CN105708802A - 一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用。本发明提供的靶向脂质体由脂质体和转铁蛋白组成；所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基，所述脂质体的羧基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇?羧基提供。本发明提供的载药脂质体由所述靶向脂质体包载药物得到，所述药物为紫花牡荆素，所述载药脂质体可用于治疗肺癌。本发明将TF修饰到脂质体表面，增强肺靶向的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作用；将抗肿瘤药紫花牡荆素包载到脂质体中，得到靶向功能的靶向肺癌细胞的脂质体，能使药物到达病灶部位，并预期能有效防止肿瘤复发。本发明为彻底根治肺癌带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。

Description

一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用，属于肺癌药物研究领域。

背景技术

肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，发达国家肺癌的5年生存率约10％～15％，在我国则更低。肺癌患者中80％～85％为非小细胞肺癌，且多数患者初次诊断时已处于晚期(Ⅲb/Ⅳ期)，失去手术机会。放疗和化疗虽可在一定程度上改善肺癌的整体治疗水平，但效果并不理想。放疗难以根除浸润转移的肺癌细胞，而化疗无选择性，在杀伤癌细胞的同时也对正常细胞造成伤害。因此，寻找更为有效和安全的治疗手段成为当前肺癌研究的一个热点。

由于脂质体(liposomes)能够保护药物避免其在血浆中降解、绕开外排转运蛋白，利于药物靶向入肺部，显著增加肺部药物浓度，从而提高治疗效果并减小全身毒副作用，广泛用于肺部药物传递的研究。转铁蛋白(transferrin，TF)是一类Ⅱ型跨膜糖蛋白家族，由2个单体(90000)经二硫键交联而成。转铁蛋白受体(transfer-receptorTFR)在分裂活跃的细胞上表达水平很高，在肿瘤细胞上每个细胞能达到1万～10万个分子，而在非增殖细胞上很少表达，甚至检测不到。TF/TFR系统在转运抗癌药、蛋白质以及基因治疗药物上显示出了很大潜能。基于此，有望提供以中方肺靶向脂质体。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用，本法通过将靶向肺癌的功能基配体TF(转铁蛋白)修饰到脂质体表面，增加脂质体到达肺部的能力；同时，本发明将紫花牡荆素包载到靶向脂质体中，增强其对肿瘤细胞促凋亡作用，为杀死肿瘤细胞提供可能，从而防止治疗后因细胞残留而引起肿瘤复发。

本发明所提供的靶向脂质体，由脂质体和转铁蛋白组成；

所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基。

上述的靶向脂质体中，所述脂质体的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-COOH)提供。

上述的靶向脂质体中，所述脂质体具体可由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-COOH)制备得到；

各原料的摩尔份数可为：

所述卵磷脂80～88份；

所述胆固醇7～15份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2～4.8份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.2～0.7份；

各原料的摩尔份数具体可为：

所述卵磷脂84份；

所述胆固醇11份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.5份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5份。

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具体可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基具体可为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)。

上述的靶向脂质体中，所述转铁蛋白与所述脂质体的质量比可为1：8.1～9.1，具体可为1：8.6。

本发明进一步提供了所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：在碳二亚胺(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下，所述转铁蛋白连接于所述脂质体的所述羧基上，即得所述靶向脂质体。

上述的制备方法中，所述脂质体可由所述卵磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基通过硫酸铵梯度法制备得到。

上述的制备方法中，所述碳二亚胺与所述转铁蛋白的摩尔比为12～18：1，具体可为16.5：1；

所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为35～40：1，具体可为39.7：1。

以所述靶向脂质体为活性成分的药物载体也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种载药脂质体，其由所述靶向脂质体包载药物得到。

所述载药脂质体中，所述药物具体可为紫花牡荆素(Casticin，CAS)分子式为C₁₉H₁₈O₈，相对分子质量374.35，熔点为186～187℃，纯品为淡黄色晶体。紫花牡荆素学名5,3'-二羟基-3,6,7,4'-四甲氧基黄酮，又叫蔓荆子黄素，属于多甲氧基黄酮类化合物。

所述载药脂质体的药脂比为1：20～40，具体可为1：30；

所述药脂比指的是所述药物的质量与所述靶向脂质体中的所述卵磷脂和所述胆固醇的质量之和的比值。

本发明提供的载药脂质体可用于治疗肺癌，所述肺癌可为肺腺癌，具体可为A549肺腺癌。

本发明所述载药脂质体能够诱导肺癌细胞的凋亡，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞，具体可为A549肺腺癌。

本发明将TF修饰到脂质体表面，增强肺靶向的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作用；将抗肿瘤药紫花牡荆素包载到脂质体中，得到靶向功能的靶向肺癌细胞的脂质体，能使药物到达病灶部位，并预期能有效防止肿瘤复发。本发明为彻底根治肺癌带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。

附图说明

图1为本发明载药脂质体(TF-CAS-脂质体)的透射电镜照片。

图2为本发明载药脂质体(TF-CAS-脂质体)的药物释放曲线。

图3为A549肺腺癌细胞的形态。

图4为不同载药脂质体对A549肺腺癌细胞的抑制作用。

图5为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体的摄取及其在细胞内的分布行为，其中，图5(A1)、图5(A2)和图5(A3)表示细胞对游离紫花牡荆素(CAS)的摄取及其在细胞内的分布行为，图5(B1)、图5(B2)和图5(B3)表示细胞对CAS-脂质体的摄取及其在细胞内的分布行为，图5(C1)、图5(C2)和图5(C3)表示细胞对TF-CAS-脂质体的摄取及其在细胞内的分布行为。

图6为A549肺腺癌细胞对不同载药脂质体的摄取能力，其中，图6(A)表示A549肺腺癌细胞对空白脂质体的摄取能力，图6(B)表示A549肺腺癌细胞对紫花牡荆素-脂质体的摄取能力，图6(C)表示A549肺腺癌细胞对TF-紫花牡荆素-脂质体的摄取能力。

图7为不同载药脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡作用，其中，图7(A)表示游离紫花牡荆素(CAS)对A549肺腺癌细胞的凋亡作用，图7(B)表示CAS-脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡作用，图7(C)表示TF-CAS-脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的试剂和仪器如下：

1、实验试剂和细胞

蛋黄卵磷脂(EPC)购自GermanyLipoidcompany,ShangHailocalagent,China；胆固醇(cholesterol)购自北京双旋微生物培养基制品厂；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)购自日本油脂株式会社(日本NOF公司)；转铁蛋白(TF)、葡聚糖凝胶(shephedexG-50,shephedexG-100)购自Sigma公司；碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)购自上海源叶生物科技有限公司；紫花牡荆素购自成都普瑞法科技开发有限公司；硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；DMEM-F12高糖培养基、0.25％胰酶购于Gibico公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于北京索莱宝生物科技有限公司；磺酰罗丹明B蛋白(SRB)购自美国Sigma公司。A549人肺腺癌细胞购自中国科学院上海细胞所。

2、实验仪器

聚碳酯过滤器(孔径为400、200nm)购自Millipore(Bedford,MA,USA)；安捷伦1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，紫外检测器)；UV-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；马尔文粒度测定仪(英国马尔文仪器公司)；SartoriusBP211D电子天平(德国赛多利斯集团)；超声波清洗器(天鹏电子新技术北京有限公司)；EYELA-1000S型旋转蒸发仪(日本EYELA东京理化器械株式会社)；JY92细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；透析袋(截留分子量8000-12000)；脂质体挤压器(德国赛多利斯集团)；流式细胞仪(美国BD公司)CO₂恒温培养箱(Thermo科技有限公司，美国)；酶标免疫测定仪(上海基因科技有限公司)。

实施例1、脂质体的制备

一、空白脂质体的制备

1、空白脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-COOH按摩尔比84：11：4.5：0.5溶解在乙腈中，旋转蒸发除去乙腈，在茄形瓶中35℃、40rpm旋转蒸发成膜，加入250mM硫酸铵10ml，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92型超声波细胞粉碎机中进一步超声(超声工作时间为10s，间歇时间为20s，全程时间为9min，保护温度为35℃)，再使用脂质体挤压器分别过400nm和200nm聚碳脂膜各3次，采用透析法用PBS液(PH＝7.4)更换脂质体外相液，得到空白脂质体。

2、转铁蛋白修饰的空白脂质体的制备

以碳二亚胺(EDCI)作连接剂将转铁蛋白链接到脂质体表面上DSPE-PEG2000-COOH的羧基上得到靶向性载药脂质体。

具体步骤：5.22μmol(1.0mg)的EDCI和12.51μmol(1.44mg)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加到1mL空白脂质体中。上述空白脂质体混悬液使用磁力搅拌器在室温下缓慢搅拌10min，然后再向其中加入0.315μmol(25mg)转铁蛋白，接着于同样的搅拌条件下继续反应3h。反应结束后将脂质体混悬液通过SephadexG-100柱(预先用pH7.4的PBS溶液平衡)分离去除游离转铁蛋白，得到TF修饰的空白脂质体(TF-L)。

二、载药脂质体的制备

药脂比＝紫花牡荆素的质量：脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和。

将紫花牡荆素(CAS)以1：30的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇中，操作方法同一中的步骤1，得到载有紫花牡荆素脂质体(CAS-脂质体)。

将上述得到的CAS-脂质体，按照一中步骤2得到TF修饰的CAS-脂质体(TF-CAS-脂质体)。

实施例2、脂质体的性能测定

一、TF修饰率测定

采用BCA试剂盒检测，在碱性环境下蛋白质与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺(biuretreaction)。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在540nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此测定转铁蛋白蛋白的浓度，测得TF-CAS-脂质体表面TF的连接效率为435.07±21.01μgTF/μmolPL。

二、包封率的测定

采用葡聚糖凝胶G-100柱层析法除去未包载到脂质体内的紫花牡荆素，取适量过柱前CAS-脂质体和TF-CAS-脂质体乙腈消解测定总紫花牡荆素含量；另取过柱后的脂质体溶液用乙腈消解，测定脂质体中紫花牡荆素含量。采用用公式(1)计算包封率：

包封率％＝W_包/W_总×100％(1)

其中W_包和W_总分别表示脂质体包载的药量和总投料量。

在所制备的载药脂质体中，紫花牡荆素的包封率可达96％，结果见表1。

表1不同载药脂质体的包封率(n＝3)

三、粒径和电位测定

分别将1ml新制得的空白脂质体、CAS-脂质体和TF-CAS-脂质体用PBS稀释，使用NanoSeriesZen4003ZetaSizer(Malverninstruments,Ltd,UK)测定脂质体的粒径、多分散系数和Zeta电位。不同脂质体的粒径、多分散系数(PDI)和zeta电位的测定结果见表2。脂质体粒径分布均匀，粒径大小在86nm-110nm之间。各载药脂质体都略带负电，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，贮存稳定性更好，不易发生聚沉。

表2不同脂质体粒径、多分散系数及Zeta电位(n＝3)

四、透射电镜(TEM)

采用透射电镜对实施例1制备的多功能TF-CAS-脂质体进行形态学观察。具体方法为使用去离子水作为分散介质稀释上述脂质体，用0.2μm微孔滤膜过滤后，将铺有碳膜的铜网漂放在脂质体溶液上，1min后取出，滤纸吸干；将俘获有脂质体粒子的铜网漂放在1％醋酸双氧铀水溶液上，1min后取出，滤纸吸干，使用透射电镜仪进行观察测定结果见图1，可见脂质体形态较为圆整，大小均一。

五、载药脂质体的释放

分别精密量取2.00mLCAS-脂质体和TF-CAS-脂质体混悬液转入经处理的透析袋中，系紧透析袋两端，悬置在盛有50倍释放介质的锥形瓶中，置于恒温振荡器中，于37±0.5℃中恒温振荡48h，在设定的取样时间取样，并立即补入等体积透析介质，过0.45μm微孔滤膜，进样20μL，HPLC分析测定。根据公式2计算CAS释放百分率：

F(％)＝(C_t/C_总)×100％(2)

C_t/C_总为各时间点实测浓度与按标示量计算得到的溶出介质中浓度之比，由此求得不同时间的释放百分率F(％)，绘制释放曲线。

由图2可知，紫花牡荆素游离药释放速度较快，在48h时达到50％，48h时CAS-脂质体以及TF-CAS-脂质体中紫花牡荆素释放率为20％左右，释放缓慢，无突释现象。表明，紫花牡荆素以脂质体为载体时稳定性良好，释放缓慢。

实施例3、载药脂质体体外对A549肺腺癌细胞的抑制作用研究

一、培养条件

1、A549肺腺癌细胞培养条件

将其培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM-F12培养基中，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱孵育。A549肺腺癌细胞贴壁生长，细胞呈长梭形(如图3)，取对数生长期细胞进行实验。

二、配制不同浓度的载药脂质体

用PBS配制系列浓度的游离CAS、CAS-脂质体和TF-CAS-脂质体，使得取10μL上述药物溶液分别加入细胞培养孔中后，紫花牡荆素的最终浓度依次为0.1、0.5、1、5、10、25、50和100μM。

三、载药脂质体对A549肺腺癌的抗增殖作用

取细胞A549接种于96孔细胞培养板中，5000个/孔，设三个复孔，置二氧化碳培养箱中于37℃、相对湿度95％的条件下孵育24h，待细胞贴壁生长。然后分别加入上述配制各药液10μl到细胞培养孔中，使最终紫花牡荆素浓度梯度为：0.1、0.5、1、5、10、25、50和100μM，另设溶剂对照孔3个复孔。将细胞培养板置二氧化碳培养箱中孵育24h和48h。孵育完毕后，吸弃培养液，每孔加入10％三氯乙酸100μl，然后在4℃冰箱中放置1h固定细胞。培养板各孔用去离子水洗涤，以去除三氯乙酸。在空气中干燥后，每孔0.4％SRB(以1％醋酸配制)100μl，室温下放置15min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合染料，空气中干燥后用10mmol/LTris碱(pH10.5)100μl溶解，在平板振荡器上振荡20min，置酶标仪中于540nm波长下测定每孔吸收度OD值，经过给药培养后药物对A549肺腺癌细胞抑制率按照如下公式计算，即得，并计算出50％抑制浓度(IC50)，计算不同载药脂质体对A549的抑制作用，如图4。从图4中可以看出：TF-CAS-脂质体对A549的抗增殖作用优于其他载药脂质体组。从图4中可以看出，游离CAS抗增殖作用较弱；TF-CAS-脂质体经TF修饰后，可能增强A549亲和力和摄取能力。

计算抑制率(抑制率＝给药组细胞吸光度/对照组细胞吸光度)，并使用SPSS计算50％抑制浓度(IC₅₀)，IC₅₀计算结果见表3。从结果中可以看出TF-CAS-脂质体的IC₅₀明显低于其他组，对A549肺腺癌细胞抗增殖作用大大提高，明显高于游离药组和其他载药脂质体。

表3不同载药脂质体的IC50值

实施例4、共聚焦显微镜研究不同载药脂质体在A549肺腺癌的分布

用激光扫描共聚焦法探究A549肺腺癌细胞对转铁蛋白-紫花牡荆素脂质体(TF-CAS-L)、紫花牡荆素脂质体及游离药的摄取及其在细胞内的分布行为。

将A549细胞接种于12孔板中，接种密度为2×10⁴个/孔，贴壁生长24h后，观察已有超过60％的细胞汇集，转铁蛋白-紫花牡荆素脂质体(TF-CAS-L)、紫花牡荆素脂质体及游离药(紫花牡荆素终浓度为10μM)置二氧化碳培养箱中，37℃培养2小时，依次用冷PBS漂洗三次，4％多聚甲醛固定10min，然后用Hoechst33258(激发波长352nm，发射波长461nm)进行细胞核染色5min。用激光共聚焦显微镜(LSM510,Zeiss,Germany)以480nm波长的激光束激发紫花牡荆素(激发波长480nm，发射波长560nm)，以346nm波长的激光束激发Hoechst33258(激发波长346nm，发射波长460nm)，然后用AimImageExaminer软件进行图像分析。

结果见图5。图5中，A表示游离CAS，B表示CAS-脂质体，C表示TF-CAS-脂质体，A1-C1绿色表示应用载药脂质体或游离CAS，药物在A549细胞内的分布；A2-C2蓝色表示经Hochest33258染色后的A549细胞的核；A3-C3：A1-C1和A2-C2的叠加图像，显示应用载药脂质体和游离CAS后，药物在A549肺腺癌细胞的细胞核、细胞质均有分布。结果表明，药物经A549细胞内吞后主要分布在细胞质中，TF-CAS-脂质体组细胞内紫花牡荆素的分布量最多。

实施例5、A549细胞及对不同载药脂质体的摄取能力

取对数生长期的A549细胞，以2×10⁵个/孔消化接种在6孔板上，于37℃二氧化碳培养箱中，相对湿度95％的条件下孵育24h，待细胞贴壁生长。给药：空白脂质体(A)，紫花牡荆素-脂质体(B)，TF-紫花牡荆素-脂质体(C)(紫花牡荆素浓度为0.5μM)，培养箱中孵育2h。孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞三次，经0.25％胰酶消化收集，再用PBS吹打成细胞悬液，经流式细胞仪检测。结果见图6，在细胞A549的摄取实验中，和其他各组载药脂质体相比，TF-CAS-脂质体显示出最强的A549细胞及的摄取能力。

实施例6、载药脂质体体外对A549肺腺癌细胞及凋亡作用研究

取对数生长期的A549肺腺癌细胞，以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。细胞生长24h后，加入游离CAS、CAS-脂质体、TF-CAS-脂质体(CAS的终浓度分别为10μM)，每个药物设三个复孔。置培养箱中继续培养24h后，用冷PBS漂洗3遍，不含EDTA的胰酶消化，离心(1000rpm离心3min)后用PBS洗涤细胞两次，300μL回流的PBS将离心的下沉细胞吹匀。之后依次加入500μL的BindingBuffer、5μLAnnexinV-TITC、10μL7-PI，混匀后于室温避光的条件下反应10min，经流式细胞仪检测。

实验结果如图7所示，对A549肺腺癌细胞：游离CAS(A)、CAS-脂质体(B)、TF-CAS脂质体(C)的凋亡率分别为10.49％、20.82％和51.52％，靶向TF-CAS脂质体对A549肺腺癌细胞的凋亡百分率最高分别为51.52％，经统计学分析，与其他各组相比具有显著性差异，说明其促凋亡作用明显强于其他各组。

Claims (10)

1.一种靶向脂质体，其特征在于：所述靶向脂质体由脂质体和转铁蛋白组成；

所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基。

2.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于：所述脂质体的羧基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基提供。

3.根据权利要求2所述的靶向脂质体，其特征在于：所述脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基制备得到；

各原料的摩尔份数为：

所述卵磷脂80～88份；

所述胆固醇7～15份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2～4.8份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.2～0.7份。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向脂质体，其特征在于：所述转铁蛋白与所述脂质体的质量比可为1：8.1～9.1。

5.权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：以碳二亚胺作为连接剂，将所述转铁蛋白连接于所述脂质体的所述羧基上，即得所述靶向脂质体。

6.一种药物载体，其活性成分为权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体。

7.一种载药脂质体，由权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体包载药物得到。

8.根据权利要求7所述的载药脂质体，其特征在于：所述药物为紫花牡荆素。

9.权利要求7或8所述载药脂质体在制备治疗肺癌的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肺癌为肺腺癌。