CN114177162A - 一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法 - Google Patents

一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素‑壳聚糖纳米胶束的制备方法，可有效解决LU和Cel的生物利用度低，减少Cel对心脏、肝脏和神经系统等重要器官的毒性问题，其解决的技术方案是，具体制备方法包括以下步骤：1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成；2）pH敏感的叶黄素‑壳聚糖聚合物的制备；3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素‑壳聚糖纳米递送系统的制备，本发明制备方法简单，制备的负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素‑壳聚糖纳米制剂可有效的响应肾小管上皮细胞内溶酶体酸性环境，释放叶黄素和雷公藤红素，快速改善肾脏炎症微环境，改善AKI，是治疗AKI药物制剂上的创新。

Description

一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制 备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法。
背景技术
急性肾损伤（Acute Kidney Injury，AKI）是一种可短期、快速发生的肾功能不全综合征。每年在全球造成 200 万人死亡，以肾功能突然恶化和肾小管细胞快速凋亡为主要特征，具有高发病率和高死亡率的特点。AKI 发生时，肾脏内活性氧（ROS）含量爆发式增长，进一步刺激细胞产生大量炎症因子，快速引起 AKI。因此，提高AKI 的治疗效果具有重要意义。
据文献报道，叶黄素（Lutein，LU）是一种类胡萝卜素，具有高效、无毒、抗氧化的特点。LU 的抗氧化效果是因为其具有多烯和自由羟基结构，可与 ROS 发生氧化还原反应，快速降低炎症环境中过量的 ROS。同时，LU 还可抑制 NF-κB p65 炎症信号通路的激活，抑制TNF-α 和 IL-6 等炎症因子的释放，同时降低组织中环氧合酶-2（COX-2）的含量。基于此，LU 可作为一种有效的抗氧化剂预防药物诱导的AKI。雷公藤红素（Celastrol，Cel）为五环三萜类天然化合物，是草药雷公藤根部的有效成分。因其具有优异的抗氧化和抗炎活性而备受关注。研究表明，Cel 可特异性抑制 NF-κB p65 和 p38 MAPK 炎症信号通路的激活，从而抑制相关炎症因子的过量表达。然而，LU和Cel等抗氧化剂均为脂溶性药物，只溶于二氯甲烷、无水乙醇和二甲基亚砜等有机溶剂，不溶于水。因而在血液循环系统中具有较低的溶解度和生物利用度。同时，Cel 具有较窄的治疗窗，单独给予Cel单体进行治疗时，Cel 可全身分布，对心脏、肝脏和神经系统等重要器官产生毒性作用，从而限制了Cel 的广泛应用，所以需组织特异性递送 Cel 来提高药物治疗功效并降低其毒副作用。鉴于此，构建一种高效、安全pH 响应释药的纳米递送系统将药物定点“运送”到肾脏，发挥药物治疗效果并减少对正常器官损伤势在必行。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，可有效解决LU 和 Cel的生物利用度低，减少Cel对心脏、肝脏和神经系统等重要器官的毒性问题。
本发明解决的技术方案是，该纳米胶束为利用pH响应辅料共价偶联低分子量壳聚糖（CS）和叶黄素（LU），合成壳聚糖和LU的共轭物，利用透析法将药物雷公藤红素（Cel）与共轭物形成定点“运送”到肾脏发挥疗效并减少对正常组织损伤的纳米递送系统，该纳米胶束的粒径为50-150nm，具体制备方法包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成
称取100-500mg叶黄素（LU）于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入1-10mL pH响应辅料（PE），最后缓慢滴加0.1-0.5mL有机溶剂，氮气保护下常温避光反应12-48h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，1-5mol/L 酸性溶剂反复萃取，最后用10-30mL饱和溶液萃取2-8次，合并有机相，然后加入固体干燥剂，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素与pH响应辅料共价偶联的产物（LU-PE）；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备
精密称取20-100mg LU-PE，加入催化剂（摩尔比LU-PE:催化剂=1:1-1:3），无水DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应2-8h，加入低分子量壳聚糖（CS，分子量范围：3000-8000），LU-PE与CS摩尔比为1:1-1:3，滴加0.5-2mL三乙胺将体系 pH 值调节为7.0-9.0，氮气保护下常温避光反应24-48h，反应结束后，用50-100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量3500 -10000）中反复透析12-72小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米递送系统的制备
将5-20mg LU-PE-CS 溶解于2-10mL超纯水溶液中，将0.5-2mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（Cel，浓度：2-4mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应2-8h，然后将产物放入透析袋（截留分子量 3500-10000），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析12-72h，然后在10000g/min离心5-15分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
所述的步骤1）中pH响应辅料为丙酸酐、柠康酸酐中的一种。
所述的步骤1）中有机溶剂为无水吡啶、三乙胺、甲苯、苯胺中的一种。
所述的步骤1）中酸性溶剂为冰醋酸、冰盐酸、丙酸中的一种。
所述的步骤1）中饱和溶液为饱和氯化钙溶液、饱和硫酸钠溶液、饱和氯化钠溶液中的一种。
所述的步骤1）中固定干燥剂为无水氯化钙、无水硫酸镁、固体氢氧化钠、活性氧化铝、无水硫酸钠中的一种。
所述的步骤1）中洗脱溶剂为石油醚、乙酸乙酯中的一种或者两者任意体积比的混合物。
所述的步骤2）中催化剂为1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、四甲基乙二胺(TEMED)中的一种或者两种以上任意质量比的混合物。
所述的纳米胶束的叶黄素接枝率为30%-60%，雷公藤红素的包封率为70%-90%。
本发明制备方法简单，制备的负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米制剂可有效的响应肾小管上皮细胞内溶酶体酸性环境，释放叶黄素和雷公藤红素，快速改善肾脏炎症微环境，改善AKI，是治疗AKI药物制剂上的创新。
附图说明
图1为本发明终制剂组和Cel@LU-CS在不同pH值时Cel的释药曲线图。
图2为本发明全自动生化检测仪检测不同组（A）Scr和（B）BUN 的含量图（n=3，与顺铂（CDDP）诱导的 AKI 模型组相比* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。终制剂组与其他给药组相比，# P < 0.005、## P < 0.01、### P < 0.001）。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取150mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入2mL pH响应辅料丙酸酐，最后缓慢滴加0.1mL有机溶剂无水吡啶。氮气保护下常温避光反应12h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，2mol/L 酸性溶剂冰醋酸反复萃取，最后用10mL饱和氯化钙溶液萃取2次，合并有机相，然后加入无水氯化钙固体，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，石油醚进行洗脱，浓缩干燥得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取20mg LU-PE，加入催化剂1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）（摩尔比LU-PE:EDC=1:1），无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应2h，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:1）低分子量壳聚糖（分子量3000），滴加0.2mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH7.5，氮气保护下常温避光反应24h，反应结束后，用50mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为4500 DA）中反复透析24小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将5mg LU-PE-CS 溶解于5mL超纯水溶液中，将1mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（2mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应4h，然后将产物放入透析袋（截留分子量4500DA），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析24h，然后在10000g/min离心5分钟，除去未包载的药物。冻干得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例2
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取200mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入5mLpH响应辅料柠康酸酐，最后缓慢滴加0.2mL有机溶剂三乙胺，氮气保护下常温避光反应24h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，2mol/L 酸性溶剂冰盐酸反复萃取，最后用20mL饱和氯化钠萃取4次，合并有机相，然后加入无水硫酸镁，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400 目）中进行纯化，石油醚进行洗脱，浓缩干燥得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取40mg LU-PE，加入催化剂1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）（摩尔比LU-PE：EDC=1:1.5），无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应4h。加入（摩尔比LU-PE：CS=1:1）低分子量壳聚糖（分子量5000），滴加0.4mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH8.0，氮气保护下常温避光反应36h，反应结束后，用100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为6500 DA）中反复透析12小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS。
）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将5mgLU-PE-CS 溶解于2mL超纯水溶液中，将0.5mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（3mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应6h，然后将产物放入透析袋（截留分子量6500DA），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析24h，然后在10000r/min离心10分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例3
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取300mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入6mLpH响应辅料柠康酸酐，最后缓慢滴加0.3mL有机溶剂甲苯，氮气保护下常温避光反应24h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，4mol/L 酸性溶剂冰醋酸反复萃取，最后用15mL饱和氯化钠溶液萃取6次，合并有机相，然后加入固体干燥剂氢氧化钠，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂乙酸乙酯进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取50mg LU-PE，加入催化剂四甲基乙二胺（TEMED）（摩尔比LU-PE: TEMED=1:1.2），无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应8h 以活化 LU-PE的羧基，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:1）低分子量壳聚糖（分子量范围：8000），滴加1mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH8.5，氮气保护下常温避光反应48h，反应结束后，用100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为9500 DA）中反复透析48小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将10mgLU-PE-CS 溶解于5mL超纯水溶液中，将1mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（3mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应8h，然后将产物放入透析袋（截留分子量9500），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析12h，然后在10000g/min离心15分钟，除去未包载的药物，冻干得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例4
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取500mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入10mL pH响应辅料柠康酸酐，最后缓慢滴加0.3mL有机溶剂苯胺，氮气保护下常温避光反应48h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，5mol/L 酸性溶剂冰盐酸反复萃取，最后用30mL饱和硫酸钠溶液溶液萃取8次，合并有机相，然后加入固体干燥剂活性氧化铝，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯（v:v=1:2）进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物。
）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取80mg LU-PE，加入催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(摩尔比LU-PE：NHS=1:1.5),无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应6h，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:2）低分子量壳聚糖（分子量：6000），滴加1.5mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH9.0，氮气保护下常温避光反应24h，反应结束后，用100ml冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为7000）中反复透析36小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将20mgLU-PE-CS 溶解于10mL超纯水溶液中，将2mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（2mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应8h，然后将产物放入透析袋（截留分子量7000），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析72h，然后在10000g/min离心5分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例5
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取300mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入4mL pH响应辅料丙酸酐，最后缓慢滴加0.3mL有机溶剂无水吡啶，氮气保护下常温避光反应24h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，3mol/L 酸性溶剂丙酸反复萃取，最后用15mL饱和氯化钙溶液萃取4次，合并有机相，然后加入固体干燥剂无水硫酸钠，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯（v:v=4:1）进行洗脱，浓缩干燥得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取40mg LU-PE，加入催化剂1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）(LU-PE、EDC、NHS摩尔比1:1.2:1.2)，无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应4h 以活化 LU-PE的羧基，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:1.5）低分子量壳聚糖（分子量范围：5000），滴加1.5mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH8.5，氮气保护下常温避光反应36h，反应结束后，用100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为6500）中反复透析72小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将20mgLU-PE-CS 溶解于5mL超纯水溶液中，将1mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（4mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应4h，然后将产物放入透析袋（截留分子量6500），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析48h，然后在10000g/min离心10分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例6
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取400mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入8mL pH响应辅料丙酸酐，最后缓慢滴加0.3mL有机溶剂三乙胺，氮气保护下常温避光反应48h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，3mol/L 酸性溶剂冰醋酸反复萃取，最后用25mL饱和氯化钠溶液萃取2次，合并有机相，然后加入固体干燥剂无水氯化钙，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯（v:v=8:1）进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取50mg LU-PE，加入催化剂1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）(LU-PE、EDC、NHS摩尔比1:1.5:1.5)，无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应8h，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:1）低分子量壳聚糖（分子量范围：8000），滴加2mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH9.0，氮气保护下常温避光反应36h，反应结束后，用100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为 9500 DA）中反复透析48小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将15mgLU-PE-CS 溶解于5mL超纯水溶液中，将1.5mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（3mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应2h，然后将产物放入透析袋（截留分子量9500），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析36h，然后在10000g/min离心10分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
实施例7
本发明在具体实施时，该纳米胶束的制备方法具体包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成：
称取300mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入4mL pH响应辅料丙酸酐，最后缓慢滴加200μL有机溶剂无水吡啶，氮气保护下常温避光反应36h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，2mol/L 酸性溶剂冰盐酸反复萃取，最后用20mL饱和硫酸钠溶液萃取6次，合并有机相，然后加入固体干燥剂氢氧化钠，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱（300-400目）中进行纯化，洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯（v:v=4:1）进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素-壳聚糖产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备：
精密称取20mg LU-PE，无水 DMSO 为溶剂充分溶解样品，加入催化剂四甲基乙二胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）(LU-PE、EDC、NHS摩尔比1:1:1)，氮气保护下常温避光反应6h 以活化 LU-PE的羧基，加入（摩尔比LU-PE：CS=1:2）低分子量壳聚糖（分子量范围：5000），滴加0.5mL三乙胺将体系 pH 值调节为pH8.0，氮气保护下常温避光反应48h，反应结束后，用75mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋（截留分子量为6500 DA）中反复透析36小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥，得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备：
将10mgLU-PE-CS 溶解于5mL超纯水溶液中，将1.5mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素（2mg/mL）逐滴加入上述溶液中，室温避光反应6h，然后将产物放入透析袋（截留分子量6500），将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析48h，然后在10000g/min离心5分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
本发明将 LU 作为一种抗氧化剂快速缓解肾小管上皮细胞的氧化应激障碍，同时联合应用 Cel 来减少炎症因子的蓄积，稳定线粒体膜电位，改善肾脏组织损伤，达到快速缓解 AKI 的作用，方法新颖独特，易操作，成本低，制备的纳米制剂的制备方法稳定可靠，pH敏感的纳米系统在酸性环境（pH=4.5）的体外药物释放实验表明纳米递送系统具有酸敏感性。能够在低 pH 值环境中96h内累积释放 60%~80%的游离药物，显著高于非 pH敏感载药胶束的药物释放率。与传统的药物制剂相比制备的负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束在体内具有明显的肾脏靶向性和良好的生物安全性，生化实验证明纳米递送系统可明显改善肾功能不全，有关实验资料如下（以实施例2为例）：
选取 48 只 6-8 周左右健康雄性 BALB/c小鼠，将小鼠随机分为以下8组，每组6只。设对照组、CDDP 组、游离 Cel 组、游离 LU 组、游离 LU-PE组、游离 Cel/LU-PE组、LU-PE-CS 组和Cel@LU-PE-CS组。对照组连续 5天尾静脉注射生理盐水，第 5 天注射 1 h 后腹腔给予生理盐水，CDDP 组在第5天腹腔注射 CDDP。其它实验组连续 5 天给予治疗药物（n=6，Cel：0.2 mg/kg，LU-PE：0.6 mg/kg），第 5 天给药 1 h 后腹腔注射 CDDP（15.0 mg/kg）。CDDP注射 3 天后处死小鼠，摘除小鼠眼球取血。3000 rpm 转速离心10 min，吸取上清液即为血清。收集各组血清并编号，放入-80ºC 超低温冰箱保存。通过上机生化检测各组小鼠血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）的含量，用来评估不同组小鼠的肾功能变化及其严重程度。与 Control 组相比，CDDP 诱导的 AKI 组血清中Scr和 BUN 的含量均显著上升。表明CDDP 可明显损伤肾功能。给药组Scr和 BUN 的含量有所减少，终制剂组的逆转效果最为明显，具体结果见图2，说明Cel@LU-PE-CS纳米递送系统能够缓解急性肾损伤的症状，证明本申请具有很好的肾脏靶向性和缓解肾脏损伤的作用，在对实施例2试验的基础上，又对其它实施例进行了同样的试验，均取得了相同或相似的结果，这里不再一一列举。
本发明根据肾脏的生理、病理特征，以低分子量壳聚糖（CS）为载体，装载抗炎药物叶黄素（LU）和雷公藤红素（Cel），增大药物的溶解度，制备方法简单，成本低，制备的负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束从疾病的发病机理出发，设计了pH 敏感药物释放系统，响应肾小管上皮细胞内溶酶体酸性环境，释放 LU 和 Cel，降低了游离药物的脱靶作用，快速改善肾脏炎症微环境，改善了顺铂造成的AKI，是治疗AKI药物制剂上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (8)

1.一种负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）pH响应辅料与叶黄素共价偶联化合物的合成
称取100-500mg叶黄素于圆底烧瓶中，无水二氯甲烷充分溶解，然后加入1-10mL pH响应辅料，最后缓慢滴加0.1-0.5mL有机溶剂，氮气保护下常温避光反应12-48h，反应结束后用二氯甲烷进行洗涤，1-5mol/L 酸性溶剂反复萃取，最后用10-30mL饱和溶液萃取2-8次，合并有机相，然后加入固体干燥剂，干燥过夜以吸收样品中的多余水分，过滤浓缩得到黄色浸膏状产物用于柱层析分离，浓缩样品上样，在活化的硅胶柱中进行纯化，洗脱溶剂进行洗脱，浓缩干燥，得到纯化的叶黄素与pH响应辅料共价偶联的产物；
2）pH敏感的叶黄素-壳聚糖聚合物的制备
精密称取20-100mg LU-PE，加入催化剂，LU-PE与催化剂的摩尔比为1:1-1:3，无水DMSO 为溶剂充分溶解样品，氮气保护下常温避光反应2-8h，加入3000-8000分子量壳聚糖，LU-PE与CS摩尔比为1:1-1:3，滴加0.5-2mL三乙胺将体系 pH 值调节为7.0-9.0，氮气保护下常温避光反应24-48h，反应结束后，用50-100mL冰乙醚反复洗涤，收集沉淀于透析袋中反复透析12-72小时，去除有机溶剂和未反应的中间体，冷冻干燥得到中间产物 LU-PE-CS；
3）负载雷公藤红素的pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米传送系统的制备
将5-20mg LU-PE-CS 溶解于2-10mL超纯水溶液中，将0.5-2mL溶解于无水乙醇的雷公藤红素逐滴加入上述溶液中，室温避光反应2-8h，然后将产物放入透析袋，将透析袋放入装有超纯水的烧杯中，反复透析12-72h，然后在10000g/min离心5-15分钟，除去未包载的药物，冻干，得到负载雷公藤红素的Cel@ LU-PE-CS 纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中pH响应辅料为丙酸酐、柠康酸酐中的一种。
3.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中有机溶剂为无水吡啶、三乙胺、甲苯、苯胺中的一种。
4.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中酸性溶剂为冰醋酸、冰盐酸、丙酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中饱和溶液为饱和氯化钙溶液、饱和硫酸钠溶液、饱和氯化钠溶液中的一种。
6.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中固定干燥剂为无水氯化钙、无水硫酸镁、固体氢氧化钠、活性氧化铝、无水硫酸钠中的一种。
7.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中洗脱溶剂为石油醚、乙酸乙酯中的一种或者两者任意体积比的混合物。
8.根据权利要求1所述的负载雷公藤红素pH敏感的叶黄素-壳聚糖纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中催化剂为1-（3-二甲胺丙基）-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、四甲基乙二胺中的一种或者两种以上任意质量比的混合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115317451A (zh) * 2022-07-29 2022-11-11 河南中医药大学 一种Cel-CSO/Taxol NPs纳米药物及应用

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