌群,使革兰氏阴性菌数量大大减少,所以内毒素含量也随之显著降低。
3.6干酪乳杆菌grx12对大鼠肝脏氧化指标的影响
正常状态下,机体内的SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化物共同作用,能有效清除体内自由基和抵抗脂质过氧化反应,使机体维持氧化还原平衡状态。但长期大量摄入酒精促使机体产生过量的自由基,使得肝细胞内的GSH含量显著下降甚至耗竭,也造成SOD和GSH-Px活性随之降低,加剧了自由基对肝脏的损害。
制备大鼠肝脏10%肝匀浆,并于4℃,3000r/min离心15min,取上清即为10%肝匀浆上清液。大鼠10%肝匀浆上清液中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行,结果见表3。
表3grx12对大鼠肝脏氧化指标的影响
组别 | MDA(nmol/mgprot) | SOD(U/mgprot) | GSH(mg/gprot) | GSH-Px酶活力 |
空白组 | 9.77±0.64 | 104.56±20.88 | 6.57±0.81 | 70.82±12.72 |
模型组 | 12.24±1.97a | 91.27±6.69a | 3.24±0.64a | 49.42±12.30a |
药物组 | 9.34±2.99b | 93.22±5.49a | 5.09±0.47ab | 57.40±7.54ab |
grx12组 | 9.85±1.99b | 102.84±15.99b | 5.92±0.15ab | 63.27±7.85ab |
注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05
由表3可知,长期大量酒精的摄入诱导体内能发挥抗氧化功能的SOD、GSH和GSH-Px含量显著降低,与空白组相比分别降低了12.71%,50.68%和30.22%。而相应的,模型组大鼠肝脏脂质过氧化产物含量则显著升高。药物和益生菌grx12的干预则可以显著提高SOD、GSH和GSH-Px含量,降低MDA含量。其中东宝甘泰抗脂质过氧化效果较好,药物组MDA含量甚至低于空白组。grx12组的GSH-Px含量、SOD和GSH含量则明显超过了药物组。
3.7干酪乳杆菌grx12对大鼠肝脏ADH和ATP酶活性的影响
酒精在体内有三条主要的代谢途径,其中之一就是肝细胞内的ADH通路。ADH活性的降低会影响肝脏对酒精的正常代谢,导致乙醇及其代谢产物在肝脏大量累积而造成肝脏损伤。肝脏中的ATP酶主要存在于线粒体中,脂质过氧化反应可激活磷脂酶C、磷脂酶D分解线粒体膜磷脂,改变其流动性和通透性,使膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase等的脂质微环境失常,影响其功能,并导致ATP减少,从而进一步加剧酒精对肝脏的损伤。大鼠10%肝匀浆上清液中ADH和ATP酶含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行,结果见表4。
表4grx12对大鼠肝脏ADH、ATP酶的影响
组别 | ADH(U/mgprot) | Na+-K+-ATPase(U/mgprot) | Ca2+-ATPase(U/mgprot) |
空白组 | 64.47±16.76 | 5.67±0.85 | 7.00±0.30 |
模型组 | 36.13±11.14a | 3.56±0.59a | 2.14±0.04a |
药物组 | 62.16±15.19b | 5.02±1.92b | 6.02±0.51ab |
grx12组 | 74.65±17.63ab | 6.63±0.52ab | 6.90±0.41b |
注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05
由表4可知,大鼠长期摄入大量酒精后,肝脏中的ADH水平大大降低,与空白组相比,降低了43.96%。同样的,肝脏中的Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase含量也明显降低,与空白组相比,分别下降了37.21%和69.43%。而药物和益生菌grx12的干预则显著提高了肝脏ADH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase含量。grx12组作用效果较好,明显优于药物组。
3.8干酪乳杆菌grx12对大鼠肝脏细胞因子的影响
细胞因子是机体防御系统的重要组成部分,既是免疫反应的产物,又可以增强免疫反应,促进肝细胞损伤。在酒精性肝病的发病机制中,酒精可通过多种途径导致机体巨噬细胞功能异常、脂肪组织的蓄积、氧化应激的产生和内毒素的产生,进而刺激炎性细胞释放各种细胞因子和炎性介质,导致肝细胞损伤及肝脏炎性反应。大鼠10%肝匀浆上清液中细胞因子含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行,结果见表5。
注:a、b为同一指标不同处理组分别为与空白组、模型组相比,P<0.05
由表5可知,模型组大鼠肝脏TNF-α、IL-6和VEGF水平较空白组显著升高,表明大鼠长期大量摄入酒精后,肝脏发生了明显的炎症反应,导致了严重的肝损伤。并且,VEGF含量的升高促进了TNF-α和IL-6的释放。通过药物和益生菌grx12干预后,TNF-α、IL-6和VEGF水平有明显降低,其中grx12组降低TNF-α和IL-6水平效果较好,显著优于药物组。
与空白组相比,模型组大鼠肝脏TGF-β1水平显著升高,益生菌grx12组大鼠肝脏TGF-β1水平与模型组相比则显著降低,而药物降低TGF-β1水平的效果则较弱。
与空白组相比,模型组大鼠肝脏NF-κB水平显著升高,益生菌grx12组大鼠肝脏NF-κB水平与模型组相比则显著降低,与空白组无显著差异。药物组效果则较弱,NF-κB水平与模型组相比无显著差异。
3.9组织切片观察
综上所述,干酪乳杆菌grx12活菌制剂灌胃慢性酒精性肝损伤大鼠后,能够显著改善慢性酒精性肝损伤大鼠肝功能,抗氧化指标;降低血脂,血清内毒素水平;降低肝脏炎性因子的表达,缓解肝脏炎症反应,从而对慢性酒精性肝损伤有明显保护作用。并且其对慢性酒精性肝损伤的缓解作用明显优于药物的作用。实施例1:干酪乳杆菌grx12益生菌发酵剂的制备
将干酪乳杆菌grx12原始菌种接种于12%的脱脂乳(115℃灭菌20min)中,37℃培养18~24h至凝乳,连续活化两代,作为母发酵剂。将母发酵剂按3%~5%接种量接种于12%的脱脂乳(115℃灭菌20min)中,37℃培养18~24h至凝乳,此时活菌数可达到109~1010cfu/mL,即得到干酪乳杆菌grx12发酵剂。
实施例2:利用干酪乳杆菌grx12和嗜热链球菌grx02混合发酵制备对酒精性肝损伤具保护作用的功能性发酵乳
嗜热链球菌grx02为本发明人获得的具有较高的抗氧化活性且具有酒精性肝损伤保护功能的专利菌株,专利公开号为CN101328469A,菌株保藏号为CGMCC No:2525。
首先,分别制备干酪乳杆菌grx12和嗜热链球菌grx02发酵剂
其次,将预处理后的牛乳加热到60℃左右,加入6%蔗糖,经充分溶解后,在20MPa压力下进行均质。然后经95℃/5min条件下热处理后,冷却至42℃左右。按2.5%接种量接入按实施例1制备的干酪乳杆菌grx12发酵剂,以及加入2.5%嗜热链球菌grx02发酵剂,在42℃下发酵至凝乳,冷却后于4℃冷藏,即得到对酒精性肝损伤具保护作用的干酪乳杆菌grx12和嗜热链球菌grx02混合功能发酵乳。
实施例3:利用干酪乳杆菌grx12制备益生菌乳饮料
将脱脂乳粉制成12%的复原脱脂乳350kg,采用95℃/8~10min热处理后,冷却至37~40℃。按3%~5%接种量接种按实施例1制备的干酪乳杆菌grx12发酵剂,在37℃培养20~24h,终点酸度控制在155~170°T;加入650kg经90~110℃/5~10s杀菌的糖、稳定剂的混合物(该混合物的组成为0.9%~1.4%的果胶和13.8%~15.4%的蔗糖),混合均匀后20~25MPa均质,然后在72℃/15s条件下热处理,冷却至15~20℃,采用无菌或卫生灌装,即得到1000kg干酪乳杆菌grx12乳饮料。
实施例4:利用干酪乳杆菌grx12制备益生菌冰淇淋
首先,按实施例1制备干酪乳杆菌grx12发酵剂。
其次,制备400kg干酪乳杆菌grx12发酵乳,即:将复原全脂乳(11.5%)加热到60℃左右,加入6%蔗糖,经充分溶解后,在20MPa压力下进行均质。然后将复原全脂乳在95℃/5min条件下热处理,冷却至42℃左右。按3%~5%接种量接入按实施例1制备的干酪乳杆菌grx12发酵剂在37℃下发酵至凝乳,冷却后于4℃冷藏,即得到干酪乳杆菌grx12发酵乳。
再次制备1吨冰淇淋。将600kg冰淇淋其他物料,包括白砂糖75kg、全脂奶粉62.5kg、黄奶油31.25kg、椰子油23kg、糖浆26.25kg、乳化稳定剂6kg、水276kg混合,预热到60~65℃,采用20MPa~30MPa进行均质,然后再80℃/20s杀菌,冷却到40~50℃,与400kg干酪乳杆菌grx12发酵乳混合,采用20MPa~30MPa进行均质,2~4℃老化6h,经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋,不经硬化的为软质冰淇淋。
Claims (2)
1.干酪乳杆菌grx12在制备治疗慢性酒精性肝损伤药物中的应用。
2.干酪乳杆菌grx12在制备具有缓解酒精性肝损伤功能的发酵乳制品及功能食品中的应用。
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