CN110339163B - 一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种顺铂‑聚谷氨酸络合胶束及其制备方法，属于药物制剂技术领域。本发明采用高分子材料聚谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物包载药物(顺铂)，制备络合胶束，并采用喷雾干燥或冷冻干燥进行固化。本发明所述制备方法得到的顺铂‑聚谷氨酸络合胶束能够提高其放置过程中的稳定性，具有pH敏感性和缓慢释放药物能力，血液稳定性增加，进而提高血液循环时间，提高肿瘤靶向能力。

Description

一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束及其制备方法。
背景技术
顺铂(Cisplatin,CDDP)化学名为顺式二氨二氯铂(II)，又称顺氯氨铂。 1967年，美国密执安州立大学教授Rosenberg等人首次发现顺铂具有抗肿瘤活性。1969年，顺铂开始应用于临床，在临床应用中证实，顺铂具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用等特点，在治疗肺癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、头颈癌、食道癌、胃癌等方面作为一线药物，特别是睾丸癌早期治愈率达100％、卵巢癌早期治愈率达80％以上。化学结构式如下所示：
Figure RE-GDA0002180873550000011
顺铂属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA 复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用，其作用机制是顺铂进入细胞后，解离失去酸根负离子-氯离子，同时结合两分子的水，形成带正电荷的水合铂。这个带正电荷的水合铂可以跟细胞内亲质子的分子结合，包括DNA、RNA和蛋白质。铂原子选择性地与DNA分子中的鸟嘌呤和腺嘌呤上的N7原子结合，形成3种不同结构的复合物，即单加合物、链内配对交联、链间配对交联，但几乎大部分结构都是链内配对交联，所有的交联都会使DNA发生扭转，从而破坏DNA的结构。
国内市售的顺铂相关制剂的给药形式均为顺铂原型药物，主要为顺铂注射液和注射用顺铂，给药后在血浆中迅速消失，随后快速分布全身，在肝、肾、大小肠及皮肤分布最多，半衰期非常短，对癌细胞缺乏特异性和选择性。同时，肾毒性、胃肠道反应、耳毒性和神经毒性等不良反应及耐药性，极大的限制了顺铂的疗效和抗癌谱。顺铂的主要剂量限制性毒性为肾脏毒性，单次中、大剂量给药后，偶会出现轻微、可逆的肾功能障碍。多次高剂量或短期重复给药，会出现不可逆的肾功能障碍，严重时出现肾小管坏死。因此，临床上常采用静脉水化、甘露醇利尿、延长给药时间等方案，以降低肾毒性的发生率和严重程度，提高临床使用的安全性。顺铂的另一剂量限制性毒性为消化系统毒性，几乎所有的病人均可出现严重的恶心、呕吐。
为了解决相应的问题，纳米胶束载药系统，特别是纳米胶束载体系统不断应用在抗肿瘤药物中。聚合物胶束通过在水中的自组装形成稳定的胶束载药系统，可经稀释而不发生聚合，对聚合物材料加以修饰可以使胶束的在体内的传递释放具有靶向作用，可以提高药物在聚合物材料中的载药量，且胶束的粒径较小，对肿瘤部位具有更强的渗透能力(EPR效应)，使胶束更容易在特定部位发挥作用，具有靶向性。至今为止，已有很多用载药胶束用于抗肿瘤研究，但是由于胶束的低载药量，不稳定易于泄露等缺陷，限制了纳米胶束的工业化研究。
专利200101819468.0(包封顺铂的高分子微胶粒及其用途)采用由聚乙二醇和聚谷氨酸构成的嵌段共聚物包封顺铂形成络合物，其可以在维持微胶粒形态至少15h，降低毒性，因此通过快速浓度给药提高患者顺应性，避免繁杂历经数小时的点滴静注，但其溶液稳定性有待解决。
专利200980123811.8(顺铂配位化合物的液体组合物)采用顺铂与聚乙二醇嵌段聚谷氨酸形成络合物溶液，虽然解决了顺铂溶液注射时带来的肾毒性，但其采用调节pH值来改善药液稳定性，稳定性时间仍较短。
专利201210037920.1(一种顺铂长循环脂质体及其制备方法)顺铂脂质体可实现缓慢释放顺铂且被动靶向肿瘤部位，但其存在包封率低，稳定性差，且药物易泄露等缺陷。
专利201210382696.X(顺铂配合物及其制备方法)提供了一种顺铂配合物，由聚(α-谷氨酸)均聚物、聚(α，β-天冬氨酸)均聚物或α-谷氨酸与α，β-天冬氨酸的共聚物接枝聚乙二醇形成，可以顺铂反应，避免突释，提高顺铂在血液中的稳定性，降低毒性。但其未对顺铂与聚合物的络合比例、制备处方及工艺详细说明，且固化工艺中药物转化率仅75％左右，无法保证制剂生产的高重现性、高质量及高稳定性，不易于工业化生产。
专利201510173538.7(一种水溶性聚谷氨酸-顺铂复合物及其制备方法与应用)提供了γ-聚谷氨酸衍生物制备及其与顺铂形成的载药复合物，提高了顺铂的抗癌效果且毒性明显降低。该聚谷氨酸衍生物在体外存在突释，不可避免会对正常组织造成伤害，且该复合物未制备成纳米制剂，其体内循环与被动靶向能力仍较弱。
2003年，H Uchino等研发了胰腺癌新药NanoPlatin○R(NC-6004)，该产品使用聚谷氨酸嵌段聚乙二醇材料，利用顺铂的Cl-与侧链上的羧基阴离子 (-COO-)交换形成疏水核，PEG作为亲水外壳，形成复合物胶束溶液，研究表明NC-6004能够缓慢释放药物，延长药物在体内的循环时间，提高药物在肿瘤组织内的蓄积，该研究提供一种包载顺铂，降低顺铂毒性的方法。2014 年，HaiyangYu等在该研究的基础上利用聚谷氨酸和聚乙二醇合成新型载体材料——聚谷氨酸接枝聚乙二醇，该载体材料在前期基础上优化了PEG的分子量，利于代谢，相容性更好，顺铂与其形成聚合物胶束后可有效避免突释，提高顺铂在血液中的稳定性，降低毒性。但以上研究制备的包载顺铂的纳米制剂均未能进行固化工艺研究，在运输和贮存过程中稳定性差，无法实现制剂的高载药量及高包封率，较难完成从实验室到产业化放大生产的过渡，不易于批量工业化生产，故实用价值有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束及其制备方法，针对顺铂剂量限制性毒性及耐药性，提供一种纳米胶束的制备方法。利用喷雾干燥或冷冻干燥固化胶束，获得的纳米胶束具有高度稳定性，高载药量和靶向性等特点，该胶束在水中长期维持稳定，在生理盐水中缓慢释放顺铂，且具有pH敏感性，在血液中可稳定存在，肿瘤靶向能力强，可显著降低对正常组织的损伤。
本发明提供了一种注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)将顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇分别用注射用水进行水化，得到顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液；所述顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶(1～9)；
(2)将步骤(1)得到的顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液混合，得到自组装胶束；
(3)将步骤(2)得到的自组装胶束进行浓缩、过滤、固化，得到注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束；
所述固化包括喷雾干燥或冷冻干燥；
所述喷雾干燥的条件为：喷嘴气体流量400～500L/h，进样速度2～5 mL/min，进口温度100～110℃；
所述冷冻干燥为将过滤后的胶束分装后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的总时长为20～46小时；所述冷冻干燥以﹣40℃进行预冻，维持时间2～8h；升温至﹣20℃，在﹣20℃～-10℃范围内阶梯式升温，进行升华干燥，时间为 15～30h；升温至20℃，进行解析干燥，时间为2～8h。
优选的是，步骤(1)所述聚谷氨酸接枝聚乙二醇数均分子量为 38000～60000g/mol。
优选的是，步骤(1)顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液的pH值为 6.0～10.0。
优选的是，步骤(1)所述水化的时间为24～72h，温度为20～40℃；所述水化包括晃动、搅拌、超声或涡旋。
优选的是，步骤(3)所述浓缩后顺铂的质量体积浓度为3～10mg/mL。
优选的是，步骤(3)所述过滤为先过0.45μm粗滤，再过0.22μm精滤。
优选的是，步骤(3)中喷雾干燥用保护剂包括海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羟丙基-β-环糊精和羟乙基淀粉中的一种或多种。
优选的是，步骤(3)中冷冻干燥用保护剂包括蔗糖、聚乙二醇、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、泊洛沙姆188、山梨醇、羟乙基淀粉和人血白蛋白中的一种或多种。
优选的是，所述喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂在使用前，进行预处理，所述预处理包括：在喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂中加入质量百分浓度0.1～0.5％的活性炭，煮沸10～60min，脱碳过滤。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束。
本发明提供了一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束的制备方法。本发明采用高分子材料聚谷氨酸接枝聚乙二醇共聚物包载药物，制备络合胶束，并采用喷雾干燥或冷冻干燥进行固化，提高放置过程中的稳定性，具有pH敏感性和缓慢释放药物能力，血液稳定性增加，进而提高血液循环时间，提高肿瘤靶向能力。顺铂-聚谷氨酸络合胶束作为一种新型的抗肿瘤药物，抗肿瘤机制与顺铂类似，与DNA分子中的鸟嘌呤和腺嘌呤上的N7原子结合，破坏DNA的结构。由于络合胶束的良好的血浆稳定性和被动靶向性，可显著降低对正常组织的损害，提高抗肿瘤活性，满足临床需要。
附图说明
图1为本发明提供的聚谷氨酸接枝聚乙二醇1H-NMR图谱；
图2为本发明提供的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束1H-NMR图谱；
图3为本发明提供的按实施例1制备的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在不同pH释放介质中释放顺铂图谱；
图4为本发明提供的按实施例2制备的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在不同pH释放介质中释放顺铂图谱；
图5为本发明提供的按实施例4制备的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在不同pH释放介质中释放顺铂图谱；
图6为本发明提供的将实施例2制备的胶束粉针分别用生理盐水和葡萄糖溶液稀释10倍的粒径分布图谱；
图7为本发明提供的聚谷氨酸接枝聚乙二醇和顺铂-聚谷氨酸络合胶束 (按实施例4制备)的溶血率；
图8为本发明提供的单剂量尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例10制备)和顺铂溶液剂的平均血药浓度-时间曲线(n＝6)；
图9为本发明提供的H460荷瘤小鼠尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束 (按实施例10制备)和顺铂溶液剂的组织分布图；
图10为本发明提供的H460荷瘤小鼠尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液(按实施例10制备)的相对肿瘤体积和小鼠体重变化图；
图11为本发明提供的H460荷瘤小鼠分别尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例2制备)和顺铂溶液剂的相对肿瘤体积和小鼠体重变化图；
图12为本发明提供的顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例24制备)在浓缩后不同时间点的胶束含量及游离药物量图。
具体实施方式
本发明提供了一种注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)将顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇分别用注射用水进行水化，得到顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液；所述顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶(1～9)；
(2)将步骤(1)得到的顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液混合，得到自组装胶束；
(3)将步骤(2)得到的自组装胶束进行浓缩、过滤、固化，得到注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束；
所述固化包括喷雾干燥或冷冻干燥；
所述喷雾干燥的条件为：喷嘴气体流量400～500L/h，进样速度2～5 mL/min，进口温度100～110℃；
所述冷冻干燥为将过滤后的胶束分装后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的总时长为20～46小时；所述冷冻干燥以﹣40℃进行预冻，维持时间2～8h；升温至﹣20℃，在﹣20℃～-10℃范围内阶梯式升温，进行升华干燥，时间为 15～30h；升温至20℃，进行解析干燥，时间为2～8h。
本发明以聚谷氨酸接枝聚乙二醇聚合物为载体，通过自组装法制备胶束，并通过固化工艺制备胶束粉针。本发明将顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇分别用注射用水进行水化，得到顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液；所述顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶(1～9)，更优选为1:2.5～6。在本发明中，所述顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1：(1～2.5)，胶束粒径在30～100nm，药物包封率>80％；所述顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶(2.5～5)，胶束粒径在15～30nm，药物包封率>90％；所述顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶(5～9)，胶束粒径在10～15nm，药物包封率>98％。在本发明中，顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇络合比例不同，其对药代动力学有很大影响：给予大鼠尾静脉5mg/kg时，药辅比(顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇络合比例)等于1:1的制剂的AUC是顺铂溶液的11.2 倍，药辅比等于1:3的制剂的AUC是顺铂溶液的69.2倍，药辅比等于1:6 的制剂的AUC是顺铂溶液的24.2倍。利用PLG-g-mPEG包载顺铂可以显著提高血药浓度，延长体内循环时间。在本发明中，顺铂与聚谷氨酸接枝聚乙二醇络合比例不同，对荷瘤小鼠组织分布有很大影响：48h时，药辅比等于 1:6的制剂的瘤内铂浓度是顺铂溶液的15.62倍，药辅比等于1:3的制剂的瘤内铂浓度是顺铂溶液的26.18倍，药辅比等于1:1的制剂的瘤内铂浓度是顺铂溶液的14.23倍。顺铂-聚谷氨酸络合胶束可以长期存在于肿瘤组织内，且肾毒性大大降低。在本发明中，与生理盐水组相比，药辅比等于1:6、1:3和 1:1的制剂抑瘤率分别是25.89％、49.26％和55.38％，药辅比对胶束的体内外性质有很大影响。在本发明中，与生理盐水组相比，顺铂溶液组、药辅比等于1:3的顺铂-聚谷氨酸络合胶束3mg/kg和6mg/kg剂量组的抑瘤率分别是 30.04％、28.56％和57.19％。顺铂-聚谷氨酸络合胶束具有明显的抑瘤效果，且具有剂量依赖性。
在本发明中，所述顺铂和注射用水的质量体积比优选为1mg：(0.5～3)mg，更优选为1mg：(1～2)mg。在本发明中，所述聚谷氨酸接枝聚乙二醇数均分子量优选为38000～60000g/mol，更优选为38000～50000g/mol。在本发明中，顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液的pH值优选为6.0～10.0，更优选为 7.0～8.0。在本发明中，所述水化的时间为24～72h，温度为20～40℃，时间更优选为24～48h，温度更优选为35～40℃；所述水化包括晃动、搅拌、超声或涡旋，本发明所述搅拌或涡旋的速率不宜过慢或过快，优选为搅拌或涡旋所使用仪器的速率调节中档。
得到顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液后，本发明将顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液混合，得到自组装胶束。本发明所述胶束将顺铂包载于内核中。本发明所述自组装胶束中顺铂的浓度优选为0.5～3mg/mL，浓度过高，顺铂溶解性不好，浓度过低，影响后续浓缩的时间和浓度，优选为 1～2mg/mL。在本发明中，所述混合操作条件优选避光。
得到自组装胶束后，本发明将自组装胶束进行浓缩、过滤、固化，得到注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束。在本发明中，浓缩后的胶束中顺铂的浓度优选为3～10mg/mL，过高的浓度会引起胶束溶液稳定性下降，过低会影响后续的固化工艺及临床用药，优选5～8mg/mL。在本发明中，所述浓缩除游离工艺可选择透析法或超滤膜法。本发明所述浓缩能够除去游离药物，提高载药胶束溶液浓度。在本发明中，所述过滤优选为先过0.45μm粗滤，再过0.22μm精滤，进行除菌。
所述固化包括喷雾干燥或冷冻干燥；
本发明所述喷雾干燥的条件为：喷嘴气体流量400～500L/h，进样速度 2～5mL/min，进口温度100～110℃。在本发明中，喷雾干燥用保护剂包括海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羟丙基-β-环糊精和羟乙基淀粉中的一种或多种，更优选为海藻糖。在本发明中，所述顺铂和冷冻干燥保护剂的混合质量比优选为1：(5`10)，更优选为1:7。本发明喷干制剂外观为白色粉末。
本发明所述冷冻干燥为将过滤后的胶束分装后进行冷冻干燥，冻干时长为20～46小时，预冻时间2～8h；升华干燥时间15～30h，解析干燥时间2～8h。在本发明中，所述分装优选为分装于50ml西林瓶中，每瓶10ml，置于冻干机隔板上进行冻干。在本发明中，所述冻干时长优选为24h，冻干粉针水分小于2％；所述冻干时长优选为44h，冻干粉针水分小于0.5％。在本发明中，冷冻干燥用保护剂包括蔗糖、聚乙二醇、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、泊洛沙姆188、山梨醇、羟乙基淀粉和人血白蛋白中的一种或多种，更优选为海藻糖和羟乙基淀粉。在本发明中，所述顺铂和冷冻干燥保护剂的质量比优选为1：(10～20)，更优选为1:15。在本发明中，冻干制剂外观应为白色疏松块状物。本发明各阶段冻干的时间与样品的体积量及加入的冻干保护剂类型有关，根据冻干的样品量及冷冻干燥保护剂的性质优选进行调整。所述冷冻干燥的总时长为20～46小时；所述冷冻干燥以﹣40℃进行预冻，维持时间2～8h；升温至﹣20℃，在﹣20℃～-10℃范围内阶梯式升温，进行升华干燥，时间为15～30h；升温至20℃，进行解析干燥，时间为2～8h。在本发明中，所述喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂在使用前，进行预处理，所述预处理包括：在喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂中加入质量百分浓度0.1～0.5％的活性炭，煮沸10～60min，脱碳过滤。在本发明中，优选活性炭用量为0.3％。优选的，活性炭煮沸30min后脱碳过滤。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束。本发明所述胶束粒径在10～100nm，ζ电位在-30～5mV， pH值>4，载药量10～30％，包封率>80％，根据EPR效应，可以有效进入肿瘤内部并长时间蓄积达到被动靶向给药的效果。经药物长期稳定性实验，本发明所述制备方法得到的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束外观、粒径、载药量及包封率无明显变化。在本发明中，所述胶束的药物包封率优选大于80％，更优选大于90％，最优选大于98％。
本发明得到的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束的粒径较小，ζ电位接近中性，pH值>6，包封率>90％，含量保持稳定。与顺铂溶液剂相比，本发明的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束可以显著延长体内循环时间，减少正常组织的分布，提高肿瘤靶向性，而且长期储存物理化学稳定性良好。血浆稳定性实验表明注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束可在体内稳定存在，顺铂-聚谷氨酸络合胶束在25±2℃及4±2℃条件下放置6个月后，外观、pH、药物含量、包封率以及平均粒径等指标都没有发生显著的变化，说明在运输和储藏过程中可稳定存在。另外，注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在体内可缓慢释放，避免药物在注射初期浓度过高而引起的不良反应。本发明的胶束粒径在 10～100nm左右，根据EPR效应，易进入肿瘤组织内部，利于发挥抗肿瘤疗效。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种顺铂-聚谷氨酸络合胶束及其制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
将20mg CDDP溶于20ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料120mg，调节pH至7，37℃水浴、避光、机械搅拌48h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用喷雾干燥或冷冻干燥法制备粉针。如表1所示，制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、含量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表1制剂(按实施例1制备)固化前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000081
结构表征：取聚谷氨酸接枝聚乙二醇载体材料和顺铂-聚谷氨酸络合胶束冻干制剂适量，以D2O为溶剂，测试温度25℃，测试频率为300MHz，记录1H-NMR图谱，结果见图1(聚谷氨酸接枝聚乙二醇1H-NMR图谱) 和图2(顺铂-聚谷氨酸络合胶束1H-NMR图谱)。结果表明制备出了以PEG 为外壳，以聚谷氨酸-顺铂复合物为疏水核的络合胶束。
实施例2
将50mg CDDP溶于25ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料150mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌48h，混合后CDDP 浓度为2mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用喷雾干燥或冷冻干燥法制备粉针。如表2所示，制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、含量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表2制剂(按实施例2制备)固化前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000091
实施例3
将90mg CDDP溶于30ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料270mg，调节pH至9，37℃水浴、避光、机械搅拌72h，混合后CDDP 浓度为3mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用喷雾干燥或冷冻干燥法制备粉针。如表3所示，制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、含量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表3制剂(按实施例3制备)固化前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000092
实施例4
将100mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料100mg，调节pH至10，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为2mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用喷雾干燥或冷冻干燥法制备粉针。如表4所示，制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、含量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表4制剂(按实施例4制备)固化前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000093
实施例5
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，25℃水浴、避光、机械搅拌72h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用喷雾干燥或冷冻干燥法制备粉针。如表5所示，制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、含量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表5制剂(按实施例5制备)固化前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000101
实施例6
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，选用海藻糖作为保护剂，药物与海藻糖的重量比为1:7，加入0.3％活性炭，煮沸30min，0.45μm过滤，再0.22μm精滤除菌。对喷雾干燥的参数设定如下：喷嘴气体流量设定为400L/h，进样速度4mL/min，进口温度100℃。如表6所示，喷干后制剂复溶后粒径、PDI、含量及包封率与喷干前无明显变化。
表6制剂(按实施例6制备)喷干前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000102
实施例7
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，选用海藻糖作为保护剂，药物与海藻糖的重量比为1:7，加入0.3％活性炭，煮沸30min，0.45μm过滤，再0.22μm精滤除菌。对喷雾干燥的参数设定如下：喷嘴气体流量设定为500L/h，进样速度5mL/min，进口温度110℃。如表7所示，喷干后制剂复溶后粒径、电位、pH、含量及包封率与喷干前无明显变化。
表7制剂(按实施例7制备)喷干前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000103
Figure BDA0002143396680000111
实施例8
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用冷冻干燥法制备冻干粉针。选用海藻糖和羟乙基淀粉作为保护剂，药物与保护剂的重量比为1:15，加入0.3％活性炭，煮沸30min，0.45μm过滤，再0.22μm精滤除菌。将样品在室温条件下放入冻干机搁板上，开启真空泵，共同降至﹣40℃进行预冻，预冻时间为2h，一次升华干燥时间为17h，二次解析干燥时间为3h，共22h得到胶束冻干粉。如表8所示，冻干制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、载药量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表8制剂(按实施例8制备)冻干前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000112
实施例9
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用冷冻干燥法制备冻干粉针。选用海藻糖和羟乙基淀粉作为保护剂，药物与保护剂的重量比为1:15，加入0.3％活性炭，煮沸30min，0.45μm过滤，再0.22μm精滤除菌。将样品在室温条件下放入冻干机搁板上，开启真空泵，共同降至﹣40℃进行预冻，预冻时间为6h，一次升华干燥时间为30h，二次解析干燥时间为8h，共44h得到胶束冻干粉。如表9所示，冻干制剂用蒸馏水复溶后可在室温下存放24h，粒径、载药量及包封率无变化，具有良好稳定性。
表9制剂(按实施例9制备)冻干前后的理化性质对比
Figure BDA0002143396680000113
Figure BDA0002143396680000121
实施例10
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，采用喷雾干燥法对胶束溶液进行固化，喷干保护剂选用海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、羟乙基淀粉(HES)等不同喷干辅料，考察了各辅料单独使用(5％w/V)及合用时，对粒子的保护作用，结果如表10所示。
表10不同喷干保护剂对制剂的影响
Figure BDA0002143396680000122
结果表明，单一辅料为保护剂时，海藻糖和葡萄糖的保护效果优于乳糖和甘露醇。乳糖和甘露醇为保护剂时，立即复溶后粒度结果较好，25℃保存 10天后，稳定性显著降低，其中甘露醇处方样品复溶后溶液浑浊。推测原因如下：乳糖吸湿性较强，含水量高，使样品粘度高而易粘附在旋风分离器内壁，同时水作为增塑剂会降低样品的玻璃化转变温度，造成储存过程中稳定性下降；甘露醇在干燥后，容易形成晶体而降低对纳米粒子形成保护作用；葡萄糖作为保护剂时，虽粒径结果较理想，但是其收率低，葡萄糖的玻璃化转变温度(Tg)较低(31℃)，低于出口温度，因此粘度较高而粘附与旋风分离器内壁。综合分析，5％海藻糖处方样品外观和分散性较好，具有较好的保护作用，但在储存过程中，出现粉末聚集和复溶速度较慢现象，因此考虑保护剂联合使用。海藻糖与乳糖、甘露醇联合使用，都没有单独使用海藻糖的保护效果好，与羟乙基淀粉联合时，由于样品粘度高，喷干过程中枪头易堵塞，同时样品复溶速度慢；以海藻糖和羟丙基-β-环糊精联用，样品聚集程度降低，复溶速度快，能够保证纳米粒在干燥过程中的稳定。
实施例11
将50mg CDDP溶于50ml注射用水中，加入聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料450mg，调节pH至8，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP 浓度为1mg·mL-1，进行浓缩和除去游离药物，浓缩后浓度为7mg/ml，利用冷冻干燥法制备冻干粉针。冻干保护剂的种类可分为单糖、多糖、醇类和聚合物类等，主要筛选了蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、羟丙基- β-环糊精和羟乙基淀粉等保护剂单独使用(10％w/V)及合用时的效果，结果如表11所示。
表11不同冻干保护剂对制剂的影响
Figure BDA0002143396680000131
由表可知，使用单一冻干保护剂时，加入葡萄糖、海藻糖、麦芽糖和蔗糖的冻干胶束的外观呈现塌陷和萎缩状态，尽管加入海藻糖的冻干制剂粒径变化不大。加入PEG4000和羟丙基-β-环糊精作为冻干保护剂，外观良好，但粒径变大，粒子明显聚集。加入甘露醇和HES，制剂外观良好，粒径稍有增大，但HES黏度较大，高浓度不易过滤。综上，海藻糖具有保护粒径的作用，甘露醇和HES具有良好的支撑作用。单一应用某种冻干保护剂，无法同时兼顾外观和粒径，因此考虑使用两种冻干保护剂，海藻糖，甘露醇和 HES在单独使用时效果好于其他，故选用海藻糖、甘露醇、HES混合搭配 (5％+5％)。当海藻糖与羟乙基淀粉搭配时，外观、复溶速度和粒径均符合要求。
实施例12
将50mg CDDP溶于25ml注射用水中，分别加入不同克数的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，调节pH至8～9，37℃水浴、避光、机械搅拌24h，混合后CDDP浓度为2mg·mL-1，反应结束后测定顺铂络合的载药量和包封率如下表。
顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇的投料比、载药量和包封率如表12。
表12不同投料比对制剂的影响
Figure BDA0002143396680000141
实施例13
在37℃的条件下，称取10mg实施例1制备的顺铂络合，用2ml 0.01M pH 为7.4或5.5的磷酸盐缓冲液溶液溶解，转移至3500Da透析袋中，用50ml 相应缓冲液进行透析，在2、4、8、12、24、48、72、96、144h分别取样1ml，测定累积释放率，释放结果如图3(顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例1制备)在不同pH释放介质中释放顺铂图谱)，由图可知，顺铂络合具有缓释作用。
实施例14
在37℃的条件下，称取10mg实施例2制备的顺铂络合，用2ml 0.01M pH 为7.4或5.5的磷酸盐缓冲液溶液溶解，转移至3500Da透析袋中，用50ml 相应缓冲液进行透析，在2、4、8、12、24、48、72、96、144h分别取样1ml，测定累积释放率，释放结果如图4(顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例2制备)在不同pH释放介质中释放顺铂图谱)，由图4可知，顺铂络合具有缓释作用。
实施例15
在37℃的条件下，称取10mg实施例4制备的顺铂络合，用2ml 0.01M pH 为7.4或5.5的磷酸盐缓冲液溶液溶解，转移至3500Da透析袋中，用50ml 相应缓冲液进行透析，在2、4、8、12、24、48、72、96、144h分别取样1ml，测定累积释放率，释放结果如图5(顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例4制备)在不同pH释放介质中释放顺铂图谱)，由图5可知，顺铂络合具有缓释作用。
实施例16
胶束稀释稳定性
将实施例2制备的胶束粉针分别用生理盐水和葡萄糖溶液稀释10倍，置于37℃水浴摇床振摇。分别于0、4、8、12h、24h及48h测定粒径及粒度分布，结果如图6(胶束粉针(按实施例2制备)分别用生理盐水(6-1)和葡萄糖(6-2)溶液稀释10倍的粒径分布图谱)。结果表明，上述胶束注射液均具有良好的物理及化学稳定性，可耐受临床使用流程，且适用于用生理盐水及葡萄糖溶液稀释。
实施例17
长期稳定性
将实施例2制备的胶束粉针在4℃和25℃条件下放置6个月，考察制剂在这些条件下的稳定性，结果见表13。实验结果表明制剂的粒径、载药量及包封率并未发生明显变化，说明冻干胶束制剂在4℃和25℃条件下放置6个月稳定性较好。
表13注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束长期稳定性实验
Figure BDA0002143396680000151
实施例18
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在正常小鼠体内的毒性试验
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例1配方制得
将正常昆明小鼠随机分成11组：生理盐水对照组、游离顺铂溶液组*5 个剂量及顺铂-聚谷氨酸络合胶束组*5个剂量，每组8只。尾静脉注射，单次给药，剂距为0.5。游离顺铂溶液组和顺铂-聚谷氨酸络合胶束组的注射剂量为5mg/kg、7.5mg/kg、11.25mg/kg、16.88mg/kg和25.32mg/kg，每天记录小鼠存活和体重变化，从体重变化方面反映药物对小鼠毒性，生理盐水组和小鼠体重呈上升趋势；顺铂-聚谷氨酸络合胶束前四个剂量呈上升趋势，后一个剂量有微微下降；而顺铂溶液组小鼠体重均呈明显下降，且有死亡现象。从存活率方面来说，观察期内，生理盐水组和顺铂-聚谷氨酸络合胶束组小鼠均未出现死亡现象；顺铂组中11.25mg/kg第七天死亡三只，16.88mg/kg 组第五天死亡五只，25.32mg/kg第三天全部死亡，结果表明顺铂-聚谷氨酸络合胶束对小鼠毒性较低。
实施例19
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束的溶血性实验
顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例1配方制得
取21支洁净的玻璃试管，分为3组，每组7支，1～5支为供试组，第6 支为阴性对照组，第7支为为阳性对照组。按下表所示依次加入2％的红细胞混悬液、0.9％氯化钠溶液或蒸馏水、样品(辅料和胶束溶液)，混匀后，置(37±0.5)℃的恒温水浴中进行孵育。如表14。
表14注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶血性实验
Figure BDA0002143396680000161
三小时后将各浓度样品溶液振摇后，室温静置0.5h，随时间的推移血细胞逐渐沉降。图7-1和图7-2是将各试管离心后的溶血情况。由图可知，肉眼观察第7和14支加入蒸馏水后出现明显的溶血现象，而辅料溶液和胶束溶液不会引起溶血现象。分离出上层液体，采用紫外分光光度法，于540nm 处测定吸光度。并按照下式计算溶血率，测定结果见图7(聚谷氨酸接枝聚乙二醇(7-3)和顺铂-聚谷氨酸络合胶束(7-4)(按实施例4制备)的溶血率)。溶血率计算公式为：溶血率(％)＝(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100％，由图7可知溶血率均小于5％，表明辅料溶液和胶束溶液没有溶血情况。
实施例20
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在大鼠体内药代动力学研究
顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例10配方制得
将24只体重为(200±20)g的雄性SD大鼠随机分成四组，每组6只，实验前禁食一夜。给药剂量为5mg·kg-1，于尾静脉注射顺铂溶液和顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液(分别为实施例10中的配方1、2和3)。给药后，分别于 10min、30min、1h、2h、5h、8h、12h和24h眼眶取血0.5mL，置于预先肝素化的1.5mL尖底离心试管中，6000rpm离心10min，吸取上层血浆，置-20℃冰箱保存。血浆样品的处理与测定：精密量取血浆样品100μL于10mL刻度试管中，加硝酸-高氯酸(V:V＝9:1)混合溶液2mL，使用智能样品处理仪进行消化处理，消化温度140℃，消化时间6h，继续加热至180℃，使液体挥发近干，加0.2％硝酸定容至1mL，涡旋10min混匀，利用原子吸收法进行测定。实验动物各时间点血药浓度的平均值与时间的关系见图8(单剂量尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液(按实施例10制备)和顺铂溶液剂的平均血药浓度-时间曲线(n＝6))。
如表15所示，顺铂溶液和顺铂-聚谷氨酸络合胶束的血药浓度具有显著性差异，顺铂-聚谷氨酸络合胶束(配方1、2和3)的AUC(0-t)分别是顺铂溶液的24.2、69.2和11.2倍，表观分布容积(Vss)和总清除率(CL)的值明显低于CDDP溶液。上述结果表明，利用聚谷氨酸接枝聚乙二醇包载顺铂后能够延长顺铂在体内的滞留时间，降低顺铂的清除率，提高顺铂的生物利用度。配方3的AUC(0-t)最小，是因为顺铂有部分以物理形式存在于胶束溶液中，由体外释放可以看出，其存在20％的突释，故进入血液中，突释的顺铂被迅速代谢，血药浓度低于其它。胶束外壳的PEG密度很大影响了其在体内的行为，PEG可以免受RES的影响，避免识别和吞噬作用，从而减少血液循环中的清除。
表15注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在大鼠体内药代动力学研究
Figure BDA0002143396680000171
实施例21
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在H460肿瘤模型中的组织分布研究
顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例10配方制得
实验采用BALB/c-nu裸鼠，80只，雄性。实验裸鼠于右前肢腋下接种 0.2ml的人非小细胞肺癌H460细胞悬液，制备裸鼠移植瘤模型。待肿瘤生长到60～100mm3时，根据移植瘤体积大小、按照组间一致原则分组后开始给药。实验动物分为4组，即注射用顺铂组和顺铂-聚谷氨酸络合胶束组(分别为实施例10中的配方1、2和3)，每组20只，给药剂量为5mg/kg。分别于给药后0.167、1、6、24和48h，颈椎脱臼处死动物，取出肾和瘤组织，用生理盐水冲洗干净后滤纸吸干，分装于自封袋中，置于-20℃冰箱中保存待测。
如图9(H460荷瘤小鼠尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液(按实施例10制备)(9-1)和顺铂溶液剂(9-2)的组织分布图)所示，实验结果表明，给药后顺铂溶液迅速分布到各个器官，特别是10min时肾脏中顺铂溶液的最大浓度为7981.64±942.64ng/g，1h时迅速降至3671.63±850.44 ng/g，表明在短时间内消除了大量的CDDP，进而导致肾毒性。而顺铂-聚谷氨酸络合胶束配方1、2和3组肾中铂浓度分别为顺铂溶液的1.03、0.55 和0.35倍，显著低于顺铂溶液组。肿瘤中顺铂溶液组的铂浓度在10min达到最大值，然后下降，而顺铂-聚谷氨酸络合胶束组随时间逐渐增加。48h后，顺铂-聚谷氨酸络合胶束配方1、2和3组肿瘤中的铂浓度分别是是顺铂溶液组的15.62、26.18和14.23倍。顺铂-聚谷氨酸络合胶束的粒径在10～100nm，有助于通过EPR效应将载有顺铂的聚合物胶束转运到肿瘤组织中。顺铂-聚谷氨酸络合胶束有效地增加了肿瘤中铂的积累，从而提高了治疗效果。
实施例22
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在H460肿瘤模型中的抗肿瘤研究
顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例10配方制得
实验采用BALB/c-nu裸鼠，24只，雄性。实验裸鼠于右前肢腋下接种 0.2ml的人非小细胞肺癌H460细胞悬液，制备裸鼠移植瘤模型。待肿瘤生长到60～100mm3时，根据移植瘤体积大小、按照组间一致原则分组后开始给药。实验动物分为4组，即生理盐水组、顺铂-聚谷氨酸络合胶束5mg/kg剂量组(分别为实施例10中的配方1、2和3)，每组6只。注射用顺铂和顺铂 -聚谷氨酸络合胶束均采用生理盐水溶解，各实验组连续3周尾静脉给药，每周两次，给药容积均为0.1ml/10g，给药期间每2天测量动物体重和肿瘤生长体积。
如图10(H460荷瘤小鼠尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液(按实施例10制备)的相对肿瘤体积(10-1)和小鼠体重变化(10-2)图)所示，顺铂-聚谷氨酸络合胶束5mg/kg剂量组(实施例10中的配方1、2和3)的抑瘤率分别为25.89％、49.26％和55.38％，药辅比不同对胶束在体内行为有很大影响。
实施例23
注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束在H460肿瘤模型中的抗肿瘤研究
顺铂-聚谷氨酸络合胶束：实施例2制得
实验采用BALB/c-nu裸鼠，24只，雄性。实验裸鼠于右前肢腋下接种 0.2ml的人非小细胞肺癌H460细胞悬液，制备裸鼠移植瘤模型。待肿瘤生长到60～100mm3时，根据移植瘤体积大小、按照组间一致原则分组后开始给药。实验动物分为4组，即生理盐水组、注射用顺铂3mg/kg组、顺铂-聚谷氨酸络合胶束3mg/kg剂量组、顺铂-聚谷氨酸络合胶束6mg/kg剂量组，每组6只。注射用顺铂和顺铂-聚谷氨酸络合胶束均采用生理盐水溶解，各实验组连续3周尾静脉给药，每周两次，给药容积均为0.1ml/10g，给药期间每2天测量动物体重和肿瘤生长体积。
如图11(H460荷瘤小鼠分别尾静脉注射顺铂-聚谷氨酸络合胶束溶液 (11-1)(按实施例2制备)和顺铂溶液剂(11-2)的相对肿瘤体积和小鼠体重变化图)所示，从体重方面来看，顺铂溶液组小鼠体重显著下降，而顺铂 -聚谷氨酸络合胶束微微下降。从抑瘤率方面来看，顺铂溶液组、顺铂-聚谷氨酸络合胶束3mg/kg和6mg/kg剂量组的抑瘤率分别是30.04％、28.56％和 57.19％。实验结果表明，同等剂量下，顺铂-聚谷氨酸络合胶束的抑瘤率与顺铂溶液组接近，而且其毒性更小；随着剂量增加，顺铂-聚谷氨酸络合胶束的抑瘤率随之增加，其可以剂量依赖性的抑制肺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长，且小鼠体重下降不明显。
实施例24
将100mg CDDP与300mg的PLG-g-mPEG用50mL注射用水溶解，调节pH至8，37℃水浴、避光机械搅拌24h，采用超滤膜法进行浓缩，分别于0、2、4、6、8、12min测定胶束含量及游离药物量，结果如图12(顺铂-聚谷氨酸络合胶束(按实施例24制备)在浓缩后不同时间点的胶束含量及游离药物量图)。结果表明，随着超滤时间的延长，胶束的含量逐渐增加，游离药物降低，可以达到浓缩目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束的制备方法，包括以下步骤：
（1）将顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇分别用注射用水进行水化，得到顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液；所述顺铂和聚谷氨酸接枝聚乙二醇的重量比为1∶9；
（2）将步骤（1）得到的顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液混合，得到自组装胶束；所述自组装胶束中顺铂的浓度为0.5~3mg/mL；
（3）将步骤（2）得到的自组装胶束进行浓缩、过滤、固化，得到注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束；所述浓缩后顺铂的质量体积浓度为3~10 mg/mL；
所述固化包括喷雾干燥或冷冻干燥；
所述喷雾干燥的条件为：喷嘴气体流量400~500 L/h，进样速度2~5 mL/min，进口温度100~110℃；所述喷雾干燥用保护剂为海藻糖和羟丙基-β-环糊精；
所述冷冻干燥为将过滤后的胶束分装后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的总时长为20~46小时；所述冷冻干燥以﹣40℃进行预冻，维持时间2~8h；升温至﹣20℃，在﹣20℃~-10℃范围内阶梯式升温，进行升华干燥，时间为15~30h；升温至20℃，进行解析干燥，时间为2~8h；所述冷冻干燥用保护剂为海藻糖和羟乙基淀粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述聚谷氨酸接枝聚乙二醇数均分子量为38000~60000 g/mol。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（1）顺铂溶液和聚谷氨酸接枝聚乙二醇溶液的pH值为6.0~10.0。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（1）所述水化的时间为24~72h，温度为20~40℃；所述水化包括晃动、搅拌、超声或涡旋。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述过滤为先过0.45μm粗滤，再过0.22μm精滤。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂在使用前，进行预处理，所述预处理包括：在喷雾干燥用保护剂或冷冻干燥用保护剂中加入质量百分浓度0.1~0.5%的活性炭，煮沸10~60min，脱碳过滤。
7.基于权利要求1~6任一项所述制备方法得到的注射用顺铂-聚谷氨酸络合胶束。
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