CN115947876A - β-D-半乳葡聚糖及其制备和用途 - Google Patents

β-D-半乳葡聚糖及其制备和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑D‑半乳葡聚糖及其制备和用途。该β‑D‑半乳葡聚糖由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其中，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为9.5‑18.5:2.2‑4.3:1.0‑2.5；所述葡萄糖为β‑D‑呋喃型葡萄糖。其来源为林下杨树桑黄，其多糖组成使其具备良好的多样性生物活性，应用范围广泛。

Description

β-D-半乳葡聚糖及其制备和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-D-半乳葡聚糖及其制备和用途。
背景技术
桑黄孔菌属(Sanghuangporus)简称桑黄，是一类多年生大型药用真菌，其属内种的种类较多，例如桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)、杨树桑黄又称杨黄(Sanghuangporus vaninii)、鲍姆桑黄(Sanghuangporus baumii)和锦带花桑黄(Sanghuangporus weigelae)等，同属不同种的真菌在生长习性、栽培技术、菌丝体和子实体的成分组成等方面存在较大差异。
桑黄种类繁多，即使同属同种的桑黄中的物质种类也非常丰富，主要包括多糖、酚类、黄酮类、萜类、漆酶、香豆素和呋喃等，这些丰富的物质种类中包括一些具备生物活性的活性物质和一些不具备生物活性或者生物活性低的物质，其中，种类丰富的活性物质使桑黄呈现出多种多样的生物活性例如抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节血糖、降尿酸、免疫调节等等活性，一般作为传统中药材使用时多考虑桑黄综合的生物活性种类，如能找出桑黄中的活性物质、并将活性物质的生物活性种类进行确定，将对实现桑黄中活性物质的精准应用提供可能。但由于同属不同种的桑黄在生长习性、栽培技术、菌丝体和子实体的成分组成等方面存在较大差异，导致同属不同种的桑黄的生物活性种类和效果(例如作为传统中药材使用时的药效)也存在较大差异，给人们研究桑黄中活性物质带来了大的挑战，即使针对同属同种的桑黄中活性物质的探索也会因需要面对真菌中种类多样的物质、同种类物质复杂多变的结构、不同的构型等而导致的是否具有活性、活性高低等问题而变得困难重重。
现有桑黄栽培方法主要包括大棚栽培和林下栽培。大棚里人工袋料栽培桑黄，大棚会提供桑黄保温、保湿、避光等环境条件。在林下栽培桑黄，林木属于自养生物，占据林地上层空间，接受充足的阳光，释放氧气，吸收二氧化碳，形成了阴凉、潮湿、通风的巨大林下空间。桑黄在林下栽培所处的环境与在大棚里种植时是完全不同的。由于由于桑黄菌本身生理生态的特殊性和复杂性，桑黄子实体发育阶段对空气相对湿度、温度、光照等环境因子有特殊的要求。桑黄在林下种植时与外部自然环境是几乎直接接触的，与在大棚内种植相比，更易于受到外部雨水、光照、气温等条件的干扰。各种不利的环境胁迫，如紫外线、低温和温差变化可能会诱导植物和真菌次生代谢产物的合成。
发明内容
目前报道的从桑树桑黄、杨黄子实体、发酵菌丝体中获得的葡聚糖均为吡喃型葡聚糖，从食药真菌类天然资源中获得的呋喃型葡聚糖未有报道。本发明发现在林下环境下栽培的杨黄中存在一种主要由β-D-呋喃型葡萄糖组成的呋喃型葡聚糖：β-D-半乳葡聚糖，其具有良好的增强免疫力，抑制肿瘤细胞生长以及良好的调节肠道菌群的作用。而大棚环境下栽培的杨黄中未发现该呋喃型葡聚糖。
一种β-D-半乳葡聚糖，由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其中，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为9.5-18.5:2.2-4.3:1.0-2.5；所述葡萄糖为β-D-呋喃型葡萄糖。
优选地：所述半乳糖为β-半乳糖。所述岩藻糖为α-岩藻糖。进一步优选地：所述β-半乳糖为β-D-吡喃型半乳糖。所述α-岩藻糖为α-L-吡喃型岩藻糖。
所述多糖的结构单元优选主链结构为(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖(β-D-Glcf)残基，在主链上连续的三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基中的任意一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上被一个β-D-吡喃型半乳糖(β-D-Galp)端基取代，在主链上相邻的两个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上分别被一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖(α-L-Fucp)端基取代，且所述β-D-吡喃型半乳糖端基、β-D-呋喃型葡萄糖端基和α-L-吡喃型岩藻糖端基分别位于三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上、不会取代同一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位。
所述一个β-D-吡喃型半乳糖端基、一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖端基在主链上三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上的排列顺序为任意顺序，可以有多种不同的变化组合，在主链结构单糖残基连接键和构型、取代基连接键和构型已确定的前提下对β-D-半乳葡聚糖的活性没有实质影响；例如可具有式Ⅰ所示的结构单元，式Ⅰ仅作为三个端基一种排列顺序的示例，以便于本领域技术人员理解，并不用于限制三个端基的排列顺序。
Figure SMS_1
Figure SMS_2
式Ⅰ中，Galp为吡喃型半乳糖，Glcf为呋喃型葡萄糖，Fucp为吡喃型岩藻糖。式Ⅰ所示结构为一个重复单元，具体重复单元的数量依据β-D-半乳葡聚糖的重均分子量来确定。
所述β-D-半乳葡聚糖的重均分子量为11KDa-55Kda，优选为23KDa-24Kda。
所述葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比优选为13.7-14.6:2.7-3.8:1.0-1.2。
所述β-D-半乳葡聚糖的来源为杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)子实体，优选在林下栽培的林下杨树桑黄子实体，可以采用市售产品，也可以采用现有栽培方法栽培例如现有林下栽培方法栽培得到的林下杨树桑黄子实体，能够获得所述β-D-半乳葡聚糖。所述林下杨树桑黄子实体可选用在自然林或人工林林下采用现有林下栽培方法栽培得到的。所述林下杨树桑黄子实体的林下栽培条件优选：林分郁闭度07-0.9，海拔200m-400m，空气湿度80％-95％，白天温度：15℃-28℃，夜间温度：8℃-18℃；易于获得所述β-D-半乳葡聚糖。进一步优选：所述林下杨树桑黄子实体的林下栽培条件为林分郁闭度0.8，海拔250m，空气湿度90％，白天温度：20℃-28℃，夜间温度：8℃-15℃。林下特定海拔、林分郁闭度、湿度、昼夜温差等环境下栽培得到的杨树桑黄子实体，易于获得所述β-D-半乳葡聚糖。
本发明还提供了所述β-D-半乳葡聚糖的制备方法，由林下杨树桑黄子实体经复合酶酶解、热水浸提分离纯化得到，操作简便，可用于大批量生产。
所述β-D-半乳葡聚糖属于水溶性多糖，可采用水溶性多糖的制备方法从林下杨树桑黄子实体中分离得到。优选由林下杨树桑黄子实体经复合酶酶解-热水浸提分离纯化得到。包括：通过复合酶酶解、70℃至95℃热水提醇沉提取林下杨树桑黄子实体粗多糖，经酶-Sevage结合法去蛋白、超滤、层析纯化得到β-D-半乳葡聚糖。
可选地，所述β-D-半乳葡聚糖的制备方法，包括步骤：
S1.将林下杨树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，先添加复合酶酶解，再用70℃-95℃热水提取、离心，所得水提液经浓缩后加入乙醇水溶液或乙醇，混匀，沉淀过夜，离心所得沉淀为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖；
S2.将一次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；将所得的提取液用截留分子量为5000Da-6000Da的滤膜进行膜分离，收集截留液，真空冻干得二次林下杨树桑黄子实体粗多糖；
S3.将二次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液经快流速DEAE-琼脂糖凝胶离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液(即收集0.3mol/L的NaCl水溶液洗脱液)经丙烯葡聚糖凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和干燥得到β-D-半乳葡聚糖，命名为SVPS2。
为了达到更好的发明效果，优选：
步骤S1中，所述复合酶选用纤维素酶和果胶酶。所述纤维素酶和果胶酶的质量比优选为4-1:1。所述复合酶酶解温度选用40℃-55℃，酶解时间选用至少2h。
所述乙醇水溶液选用体积百分浓度为大于等于90％的乙醇水溶液。
所述沉淀过夜的温度在2℃-5℃较适宜。
所述料液中水作为提取溶剂，用量没有严格的限制。
所述热水提取的时间以至少2小时为宜。
步骤S2中，所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述蛋白酶的重量选用占一次林下杨树桑黄子实体粗多糖重量的1％-3％。所述用蛋白酶酶解的条件优选为：在50℃-55℃水浴2h-3.5h。
所述有机溶剂选用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。
本发明灭酶的条件采用本领域常规的灭酶条件。
步骤S3中，所述二次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液的浓度可设置在10mg/mL-25mg/mL，流速可设置在1.0mL/min-2.0mL/min。
所述快流速DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose Fast Flow)离子交换层析柱层析的条件选用：采用梯度洗脱，洗脱液为0.01mol/L-0.9mol/L的NaCl水溶液，流速1.0mL/min-3.0mL/min。
所述丙烯葡聚糖凝胶过滤层析的条件选用：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1；流速设置在0.5mL/min。
所述丙烯葡聚糖凝胶可选用市售产品，例如市售的Sephacryl-S 100。
所述透析主要为了去除小分子物质。
所述磷酸盐缓冲液等的配制方法按照本领域现有方法，例如可参照《中国药典》。
本发明还提供了所述β-D-半乳葡聚糖的用途。本发明β-D-半乳葡聚糖SVPS2具有良好的增强免疫力活性、抗肿瘤活性和增强肠道微生物蠕动活性。例如：SVPS2在0.4mg/mL浓度时，RAW264.7细胞中产生的NO含量在41.07μM-43.92μM、TNF-α含量在453.82pg/mL-457.32pg/mL、IL-1β含量在125.90pg/mL-127.67pg/mL、IL-6含量在55.87pg/mL-57.76pg/mL，与同从林下杨树桑黄子实体中获得的SVPS1、SVPS3、从大棚栽培杨树桑黄子实体中获得的多糖C1-SVPS2、空白对照组对免疫功能的影响相比均有显著增强，表明SVPS2具有良好的增强免疫力活性。SVPS2在0.6mg/mL浓度时，对人结肠癌细胞HT-29抑制率在56.15％-57.32％，与同从林下杨树桑黄子实体中获得的SVPS1、SVPS3、从大棚栽培杨树桑黄子实体中获得的多糖C1-SVPS2、空白对照组对人结肠癌细胞HT-29抑制率相比均有显著增强，表明SVPS2具有良好的抗肿瘤活性。SVPS2作用在小鼠体内，与同从林下杨树桑黄子实体中获得的SVPS1、SVPS3、从大棚栽培杨树桑黄子实体中获得的多糖C1-SVPS2、空白对照组作用在小鼠体内相比，能够显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌等肠道有益的数量、降低大肠杆菌数等肠道致病菌的数量，从而调节肠道菌群结构，增强肠道微生物蠕动。因此，本发明β-D-半乳葡聚糖可以直接作为增强免疫力和/或抗肿瘤功能品，也可用于制备增强免疫力和/或抗肿瘤功能产品。本发明β-D-半乳葡聚糖还可以直接作为增强肠道微生物蠕动功能品，也可用于制备增强肠道微生物蠕动功能产品。所述功能产品包括食品、保健品或药品等。例如，所述的β-D-半乳葡聚糖可用于制备抗肿瘤的保健品、抗肿瘤的药品、增强免疫力的保健品、增强免疫力的食品、增强免疫力的药品、增强肠道微生物蠕动食品、增强肠道微生物蠕动保健品、增强肠道微生物蠕动药品等。
本发明所用的原料、试剂、耗材、仪器等均可采用市售产品。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明从杨树桑黄子实体中首次获得了一种具有多样性生物活性的呋喃型β-D-半乳葡聚糖，该呋喃型β-D-半乳葡聚糖在大棚环境下栽培的杨树桑黄子实体中不存在，表明特定的菌株和林下栽培环境能够诱导多糖等特殊有益次生代谢产物的生成，为获得更生态、更绿色，营养价值、药用价值更高的杨树桑黄的栽培提供了科学依据。林下栽培杨树桑黄，与在传统的大棚里生长对比，由于林下栽培处于近似野外的环境里，温度、光照、湿度等都在不断变化，在这些自然环境的共同刺激和胁迫作用下，会诱导多糖等次生代谢活性物质的生成，在林下野外环境下长出的桑黄子实体，其多糖的高级结构与传统的大棚里种植的桑黄完全不同，其生物活性也高低不一样。林下产出的桑黄更生态、更绿色，营养价值、药用价值更高。
本发明呋喃型β-D-半乳葡聚糖有良好生物活性，例如良好的增强免疫力活性、抗肿瘤活性和增强肠道微生物蠕动活性，具有广泛的实际应用价值。
本发明呋喃型β-D-半乳葡聚糖的获得方法操作方便，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，可工业化推广生产。
附图说明
图1为二次林下杨树桑黄子实体粗多糖水溶液经快流速DEAE-琼脂糖凝胶离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube numbers为管数；
图2为经丙烯葡聚糖凝胶S-100(Sephacryl S-100)纯化后的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube numbers为管数；
图3为实施例6中乙酰化产物的GC-MS图谱；a为标准品对照图谱，b为样品图谱；其中，纵坐标Relative Abundance为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)，Rham为鼠李糖，Rib为核糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖，Xyl为木糖，Man为甘露糖，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖；
图4为SVPS2的激光光散射图；其中，纵坐标为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)；
图5a为SVPS2的1H-NMR图谱，图5b为SVPS2的13C-NMR图谱，图5c为SVPS2的HSQC图谱，图5d为SVPS2的COSY图谱，图5e为SVPS2的1H-13C HMBC图谱；
图6为SVPS2二维原子力显微镜测试图；
图7a至图7d为不同浓度的SVPS2对RAW264.7 c细胞增强免疫力的作用效果图；
图8为不同浓度的SVPS2对HT-29细胞的抗肿瘤作用效果图；其中纵坐标Inhibition(％)表示抑制率(％)，横坐标表示浓度(μg/mL)。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明的技术方案作详细的说明，以便本领域技术人员理解该技术方案，不应视为对本发明技术方案的限制。
林下杨树桑黄子实体(Sanghuangporus vaninii)采自浙江省桐庐县国有林场林下种植。林下栽培条件：林分郁闭度0.8，海拔250m，空气湿度90％，白天温度：20℃-28℃，夜间温度：8℃-15℃。
实施例1
S1.将林下杨树桑黄子实体水洗干净后在55℃干燥3h烘干，粉碎，过40目筛，得到林下杨树桑黄子实体粉末。将林下杨树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与林下杨树桑黄子实体粉末的重量比为2：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为2:1)在40℃酶解2h，之后再在70℃提取3h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度95％的乙醇水溶液，搅拌混匀，3℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S2.在一次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖重量的1％，酶解条件：在55℃水浴2h，经105℃灭酶15min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。将所得的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.15m2/h，压力差为0.15MPa、料液温度为25℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S3.将二次林下杨树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到10mg/mL二次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(直径6.0cm×50cm)层析，上样量10mL，流速1.0mL/min；洗脱液为0.01mol/L-0.9mol/LNaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.0mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图1)，分别收集第一洗脱峰的洗脱液、第二洗脱峰的洗脱液以及第三洗脱峰的洗脱液。
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经Sephacryl-S 100凝胶层析柱(1.4cm×80cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为6000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到林下杨树桑黄子实体多糖，命名为SVPS1。
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经Sephacryl-S 100凝胶层析柱(1.4cm×80cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图2)，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为6000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状β-D-半乳葡聚糖，命名为SVPS2。
将收集的第三洗脱峰的洗脱液经Sephacryl-S 100凝胶层析柱(1.4cm×80cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为6000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到林下杨树桑黄子实体多糖，命名为SVPS3。
实施例2
S1.将林下杨树桑黄子实体水洗干净后在50℃干燥4h烘干，粉碎，过80目筛，得到林下杨树桑黄子实体粉末。将林下杨树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与林下杨树桑黄子实体粉末的重量比为6：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为4:1)在55℃酶解2.5h，之后再在80℃提取2h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度98％的乙醇水溶液，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S2.在一次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖重量的3％，酶解条件：在50℃水浴2.5h，经105℃灭酶20min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。将提取液用截留分子量为6000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.10m2/h，压力差为0.10MPa、料液温度为20℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S3.将二次林下杨树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到20mg/mL二次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(6.0cm×50cm)层析，上样量10mL，流速1.5mL/min；洗脱液为0.01mol/L-0.9mol/LNaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.5mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集第二洗脱峰的洗脱液。将收集的第二洗脱峰的洗脱液经Sephacryl-S 100凝胶层析柱(1.4cm×80cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/LNaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为6000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状β-D-半乳葡聚糖，命名为SVPS2。
实施例3
S1.将林下杨树桑黄子实体水洗干净后在60℃干燥2h烘干，粉碎，过100目筛，得到林下杨树桑黄子实体粉末。将林下杨树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与林下桑黄子实体粉末的重量比为7：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为1:1)在50℃酶解2h，之后再在95℃提取2h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度90％的乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S2.在一次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次林下杨树桑黄子实体粗多糖重量的2％，酶解条件：在55℃水浴3.5h，经100℃灭酶20min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。将提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.20m2/h，压力差为0.20MPa、料液温度为28℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次林下杨树桑黄子实体粗多糖。
S3.将二次林下杨树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到15mg/mL二次林下杨树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(6.0cm×50cm)层析，上样量10mL，流速2.0mL/min；洗脱液为0.01mol/L-0.9mol/LNaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速2.0mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集第二洗脱峰的洗脱液。将收集的第二洗脱峰的洗脱液经Sephacryl-S 100凝胶层析柱(1.4cm×80cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/LNaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为5000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状β-D-半乳葡聚糖，命名为SVPS2。
对比例1：
采用市售的杨黄子实体(样本1：浙江康脉农业科技有限公司，大棚栽培；样本2：安徽金寨县祥瑞桑黄种植专业合作社，大棚栽培)，替换实施例2中林下杨树桑黄子实体，其它提取、分离和纯化操作步骤与实施例2中完全相同，得到多糖C1-SVPS2(样本1)、C2-SVPS2(样本2)。经结构鉴定，多糖C1-SVPS2与C2-SVPS2结构相同，具体为：单糖组成Glc:Gal:Man＝6.85:3:2.4(摩尔比)，重均分子量50.43KDa，其主链由(1→4)连接的吡喃型葡萄糖(1,4-linked Glcp)，(1→6)连接的吡喃型半乳糖(1,6-linked Galp)和(1,6→3)连接的吡喃型葡萄糖(1,3,6-linked Glcp)组成，支链由端基吡喃型甘露糖(1-linked Manp)组成。与从林下杨树桑黄子实体中获得的SVPS2的主链结构(1→5)连接的呋喃型葡萄糖(1,5-linkedGlcf)和(1,6→5)连接的呋喃型葡萄糖(1,5,6-linked Glcf)完全不同。
关于SVPS2结构鉴定和性能分析：
实施例4：理化性质组分及分子量检测
将实施例1制得的β-D-半乳葡聚糖SVPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.83％。从图4看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰，具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SVPS2的保留时间主要分布在28min-38min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SVPS2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝2.34×104Da。
将实施例2制得的β-D-半乳葡聚糖SVPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.72％。其激光光散射图检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SVPS2的保留时间主要分布在29min-40min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SVPS2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝2.38×104Da。
将实施例3制得的β-D-半乳葡聚糖SVPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.78％。其激光光散射图检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SVPS2的保留时间主要分布在27min-40min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SVPS2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝2.35×104Da。
实施例5：单糖组成
分别取3mg实施例1、实施例2、实施例3中的SVPS2放入薄壁长试管内，加2.0mol/L三氟乙酸4.0mL，封管，110℃水解2h。水解后，试管中溶液在低于40℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，“加入甲醇蒸干”的步骤重复操作4-5次，以完全除去三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。
将各种单糖标准品和完全酸水解的样品分别溶于3mL蒸馏水中，加入30mg硼氢化钠，密塞，于室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的硼氢化钠，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复“加入少量甲醇，减压浓缩蒸干”步骤4-5次。再加入醋酐(乙酸酐)4mL，100℃反应1h，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，得到乙酰化后的产物。将各乙酰化后的产物分别用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入等量的蒸馏水充分混匀，待静置后，除去上层水溶液，如此重复3-4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥、过滤，用氯仿定容至10mL，即得乙酰化产物，待GC-MS分析。
GC-MS条件：采用DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温(初始柱温为120℃，以10℃/min升温至240℃，保持6.5min)，接口温度250℃，离子源温度250℃，进样量2.0μL，以氦气做载气，流速1.0mL/min。
多糖水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱如图3b，对应单糖标准品谱图(图3a)，实施例1中SVPS2多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、L-岩藻糖和D-葡萄糖组成，其中，D-葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为13.9:2.7:1.0，说明SVPS2是一种新型的半乳葡聚糖。
实施例2中SVPS2多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、L-岩藻糖和D-葡萄糖组成，其中，D-葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为13.7:3.4:1.1，说明SVPS2是一种新型的半乳葡聚糖。
实施例3中SVPS2多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、L-岩藻糖和D-葡萄糖组成，其中，D-葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为14.6:3.8:1.2，说明SVPS2是一种新型的半乳葡聚糖。
实施例6：甲基化分析
分别取2mg实施例1、实施例2、实施例3中SVPS2样品溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylationofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。
SVPS2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表1可知：该多糖含有5种残基，分别为端基L-吡喃型岩藻糖(T-L-Fucp)(4.28mol％)，端基D-呋喃型葡萄糖(5.93mol％)，端基D-吡喃型半乳糖(17.21mol％)，(1→5)连接的D-呋喃型葡萄糖(44.62mol％)和(1,6→5)连接的D-呋喃型葡萄糖(27.96mol％)。
表1 SVPS2甲基化分析
甲基化单糖残基 连接方式 摩尔比 主要碎片离子(m/z)
2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-L-Fucp 1-linked Fucp 4.28 43,59,71,89,101,117,129,144,161,187
2,3,5,6-Me<sub>4</sub>-D-Glcf 1-linked Glcf 5.93 43,59,87,89,101,113,117,205
2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-D-Galp 1-linked Galp 17.21 43,87,99,102,117,127,205
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glcf 1,5-linked Glcf 44.62 43,87,99,101,117,127
2,3-Me<sub>2</sub>-D-Glcf 1,5,6-linked Glcf 27.96 43,87,101,117,127
实施例7：核磁共振
分别取60mg实施例1、实施例2、实施例3中SVPS2溶于0.5mL氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。
根据SVPS2的1H-NMR(见图5a)、13C-NMR(见图5b)结合HSQC谱(见图5c)，检测到5个峰较为显著可用于分析。在1H-NMR谱中，于化学位移δ4.50-5.30ppm之间显示了SVPS2的主要的5个异头质子信号，按低场到高场分别为δ5.25,5.20,5.03,5.00和4.53ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E；13C-NMR谱中也有5个异头碳信号(图5b)，δ107.88,δ107.88,δ108.80,δ98.74和δ103.11ppm分别逐一对应。为了进一步阐明其化学结构，糖残基A-E的1H-NMR、13C-NMR谱化学位移经进一步结合1H-1H COSY图谱(见图5d)、1H-13C HSQC图谱(见图5c)和1H-13CHMBC图谱(见图5e)等二维核磁共振谱得到归属，归属结果见表2。
各残基的化学位移见表2，将所有残基的氢、碳化学位移，耦合常数与标准残基对照发现，A归属于T-Glc糖残基(末端残基)，B归属于→5)-β-D-Glcf-(1→，C归属于→5,6)-β-D-Glcf-(1→残基，D归属于T-Fucp糖残基(末端残基)，E归属于T-Galp糖残基(末端残基)。一般来说可以通过“苷化位移”来判断多糖中单糖之间的连接位置，糖残基的各个碳都得到归属后，通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，确定糖链的连接位置。
以上分析结果和甲基化分析结果相一致。
表2SVPS2糖残基的化学位移全归属
Figure SMS_3
通过HMBC谱可以推断出多糖SVPS2糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基C的C-5(δ76.26ppm)与残基C的H-1(δ5.03ppm)存在交叉峰，残基B的C-5(δ76.39ppm)与残基B的H-1(δ5.20ppm)存在交叉峰。同理分析可以得出，残基A连接在残基C的C-6位上；残基D连接在残基C的C-6位上；残基E连接在残基C的C-6位上。上述结果与甲基化分析的结果相符。
实施例8：原子力显微镜测试
分别将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2、实施例3中SVPS2水溶液涂抹在云母片上测试，获得多糖的二维原子力形貌，如图6，可以看出样品呈现伸展的柔顺链，单糖链高度为0.5nm-0.8nm。
结合实施例4至8的分析结果，显示本发明SVPS2由重量百分含量99％以上的多糖组成；该多糖由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其中，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为9.5-18.5:2.2-4.3:1.0-2.5，优选为13.7-14.6:2.7-3.8:1.0-1.2。其葡萄糖为β-D-呋喃型葡萄糖。其半乳糖为β-D-吡喃型半乳糖。其岩藻糖为α-L-吡喃型岩藻糖。其重均分子量为11KDa-55Kda，优选为23KDa-24Kda。多糖的结构单元中主链结构为(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基；在主链上连续的三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基中的任意一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上被一个β-D-吡喃型半乳糖端基取代，在主链上相邻的两个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上分别被一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖端基取代，且所述β-D-吡喃型半乳糖端基、β-D-呋喃型葡萄糖端基和α-L-吡喃型岩藻糖端基分别位于三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上、不会取代同一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位。一个β-D-吡喃型半乳糖端基、一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖端基在主链上连续的三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上的排列顺序为任意顺序，可以有多种不同的变化组合，具体结构单元可以是式Ⅰ所示的一种结构单元，也可以是三个端基在主链上三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上按其他排列顺序排列的结构单元。可见本发明本发明SVPS2与现有已发现的桑黄多糖的组成、分子量和结构(构型等)完全不同，为一种新发现的从林下杨树桑黄中提取分离的多糖。
实施例9：不同桑黄子实体多糖的生物活性对比
1.体外免疫功能实验：
1.1细胞培养
RAW264.7细胞以RPMI 1640(含20μg/mLPMB，质量百分比10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)完全培养液于37℃、体积百分比5％CO2细胞培养箱中培养，第4-6代指数生长期细胞用于实验。CCK-8法测定RAW264.7巨噬细胞的细胞活力。
RAW264.7细胞在96孔板中以5×104个细胞/mL/孔的密度预孵育24h。每孔加入多糖样品，37℃孵育24h。根据Griess试剂法测定RAW264.7细胞培养上清中NO的含量，结果见图7a。按照ELISA试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞培养上清中炎症细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的含量水平，结果见图7b、7c和图7d。
表3不同杨黄子实体多糖的增强免疫力功能对比
Figure SMS_4
Figure SMS_5
注：SVPS2分别与SVPS1、SVPS3、对比例1、空白对照组对比，对比例1与SVPS1、SVPS3、空白对照组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。SVPS2与对比例1对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
比较林下杨树桑黄子实体粗多糖经DEAE Sepharose FF分离得到的3个组分SVPS2、SVPS1、SVPS3的体外增强免疫力能力，由表3可以看出，SVPS3和SVPS1与空白对照组相当，表明SVPS3和SVPS1不能促进RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，不具有体外增强免疫力活性。对比例1与空白对照组相比，能促进RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，差异显著(P<0.05)。与SVPS1、SVPS3和对比例1相比，SVPS2显著促进RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，差异显著(P<0.01)，表明SVPS2具有较强的体外增强免疫力活性。由此可见，从林下杨树桑黄子实体中提取分离出的多糖组分增强免疫力活性有明显差别，SVPS3和SVPS1不具有免疫调节活性，SVPS2具有显著地免疫调节活性。同时，采用相同的提取和分离方法，来源于大棚里的杨黄子实体多糖和林下培养的杨黄子实体多糖的体外增强免疫力活性也具有显著差别。
2.体外抗肿瘤(MTT法)
取对数生长期的HT-29(人结肠癌细胞)，贴壁细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1-10×104个/mL的细胞悬液，经过准确的细胞计数后按500个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔加100μL，置于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h，再加入用完全培养基将样品稀释成不同浓度的样品溶液10μL，空白对照组为加入等体积的RPMll640完全培养基，每组设5个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37℃5％CO2及饱和湿度条件下培养24h、48h。培养结束后，每孔加入用按5mg/mL新鲜配制的四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液50μL，温育4小时，使MTT还原，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200μL，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪于570nm处测定光密度值(OD)，设置对照组，按公式计算细胞的抑制率。抑制率(％)＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。
表4不同杨黄子实体多糖的的抗肿瘤活性对比
Figure SMS_6
Figure SMS_7
注：SVPS2分别与SVPS1、SVPS3、对比例、空白对照组对比，对比例1与SVPS1、SVPS3、空白对照组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。SVPS2与对比例1对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
比较林下杨树桑黄子实体粗多糖经DEAE Sepharose FF分离得到的3个组分SVPS2、SVPS1、SVPS3的体外抗肿瘤能力，由表4可以看出，与空白对照组相比，SVPS3和SVPS1对HT-29(人结肠癌细胞)抑制率无显著差异，表明SVPS3和SVPS1组分不具有抑制肿瘤细胞的能力；对比例1与空白对照组相比，对HT-29细胞具有一定的抑制作用。与SVPS1、SVPS3和对比例1相比，SVPS2对HT-29(人结肠癌细胞)具有显著的抑制作用(p<0.01)，表明SVPS2具有较强的体外抑制肿瘤细胞的活性。由此可见，从林下杨树桑黄子实体中提取分离出的多糖组分体外抑制肿瘤细胞的活性有明显差别，SVPS3和SVPS1对HT-29细胞不具有抑制作用，SVPS2对HT-29细胞具有显著的抑制作用。同时，采用相同的提取和分离方法，来源于大棚里的杨黄子实体多糖和林下培养的杨黄子实体多糖的体外抑制肿瘤细胞的活性也具有显著差别。
3.对肠道微生物的作用
将100只健康小鼠随机分组，每组10只，给药组小鼠每天灌胃给药1次，多糖水溶液浓度0.1mg/mL，剂量为每次50mg多糖/kg小鼠体重，连续给药14d后处死，收集组织。空白组小鼠以与给药组给药量等体积的生理盐水进行灌胃，每天1次，连续14d后处死，收集组织。将小鼠盲肠内容物置于4.5mL无菌生理盐水的离心管中，在微型振荡器中摇匀，此为10-1倍稀释液，将10-1倍稀释液离心，取上清液0.5mL，加入含4.5mL无菌生理盐水的离心管中，在微型振荡器中摇匀得到10-2倍稀释液，依照上述步骤直至稀释至10-7倍。将10-7倍稀释液进行细菌培养，乳酸杆菌采用LBS琼脂培养基在37℃厌氧培养48h，大肠杆菌采用EMB琼脂培养基在37℃有氧培养24h，双歧杆菌采用BS琼脂培养基在37℃厌氧培养48h，每种细菌培养试验设3个重复。细菌培养试验结束，对细菌进行平板菌落计数，统计乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌所含的细菌数。
表5对微生物菌群的影响单位：lg CFU/g(101CFU/g)
糖组分 乳酸杆菌 双歧杆菌 大肠杆菌
实施例1中SVPS2 9.03±0.16<sup>**##</sup> 8.94±0.14<sup>**##</sup> 5.18±0.13<sup>**##</sup>
实施例2中SVPS2 9.09±0.15<sup>**##</sup> 8.87±0.15<sup>**##</sup> 5.11±0.12<sup>**##</sup>
实施例3中SVPS2 9.07±0.17<sup>**##</sup> 8.91±0.13<sup>**##</sup> 5.13±0.14<sup>**##</sup>
SVPS1 7.34±0.11 6.92±0.12 6.15±0.14
SVPS3 7.39±0.12 6.98±0.14 6.18±0.15
对比例1中C1-SVPS2 7.65±0.11 7.12±0.13 5.98±0.16
空白组 7.27±0.14 6.87±0.15 6.25±0.13
注：SVPS2分别与SVPS1、SVPS3、对比例1、空白组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。SVPS2与对比例1对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
比较林下杨树桑黄子实体粗多糖经DEAE Sepharose FF分离得到的3个组分SVPS2、SVPS1、SVPS3对小鼠肠道微生物菌群的影响作用，由表5可以看出，与空白组相比，SVPS3和SVPS1对乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌无显著差异，表明SVPS3和SVPS1组分不具有调节肠道菌种的作用；对比例1与空白组相比，对乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌无显著差异，表明其不具有调节肠道菌种的作用。与SVPS1、SVPS3和对比例1相比，SVPS2显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌的数量(p<0.01)、降低大肠杆菌数量(p<0.01)。乳酸杆菌与双歧杆菌为常见的益生菌，其大量增殖可以遏制病原微生物增殖，对保证肠道健康具有重要意义，表明SVPS2可以调节肠道菌群结构。
本发明中β-D-半乳葡聚糖SVPS2由重量百分含量99％以上的多糖组成；该多糖由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其中，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为9.5-18.5:2.2-4.3:1.0-2.5，葡萄糖为β-D-呋喃型葡萄糖。该组成的多糖具有较强的生物活性，例如增强免疫力活性、抗肿瘤活性和增强肠道微生物蠕动活性。本发明制备方法中参数的变化并不影响β-D-半乳葡聚糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现β-D-半乳葡聚糖的制备。在此不再赘述。

Claims (10)

1.一种β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其中，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为9.5-18.5:2.2-4.3:1.0-2.5；所述葡萄糖为β-D-呋喃型葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述半乳糖为β-半乳糖；所述岩藻糖为α-岩藻糖。
3.根据权利要求2所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述半乳糖为β-D-吡喃型半乳糖；所述岩藻糖为α-L-吡喃型岩藻糖。
4.根据权利要求1或3所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述多糖的结构单元中主链结构为(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基，在主链上连续的三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基中的任意一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上被一个β-D-吡喃型半乳糖端基取代，在主链上相邻的两个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上分别被一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖端基取代，且所述β-D-吡喃型半乳糖端基、β-D-呋喃型葡萄糖端基和α-L-吡喃型岩藻糖端基分别位于三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上、不会取代同一个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位。
5.根据权利要求4所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述一个β-D-吡喃型半乳糖端基、一个β-D-呋喃型葡萄糖端基和一个α-L-吡喃型岩藻糖端基在主链上三个(1→5)连接的β-D-呋喃型葡萄糖残基的C-6位上的排列顺序为任意顺序。
6.根据权利要求1或4所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述β-D-半乳葡聚糖的重均分子量为11KDa-55KDa。
7.根据权利要求1或4所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述β-D-半乳葡聚糖的来源为杨树桑黄子实体。
8.根据权利要求7所述的β-D-半乳葡聚糖，其特征在于，所述β-D-半乳葡聚糖的来源为林下杨树桑黄子实体。
9.根据权利要求1-8任一项所述的β-D-半乳葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：将杨树桑黄子实体经酶解、水浸提后分离纯化得到。
10.根据权利要求1-8任一项所述的β-D-半乳葡聚糖在制备抗肿瘤的产品、增强免疫力的产品、增强肠道微生物蠕动的产品中的应用。
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