CN115181769B - 一种提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)胞外多糖产量的方法，涉及微生物技术领域。所述方法包括将所述嗜盐四联球菌置于正常温度条件与低温条件下交替间歇培养后收集胞外多糖；所述正常温度条件为28‑32℃；所述低温条件为18‑22℃。本发明的方法通过正常温度与低温下间歇培养的方式使得能够更好地利用嗜盐四联球菌的低温保护机制以产生更多的胞外多糖，本发明方法简单，便于操作，成本低廉，可用于提高嗜盐四联球菌胞外多糖的产量。

Description

一种提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种提高嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)胞外多糖产量的方法。
背景技术
微生物胞外多糖(EPS)具有广泛的应用前景，特别是由于其独特的理化性质和生物活性，如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、免疫调节以及冷冻和冻干保护活性等，越来越受到研究者的关注。此外，微生物胞外多糖作为一种天然高分子聚合物，具有可再生、生物安全性、生物降解性以及生物相容性等特点，与合成化合物相比具有竞争优势。然而，微生物胞外多糖产量低一直是限制其工业大规模生产的主要原因，因此，提高微生物胞外多糖产量，促进微生物胞外多糖的工业发展应用，具有重要意义。
嗜盐四联球菌胞外多糖已被报道具有抗氧化、冷冻和冻干保护活性，可应用于微生物工业发展以及化妆品、食品和保健品等领域。提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量，探索嗜盐四联球菌胞外多糖更多生物活性，有助于丰富微生物胞外多糖的应用，促进微生物胞外多糖的工业发展。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供及一种提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量的方法，本发明方法解决了现有技术中存在的嗜盐四联球菌胞外多糖产量较低的技术问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种提高嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)胞外多糖产量的方法，所述方法包括：将所述嗜盐四联球菌置于正常温度条件与低温条件下交替间歇培养后收集胞外多糖；所述正常温度条件为28-32℃；所述低温条件为18-22℃。
在一个实施方案中，所述间歇培养的次数为2-3次。
在本发明中，所述正常温度条件包括但不限于28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃和32℃。
在本发明中，所述低温条件包括但不限于18℃、18.5℃、19℃、19.5℃、20℃、20.5℃、21℃、21.5℃和22℃。
在一个优选的实施方案中，所述正常温度条件为30℃；所述低温条件为20℃。
在一个实施方案中，所述交替间歇培养的总培养时间为55-70小时。
在一个优选的实施方案中，所述交替间歇培养的总培养时间为60小时。
在一个实施方案中，所述交替间歇培养为依次在正常温度条件、低温条件、正常温度条件、低温条件以及正常温度条件下培养。
在本发明中，所述交替间歇培养是指正常温度与低温条件交替培养，培养终点为正常温度条件。也即1次间歇培养为正常温度条件、低温条件、正常温度条件的培养，2次间歇培养为正常温度条件、低温条件、正常温度条件、低温条件以及正常温度条件下培养；3次间歇培养为正常温度条件、低温条件、正常温度条件、低温条件、正常温度条件、低温条件和正常温度条件下培养。当进行1-3次间歇培养时，需保证所述交替间歇培养的总培养时间为55-70小时(优选为60小时左右)，总培养时间过短，不足以产生胞外多糖；总培养时间过长，发酵后期不再产生胞外多糖。
在一个实施方案中，所述交替间歇培养为将所述嗜盐四联球菌在正常温度条件下培养24-26h，低温下培养5-8h；再在正常温度培养16-20h，低温下培养5-8h；再在正常温度培养5-8h。
在一个实施方案中，所述交替间歇培养为将所述嗜盐四联球菌在正常温度条件下培养24h，低温条件下培养6h；再在正常温度条件培养18h，低温条件下培养6h；再在正常温度条件下培养6h。
在一个实施方案中，所述嗜盐四联球菌的培养基的组成为：蛋白胨8～12g、牛肉浸粉7～9g、酵母提取物3～5g、葡萄糖18～22g、山梨醇单油酸酯0.8～1.2mL、磷酸氢二钾1.5～2.5g、三水合乙酸钠4～6g、柠檬酸铵1.5～2.5g、七水合硫酸镁0.1～0.3g、四水合硫酸锰0.03～0.06g、蒸馏水1000mL。
在一个优选实施方案中，所述嗜盐四联球菌的培养基的组成为：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、山梨醇单油酸酯1mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、七水合硫酸镁0.2g、四水合硫酸锰0.05g和蒸馏水1000mL。
在一个实施方案中，所述方法还包括对收集得到的胞外多糖进行产量测定。本发明通过嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)发酵产生胞外多糖。
在一个实施方案中，所述嗜盐四联球菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3792。本发明所涉及的嗜盐四联球菌菌株是从酱油酱醪中分离得到，经生理生化和16S rDNA序列分析鉴定，该菌株已经于2010年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株为已公开的菌株，本发明的侧重点在于所述提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量的方法。
有益效果：
(1)本发明通过正常温度和低温间歇培养嗜盐四联球菌，使其产生了一种适应性保护机制，其胞外多糖产量相比正常条件下培养显著增加；
(2)本发明方法简单可靠，操作易行，适合大规模推广应用；
(3)本发明方法的胞外多糖产量可达522mg/L以上。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、嗜盐四联球菌的培养
(1)将嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)CGMCC No.3792进行活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、山梨醇单油酸酯1mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、七水合硫酸镁0.2g、四水合硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL；
先在30℃静置培养24h，再在20℃静置培养6h，再在30℃静置培养18h，再在20℃静置培养6h，再在30℃静置培养6h，获得含有嗜盐四联球菌胞外多糖的发酵液。
实施例2、嗜盐四联球菌的培养
(1)将嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)CGMCC No.3792进行活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、山梨醇单油酸酯1mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、七水合硫酸镁0.2g、四水合硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL。
先在32℃静置培养24h，再在22℃静置培养6h，再在32℃静置培养18h，再在22℃静置培养6h，再在32℃静置培养6h，获得含有嗜盐四联球菌胞外多糖的发酵液。
实施例3、嗜盐四联球菌的培养
(1)将嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)CGMCC No.3792进行活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、山梨醇单油酸酯1mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、七水合硫酸镁0.2g、四水合硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL；
先在30℃静置培养24h，再在20℃静置培养7h，再在30℃静置培养17h，再在20℃静置培养7h，再在30℃静置培养5h，获得含有嗜盐四联球菌胞外多糖的发酵液。
实施例4、嗜盐四联球菌的培养
(1)将嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)CGMCC No.3792进行活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、山梨醇单油酸酯1mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、七水合硫酸镁0.2g、四水合硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL；
先在28℃静置培养24h，再在18℃静置培养6h，再在28℃静置培养18h，再在18℃静置培养6h，再在28℃静置培养6h，获得含有嗜盐四联球菌胞外多糖的发酵液。
此外，本发明还在本发明所限定的培养基的含量范围内(蛋白胨8～12g、牛肉浸粉7～9g、酵母提取物3～5g、葡萄糖18～22g、山梨醇单油酸酯0.8～1.2mL、磷酸氢二钾1.5～2.5g、三水合乙酸钠4～6g、柠檬酸铵1.5～2.5g、七水合硫酸镁0.1～0.3g、四水合硫酸锰0.03～0.06g、蒸馏水1000mL)做了其他实验，实验结果表明培养基组分在本发明限定的范围内的情况下，对嗜盐四联球菌胞外多糖的产量没有显著影响，也即本发明限定的培养基含量范围均能实现与实施例1-4类似的效果。
对比例1、正常温度嗜盐四联球菌的培养
与实施例1类似，不同之处在于将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，在30℃静置培养60h。
对比例2、低温嗜盐四联球菌的培养
与实施例1类似，不同之处在于将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，在20℃静置培养60h。
效果例1、嗜盐四联球菌胞外多糖的制备与产量测定
(1)将各实施例和对比例制得的液体发酵液离心，收集上清液；
(2)将步骤(1)制得的上清液中加入终浓度为3-8％的三氯乙酸，室温搅拌半小时，离心，收集上清液；
(3)将步骤(2)制得的上清液中加入三倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；
(4)将步骤(3)制得的沉淀用水溶解，透析，真空冷冻干燥后，制得嗜盐四联球菌胞外多糖；
(5)采用苯酚硫酸法测定嗜盐四联球菌胞外多糖产量。
各组胞外多糖的统计见表1。
表1.苯酚硫酸法测定嗜盐四联球菌胞外多糖产量的结果统计
组别 胞外多糖产量(mg/L)
实施例1 541
实施例2 526
实施例3 538
实施例4 533
对比例1(正常温度) 450
对比例2(低温培养) 522
结果表明，与正常温度培养或低温条件培养相比，采用正常温度和低温间歇培养的方法能够显著提高嗜盐四联球菌胞外多糖产量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种提高嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）胞外多糖产量的方法，其特征在于，包括：将所述嗜盐四联球菌置于正常温度条件与低温条件下交替间歇培养后收集胞外多糖；所述正常温度条件为28-32℃；所述低温条件为18-22℃；
所述交替间歇培养为将所述嗜盐四联球菌在正常温度条件下培养24-26 h，低温下培养5-8 h；再在正常温度培养16-20 h，低温下培养5-8 h；再在正常温度培养5-8h；
所述嗜盐四联球菌的培养基的组成为：蛋白胨8~12 g、牛肉浸粉7~9 g、酵母提取物3~5g、葡萄糖18~22 g、山梨醇单油酸酯0.8~1.2 mL、磷酸氢二钾1.5~2.5 g、三水合乙酸钠4~6g、柠檬酸铵1.5~2.5 g、七水合硫酸镁0.1~0.3 g、四水合硫酸锰0.03~0.06 g、蒸馏水1000mL；
所述嗜盐四联球菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3792。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常温度条件为30℃；所述低温条件为20℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交替间歇培养的总培养时间为55-70小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交替间歇培养为将所述嗜盐四联球菌在正常温度条件下培养24 h，低温条件下培养6 h；再在正常温度条件培养18 h，低温条件下培养6 h；再在正常温度条件下培养6 h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对收集得到的胞外多糖进行产量测定。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004141163A (ja) * 2002-10-04 2004-05-20 Ryukyu Bio Resource Kaihatsu:Kk 発酵処理物及びその製造方法
CA3021861A1 (en) * 2013-04-22 2014-09-18 Halliburton Energy Services, Inc. Treatment of a subterranean formation with composition including a microorganism or compound generated by the same
CN105838636A (zh) * 2015-12-02 2016-08-10 四川大学 一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法
CN105907691A (zh) * 2016-07-13 2016-08-31 四川大学 一种两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法
CN113278554A (zh) * 2021-05-24 2021-08-20 四川大学 一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法
CN114085875A (zh) * 2021-11-10 2022-02-25 四川大学 一种胞外多糖、制备方法及其应用
CN114196564A (zh) * 2021-10-08 2022-03-18 沈阳农业大学 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004141163A (ja) * 2002-10-04 2004-05-20 Ryukyu Bio Resource Kaihatsu:Kk 発酵処理物及びその製造方法
CA3021861A1 (en) * 2013-04-22 2014-09-18 Halliburton Energy Services, Inc. Treatment of a subterranean formation with composition including a microorganism or compound generated by the same
CN105838636A (zh) * 2015-12-02 2016-08-10 四川大学 一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法
CN105907691A (zh) * 2016-07-13 2016-08-31 四川大学 一种两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法
CN113278554A (zh) * 2021-05-24 2021-08-20 四川大学 一种利用混菌生物膜提高乳酸菌耐酸能力的方法
CN114196564A (zh) * 2021-10-08 2022-03-18 沈阳农业大学 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用
CN114085875A (zh) * 2021-11-10 2022-02-25 四川大学 一种胞外多糖、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792 存活率及细胞成分的影响;何桂强;《食品工业科技》;第37卷(第5期);第182-186页 *

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