CN110894481A

CN110894481A - 一株假链状双歧杆菌及其应用

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Publication number: CN110894481A
Application number: CN201911247645.4A
Authority: CN
Inventors: 毕德玺
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110894481B

Abstract

本发明公开了一株假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)及其应用，该菌株首次分离自人类肠道，其16S rRNA基因的序列如SEQ ID No.1所示，该菌株命名为DX1，其保藏编号为CCTCC NO:M2019852。本发明通过小鼠模型证实DX1菌种具有缓解肥胖、血糖稳态异常及肝脏脂肪变性的益生功效；该DX1菌种在高脂饮食小鼠中，可显著降低其体重、改善葡萄糖糖耐量和胰岛素抵抗以及改善肝脏脂肪变性，且不引起系统性炎症和肠道炎症，具有一定安全性，这为预防或治疗肥胖和糖尿病等代谢性疾病奠定了一定的理论基础。

Description

一株假链状双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及双歧杆菌技术领域，尤其涉及一株假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)及其应用，该菌株分离自人类肠道。

背景技术

肥胖和糖尿病等代谢性疾病已成为全球性健康问题。最新统计数据表明肥胖人群不断增长，至2016年全球成年人和儿童中超重(BMI≥25kg/m²)人群比例已分别高达40％和18％左右，其中成年肥胖(BMI≥30kg/m²)人群在男性中约占12％，在女性中约占16％，分别为1975年的四倍和两倍。同时，糖尿病发病率亦在不断攀升，据世界卫生组织统计，在2014年全球糖尿病患者已超过4.2亿，在成年人中发病率已达到8.5％。据估计，在2016年全球约有160万人直接死于糖尿病。在我国，随生活水平提升，肥胖和糖尿病等代谢性疾病的发病率已呈快速增长趋势。

证据不断表明，肠道菌群失调在代谢性疾病发生发展中扮演重要角色。肠道菌群参与机体食物消化、营养吸收、免疫调节、稳态维持等重要生理过程，与人体健康密切相关。研究已发现肠道微生态失调与包括糖尿病、肥胖、肿瘤、自闭症等50多种慢性疾病存在直接关系。代谢性疾病患者肠道菌群会呈现特定的菌群结构变化。因此肠道微生态治疗已成为一个研究热点。研究发现，通过摄入乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌可有效改善肠道菌群，缓解代谢性疾病。但是，目前已知的益生菌数量仍然有限，肠道微生态资源及相关功能仍有待于深入挖掘和探究。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一株从人类肠道中分离获得的假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)分离株DX1，并通过小鼠模型证实其具有缓解肥胖、肝脏脂肪性病变及血糖稳态异常的益生功效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一株假链状双歧杆菌，所述假链状双歧杆菌的16SrRNA基因的序列如SEQ ID No.1所示。该序列具体如下：

进一步地，所述假链状双歧杆菌分离自人类肠道。

进一步地，所述假链状双歧杆菌分离自人类肠道的肠上皮组织。

进一步地，所述假链状双歧杆菌的培养条件为：哥伦比亚血平板培养基，37℃厌氧培养。

进一步地，将培养获得的单菌落经划线稀释法纯化，分离株通过16S rRNA基因扩增测序鉴定菌种，上述菌株在哥伦比亚血平板培养3天后，形成相对较小、圆形、光滑、半透明白色菌落，该菌株经革兰染色后镜下呈紫色、典型双歧杆菌形态。

进一步地，所述假链状双歧杆菌的16S rRNA基因经通用引物27F和1492R进行扩增测序。上述引物27F和1492R的序列如下：

进一步地，所述假链状双歧杆菌的16S rRNA基因与假链状双歧杆菌株B1279的16SrRNA基因序列具有99.86％一致性。

进一步地，所述假链状双歧杆菌命名为DX1，其分类命名为假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)，其保藏编号为CCTCC NO:M2019852，保藏日期为2019年10月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的第二个方面是提供一种任一上述的假链状双歧杆菌在制备缓解肥胖、肝脏脂肪性病变和/或血糖稳态异常的制剂中的应用。

进一步地，所述肥胖、肝脏脂肪性病变和/或血糖稳态异常由高脂饮食引起。

进一步地，所述假链状双歧杆菌不会引起系统性炎症和肠道炎症，具有一定安全性。

进一步地，所述假链状双歧杆菌能降低体重、改善葡萄糖糖耐量和胰岛素抵抗、改善肝脏脂肪变性。

进一步地，采用小鼠模型进行DX1菌株益生功效的验证，其用法及用量为：每两天接受一次DX1菌株灌胃，剂量为每次1×10⁹CFU，饲养周期为16周。

本发明的第三个方面是提供一种含有任一上述的假链状双歧杆菌的制剂。

进一步地，所述制剂还包含可摄取的辅料，例如相应的胶囊、片剂或粉末的药用载体等。

本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

与现有技术相比，双歧杆菌虽为常见益生菌，但关于双歧杆菌属中B.pseudocatenulatum菌种的益生功能报道较少，本发明首次自人类肠道中发现并分离获得B.pseudocatenulatum DX1，证实其益生功效优于现有公开报道的菌株，其在降低体重、改善葡萄糖糖耐量和胰岛素抵抗方面具有更加优异的效果，且通过本发明实施例可知DX1菌株不会引起系统性炎症和肠道炎症，在小鼠体内具有安全性，此为利用该菌株DX1进行预防或治疗肥胖和糖尿病等代谢性疾病奠定了一定的理论基础。

附图说明

图1是本发明一实施例中假链状双歧杆菌DX1的菌落形态图。

图2是本发明一实施例中假链状双歧杆菌DX1经革兰染色后的镜下形态图。

图3是本发明一实施例中假链状双歧杆菌DX1显著缓解由高脂饮食引起的肥胖的结果示意图；其中，A表示三组小鼠起始体重；B表示试验16周后三组小鼠体重；C表示小鼠附睾脂肪组织中平均脂肪细胞面积；D表示小鼠附睾脂肪组织中冠状结构(CLS)比例；统计学比较分析采用One-way ANOVA和Tukey多重检验校正；图中为校正后p值，p<0.05时认为有统计学差异。

图4是本发明一实施例中假链状双歧杆菌DX1显著缓解由高脂饮食引起的血糖稳态异常的结果示意图；其中，A表示试验16周后小鼠空腹血糖水平；B表示试验16周后小鼠空腹胰岛素水平；C表示试验16周后OGTT试验血糖曲线线下面积(AUC表示)；D表示试验16周后OGTT试验胰岛素曲线线下面积(AUC)；统计学比较分析采用One-way ANOVA和Tukey多重检验校正；图中为校正后p值，p<0.05时认为有统计学差异。

图5是本发明一实施例中假链状双歧杆菌DX1显著缓解由高脂饮食引起的肝脏脂肪变性的结果示意图；其中，左图为各组评分频数分布(Fisher精确检验)；右图为评分分组比较(Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正)；图中为校正后p值，p<0.05时认为有统计学差异。

图6为本发明一实施例中验证假链状双歧杆菌DX1的安全性的结果示意图，其结果表明灌胃不引起系统性炎症和肠道炎症。

上述假链状双歧杆菌DX1已进行保藏，其分类命名为假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)，其保藏编号为CCTCC NO:M2019852，保藏日期为2019年10月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

具体实施方式

本发明公开了一株假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)及其应用，该菌株首次分离自人类肠道，其16S rRNA基因的序列如SEQ ID No.1所示，该菌株命名为DX1，其保藏编号为CCTCC NO:M2019852。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为假链状双歧杆菌DX1的分离及菌种鉴定。

(1)假链状双歧杆菌DX1的分离：

假链状双歧杆菌DX1分离自人类肠道的肠上皮组织。组织放入胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，由成品TSB干粉配制)中，经机械打碎后，梯度稀释10²-10³倍，涂布于哥伦比亚血平板(由成品哥伦比亚琼脂基础干粉、5-7％无菌脱纤维羊血配制)，37℃厌氧培养2-3天。挑取平板上生长的疑似单菌落并进行菌种鉴定。最终获得DX1分离株。获得的DX1单菌落在哥伦比亚血平板再次划线培养2-3次，以纯化该菌株。分离的假链状双歧杆菌采用哥伦比亚血平板培养基进行培养，培养条件为37℃厌氧培养。如图1和图2所示，该菌株在哥伦比亚血平板培养3天后，形成相对较小、圆形、光滑、半透明白色菌落，该菌株经革兰染色后镜下呈紫色、典型双歧杆菌形态。

(2)菌种鉴定：

上述分离株DX1通过16S rRNA基因扩增测序鉴定菌种。采用一般的全基因组制备试剂盒按说明书给定方法提取分离株DX1的总DNA。16S rRNA基因的PCR扩增采用通用引物27F(序列：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(序列：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。扩增体系参照扩增试剂盒说明书配制。扩增程序为，首先95℃预变性5分钟；之后为扩增循环，每循环包括：95℃维持30秒，55℃维持30秒，72℃维持90秒，重复25个循环；最后72℃维持5分钟，降温至15℃。采用Sanger法测序扩增片段。序列比对通过NCBI网站的BLASTn在线工具比对，比对数据库为“16S ribosomal RNA sequences(Bacteria and Archaea)”，其余为默认参数。

该菌株16S rRNA基因经通用引物27F和1492R扩增测序后所得序列如上述SEQ IDNo.1所示，其与B.pseudocatenulatum菌株B1279的16S rRNA基因序列(NCBI登录号NR_037117.1)有99.86％一致性。

实施例2

本实施例为假链状双歧杆菌DX1益生功效的验证。

25只四周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6J小鼠给予低脂饲料(10kcal％fat)适应饲养四周；后随机分为3组，分别为低脂饮食组(LFD，n＝7)、高脂饮食组(HFD，n＝9)和高脂饮食加DX1菌株灌胃组(HFD+Bp，n＝9)。其中，LFD组继续接受低脂饲料(10kcal％Fat)饲喂；HFD组和HFD+Bp组均接受高脂饲料(60kcal％Fat)饲喂；此外HFD+Bp组每两天接受一次B.pseudocatenulatum DX1菌株灌胃，剂量为每次1×10⁹CFU，而HFD组对应地接受生理盐水灌胃。以此持续16周。

(1)DX1菌株显著缓解由高脂饮食引起的肥胖；

试验过程中定期记录各组小鼠体重变化，发现DX1菌株可显著缓解由高脂饮食引起的肥胖。三组小鼠初始体重无差异(图3的A部分)。在试验结束后，HFD组小鼠体重显著高于LFD组小鼠，平均体重为LFD组的1.2倍；接受DX1菌株灌胃的高脂饮食小鼠(HFD+Bp组)小鼠体重显著低于HFD小鼠，平均体重较HFD组降低10％(图3的B部分)。此外，该组小鼠平均体重虽为LFD组的1.09倍，但仅在数值上高于LFD组，统计学并无显著性差异(图3的B部分)。小鼠断颈处死后取附睾脂肪组织，经福尔马林固定后用石蜡包埋，切片后行HE染色。镜下观察发现HFD+Bp组小鼠的附睾脂肪细胞显著要小于HFD组的，但仍大于LFD组的(图3的C部分)。而HFD+Bp组小鼠脂肪组织中冠状结构数目显著少于HFD组，与LFD组无显著差异(图3的D部分)。

(2)DX1菌株显著缓解由高脂饮食引起的血糖稳态异常；

试验结束后测定小鼠空腹血糖，并进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，发现DX1菌株可显著缓解由高脂饮食引起的血糖稳态异常。在试验结束后，HFD组小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平显著高于LFD组(图4的A部分和图4的B部分)；而HFD+Bp组与HFD组相比显著降低，且与LFD组之间无显著差异。进一步的OGTT结果与之基本一致，HFD组血糖和胰岛素线下面积(AUC)均显著高于LFD组，而HFD+Bp组与HFD组相比显著降低，但仍高于LFD组(图4的C部分和图4的D部分)。可见DX1菌可显著改善葡萄糖糖耐量和胰岛素抵抗。

(3)DX1菌株显著缓解由高脂饮食引起的肝脏脂肪变性；

试验16周后，小鼠断颈处死，取肝脏组织，经福尔马林固定后用石蜡包埋，切片后行HE染色。对肝脏脂肪变性程度进行Brunt评分。LDF组小鼠评分最低，脂肪变性程度最小，HFD小组评分最高，脂肪变性程度最为严重，HFD+Bp组小鼠肝脏脂肪变性程度较HFD组显著降低，虽中位评分高于LFD组，但无显著差异(图5)。该结果说明DX1菌株显著缓解由高脂饮食引起的肝脏脂肪变性，改善肝脏脂肪变性症状。

(4)DX1菌株不会引起系统性炎症和肠道炎症；

试验16周后，小鼠断颈处死，取脾脏称重，测定结直肠长度，测定血清中炎症因子TNF-α和IL-6水平，三组间均无显著差异(图6)。取结肠组织固定包埋后行病理切片检查，三组小鼠均未发现结肠中存在炎症。说明DX1菌株灌胃不引起系统性炎症和肠道炎症，具有一定安全性。

对比例

Zhao et al等人近期(Science 2018,359:1151–1156)报道了一株假链状双歧杆菌C95。C95可缓解高脂饮食诱发的肥胖和血糖稳态异常。灌胃C95的高脂饮食小鼠较单纯高脂饮食小鼠体重平均降低8％，低于实施例2中所述的10％，且小鼠体重与低脂饮食组仍存在统计学显著性差异。此外，灌胃C95的高脂饮食小鼠OGTT血糖线下面积与单纯高脂饮食小鼠未呈现出显著性差异。该对比说明DX1具有更为优异的缓解肥胖及血糖稳态异常的功效。此外，未见C95关于缓解肝脏脂肪性病变和安全性评价的报道。

由上述实施例可知，本发明首次从人类肠道中分离所得的假链状双歧杆菌DX1，具有缓解肥胖、肝脏脂肪性病变及血糖稳态异常的益生功效，且其益生功效优于现有技术，且该DX1菌株不会引起系统性炎症和肠道炎症，具有一定安全性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 毕德玺

<120> 一株假链状双歧杆菌及其应用

<141> 2019-12-09

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1466

<212> DNA

<213> DX1 16S rRNA基因序列(Bifidobacterium pseudocatenulatum)

<400> 1

atggctcagg atgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg ggatccatca 60

ggctttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga cctgccccat 120

acaccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat gctccgactc ctcgcatggg 180

gtgtcgggaa agatttcatc ggtatgggat ggggtcgcgt cctatcaggt agtcggcggg 240

gtaacggccc accgagccta cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacattgg 300

gactgagata cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc 360

gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgcgg gatgacggcc ttcgggttgt aaaccgcttt 420

tgatcgggag caagccttcg ggtgagtgta cctttcgaat aagcaccggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaaggg 540

ctcgtaggcg gttcgtcgcg tccggtgtga aagtccatcg cttaacggtg gatctgcgcc 600

gggtacgggc gggctggagt gcggtagggg agactggaat tcccggtgta acggtggaat 660

gtgtagatat cgggaagaac accaatggcg aaggcaggtc tctgggccgt tactgacgct 720

gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

ggtggatgct ggatgtgggg cccgttccac gggttccgtg tcggagctaa cgcgttaagc 840

atcccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa gaaattgacg ggggcccgca 900

caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tgggcttgac 960

atgttcccga cagccgtaga gatatggcct cccttcgggg cgggttcaca ggtggtgcat 1020

ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1080

gccctgtgtt gccagcacgt catggtggga actcacgggg gaccgccggg gtcaactcgg 1140

aggaaggtgg ggatgacgtc agatcatcat gccccttacg tccagggctt cacgcatgct 1200

acaatggccg gtacaacggg atgcgacacg gcgacgtgga gcggatccct gaaaaccggt 1260

ctcagttcgg attggagtct gcaacccgac tccatgaagg cggagtcgct agtaatcgcg 1320

gatcagcaac gccgcggtga atgcgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat 1380

gaaagtgggt agcacccgaa gccggtggcc taaccttttt ggatggagcc gtctaaggtg 1440

agactcgtga ttgggactaa gtcgta 1466

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物27F(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物1492R(Artificial Sequence)

<400> 3

cggttacctt gttacgactt 20

Claims

1.一株假链状双歧杆菌，其特征在于，所述假链状双歧杆菌的16S rRNA基因的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一株假链状双歧杆菌，其特征在于，所述假链状双歧杆菌分离自人类肠道。

3.根据权利要求2所述的一株假链状双歧杆菌，其特征在于，所述假链状双歧杆菌分离自肠上皮组织。

4.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述假链状双歧杆菌的培养条件为：哥伦比亚血平板培养基，37℃厌氧培养。

5.根据权利要求1所述的一株假链状双歧杆菌，其特征在于，所述假链状双歧杆菌的16S rRNA基因与假链状双歧杆菌株B1279的16S rRNA基因序列具有99.86％一致性。

6.根据权利要求1所述的一株假链状双歧杆菌，其特征在于，所述假链状双歧杆菌命名为DX1，其保藏编号为CCTCC NO:M2019852。

7.一种如权利要求1～6中任一项所述的假链状双歧杆菌在制备缓解肥胖、肝脏脂肪性病变和/或血糖稳态异常的制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肥胖、肝脏脂肪性病变和/或血糖稳态异常由高脂饮食引起。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述假链状双歧杆菌不会引起系统性炎症和肠道炎症。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述假链状双歧杆菌能降低体重、改善葡萄糖糖耐量和胰岛素抵抗、改善肝脏脂肪变性。