CN116622559A - 一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法 - Google Patents
一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法，属于益生菌技术领域。所述干酪乳杆菌FPHC0700分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCCNO.26762，保藏日期为2023年3月6日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌具有高耐胃酸、耐胆碱存活率，具有发酵高产乙醛脱氢酶的能力，该菌株易培养、繁殖速度快，在菌种混合培养时属于优势菌种。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法。
背景技术
酒是具有刺激性的饮品，许多资料表明，酒精对肝脏、肾脏、胃肠道、神经系统、循环系统都有一定毒性，导致胃肠道功能紊乱，诱发胃、十二指肠溃疡，急性大量饮酒可引起恶心、呕吐、记忆力减退、注意力不集中、精细运动能力受损和情绪不稳定，严重时甚至可因呼吸肌麻痹而导致死亡。长期过量饮酒可引起精神障碍、胃溃疡以及肝功能受损，严重者可发生脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等疾病，有资料表明食道癌、肝癌发病率的升高似乎也与饮酒有关。
在美国，摄取过量酒精引起的肝脏疾患已成为男性的第四大主要死亡原因。在我国，肝病发生率是美国人的36倍。每年约有11万人死于酒精中毒，占总死亡率的41.3％；致残270万人，占总致残率的3％。因此，酒精的毒性作用日益危害人们的健康。
人体对乙醇的消除反应主要是通过代谢途径来实现的。另外，有少量的乙醇通过呼吸(0.7％)、汗液(0.1％)及尿液(0.3％)分泌所排出。乙醇的消除反应主要通过在肝脏的氧化，且主要受乙醇脱氢酶(ADH)及乙醛脱氢酶(ALDH)催化特性的调控。其过程为：酒(乙醇)-通过口腔食管进入胃肠直接吸收(80％被胃吸收、18％被小肠吸收、2％随呼吸、汗腺排出)-进入血液-乙醇脱氢酶将乙醇脱掉一个氢分子后变成了乙醛(乙醛的毒性是乙醇的200倍)-乙醛脱氢酶再将乙醛脱掉一个氢分子后变成乙酸-身体里的其他氧化酶将乙酸分解成二氧化碳、水和热量排出体外。
由胃肠道吸收的乙醇，经血循环进入肝脏，由肝细胞分泌的乙酰水解酶(ADH)把酒精变成乙醛，再进入血液。乙醛是一种毒性极强的物质，过量饮酒(醉酒)，使乙酰水解酶不足，就会醉酒。所出现的头晕、头痛、恶心、呕吐，就是乙醛中毒的结果。
进入血液的乙醛需要再次进入肝脏，经过醛基水解酶的分解，把乙醛变成醋酸，醋酸再分解为二氧化碳和水。完成酒精的全部分解过程大约需要1-3小时。肝脏分解酒精的功能是每小时7克，超过了这个量，解酒过程就要延长。
当乙酰水解酶不足时，就会动用肝里面的细胞色素P450酶(CYP450)，帮助分解酒精。有些人天天如此，反复大量饮用过量的酒，过量消耗细胞色素P450酶，CYP450本是肝脏中用来解毒、分解脂肪的，现在却用来解酒，大大浪费了CYP450，使其供不应求，造成脂肪无法分解，毒素无法分解，造成了对肝脏的伤害。
酒精在人体内不需要经过消化作用，就可直接扩散进入血液中，并分布至全身。酒精被吸收的过程在口腔中就开始了，到了胃部，也有少量酒精可直接被胃壁吸收，这部分占到总吸收量的20％，到了小肠后，小肠会很快地大量吸收其余80％。酒精的吸收速度则与胃内有无食物、胃壁的功能状况、饮料含酒精的多少以及饮酒习惯有关。空腹饮酒时最快，15分钟吸收50％，半小时吸收60％-90％，2-3小时可完全吸收。进入血液后，随血液循环流到各个器官，主要是分布在肝脏和大脑中。一小部分渗出血管进入组织间液经皮肤排出，一小部分经肾脏滤出随尿液排出，一小部分循环到肺部挥发经呼吸排出。这些酒精都没有分解，以原形排出，因此酒喝多了浑身都是酒气。这些都只有少部分，只占到进入身体酒精的10％，用呼吸测酒器可大约检测出体内酒精含量。而90％的酒精要循环到肝脏后由肝脏分解，肝脏依靠其自身的分泌、蓄积、吞噬功能处理部分酒精，大部分要依靠肝脏里面的酶与酒精进行生物化学反应。
这个系统有两部分，一部分是肝微粒体乙醇氧化酶系统、过氧化氢氧化酶系统等把酒精氧化为乙醛。一部分是乙醇脱氢酶把乙醇分解成乙醛，乙醛对人体仍然有害，它也依靠两部分分解，一是由乙醛脱氢酶快速分解成乙酸，二是由肝脏的细胞色素P450慢慢将乙醛转化成乙酸，最后，乙酸进入循环系统后会被代谢成能量、水和二氧化碳。
在这两套系统中，肝微粒体和细胞色素对乙醇乙醛的氧化分解，并不受血液中酒精浓度高低的影响，也不按机体的需要进行，它只按其固定的规律进行，即肝脏以每小时10毫升的速度将酒精分解成水、二氧化碳和糖，直至分解完为止，而依靠乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶这套系统则高效快速得多，这与它们的数量和活性有关。人体内乙醇脱氢酶的含量较为恒定，但从遗传学得知，乙醛脱氢酶在人体内含量具有明显的个体差异性，研究表明，黄种人先天性携带着缺陷型乙醛脱氢酶基因，而乙醛脱氢酶的产生是由基因控制的，所以黄色人解酒能力要稍弱一些。只在极少数人，大约占到十万分之一，这种人的酶数量和活性相当高，他的海量自然非常人能及。所以当常人喝酒控制不得当，吸入速度大于分解速度，血液里的乙醇和乙醛含量不断增加，人体便会遭受酒的毒害。
人体内若是具备乙醇脱氢酶，就能使乙醇分解成乙醛。乙醛再经过乙醛脱氢酶的分解，变成乙酸。乙酸对人体没有危害，然后又会被分解成二氧化碳和水。乙醇和乙醛对人体危害最大。在人体中，都存在乙醇脱氢酶，而且数量基本是相等的。但缺少乙醛脱氢酶的人就比较多。这种乙醛脱氢酶的缺少，使乙醛不能被完全分解为乙酸，而是以乙醛继续留在体内，使人喝酒后产生恶心欲吐、昏迷不适等醉酒症状。因此，不善饮酒，酒量在合理标准以下的人，即属于乙醛脱氢酶数量不足或完全缺乏的人。对于善饮酒的人，如果饮酒过多、过快，超过了乙醛脱氢酶的分解能力，也会发生醉酒。人是否醉酒，取决于血液中乙醇的浓度。当血液中乙醇浓度在0.05％-0.1％时，人开始朦胧、畅快地微醉；而达到0.3％时，人就会口齿不清，步态蹒跚，这就是我们常说的酒醉了；如果达到了0.7％，人就会死亡。对于乙醇的承受力，人与人的差异很大。这是由于胃肠吸收能力和肝脏的代谢处理能力不同所致。也就造成了人之间的酒量不同。
根据现代医学研究，不健全的饮食习惯，周围环境的污染，减少和削弱了体内有益菌的数量、活性以及对人体细胞的保护作用。特别是酗酒者、酒精中毒者可能发生肠道细菌移位，肠道中的有害菌、病原体伺机繁殖，引发炎症，这些人的肠道菌群严重紊乱，肠道功能失调，小肠中聚集的由酒精毒素产生的细菌可能会导致脂肪、碳水化合物、蛋白质、叶酸和维生素B的吸收不良。
经常过量饮酒和醉酒会影响其肠道菌群的结构和功能，而肠道菌群失调时又会反过来影响肝脏功能(二者是相辅相成的关系)。因酗酒造成的脂肪肝等慢性肝病患者，免疫功能低下，胆汁分泌异常，常会引起“小肠污染综合征”，出现消化不良，营养不足。肝昏迷时常有大肠杆菌(坏细菌)大量增殖，且易移位到空肠，释放出尿素酶，过多分解尿素产生氨，使血氨升高，加重肝昏迷。如能调整肠道菌群，大量增殖体内有益菌，可以促进肝脏健康，维持肠道菌群平衡，抑制肠道中有害菌的生长，显著地提高免疫功能。世界微生态学会专家提出：改善微生态恶化，预防疾病最有效的途径就是提高益生菌比率。因此，补充益生菌是调理肠道菌群紊乱有效的方法。
补充益生菌可以减少体内毒素及过量酒精引起的胃肠道功能紊乱，并能减少酒精对于肝脏的损害程度。研究表明，益生菌中的乳杆菌和双歧杆菌不会将酒精转变为有毒的致癌物乙醛，具有较好的代谢清除乙醛的能力。乳杆菌和双歧杆菌，对于结肠中内源和外源性乙醛水平具有很好的调节作用，说明益生菌可以降低由于摄入过量酒精产生乙醛而引起的不适和胃肠道疾病的发病率。
连续口服益生菌，酗酒者肠道菌群中益生菌数目明显增加。这些增加的益生菌能够帮助重建肠道菌群平衡，改善酒精导致的肝损伤，改善肝脏酶的活性，维护肝脏健康。进入体内的乙醇及其代谢产物可产生大量的自由基而对肝脏等器官造成损伤，因此获得有效清除自由基及提高体内清除自由基的酶类活性物质是解酒保肝的重点。机体内存在的酶促防御体系包括SOD、CAT、GSH-Px等，它们可以有效清除ROOH等活性氧并终止自由基链式反应从而防止机体的氧化。而血液中的这些氧化酶活性是反映机体抗氧化能力的重要指标。益生菌可以改善肠黏膜氧化损伤，减轻腹泻。有学者发现芽孢杆菌通过显著增加机体GSH-Px、SOD等抗氧化酶活性和抗超氧阴离子活性，而使其总抗氧化能力显著提高；Lin等的研究也表明乳酸菌具有清除ROS、减少氧化损害的能力。益生菌通过提高SOD和CAT等抗氧化酶的活性，降低MDA含量，消除自由基对机体的影响。
如果喝酒前先口服益生菌，在人体的微生物环境上提前建立一个良性环境，不仅降低了肝脏器官的负担，减少了酒精对胃黏膜的刺激而且可以弥补酒精带来的肠道微生物环境的破坏，确保人体的生态平衡，从而加快毒素的代谢，减轻人体系统地解酒，防止醉酒，避免中毒。还可以提高人体的超氧化歧化酶活力，达到清除自由基及脂质过氧化物，从而起到保护肝细胞及机体内组织器官的作用，但此种方式仍然解酒效果仍然不佳。
发明内容
本发明的目的在于提出一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法，该产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌具有高耐胃酸、耐胆碱存活率，具有发酵高产乙醛脱氢酶的能力，该菌株易培养、繁殖速度快，在菌种混合培养时属于优势菌种。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700，所述干酪乳杆菌FPHC0700分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCC NO.26762，保藏日期为2023年3月6日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
作为本发明的进一步改进，所述干酪乳杆菌FPHC0700的16S rDNA序列如SEQ IDNo.1所示。
作为本发明的进一步改进，所述干酪乳杆菌FPHC0700为革兰氏阳性菌，菌体菌体呈杆状，成单或者成链，在MRS培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，表面湿润光滑，不产生色素。
本发明进一步保护含有上述干酪乳杆菌FPHC0700的微生物制剂。
本发明进一步保护上述的干酪乳杆菌FPHC0700在微生物发酵制备γ-氨基丁酸中的应用。
本发明进一步保护上述的干酪乳杆菌FPHC0700在制备解酒、预防和辅助治疗酒精性肝损伤产品中的应用。
本发明进一步保护一种解酒益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将绿豆粉碎，加入水中，加入蛋白酶酶解，灭酶，过滤，冷冻干燥，得到绿豆蛋白酶解产物；
S2.将葛根、铁皮石斛分别洗净，干燥，粉碎，混合后得到粉末，加入乙醇水溶液，加热提取，过滤，滤渣洗涤，干燥，制得干滤渣，滤液减压除去溶剂，干燥，制得醇提取物；
S3.将上述产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700接种至高氏培养基中，活化培养，制得菌种种子液；
S4.将步骤S2中的干滤渣加入无菌水中，加入添加剂，灭菌，接种步骤S3制得的干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液，发酵培养，冷冻干燥，制得发酵产物；
S5.将海藻酸钠溶于水中，加入步骤S4制得的发酵产物，搅拌混合均匀，加入明胶和金属盐溶液，乳化，制得包埋发酵产物的微球，加入步骤S1制得的绿豆蛋白酶解产物、步骤S2制得的醇提取物和玉米低聚肽，混合均匀，制得解酒益生菌组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3-5:2，所述绿豆和蛋白酶的质量比为100:3-5，所述酶解条件为39-42℃，酶解0.5-1h，步骤S2中所述葛根、铁皮石斛的质量比为5-7:3-5，所述粉末和乙醇水溶液的固液比为1:5-7g/mL，所述乙醇水溶液中乙醇含量为55-75wt％，所述加热提取的温度为65-75℃，时间为1-2h，步骤S3中所述活化培养的条件为缺氧条件下，37-39℃，50-70r/min，活化培养12-18h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述干滤渣、无菌水和添加剂的质量比为10-12:100:1-2，所述添加剂包括氯化钙、维生素B1和维生素B6，质量比为1-2:0.2-0.3:0.1-0.2，所述干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液的接种量为1.5-2％，所述发酵培养的条件为缺氧条件下，37-39℃，50-70r/min，活化培养38-48h，步骤S5中所述金属盐为氯化钙或氯化铝，所述海藻酸钠、发酵产物、明胶和金属盐的质量比为12-15:5-7:3-5:1-2；所述包埋发酵产物的微球、绿豆蛋白酶解产物、醇提取物和玉米低聚肽的质量比为10-12:3-5:7-10:1-2。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的解酒益生菌组合物。
本发明具有如下有益效果：本发明产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌具有高耐胃酸、耐胆碱存活率，具有发酵高产乙醛脱氢酶的能力，该菌株易培养、繁殖速度快，在菌种混合培养时属于优势菌种。
本发明提供了一种助睡眠益生菌组合物，原料包括绿豆、葛根、铁皮石斛和玉米低聚肽，以及发酵菌产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌。酒精经肝脏代谢后会造成乙醛，乙醛脱氢酶可以分解乙醛，但是乙醛脱氢酶遗传基因缺陷就会使身体难以分解乙醛，体内的乙醛就会过多，这就是说导致脸红和血压高的原因。肝中的乙醇脱氢酶负责将乙醇(酒的成分)氧化为乙醛，生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶催化下转变为无害的乙酸(即醋的成分)。因此，经过产生高浓度的乙醛脱氢酶，对于机体将乙醇降解为乙酸排出体外有明显的促进作用，从而加快的解酒的效果，能快速消除脸红、血压升高等症状。
葛根，又名粉葛、甘葛，是豆科落叶藤本植物野葛或甘葛藤的根。中医认为，葛根性味甘、辛、凉，入脾、胃经，有发汗解饥，解表透疹，升阳止泻，生津止渴之功。葛根的醇提取物含有的葛根素、木糖苷以及一些其他化合物，能够提高肝细胞的再生能力，恢复正常肝脏机能，促进胆汁分泌，防止脂肪在肝脏堆积，还对降低高血压、改善血液循环有一定的益处。葛根中淀粉含量高，透明度高，其含有13种氨基酸，其中有8种都是人体必需的氨基酸，而且还含有铁、钙、锰等微量元素，对养生保健有着重要的功效。铁皮石斛具有生津养胃；滋阴清热；润肺益肾；明目强腰之功效，其水提取物含有丰富的多糖类化合物而具有良好的抗氧化保肝活性。具有多成分、多靶点、多通路协调发挥药效，毒副作用较小、安全性较高等优势，两者协同作用下，能够起到快速见效，高效解酒，对肝脏损伤起到明显的保护作用。
绿豆是一种很好的解酒食品，含有丰富的蛋白质，其蛋白质经过酶解后，能够产生丰富的活性短肽，其中，活性短肽中谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸的含量较为丰富，谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸有利于合成乙醇代谢酶并减轻醉酒症状。
玉米低聚肽含有多种生物活性，可以降低胆固醇水平，抑制血管紧张素转化酶水解，降低血压，降低血脂，保护心血管，摄入玉米肽以后，通过提高血液中丙氨酸和亮氨酸的浓度，能够产生稳定的分解乙醇的辅脱氢酶，增强肝脏乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，促进体内乙醇的分解和代谢，从而降低血液中乙醇的浓度，达到降低醉酒程度和醒酒的作用。
海藻酸钠是从海藻细胞壁和细胞间质中提取的一种阴离子聚电解质，具有生物相容性好、低毒性、低成本和易与二价金属离子凝胶化等优点。明胶为带正电的高分子多糖。将海藻酸钠和明胶混合，通过正电荷和负电荷的静电吸附，形成一层稳定的壳层，同时，在金属盐的交联作用下，很快形成了缓释壳层，不仅具有很好的缓释效果，能保护发酵产物在胃部不被分解释放，在肠道碱性环境下溶胀释药，且原料来源广，使用安全。
本发明解酒组合物经过干酪乳杆菌FPHC0700发酵后，能产生大量的乙醛脱氢酶，为开发新的解酒、保肝护肝、预防和辅助治疗酒精性肝损伤的保健食品提供依据，将所述干酪乳杆菌FPHC0700应用于食品、保健品的开发，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为干酪乳杆菌FPHC0700的菌落形态图；
图2为干酪乳杆菌FPHC0700的菌体形态图；
图3为各组菌耐胃酸能力的对比图；
图4为各组菌耐胆盐能力的对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700，所述干酪乳杆菌FPHC0700分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCC NO.26762，保藏日期为2023年3月6日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
木瓜蛋白酶，FDG-2203，酶活力10万U/g，菠萝蛋白酶，FDG-2201，酶活力10万U/g，均购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。玉米低聚肽，纯度>98％，<500Da，购于陕西本禾生物工程有限公司。
实施例1干酪乳杆菌FPHC0700的筛选及鉴定
1、干酪乳杆菌FPHC0700的筛选
1.1样品来源
本发明所使用的菌株均收集自果醋泡菜制品，即本发明来自于泡菜作为样品。
1.2培养基的配制
样品分离和菌株筛选所用的培养基为MRS液体培养基，成分如下：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH＝6.2±0.1。
1.3菌株的分离
将10g泡菜样品加入含有0.55％的NaCl无菌溶液中，得到浑浊液，将浑浊液进行梯度稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的菌液100μL涂于含有无菌MRS固体培养基(购于北京路桥公司)的培养皿上，于有氧条件下38℃静置培养24h，至有明显单菌落形成后，从培养基中选择生长有70-110个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS固体平板培养基上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，得培养，物做菌株鉴定。
1.4菌株的保藏
挑选单菌落到MRS液体培养基中，于38℃下，50r/min，培养36h，吸取500μL菌液加入1mL 60％(v/v)的甘油管中，于-80℃冷冻保藏。
2、干酪乳杆菌FPHC0700的鉴定
2.1菌落特征
干酪乳杆菌FPHC0700在MRS固体培养基中培养24h后，在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，表面湿润光滑，不产生色素，见图1。
2.2显微镜下形态
干酪乳杆菌FPHC0700菌落涂片：革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，成单或者成链，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
鉴定单位：上海美吉生物医药科技有限公司。
鉴定序列：
GCCGGTGGGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGTGACAAAGTTGGGGC。
鉴定结果：根据菌株的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的菌株为Lactobacillus casei(干酪乳杆菌)。
实施例2干酪乳杆菌FPHC0700菌株耐酸能力测试
人工胃液的配制：NaCl 0.2％、胃蛋白酶0.35％、用1mol/L的HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌，现配现用。
38℃，70r/min，MRS液体培养基培养24h，经5000r/min离心10min收集菌体后重悬于生理盐水，制成菌悬液，取1mL菌悬液与9mL pH3.0的人工胃液混合，摇匀，置于恒温振荡器中培养(38℃，300r/min)，并分别在0h、1h、2h和3h取样，用MRS琼脂培养基倾注38℃培养48h。用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)：
存活率(％)＝取样时的活菌数/0h的活菌数×100％
相同条件下以嗜酸乳杆菌La28(Lactobacillus acidophilus La28)、植物乳杆菌LP45(Lactobacillus plantarum LP45)(均由河北一然生物科技有限公司提供)、嗜酸乳杆菌LA16(由本公司提供)作为对照，菌株溶液、活菌量与干酪乳杆菌FPHC0700相同。
模拟胃酸存活率的结果如图3。由图可知，干酪乳杆菌FPHC0700在体外模拟胃酸实验时，在3h的存活率达到了82.5±4.12％，存活率远超过其他对照菌株。
实施例3干酪乳杆菌FPHC0700菌株耐受胆盐的测定
将活化好的菌液用移液枪按2％的接种量接种于含0.3％牛胆盐的MRS培养基。在恒温振荡器中38℃培养6h后，以0h为对照，分别在0h、2h、4h和6h取样，测定上述溶液的活菌值，计算菌株对胆盐的耐受力(％)。
胆盐耐受力(％)＝取样时溶液的活菌数/0h时溶液的活菌数×100％。
相同条件下以嗜酸乳杆菌La28(Lactobacillus acidophilus La28)、植物乳杆菌LP45(Lactobacillus plantarum LP45)(均由河北一然生物科技有限公司提供)、嗜酸乳杆菌LA16(由本公司提供)作为对照，菌株溶液、活菌量与干酪乳杆菌FPHC0700相同。
胆盐耐受力的结果如图4。由图可知，干酪乳杆菌FPHC0700在体外模拟胆盐耐受力实验时，在6h的存活率达到了65.7±6.54％，存活率远超过其他对照菌株。
实施例4产乙醛脱氢酶的能力
1)菌种培养：将保藏的菌种接入MRS液体培养基，38℃静置活化12h，再以2％的接种量接种于装有50mL MRS液体培养基的250mL摇瓶中38℃，220rpm，发酵36h，获得发酵液。
2)粗酶液的提取：将上述获得的发酵液12000r/min离心2min，去除上清收集菌体，将生理盐水稀释菌体后进行超声破碎(1000W超声2min)，12000r/min离心2min获取上清得到粗酶液，然后进行酶鉴定和酶活测定。确定含乙醛脱氢酶，酶活测定为44.7U/mL。
实施例5
本实施例提供一种解酒益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将100重量份绿豆粉碎，加入200重量份水中，加入3重量份蛋白酶，39℃酶解0.5h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，得到绿豆蛋白酶解产物；
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3:2；
S2.将5重量份葛根、3重量份铁皮石斛分别洗净，干燥，粉碎，混合后得到粉末，加入55wt％乙醇水溶液，所述粉末和55wt％乙醇水溶液的固液比为1:5g/mL，加热至65℃，提取1h，过滤，滤渣洗涤，干燥，制得干滤渣，滤液减压除去溶剂，干燥，制得醇提取物；
S3.将产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700接种至高氏培养基中，缺氧条件下，37℃，50r/min，活化培养12h，制得菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S4.将10重量份步骤S2中的干滤渣加入100重量份无菌水中，加入1重量份添加剂，紫外线灭菌，接种步骤S3制得的干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液，所述干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液的接种量为1.5％，缺氧条件下，37℃，50r/min，活化培养38h，冷冻干燥，制得发酵产物；
所述添加剂包括氯化钙、维生素B1和维生素B6，质量比为1:0.2:0.1；
S5.将12重量份海藻酸钠溶于100重量份水中，加入5重量份步骤S4制得的发酵产物，搅拌混合均匀，加入20重量份含3重量份明胶和1重量份氯化铝溶液，12000r/min乳化15min，制得包埋发酵产物的微球，将10重量份包埋发酵产物的微球加入3重量份步骤S1制得的绿豆蛋白酶解产物、7重量份步骤S2制得的醇提取物和1重量份玉米低聚肽，搅拌混合20min，制得解酒益生菌组合物。
实施例6
本实施例提供一种解酒益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将100重量份绿豆粉碎，加入200重量份水中，加入5重量份蛋白酶，42℃酶解1h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，得到绿豆蛋白酶解产物；
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为5:2；
S2.将7重量份葛根、5重量份铁皮石斛分别洗净，干燥，粉碎，混合后得到粉末，加入75wt％乙醇水溶液，所述粉末和75wt％乙醇水溶液的固液比为1:7g/mL，加热至75℃，提取2h，过滤，滤渣洗涤，干燥，制得干滤渣，滤液减压除去溶剂，干燥，制得醇提取物；
S3.将产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700接种至高氏培养基中，缺氧条件下，39℃，70r/min，活化培养18h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S4.将12重量份步骤S2中的干滤渣加入100重量份无菌水中，加入2重量份添加剂，紫外线灭菌，接种步骤S3制得的干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液，所述干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液的接种量为2％，缺氧条件下，39℃，70r/min，活化培养48h，冷冻干燥，制得发酵产物；
所述添加剂包括氯化钙、维生素B1和维生素B6，质量比为2:0.3:0.2；
S5.将15重量份海藻酸钠溶于100重量份水中，加入7重量份步骤S4制得的发酵产物，搅拌混合均匀，加入20重量份含5重量份明胶和2重量份氯化钙溶液，12000r/min乳化15min，制得包埋发酵产物的微球，将12重量份包埋发酵产物的微球加入5重量份步骤S1制得的绿豆蛋白酶解产物、10重量份步骤S2制得的醇提取物和2重量份玉米低聚肽，搅拌混合20min，制得解酒益生菌组合物。
实施例7
本实施例提供一种解酒益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将100重量份绿豆粉碎，加入200重量份水中，加入4重量份蛋白酶，40℃酶解1h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，得到绿豆蛋白酶解产物；
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4:2；
S2.将6重量份葛根、4重量份铁皮石斛分别洗净，干燥，粉碎，混合后得到粉末，加入65wt％乙醇水溶液，所述粉末和65wt％乙醇水溶液的固液比为1:6g/mL，加热至70℃，提取1.5h，过滤，滤渣洗涤，干燥，制得干滤渣，滤液减压除去溶剂，干燥，制得醇提取物；
S3.将产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700接种至高氏培养基中，缺氧条件下，38℃，60r/min，活化培养15h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S4.将11重量份步骤S2中的干滤渣加入100重量份无菌水中，加入1.5重量份添加剂，紫外线灭菌，接种步骤S3制得的干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液，所述干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液的接种量为1.7％，缺氧条件下，38℃，60r/min，活化培养42h，冷冻干燥，制得发酵产物；
所述添加剂包括氯化钙、维生素B1和维生素B6，质量比为1.5:0.25:0.15；
S5.将13.5重量份海藻酸钠溶于100重量份水中，加入6重量份步骤S4制得的发酵产物，搅拌混合均匀，加入20重量份含4重量份明胶和1.5重量份氯化钙溶液，12000r/min乳化15min，制得包埋发酵产物的微球，将11重量份包埋发酵产物的微球加入4重量份步骤S1制得的绿豆蛋白酶解产物、8.5重量份步骤S2制得的醇提取物和1.5重量份玉米低聚肽，搅拌混合20min，制得解酒益生菌组合物。
实施例8
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S1中蛋白酶为单一的木瓜蛋白酶。
实施例9
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S1中蛋白酶为单一的菠萝蛋白酶。
对比例1
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S1中未进行酶解。
对比例2
与实施例7相比，不同之处在于，未进行步骤S1，体系中未添加绿豆。
对比例3
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S2中未添加葛根。
对比例4
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S2中未添加铁皮石斛。
对比例5
与实施例7相比，不同之处在于，未进行步骤S2至S4。
对比例6
与实施例7相比，不同之处在于，未进行步骤S2的乙醇水溶液提取。
对比例7
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S4中添加剂未添加氯化钙。
对比例8
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S4中添加剂维生素B1。
对比例9
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S4中添加剂维生素B6。
对比例10
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S4中添加剂维生素B1和维生素B6。
对比例11
与实施例7相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
对比例12
与实施例7相比，不同之处在于，步骤S5中未进行包埋，直接将发酵产物、绿豆蛋白酶解产物、醇提取物和玉米低聚肽搅拌混合20min，制得助睡眠益生菌组合物。
测试例1防醉酒效果试验
将大鼠随机分为空白对照组、实施例1-9组、对比例1-12组、阳性对照组(力克，市售)，每组10只，雌雄各半。每只大鼠灌胃53°白酒7mL/kg，灌药30min后，试验组给药2g/kg，阳性对照组给药2g/kg，空白对照组给予生理盐水2g/kg。每只大鼠灌胃结束，把大鼠进行颠倒放置，即四肢朝上、背部朝下，观察其翻正反射的情况。醉酒判定标准：翻正反射消失并且持续30s，为醉酒，记录翻正消失的时间称为耐受时间。
结果见表1。
表1
注释：*为与空白对照组相比，P<0.05，#为与阳性对照组相比，P<0.05。
测试例2解酒效果试验
将大鼠随机分为空白对照组、实施例1-9组、对比例1-12组、阳性对照组(力克，市售)，每组10只，雌雄各半。每只大鼠灌胃53°白酒7mL/kg。灌药30min后，试验组给药2g/kg，阳性对照组给药2g/kg，空白对照组给予生理盐水2g/kg。观察大鼠活动情况，以大鼠后腹拖地、爬行不稳、闭眼懒动等为睡眠(醉酒)指标，以四肢灵活、行动自如、精神恢复为苏醒(醒酒)指标。记录大鼠入睡醉酒时间和苏醒醒酒时间。
结果见表2。
表2
注释：*为与空白对照组相比，P<0.05，#为与阳性对照组相比，P<0.05。
测试例3酒精性肝损伤的保护效果
将大鼠随机分为空白对照组、实施例1-9组、对比例1-12组、阳性对照组(力克，市售)，每组10只，雌雄各半。每天试验组给药2g/kg，阳性对照组给药2g/kg，空白对照组给予生理盐水2g/kg，30min后均以7mL/kg体重53°白酒白酒灌胃，连续不间断灌胃30d。试验结束后，从大鼠颈动脉取血，采用IFCC推荐法，测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT，谷丙转氨酶)含量。
结果见表3。
表3
注释：*为与空白对照组相比，P<0.05，#为与阳性对照组相比，P<0.05。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700，其特征在于，所述干酪乳杆菌FPHC0700分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCCNO.26762，保藏日期为2023年3月6日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
2.根据权利要求1所述产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700，其特征在于，所述干酪乳杆菌FPHC0700的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700，其特征在于，所述干酪乳杆菌FPHC0700为革兰氏阳性菌，菌体菌体呈杆状，成单或者成链，在MRS培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，表面湿润光滑，不产生色素。
4.含有权利要求1-3任一项所述干酪乳杆菌FPHC0700的微生物制剂。
5.如权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌FPHC0700在微生物发酵制备γ-氨基丁酸中的应用。
6.如权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌FPHC0700在制备解酒、预防和辅助治疗酒精性肝损伤产品中的应用。
7.一种解酒益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将绿豆粉碎，加入水中，加入蛋白酶酶解，灭酶，过滤，冷冻干燥，得到绿豆蛋白酶解产物；
S2.将葛根、铁皮石斛分别洗净，干燥，粉碎，混合后得到粉末，加入乙醇水溶液，加热提取，过滤，滤渣洗涤，干燥，制得干滤渣，滤液减压除去溶剂，干燥，制得醇提取物；
S3.将权利要求1中所述产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌FPHC0700接种至高氏培养基中，活化培养，制得菌种种子液；
S4.将步骤S2中的干滤渣加入无菌水中，加入添加剂，灭菌，接种步骤S3制得的干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液，发酵培养，冷冻干燥，制得发酵产物；
S5.将海藻酸钠溶于水中，加入步骤S4制得的发酵产物，搅拌混合均匀，加入明胶和金属盐溶液，乳化，制得包埋发酵产物的微球，加入步骤S1制得的绿豆蛋白酶解产物、步骤S2制得的醇提取物和玉米低聚肽，混合均匀，制得解酒益生菌组合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3-5:2，所述绿豆和蛋白酶的质量比为100:3-5，所述酶解条件为39-42℃，酶解0.5-1h，步骤S2中所述葛根、铁皮石斛的质量比为5-7:3-5，所述粉末和乙醇水溶液的固液比为1:5-7g/mL，所述乙醇水溶液中乙醇含量为55-75wt％，所述加热提取的温度为65-75℃，时间为1-2h，步骤S3中所述活化培养的条件为缺氧条件下，37-39℃，50-70r/min，活化培养12-18h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述干滤渣、无菌水和添加剂的质量比为10-12:100:1-2，所述添加剂包括氯化钙、维生素B1和维生素B6，质量比为1-2:0.2-0.3:0.1-0.2，所述干酪乳杆菌FPHC0700菌种种子液的接种量为1.5-2％，所述发酵培养的条件为缺氧条件下，37-39℃，50-70r/min，活化培养38-48h，步骤S5中所述金属盐为氯化钙或氯化铝，所述海藻酸钠、发酵产物、明胶和金属盐的质量比为12-15:5-7:3-5:1-2；所述包埋发酵产物的微球、绿豆蛋白酶解产物、醇提取物和玉米低聚肽的质量比为10-12:3-5:7-10:1-2。
10.一种如权利要求7-9任一项所述的制备方法制得的解酒益生菌组合物。
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- 2023-05-10 CN CN202310520117.1A patent/CN116622559B/zh active Active
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