CN105907691A - 一种两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于两阶段pH控制策略缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明以嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）CGMCC no. 3792为发酵菌株，所用发酵培养基为（w/v）：葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨6.4%，胰蛋白胨8%，七水硫酸镁0.025%，抗坏血酸0.05%，氯化钠12%，用蒸馏水配制，pH为6.5，121℃灭菌20 min；在发酵第一阶段（0~60小时）将pH控制在6.5，在发酵第二阶段（60小时后）将pH控制在6.0。以本发明提供的操作方法简便可靠，有效地缩短了12小时的发酵时间，并且生物量提高了17.3%，为乳酸菌在实际的发酵生产应用中提供一种有效的方法。

Description

一种两阶段 pH 控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法
技术领域
本发明涉及一种两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，具体体现在不同的发酵阶段采取不同的pH控制，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）属于乳酸菌科中的四联球菌属，广泛存在于酱油、果酱等高盐或高糖环境中。嗜盐四联球菌是产生挥发性物质的主要微生物之一，将其应用于酱油、鱼酱等调味品中，不仅能缩短发酵周期，而且能产生更多的挥发性物质，从而促进香味成分的生成，同时明显改善调味品的口感和品质。但是，在这些盐渍食品中，嗜盐四联球菌不可避免地遭受高盐胁迫，严重抑制了菌体的生长和代谢，使其生产效率及产品品质受到严重的影响。因此，提高嗜盐四联球菌在高盐发酵过程中的菌体密度具有重要意义。
高密度培养技术（High cell density cultivation）也称高密度发酵技术，是指应用一定的技术手段和装置提高菌体的密度，使其较常规培养的菌体密度有显著的提高。这种培养技术的优势在于减少设备费用、降低生产成本，能使产品的市场竞争力得到极大的提高。但是，在高盐发酵过程中，发酵液的渗透压较高，使乳酸菌的迟滞期延长，从而对乳酸菌的生理代谢造成很大的抑制和毒害作用。同时，由于乳酸菌有较强的产酸能力，因此发酵过程中pH的变化也对乳酸菌生长产生重要影响。
由此可见，嗜盐四联球菌在发酵工业应用中，所遭遇到的胁迫环境是多重和复杂的。交互保护是乳酸菌常见的一种应激保护方式，当细胞处于胁迫环境中时，由一种适应性反应所诱导的保护作用，可以保护细胞抵御更为恶劣的胁迫环境。在嗜盐四联球菌高盐发酵过程中，通过在不同阶段控制不同的pH，以期适应高盐胁迫环境，从而有利于获得更高密度的菌体细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种两阶段pH控制策略，用以缩短嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）高盐发酵周期及提高菌体密度。
所述的两阶段控制pH策略为在发酵第一阶段（0~60小时）将pH控制在6.5，在发酵第二阶段（60小时后）将pH控制在6.0。
菌株：嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）CGMCC 3792，实验室从酱油醪中分离，经形态、生理生化特性试验和16S rDNA测序鉴定，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2010年4月29日，保藏编号为CGMCC no. 3792，并分类命名为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）。
一种两阶段pH控制策略缩短嗜盐四联球菌高盐发酵周期的方法，包括以下步骤：
（1）种子培养方法；取-80℃保藏的嗜盐四联球菌甘油管储存液以5%（v/v）的接种量接种于种子培养基中，30℃静置培养24小时。种子培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，大豆蛋白胨 2%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，氯化钠 0%，pH为6.5；
（2）二级种子扩大培养方法；取上述活化种子液，以5%（v/v）的接种量接种于扩大培养基中，30℃静置培养24小时。扩大培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，胰蛋白胨 0.5%，大豆蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.5%，酵母膏 0.25%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，β-甘油磷酸钠 1.9%，氯化钠 6%，pH为6.5；
（3）5 L发酵罐培养方法；取上述二级种子扩大培养液，以5%（v/v）的接种量接种于5 L发酵罐中30℃发酵，发酵罐装液量为4 L，搅拌转速为150 r/min。发酵培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，大豆蛋白胨 6.4%，胰蛋白胨 8%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，氯化钠 12%，pH为6.5。
菌体生物量的测定：定时取出不同发酵时间的菌悬液离心（10000 r/min, 5 min, 4℃）收集菌体，用无菌水洗涤3次后稀释适当的倍数，摇匀，用TU-1901双束光紫外可见分光光度计，于600 nm处比浊测定OD值。
本发明的有益效果：在高盐发酵过程中，采用两阶段控制pH策略，可以有效地缩短发酵时间12小时，同时菌体生物量提高了17.3%。本发明提供了一种两阶段pH控制策略缩短嗜盐四联球菌高盐发酵周期的方法，简单易行，可探索乳酸菌应对不同环境胁迫时交互保护的作用机理以及为乳酸菌的工业化发酵提供了必要的理论指导。
附图说明
图1 不同pH控制对嗜盐四联球菌生长的影响。
具体实施方式
实例1（对照组1）：嗜盐四联球菌 CGMCC 3792在恒定pH为6.5条件下发酵（图1）
（1）种子培养；取-80℃保藏的嗜盐四联球菌甘油管储存液以5%（v/v）的接种量接种于种子培养基中，30℃静置培养24小时。种子培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，大豆蛋白胨 2%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，氯化钠 0%，pH为6.5；
（2）二级种子扩大培养；取上述活化种子液，以5%（v/v）的接种量接种于扩大培养基中，30℃静置培养24小时。二级种子培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，胰蛋白胨 0.5%，大豆蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.5%，酵母膏 0.25%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，β-甘油磷酸钠 1.9%，氯化钠 6%，pH为6.5；
（3）5 L发酵罐培养；取上述种子扩大培养液，以5%（v/v）的接种量接种于5 L发酵罐中30℃发酵，5 L发酵罐装液量为4 L，搅拌转速为150 r/min，控制pH为6.5。发酵培养78 小时到达稳定期，菌体OD600值稳定在2.60。
实例2（对照组2）：嗜盐四联球菌 CGMCC 3792在恒定pH 为6.0条件下发酵（图1）
其他条件同实例1。取二级种子培养液，以5%（v/v）的接种量接种于5 L发酵罐中30℃发酵，5 L发酵罐装液量为4 L，搅拌转速为150 r/min，控制pH为6.0。发酵培养96 小时到达稳定期，菌体OD600值稳定在3.05。
实例3（实验组）：嗜盐四联球菌 CGMCC 3792在两阶段pH控制条件下发酵（图1）
其他条件同实例1。取二级种子培养液，以5%（v/v）的接种量接种于5 L发酵罐中30℃发酵，5 L发酵罐装液量为4 L，搅拌转速为150 r/min，发酵前60小时控制pH为6.5，60小时后控制pH为6.0。发酵培养84 小时到达稳定期，OD600值稳定在3.05。与恒定pH 6.5（对照组1）相比，菌体生物量提高了 17.3%；与恒定pH 6.0（对照组2）相比，进入稳定期的时间缩短了 12 小时。

Claims (6)

1.一种两阶段pH控制策略缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，包含以下步骤：
（1）种子培养；取-80℃保藏的乳酸菌甘油管储存液，以5%（v/v）的接种量接种于种子培养基中，30℃静置培养24小时；
（2）二级种子扩大培养；取上述活化种子液，以5%（v/v）的接种量接种于扩大培养基中，30℃静置培养24小时；
（3）5 L发酵罐培养；取上述二级种子，以5%（v/v）的接种量接种于5 L发酵罐中30℃培养，发酵罐装液量为4 L，搅拌转速为150 r/min。
2.根据权利要求1所述两阶段pH控制策略缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，其特征在于：所述乳酸菌为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus），其保藏编号为CGMCC no. 3792。
3.根据权利要求1所述两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，其特征在于：所述种子培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，大豆蛋白胨 2%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，氯化钠 0%，pH为6.5。
4.根据权利要求1所述两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，其特征在于：所述二级种子扩大培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，胰蛋白胨 0.5%，大豆蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.5%，酵母膏 0.25%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，β-甘油磷酸钠 1.9%，氯化钠 6%，pH为6.5。
5.根据权利要求1所述两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，其特征在于：所述发酵培养基为（w/v）：葡萄糖 0.5%，大豆蛋白胨 6.4%，胰蛋白胨 8%，七水硫酸镁 0.025%，抗坏血酸 0.05%，氯化钠 12%，pH为6.5。
6.根据权利要求1所述两阶段pH控制缩短乳酸菌高盐发酵周期的方法，其特征在于：所述两阶段pH控制策略为：在5 L发酵罐中，在发酵第一阶段（0~60小时）将pH控制为6.5，在发酵第二阶段（60小时后）将pH控制为6.0。
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