KR20190131797A - 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 나노입자는 약물을 안정적으로 담지하고, 산성의 pH를 갖는 타겟 세포에서만 약물을 방출하는 등의 약물 전달체로서 우수한 특성을 나타내므로, 질병의 치료, 진단 및 조직 재생 등을 위한 의약품으로 유용하게 활용될 수 있고, 나아가 피부 미백, 보습 또는 노화 예방 등의 화장료 조성물로서도 적용 가능하다.

Description

인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 {A hybrid nanoparticle comprising calcium phosphate, a preparation method thereof and a smart delivery vehicle for loading and delivery of bioactive agents}

본 발명은 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 생체활성물질을 효과적으로 담지 하면서도, 외부환경 감응에 따른 방출이 가능한 나노전달체가 성공적인 질병 진단 및 치료를 위한 필수적인 요소로 인식되고 있으며, 조직재생, 화장품 산업 등 이러한 나노전달체가 적용될 수 있는 응용분야가 넓어지고 있다.

현재까지 나노전달체는 유기 고분자 입자, 무기입자 및 유무기 입자를 중심으로 개발되어 왔으며, 외부환경에 감응하여 효과적으로 담지된 생체활성물질의 방출을 유도하는 유무기 입자가 큰 관심을 받고 있다. 이는 고분자 입자 및 무기입자 단일 소재의 한계를 유무기 복합화를 통해 극복할 수 있기 때문이며, 최근 인산칼슘과 고분자 나노입자를 핵심 성분으로 하는 생체활성물질 담지 및 방출제어 시스템에 대한 연구가 진행되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 종류의 나노 캐리어를 개발하고자 예의 노력한 결과, 친수성 고분자와 소수성 poly DOPA로 구성된 양친성 블록 공중합체를 이용하여, 수용액상에서 자기조립에 의해 나노입자를 제조하고, 상기 나노입자의 코어에 인산칼슘 미네랄 형성을 유도할 경우, 혈청 조건에서 안정한 구조를 가져 담지된 생체활성 물질을 효과적으로 보존하면서도, 약산성 조건에서 담지된 생체 활성 물질의 방출이 촉진될 수 있는 나노입자를 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

Sang Cheon Lee et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 157 (2017) 215-222

본 발명의 하나의 목적은, poly DOPA (poly(L-dihydroxyphenylalanine)) 및 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 공중합체; 인산칼슘; 및 약물을 포함하며, 상기 공중합체의 poly DOPA 및 상기 인산칼슘이 코어부를 형성하고; 상기 공중합체의 비이온성 친수성 폴리머가 쉘부를 형성하며, 상기 코어부에 약물이 담지되어 있는, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 비이온성의 친수성 폴리머 및 poly DOPA로 구성되는 공중합체 수용액; 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계(단계 1); 상기 단계 1의 혼합액에 약물을 첨가하여 혼합하는 단계(단계 2); 및 상기 단계 2의 혼합액에 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄) 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계(단계 3)를 포함하는, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하는, 약물 전달체 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 제공한다.

본 발명은, 약물이 담지된 인산칼슘 코어 및 고분자 쉘로 구성된 약물 담지 인산칼슘 복합 나노 입자로서 혈류 내에서는 안정한 상태로 인산칼슘의 방출이 일어나지 않아 인산칼슘 코어 내에 존재하는 약물의 방출이 일어나지 않고, 표적화 후 암조직 및 세포 내 엔도좀/라이소좀 등의 산성 pH에서 용해되어 인산칼슘 용해에 따른 담지 약물의 방출을 유도할 수 있어 약물 전달체로서 사용할 수 있는, pH 감응형 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 제공한다.

구체적인 실시 양태로서, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는,

poly DOPA (poly(L-dihydroxyphenylalanine)) 및 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 공중합체; 인산칼슘; 및 약물을 포함하며,

상기 공중합체의 poly DOPA 및 상기 인산칼슘이 코어부를 형성하고;

상기 공중합체의 비이온성 친수성 폴리머가 쉘부를 형성하며,

상기 코어부에 약물이 담지되어 있는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 공중합체는 poly DOPA (poly(L-dihydroxyphenylalanine)) 및 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 공중합체의 poly DOPA는 홍합에서 발견되는 단백질 중 하나로서, poly DOPA는 인산칼슘 등과 반응하여 결정화됨으로써 나노입자의 코어부 형성에 관여하며, 형성된 상기 코어부에 약물을 담지할 수 있게 된다.

또한, 상기 공중합체의 비이온성 친수성 폴리머는 수화된 쉘을 형성하고, 분출, 투과 상승 및 저류(enhanced permeation and retention, EPR) 효과를 위한 장기적인 순환에 기여한다.

따라서, 본 발명의 공중합체는 poly DOPA 및 비이온성 폴리머로 구성되는 것이면 어느 것이나 가능하며, AB형 블록 공중합체(block copolymer) 또는 그라프트 공중합체(graft copolymer)일 수 있고, 또한 용액 상에서 자기조립 (self-assembly) 되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적 예로, 상기 비이온성 친수성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥사졸린, 폴리(N-비닐피롤 리돈), 폴리비닐알콜, 폴리히드록시에틸메타크릴에이트, 덱스트란 또는 메틸셀룰로스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 공중합체는 poly DOPA 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 약물은 항암제, 항염증제, 항산화제 또는 이들의 조합일 수 있고; 골재생 유도형 화합물, 펩타이드, 단백질 약물 또는 이들의 조합일 수 있고; 피부 미백제, 피부 보습제, 피부 주름 개선제 또는 이들의 조합일 수 있으며, 저분자량, 유전자 약물 또는 단백질 약물 등의 형태일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 골재생 유도형 화합물은 심바스타틴(simvastatin) 또는 덱사메타손(dexamethasone)일 수 있고; 상기 골재생 유도형 펩타이드는 아발로파라티드 (Abaloparatide; BA058) 또는 골 형성 펩타이드 (Bone forming peptides, BFPs)일 수 있으며; 골재생 유도형 단백질 약물은 골형성 성장인자(bone morphogenetic proteins, BMPs), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factors, FGFs), 혈소판 유도 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factors, IGFs), 파라티로이드 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 예로, 상기 저분자량 약물 중 항암제로는 독소루비신 (doxorubicin), 닥디토마이신 (dactinomycin), 미토마이신 (mitomycin), 블레오마이신 (bleomycin) 시타라바인 (cytarabine), 아자세르진 (azaserzine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 트리에틸렌멜라민 (triethylenemelamine), 트레오설판 (treosulfan), 레티노익산 (retinoic acid), 빈블라스틴 (vinblastine) 또는 빈크리스틴 (vincristine) 등일 수 있고,

상기 저분자량 약물 중 항염증제로는 아스피린 (aspirin), 살리실레이트 (salicylates), 이부프로펜 (ibuprofen), 플루르비프로펜 (Flurobiprofen), 피록시캄 (pyroccikam), 나프로센 (naproxen), 페노프로펜 (fenoprofen), 인도메타신 (indomethacin), 페닐부타존 (phenyltazone), 메소트렉세이트 (methotrexate), 메클로에타민 (mechlorethamine), 덱사메타손 (dexamethasone), 프레드니솔론 (prednisolone), 셀레콕시브 (celecoxib), 발데콕시브 (valdecoxib), 니메슐리드 (nimesulide), 코르티손 (cortisone) 또는 코르티코스테로이드 (corticosteroid) 등일 수 있고,

상기 저분자량 약물 중 항산화제로는 비타민 C, 루테인, 비타민B군, 코엔자임큐텐, 오메가3, 에리소르빈산나트륨 또는 α-토코페롤 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 저분자량 약물 중 피부 미백제로는 플라보노이드계 화합물, 폴리페놀 화합물, 락톤계 화합물 또는 비타민 C 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 “피부 미백제”는 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 물질을 의미한다.

또한, 상기 저분자량 약물 중 피부 보습제로는 비타민B군, 히알루론산 또는 세라마이드 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 “피부 보습제”는 피부에 수분감을 증가시켜주고, 촉촉한 상태를 유지시키는 물질을 의미한다.

또한, 상기 저분자량 피부 주름 개선제로는 비타민B군, 히알루론산 또는 세라마이드 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 “주름 개선제”는 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 물질을 의미한다.

상기 저분자량 약물은 1종 단독 또는 2종 이상의 조합으로 사용할 수 있다.

또한, 상기 유전자 (gene) 약물은 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA), 작은 헤어핀 리보핵산 (small hairpin RNA, shRNA), 마이크로 리보핵산 (microRNA, miRNA), 플라스미드 데옥시리보핵산 (plasmid DNA) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 약물은 1종 단독 또는 2종 이상의 조합으로 사용할 수 있다.

또한, 상기 단백질 (protein) 약물 중 항암제로는, 단일클론 항체 (monoclonal antibody)계의 트라스트주맵 (trastuzumab), 리투시맵 (rituximab), 베바시주맵 (bevacizumab), 세투시맵 (cetuximab), 보테조밉 (bortezomib), 엘로티닙 (erlotinib), 제피티닙 (gefitinib), 이매티닙 메실레이트 (imatinib mesylate), 수니티닙 (sunitinib); 효소(enzyme)계의 L-아스파라지나제 (L-asparaginase); 호르몬 (hormone)계의 트리톨레린 아세테이트 (triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트 (megestrol acetate), 플루타미드 (flutamide), 비카루타마이드 (bicalutamide), 고세레린 (goserelin); 시토크롬 씨 (cytochrome c), p53 단백질 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질 약물은 1종 단독 또는 2종 이상의 조합으로 사용할 수 있다.

가장 구체적으로, 상기 약물은 독소루비신 (doxorubicin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 pH 4 내지 7, 구체적으로 pH 4 내지 6.5에서 용해되는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 ~pH 7.4의 혈류 내에서는 용해되지 않고 안정한 특성을 나타내는 반면, 암조직 pH(pH ~6.3), 세포내 의 엔도좀(endosome, pH ~5.0) 및 라이소좀(lysosome, ~pH 4.5) 내의 낮은 pH 환경에서는 코어부의 인산칼슘의 용해가 일어나 인산칼슘 내에 담지되어 있는 약물의 방출을 유도할 수 있는 특성을 나타낸다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자의 제조방법을 제공한다.

구체적인 실시 양태로서, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

비이온성의 친수성 폴리머 및 poly DOPA로 구성되는 공중합체 수용액; 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 혼합액에 약물을 첨가하여 혼합하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2의 혼합액에 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄) 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계(단계 3).

또한, 상기 제조방법은 상기 단계 3 이후에 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:

상기 단계 3의 반응액을 침전하여 생성물을 회수하는 단계(단계 4);

상기 단계 4의 상층액을 삼투 교환시키는 단계(단계 5); 및

상기 단계 5의 삼투 교환된 용액을 동결건조시키는 단계(단계 6).

구체적으로, 상기 단계 1은, poly DOPA 및 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 공중합체의 수용액, 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계로서, 인산칼슘과 함께 코어부를 형성하는 poly DOPA와 쉘부를 형성하는 비이온성 친수성 폴리머 부분으로 구성되는 공중합체의 수용액과 상기 poly DOPA와 함께 코어부를 형성하는 인산칼슘을 얻기 위한 염화칼슘의 수용액을 혼합하는 단계이다.

이때, 상기 “poly DOPA” 및 “비이온성 친수성 폴리머”에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 단계 1의 공중합체 내 DOPA기와 염화칼슘의 몰비는 1:0.1 내지 1:1일 수 있다. 만약 상기 공중합체와 염화칼슘의 몰비가 상기 범위 밖이면 인산칼슘 복합 나노입자가 형성되지 않거나, 인산칼슘만으로 이루어진 나노입자가 형성되는 단점이 있다.

상기 단계 2는, 상기 단계 1의 혼합액에 약물을 첨가하여 혼합하는 단계로서, 코어부를 형성하는 인산칼슘 내에 담지시키기 위한 약물을 상기 단계 1의 공중합체 수용액과 염화칼슘 수용액의 혼합액에 첨가하여 혼합하는 단계이다.

이때, 상기 “약물”에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

구체적으로, 상기 약물은 물에 용해시켜 수용액의 형태로 첨가될 수 있다.

상기 단계 3은, 상기 단계 2)의 혼합액에 인산수소이나트륨 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계로서, 코어부를 형성하는 인산칼슘을 얻기 위하여 상기 단계 2)의 혼합액 중에 존재하는 염화칼슘과 반응하는 인산수소이나트륨 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계 3의 인산수소이나트륨은 상기 단계 2의 혼합액 중에 존재하는 염화칼슘 즉, 상기 단계 1의 염화칼슘과 1:2 내지 2:1의 몰비로 첨가될 수 있다. 반응 효율면에서 상기 단계 3의 인산수소이나트륨은 상기 단계 1의 염화칼슘 과 동일한 몰비로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 3의 반응 시간은 1 내지 5시간, 구체적으로 2 내지 4시간일 수 있다. 반응 시간이 상기 하한보다 짧으면 반응이 완료되지 않을 수 있으며, 상기 상한보다 길면 부반응이 발생할 수 있는 단점이 있다.

또한, 상기 단계 3의 반응 온도는 상온, 구체적으로 10 내지 30℃일 수 있다. 반응 온도가 상기 범위 밖이면 부반응이 발생하는 단점이 있다.

또한, 상기 단계 1 및 3에서 사용하는 공중합체 수용액, 염화칼슘 수용액 및 인산수소이나트륨 수용액의 pH는 7.0 내지 9.0일 수 있다. 또한, 약물이 수용액의 형태로 첨가될 경우, 상기 단계 2의 약물 수용액의 pH도 7.0 내지 9.0일 수 있다. 만일 상기 수용액들의 pH가 상기 범위 밖이면 인산칼슘의 형성이 어려운 단점이 있다.

상기 단계 4는, 상기 단계 3의 반응액을 침전하여 생성물을 회수하는 단계로서, 반응액을 용매를 이용하여 반복적으로 침전시켜 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하고 있는 생성물을 회수하는 단계이다.

구체적으로, 사용될 수 있는 용매는 n-헥산, 디에틸에테르 또는 다이에틸에터 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 5는, 상기 상층액을 삼투 교환시키는 단계로서, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하고 있는 상층액을 삼투 교환시켜 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 걸러내는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계 5의 삼투 교환은 삼투막 비닐을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 삼투막 비닐의 분자량 제한은 500 내지 1500 g/mol, 더욱 구체적으로 1000 g/mol일 수 있다.

상기 단계 6은, 상기 삼투 교환된 용액을 동결건조시키는 단계로서, 삼투 교환으로 분리된 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하고 있는 용액을 동결건조시켜 분말 형태의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 얻는 단계이다.

구체적으로, 상기 단계 6의 동결건조는 -15 내지 -50℃에서 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자의 제조방법은 상기와 같이 공중합체, Ca²⁺ 양이온, 약물 및 PO₄ ^3- 음이온을 연속적으로 첨가하여 단일 반응 용기(one-pot) 내에서 반응시킴으로써, 인산칼슘과 poly DOPA가 함께 형성한 복합 코어(core) 내에 in-situ로 약물이 담지되고 비이온성 친수성 폴리머가 형성하는 쉘 (shell)이 외곽에 존재하는 방식으로 구형의 코어-쉘 구조의 나노입자를 자발적으로 형성시킬 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하는 약물 전달체 조성물을 제공한다.

이때, 상기 “약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자”에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 pH 7.0 이상의 조건에서는 용해되지 않으나, pH 4.0 내지 pH 6.5의 조건에서는 용해되는 용해 거동을 나타냄으로써, ~pH 7.4의 혈류 내에서는 용해되지 않고 안정한 특성을 나타내는 반면, 암조직 pH(pH ~6.3), 세포 내의 엔도좀(endosome, pH ~5.0) 및 라이소좀(lysosome, ~pH 4.5) 내의 낮은 pH 환경에서는 코어부의 인산칼슘의 용해가 일어나 인산칼슘 내에 담지되어 있는 약물의 방출을 유도할 수 있으므로 약물 전달체로서 사용될 수 있다.

본 발명에서, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하는 상기 조성물은, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자가 담지하고 있는 항암제, 항염증제 또는 항산화제 등에 의하여 예방, 개선 또는 치료 가능한, 암, 알츠하이머, 심혈관 질환, 류마티스 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 조성물은 혈류 내에서는 용해되지 않고 안정하며 암조직 및 세포 내에서는 약물의 방출을 유도할 수 있으므로, 정맥 주사제 형태로 투여되는 것일 수 있다.

나아가, 상기 조성물은, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자가 담지하고 있는 피부 미백제, 피부 보습제, 피부 주름개선제 등을 통해 관련한 생체 활성 효과를 나타내므로, 피부 미백, 피부 보습, 피부 주름개선 용도로 사용할 수 있으나, 약물이 이외의 추가의 활성을 나타내는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

정맥주사를 통하여 질병조직에 약물을 전달하는 나노입자는 하기 2가지 선행 조건을 만족해야만 한다. 첫째, 나노입자 내에 담지된 약물이 표적 조직에 도달하기 전까지 담지된 약물의 손실 없이 안전하게 보존되어야 한다. 이는 특정 질병 조직 치료 효율을 높이기 위함이고, 혈액 내에서 약물방출이 일어나면 그만큼 치료 효율이 감소 하게 되기 때문이다. 둘째, 특정 질병 조직에 도달한 후 담지된 약물을 방출할 수 있어야 한다. 표적 조직의 세포 내로 나노입자가 들어와 세포 내 낮은 pH 환경인 엔도좀, 라이소좀에서 약물이 방출될 수 있는 시스템이 바람직하다. 이러한 두가지 요건을 만족시키는 나노입자로, 본 발명에서는 인산칼슘 복합 나노입자를 이용한다.

구체적으로, poly DOPA와 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 공중합체를 이용하여, 칼슘 침착 및 연속적인 인산 이온 침착으로 인한 인산칼슘 미네랄 코어구조를 형성하고 친수성 폴리머는 밖의 쉘 부분에 존재하여 수용액 상의 콜로이드 안정성을 높인다. 이때, 이온성 저분자 약물, 유전자 약물, 단백질 약물을 투입하면 인산칼슘 미네랄 형성과 동시에 다중 이온결합을 통해 인산칼슘 미네랄 코어에 담지되게 된다. 본 발명에서 제조된 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 인산칼슘이 중성 pH 영역(~7.4), 즉 혈액 내 pH에서는 용해가 일어나지 않아 담지된 약물의 손실 없이 안전하게 표적조직으로 수송할 수 있으므로 상기 첫 번 째 요건을 만족한다. 또한, 표적조직 도달 후 엔도좀, 라이소좀 pH 영역에서 인산칼슘 미네랄이 이온으로 용해되므로, 담지된 약물의 방출이 가능하다. 따라서, 본 발명의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 상기 두 번째 요건도 충족한다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 안정한 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 형성하기 위하여, 113의 PEG 단위 및 8의 DOPA 단위를 갖는 PEG-PDOPA에 약물로서 DOX, CaCl₂ 용액 및 Na₂HPO₄ 수용액을 첨가하여 DOX가 로딩된 CaP- 무기질화 PEG-PDOPA 나노입자 (DOX-CaP-NPs)를 수득하였다 (도 1, 및 실시예 1-2 및 1-3). 이후, 산란된 광 강도 비율을 분석한 결과 PDOPA 코어 도메인의 CaP 무기질화가 혈청 조건 하에서 DOX-NP의 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였고, pH가 감소함에 따라 DOX-CaP-NPs로부터의 Ca²+ 이온 방출 속도가 증가함을 확인하였으며, 혈액에서는 약물 누출을 예방하며 세포 내에서 약물을 방출하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 4).

상기 결과를 통해, 본 발명의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 약물을 안정적으로 담지하고 산성의 pH를 갖는 타겟 세포에서만 약물을 방출하므로, 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 약물을 안정적으로 담지하고, 산성의 pH를 갖는 타겟 세포에서만 약물을 방출하는 등의 약물 전달체로서 우수한 특성을 나타내므로, 질병의 치료, 진단 및 조직 재생 등을 위한 의약품으로 유용하게 활용될 수 있고, 나아가 피부 미백, 보습 또는 노화 예방 등의 화장료 조성물로서도 적용 가능하다.

도 1은 DOX-로딩된 고분자 나노입자의 PDOPA core-templated CaP 결정화 및 세포 내 엔도솜 pH에 의한 DOX 방출을 나타낸 것이다.
도 2는 (a) DOX-NP (음성 염색됨) 및 (b) DOX-CaP-NP (염색하지 않음) (scale bar : 200 nm)의 TEM 이미지, (c) DOX-NP 및 (d) DOX-CaP-NP의 TEM 관련 EDX 데이터, (e) DOX-CaP-NP에서 CaP 미네랄 성분의 존재를 나타내는 EDX 매핑 이미지 (눈금 막대 : 50 nm)를 나타낸 것이다.
도 3은 (a) PBS 용액 (pH 7.4)에서 DOX-NP 및 DOX-CaP-NP로부터 프로파일된 DOX 방출 및 (b) DOX-CaP-NP로부터 pH 조절된 DOX 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 각 점은 n 실험의 평균값 ± S.D를 나타낸다 (n = 3)
도 4는 24 시간 후 SCC-7 세포에 대한 DOX, DOX-NP 및 DOX-CaP-NP의 시험 관내 세포 독성을 나타낸 것이다. 각 점은 n 실험의 평균값 ± S.D를 나타낸다 (n = 3).
도 5는 DOX-free NP와 CaP-NP 첨가 후 Rhod-2 표지된 SCC-7 세포의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 LysoTracker (50 nm), 유리 DOX (5 μg / mL), DOX-NP (DOX = 5 μg / mL) 및 DOX-CaP-NP (DOX = 5 μg / mL)로 처리한 생존 MCF-7 세포의 CLSM 이미지를 나타낸 것이다 ( g / mL). (녹색 형광은 LysoTracker와 관련이 있으며, 빨간색 형광은 자유 DOX, 방출된 DOX 및 DOX-NP 또는 DOX-CaP-NP 내에 보유된 DOX로 표시된 것이다. 노란색 화살표는 DOX-CaP-NP의 엔도솜의 위치를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 및 방법

1-1. 실험 재료

SunBio Inc. (서울, 대한민국)에서 α-메톡시-ω-아미노-폴리(에틸렌 글리콜)(α-Methoxy-ω-amino-poly (ethylene glycol) (CH3O-PEG-NH2) (Mn : 5000g / mol)를 구입하여, 수령한 그대로 사용하였다. Sigma 사 (St. Louis, MO)로부터 L-3,4- 디하이드록시-1-페닐알라닌(L-3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine)(L-DOPA), 독소루비신 (doxorubicin), 하이드로클로라이드(hydrochloride) (DOX · HCl), 아세트산 무수물, 트리포스 유전자, 피페리딘 및 빙초산(glacial acetic acid)을 구입하여, 추가 정제 없이 사용하였다. 테트라하이드로푸란(Tetrahydrofuran)(THF)은 N₂ 하에서 증류시킨 후에 사용하였다. N, N- 디메틸포름아미드 (DMF) 및 디메틸술폭시드 (DMSO)를 건조시키고 수소화 칼슘(calcium hydride)으로 진공 증류시켰다. 염화칼슘 (CaCl₂)과 인산수소이나트륨 (Na₂HPO₄)은 시약 등급(reagent grade)이었다.

1-2. 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(3,4-디히드록시-L-페닐알라닌) 공중합체 (poly(ethyleneglycol)-b-poly(3,4-dihydroxy-l-phenylalanine)(PEG-PDOPA) copolymer) 합성

세 단계 합성 절차를 통해 PEG-PDOPA 블록 공중합체를 합성하였다.

먼저, 디-O,O'-아세틸-l-DOPA 하이드로클로라이드 ((AC₂)-DOPA)를 합성하였다. 구체적으로, 빙초산 (100 mL) 내 L-DOPA (10 g, 50.7 mmol)을 아세트산 무수물 (20 mL, 212 mmol)과 반응시켰으며, 반응 온도를 실온에서 55 ℃로 상승시켰다. 디에틸에테르로 내로 침전을 반복하여 (AC₂)-DOPA를 수집하였다. 이 때 수율은 71.2 %였으며, ¹H NMR (DMSO-d6)은 다음과 같다 : δ 2.21 (s, 6H), 3.12 (m, 2H), 4.51 (m, 1H), 7.0-7.3 (m, 3H).

두 번째로, 디-O,O'-아세틸-l-DOPA 하이드로클로라이드 ((AC₂)-DOPA-NCA)를 위하여, 실온에서 질소 하에 디-O,O'-아세틸-l-DOPA 하이드로클로라이드 ((AC₂)-DOPA-NCA) (7 g, 22.03 mmol)가 교반된 현탁액에 트리 포스겐 (2.2 g, 7.41 mmol)을 첨가하였다. 이때 반응은 60 ℃에서 3시간 동안 유지되었다. (AC₂)-DOPA-NCA는 THF로부터 n- 헥산으로의 반복 침전으로 분리하였으며, 이 때 수율은 84.1 %였다.

마지막으로, 113의 PEG 단위 및 8의 DOPA 단위를 갖는 PEG-PDOPA는 CH₃O-PEG-NH₂ 마크로 개시제(macroinitiator)의 존재 하에 (AC₂)-DOPA-NCA의 고리열림중합(ring-opening polymerization)으로 합성하였고, 이어서 PEG-P ((AC₂)-DOPA)의 디프로텍션(deprotection) 과정을 수행하였다.

구체적으로, 건조 DMF (50 mL) 중 교반된 CH₃O-PEG-NH₂ (4.5 g, 0.9 mmol) 용액을 N₂ 존재하 35 ℃에서 (AC₂)-DOPA-NCA (5.6 g, 18.23 mmol)에 첨가 하였으며, 혼합물 용액을 24 시간 동안 반응시켰다. DMF에서 디에틸에테르로 반복적으로 침전시킴으로써 PEG-P((AC₂)-DOPA)를 단리하였다. 다음으로 AC 그룹을 제거하기 위해, 건조 DMF (40 mL) 중 PEG-P ((AC₂)-DOPA) (4 g, 1 mmol)를 피페리딘 (0.53 mL)으로 15분 동안 처리하였다. 조생성물을 DMF에서 다이에틸에터로 반복적으로 침전시켜 분리시켰다. 0.1 N HCl 중의 조생성물 용액을 멤브레인백(a membrane bag) (Spectrapor, 분자량 컷-오프 (MWCO) : 3500 g / mol)을 사용하여 산성 용액 (HCl, pH 4.5)으로 투석하고, 이어서 멸균하여 최종 생성물인 PEG-PDOPA를 생산하였다. 이 때 수율은 40.7 %이었다.

1-3. PDOPA 템플릿 결정화 (PDOPA-templated mineralization)을 이용한, DOX-loaded CaP-mineralized nanoparticles (DOX-CaP-NPs)의 제조

PEG-PDOPA (10mg)를 DMF (1mL)에 용해시키고, 이어서 탈염된 DOX 용액 (0.3mL)을 실온의 암실에서 4 시간 동안 첨가 및 교반하였다. PEG 셸 및 PDOPA 코어 (DOX-NP)를 갖는 DOX- 로딩된 비무기화 나노입자를 얻기 위해, 막 (MWCO : 1000 g / mol)을 사용하여 상기 용액을 투석하였다. PDOPA 코어 도메인에서 CaP 의 무기화(mineralization)를 유도하기 위해, pH 7.0에서 DOX-NPs (0.9 mL, 1 g / L)의 교반 용액에 수성 CaCl₂ 용액 (0.1 mL, 2.9 mmol)을 첨가하고 400 rpm에서 교반하면서 30 분간 평형화 하였다. Na₂HPO₄ 수용액 (0.2 mL, 2.9 mmol)을 반응 혼합물에 서서히 첨가하고, 용액을 실온에서 1 시간 동안 400 rpm으로 자기 교반 하였다. [DOPA] : [Ca2 +] : [PO43-]의 몰 농도 비율은 1 : 1 : 1이었다. 용액을 투석하여 미반응 이온 종을 제거 하였다. 이어서, 이러한 투석액을 감압 동결 건조하여 DOX가 로딩된 CaP- 무기화 PEG-PDOPA 나노입자 (DOX-CaP-NPs)를 수득하였다.

1-4. DOX-CaP-NPs의 특성

동적 광산란 분석(Dynamic light scattering analyses)은 90 Plus 입자 크기 분석기 (Brookhaven Instruments Corporation)를 사용하여 수행하였다. 수직으로 편광된 He-Ne 레이저 (632.8 nm)를 광원으로 사용하였다. 수직 편광된 He-Ne 레이저 (632.8 nm)의 산란광을 90°의 각도에서 측정하여 자동 상관기(autocorrelator)에서 수집하여, 평균 유체 역학 지름(mean hydrodynamic diameter)(d) 및 다분산계수 (polydispersity factor)(PDF)를 계산하였다. DOX-CaP-NPs의 형태는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 검사 하였다. DOX-NP의 시각화를 위해, 우라닐 아세테이트 용액 (1 중량 %)을 사용하여 음성 염색(negative staining)을 수행하였고, DOX-CaP-NP는 염색 공정 없이 시각화 하였다. TGA (thermogravimetricanalyzer) 측정은 SDT Q600 (TAInstruments, Delaware, USA)을 사용하여, 질소 대기 하에서 10 ℃/ min의 속도로 실온에서 800 ℃까지 측정 하였다. DOX loading 컨텐트를 결정하기 위해 DOX-CaP-NP를 수성 산성 용액과 DMF (1 : 9, v/v)의 혼합물에 용해시켰다. DOX는 588 nm에서 형광 방출 강도 (Δex = 480 nm)로 분석하였고, loading content는 DMF에서 DOX의 보정 곡선에 기초하여 결정하였다.

1-5. DOX-CaP-NPs의 안정성

동적 광산란 분석으로, 혈청 함유 수용액에서의 DOX-CaP-NP의 물리적 안정성을 평가하였다. 혈청 조건에서의 안정성을 위해, 혈청을 함유한 PBS 용액 (50 % 소태아혈청 (FBS))에서 DOX-CaP-NP (3g / L)의 안정성을 조사 하였다. prefixed time intervals에서, 산란광 세기 (SLI)를 초기 산란광 세기 (SLI₀)와 비교하고, 산란광 강도 (SLI / SLI₀)의 비율을 모니터링 하였다. 비교를 위해, 동일한 혈청 조건 하에서 비-무기화 DOX-NP의 안정성을 평가하였다.

1-6. DOX-CaP-NP로부터 pH 조절 DOX 방출

수성 완충 용액 (pH 7.4 PBS, pH 6.4 및 pH 5.0 아세테이트 완충액)을 이용하여, DOX-CaP-NP로부터의 pH 의존성 DOX 방출을 평가하였다. DOX-CaP-NP 수용액 (1 mL, 1 g / L)을 투석용 멤브래인백 (dialysis membrane bag) (MWCO : 3500 g / mol)에 넣었다. 방출 매질(release medium)(10 mL)을 37 ℃에서 100 rpm의 속도로 배양 하였다. 미리 결정된 시간 간격에서 샘플 (10 mL)을 회수하고 동일한 부피의 새로운 매질로 대체 하였다. 24 시간 후, 수집된 샘플의 DOX를 588 nm에서 형광 방출 강도 (Δex = 480 nm)로 분석 하였다. DOX의 농도는 DMF에서 다양한 농도의 DOX (0.0001-0.1 mg / mL)를 사용하여 얻은 표준 교정 곡선을 기준으로 결정하였다.

1-7. DOX-CaP-NP의 pH 의존성 CaP 용해

수용액 완충 용액 (pH 7.4 PBS, pH 6.4 및 pH 5.0 아세테이트 완충액)을 이용하여 DOX-CaP-NPs의 pH 의존성 CaP 용해를 모니터링 하였다. 투석용 멤브레인백 (MWCO : 3500 g / mol)의 DOX-CaP-NP 용액 (1 g / L)을 37 ℃에서 100 rpm으로 교반하였. 방출 매질 (10 mL)을 사전 설정된 시간 간격으로 회수하고, 동일한 부피의 새로운 매질로 대체 하였다. 방출 된 Ca²+ 이온은 50㎕ 샘플을 취하여 PBS (pH 7.4) 중 알세나죠(Arsenazo III) 용액 (1 mL, 0.2 mM)에서 희석하여 모니터링 하였다. 용액의 흡광도를 656 nm에서 측정하고, 표준 곡선에 따라 Ca²+ 이온의 농도를 측정하였다.

1-8. CaP-NPs의 독성

SCC-7 두경부암 (head and neck cancer) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, Seoul)에서 얻은 후, 10 % (v/v) RPMI 1640 및 1 % (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco BRL)을 첨가 한 둘베코변형이글스배지 (DMEM, Gibco BRL, Gaithers-burg, MD)에서 배양하였다. 5% CO₂, 37 ℃에서 습기가 있는 배양기에서 상기 세포를 배양 하였으며, 2 일마다 배지를 교체하였다. 세포를 1 일 동안 96-웰 플랫-플랫 바텀 플레이트 (flat-bottomed plate)에 5 x 10³ 세포/웰의 수로 파종 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 1 내지 200㎍ / mL의 농도 범위를 얻기 위해 배양 배지에서 DOX가없는 NP 및 CaP-NP를 함유하는 200㎕의 새로운 배지와 함께 인큐베이션 하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 1 내지 200㎍/mL의 농도 범위를 얻기 위해 배양 배지에서 DOX가 없는 NP 및 CaP-NP를 함유하는 200㎕의 새로운 배지와 함께 인큐베이션 하였다. 24 시간 후 및 48 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 세포 계수 키트 (CCK) 분석 (Dojindo Laboratories, 쿠마모토)을 수행 하였다. 마이크로 플레이트 판독기 (BioradElizer, PA)를 이용해 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 미처리된 대조군과 비교하여 세포 생존력을 평가하였다.

1-9. DOX-CaP-NPs의 독성

1 일 동안 96-웰 플랫-플랫 바텀 플레이트에 웰당 5 × 10³ 세포수로 SCC-7 세포를 파종하였다. 세포를 PBS로 세척하고 다양한 농도의 DOX, DOX-NP 및 DOX-CaP-NP와 함께 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 배지를 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 용액으로 대체 하였다. 마이크로 플레이트 판독기 (Biorad Elizer, PA)에 의해 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정 였다. 데이터는 대조군의 생존율과 비교하여 생존 세포의 백분율로 표시하였다.

1-10. DOX-CaP-NP로부터 CaP 용해의 시각화

커버 글라스-바텀 디쉬(cover glass-bottom dishes)에 SCC-7 세포를 1.0 × 10⁵cells / well의 밀도로 접종하고, 가습 조건 하에서 24 시간 동안 배양하였다. DMSO 내의 Rhod-2 / AM (2 mL, 2.2 μM)을 커버 글라스-바텀 디쉬에 첨가하고 20 분 동안 배양 하였다. PBS로 3 회 세척 한 후, Dox가 없는 NP 또는 CaP-NP를 함유한 배지 (2 mL, 300 μg/mL)를 배양 접시에 넣고 6 시간 동안 인큐베이션했다. 세척 공정 후, 실온에서 3.7 % 포름알데히드를 사용하여 세포를 고정시켰다. 세포핵을 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 2mL)로 15 분 동안 염색 하였다. SCC-7 세포의 형광 이미지를 얻기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (C1si, Nikon, Japan)을 사용하였다. ROD-2 / AM 및 DAPI 염색의 가시화를 위해, 550/580 및 350/461 nm의 여기(excitation)/ 방출(emission) 파장을 각각 사용하였다.

1-11. DOX-CaP-NPs의 세포 내 분포

커버 글라스-바텀 디쉬에 1.0 × 10⁵ 세포/웰의 밀도로 SCC-7 세포를 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 이어서 배양 배지를 DOX, DOX-NP 및 DOX-CaP-NP가 5g / mL DOX 당량인 배지로 대체하고, LysoTracker 용액 (50nM)을 첨가 하여, 세포를 1 시간 및 6 시간 동안 배양 하였다. PBS로 3 회 세척한 후, 세포를 3.7 % 포름 알데히드에서 5 분간 고정시켰다. LysoTracker (λex=470-490nm) 및 DOX fluorescence (λex= 520550 nm)이 처리된 공초점레이저주사현미경(confocallaser scanning microscope) (C1si, Nikon, Japan)을 이용하여, LysoTracker, free DOX 및 DOX-로드된 나노입자로 처리된 SCC-7 세포의 형광 이미지를 모니터링 하였다.

실시예 2: 실험 결과

2-1. DOX가 로딩된 CaP-무기화 PEG-PDOPA 나노 입자 (DOX-CaP-NPs)의 제조 및 특성 규명

PEG-PDOPA 나노입자에 대한 자기 조립 블록 공중합체(self-assembling block copolymer)는 CH₃O-PEG-NH₂ 마크로 개시제(macroinitiator)의 존재 하에 (AC₂)-DOPA N-카르복시 무수물 ((AC₂)-DOPA-NCA)의 고리열림중합으로 합성하였으며, 뒤이어 탈보호 공정을 수행하였다. 합성 및 탈보호가 성공적으로 이루어졌는지 여부를 ¹H NMR 분광법으로 확인하였다. DOPA의 몰 조성비는 ¹H NMR 분석에 의해 113 : 8로 계산되었다. ¹H NMR에 의해 측정된 PEG-PDOPA의 수 평균 분자량 (Mn)은 6400 g/mol이었다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 분석 결과 좁은 분자량 분포 (Mw/Mn = 1.07)를 나타내었고 블록 공중합체가 형성된 것을 확인하였다. 소수성 PDOPA 코어와 친수성 PEG 껍질인 별개 영역을 가진 코어-쉘 폴리머 나노입자를 형성하도록 자기 조립 PEG-PDOPA를 설계하였다. DOX는 투석 방법으로 PDOPA 코어 도메인에 로드 할 수 있으며, 로딩 함량(loading content)은 10.8 중량 %, 로딩 효율(loading efficiency)은 54.0 중량 %였다.

그림 1에서 볼 수 있듯이, PDOPA 코어 도메인 내의 CaP 무기질화(mineralization)는 주로 생리학적 pH에서 mono-catechol-Ca²+ 또는 bis-catechol-Ca²+ 복합체를 통해 catecholic OH와 Ca²+ 이온의 배위에 의해 시작되었으며, PO₄ ³- 이온의 첨가는 코어 도메인 내 이온 과포화를 유도함으로써 CaP 무기질화를 촉발시켰다.

TEM 사진 (그림 2 (a)와 (b))은 DOX-NP와 DOX-CaP-NP의 모습을 나타낸다. 그 결과, DOX-CaP-NP는 염색 과정 없이도 어두운 반점으로 시각화되는 반면, DOX-NP는 단지 음성 염색(negative staining)으로만 확인되었다. DOX-CaP-NP의 크기 분포는 CaP 무기질화 이후에도 유지되었다. TEM에 의해 가시화된 DOX-CaP-NP의 평균 직경은 DOX-PM의 평균 직경보다 작은 것으로 확인되었다. 이것은 CaP의 광물이 DOX-NP의 PDOPA 코어 도메인 내에서 발생한다는 것을 나타낸다. EDX spectroscopy는 DOX-CaP-NPs가 CaP 종의 성분인 Ca와 P를 포함하고 있음을 보여주었다 (그림 2 (d)). 또한 그림 2 (e)의 비색계(colorimetric) EDX 원소 매핑을 통해 CaP의 존재를 확인하였다. TGA에 의해 추정된, DOX-NPs 상에 침착된 CaP 미네랄 질량은 32wt%이었다. CaP 광물화가 제타 전위를 -10.9mV에서 +1.4mV로 증가시킴으로써, PDOPA 코어에 CaP 미네랄 증착이 카테콜 그룹의 음이온 특성을 보호한다는 것을 알 수 있다.

2-2. Dox-CaP-NP의 안정성에 대한 CaP 무기질화의 효과

PDOPA 핵심 도메인의 CaP 무기질화를 통해, 혈액에서 조립된 나노입자의 주요 방해 요인인 DOX-NPs 혈청 단백질에 대한 안정성이 향상되는지 여부를 확인하고자 하였다.

산란된 광 강도 (SLI/SLI0)의 비율을 이용해 소 태아 혈청 (FBS) 함유 용액 내 DOX-NP 및 DOX-CaP-NP의 시간-의존적 안정성을 모니터링 하였다. DOX-CaP-NP는 24 시간 후에도 초기 산란광 강도를 약 100 %로 유지했다. 반면, DOX-NP는 동일한 시간대에 87.0 %의 산란 강도를 나타내었다.

따라서 이러한 결과를 통해, PDOPA 코어 도메인의 CaP 무기질화가 혈청 조건 하에서 DOX-NP의 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

2-3. pH 조절에 따른 DOX 방출

다음으로, 다음에 DOX 방출 동력학에 대한 CaP 무기질화가 미치는 영향을 조사하고자 하였다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, DOX-CaP-NP는 DOX-NP와 비교하여 DOX 방출이 유의하게 억제되었다. 24 시간 후, DOX-CaP-NP는 일부 DOX (21.0 %)만을 방출함을 확인하였다. 대조적으로, DOX-NP는 24 시간에 걸쳐 DOX (66.0 %)의 더 빠른 방출을 보였다. 이는 DOX가 로딩된 PDOPA 도메인 상에 침착된 CaP가 DOX 방출에 대한확산 장벽으로서 작용하여, 세포 외 pH (pH 7.4)에서 DOX 방출을 지연 시켰음을 의미한다.

또한, DOX-CaP-NP는 종양 또는 엔도솜 산성 pH에 반응하여 DOX 방출을 유발할 수 있는 pH 조절 전달 시스템으로 이용될 수 있다. 도 3 (b)는 DOX-CaP-NP로부터의 DOX 방출이 pH에 의존함을 의미한다. pH 7.4에서는 DOX 방출이 지연된 반면, 약산성 pH (pH 6.4)에서는 DOX 방출이 촉진되었고, DOX 방출 속도는 세포 내 엔도솜 pH (pH 5.0)에서 24 시간 동안 72.1 %에 달하였다. 이는 CaP 미네랄이 pH 7.4에서는 고체 CaP 구조 내에서 DOX를 안정적으로 유지하는 반면, 엔도솜 산성 pH에서는 CaP 미네랄의 용해에 의해 DOX 방출이 촉진될 수 있음을 의미한다.

2-4. pH 조절에 따른 CaP 미네랄의 용해 확인

DOX가 적재된 PDOPA에 침착된 CaP 미네랄의 pH 의존적 용해 여부가 pH 조절 DOX 방출 동력학에 영향을 미치는 주요 요인인지를 확인하고자 하였다.

다양한 pH 범위에서 DOX-CaP-NP로부터의 Ca²+ 이온 방출을 모니터링 하여, CaP 용해 작용을 확인하였다. pH가 감소함에 따라 DOX-CaP-NPs로부터의 Ca²+ 이온 방출 속도가 증가함을 알 수 있다. CaP 분해 양상의 pH 의존성은 pH 의존성 Dox 방출 프로파일과 일치함을 알 수 있다. 하이드로늄 이온 농도에 비례하여 CaP의 수용해도가 증가하기 때문에, CaP 미네랄의 용해가 촉진될 것으로 예상할 수 있다. CaP 미네랄의 용해는 DOX 방출을 위한 확산 장벽을 제거하여, 결과적으로 약물 방출 속도를 향상시켰다.

따라서, CaP의 용해가 pH 조절 DOX 방출에서의 주된 요인에 해당함을 알 수 있다.

2-5.DOX-CaP-NP의 시험관 내 세포 독성 여부 확인

in vitro 조건에서, DOX가 없는 NP와 CaP-NP의 세포 독성을 SCC-7 세포를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 나노입자는 200㎍/mL 농도까지 유의성 있는 세포 독성을 나타내지 않았다. 도 4와 같이, DOX-CaP-NP는 자유(free) DOX (IC50 = 1.22㎍ / mL) 및 DOX-PM (IC50 = 2.59㎍ / mL)과 비교하여 비교적 낮은 독성 (IC50 = 6.59㎍ / mL) / mL)을 나타냄을 확인하였다.

세포핵 내에 자유 DOX가 빠르게 축적될 경우 높은 독성을 초래할 수 있다. 자유로운 DOX와 비교하여 DOX-NP의 독성이 낮게 나타난 것은 세포 내에서 DOX가 점진적으로 방출되었기 때문인 것으로 볼 수 있다. 유사하게, DOX-CaP-NP는 DOX-NP보다도 더욱 낮은 독성을 나타내었다. DOX-CaP-NP로부터의 DOX 방출은 엔도시토시스 후 및 산성 엔도솜 내 CaP 미네랄의 용해 후에 촉진된 것일 수 있다. 따라서, in vitro 실험을 통해 DOX-CaP-NP는 보다 낮은 독성을 나타내며, DOX-CaP-NP가 DOX를 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.

또한, DOX-CaP-NP는 혈액에서 약물 누출을 예방할 뿐만 아니라 세포 내에서 DOX를 방출 할 수 있는 가능성이 있으므로, DOX-CaP-NP는 DOX 및 DOX-NP의 보다 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다.

2-6. 세포 내 CaP 용해의 시각화

DOX-CaP-NP는 나노입자 코어 내에 침착된 CaP 미네랄이 이온으로 용해될 때에만 DOX를 효과적으로 방출할 수 있다. DOX-CaP-NP로부터 CaP 미네랄의 세포내 용해를 시각화하기 위해 칼슘 특이적 Rhod-2(Rhod-2/AM)의 막투과성 전구체를 사용했다. Rhod-2/AM은 세포 내에서 Rhod-2로 빠르게 전환되고, Ca²+ 이온과 특이적으로 결합하여 Rhod-2-Ca²+ 복합체를 형성하며, 이는 적색 형광을 나타낸다.

도 5와 같이, Rod-2/AM 및 DOX-free NP로 처리된 SCC-7 세포는 약한 적색 형광을 나타내었고, 세포 내에서 천연 Ca²+ 이온으로부터 유도되었다. 반면, DOX가 없는 CaP-NP로 처리된 세포는 전체 세포에 걸쳐 강한 적색 형광을 나타냈다. 이는 CaP 미네랄이 산성 엔도좀에 의해 용해되어 다량의 Ca²+ 이온이 생성됨을 의미한다.

2-7. DOX-CaP-NP의 세포 내 분포 확인

위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)으로 DOX-CaP-NP의 세포 독성과 세포내 국소화 양상을 관찰하였다. SCC-7 세포의 산성 구획을 녹색 형광성 LysoTracker로 표지 하고, 세포를 free DOX, DOX-NP 또는 DOX-CaP-NP와 함께 배양 하였다. 1 시간 동안 배양한 후, DOX로 처리 한 SCC-7 세포는 강력한 형광을 나타내어, DOX가 핵으로 상당량 축적되었음을 나타냈다 (도 6). 마찬가지로, DOX-NP를 처리한 경우에도 배양 1 시간 후 핵이 붉은 색으로 염색되어, 세포 배양 배지에서 DOX-NP로부터 DOX가 방출되었음을 알 수 있다. 한편, DOX-CaP-NP는 배양 1시간 후 적색 형광을 생성하고, LysoTracker로 표지된 엔도좀에 한하여 CaP 무기질화 코어 내에서 DOX를 보유하였다. 또한, 배양 5 시간 후, DOX에 의한 형광이 전체 세포 주위로 퍼지며, 핵 내의 DOX 축적이 관찰되었다. 이는 DOX-CaP-NP의 CaP 미네랄이 효과적으로 세포 증식 전의 DOX 방출을 억제하고, DOX 방출이 산성 조건 내에서 촉진되어 DOX를 핵으로 전달한다는 것을 나타낸다.

지금까지 생체 내 약물의 장기적인 순환을 위해서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 이용한 나노입자의 표면 개질이 널리 사용되었. 그러나 PEG 화 나노입자는 스텔스 효과(stealth effect)로 인해 in vitro에서 세포 섭취가 감소하는 것으로 나타났다. 결과적으로 생체 내 적용을 위해서는 PEG 표면 효과에 따른 세포 내 흡수와 나노입자의 스텔스 효과 사이의 균형이 중요하다.

본 실시예에서는 CaP 무기질화를 위한 나노 템플릿으로 PEG-DOPA 미셀을 활용하였다. 쉘 도메인의 PEG 사슬 밀도는 세포 흡수 및 스텔스 효과의 주된 결정 인자가 될 수 있다. 만약 PEG의 표면 밀도가 낮으면, 소수성 코어상의 일부분이 노출 될 수 있다. 나노입자가 노출된 코어 도메인을 가질 경우, 나노입자는 세포에 쉽게 흡수 될 수 있다. 세포 내 섭취 자료를 토대로, 셸 도메인에서 PEG의 표면 밀도를 조절하여 CaP-무기질화 코어의 일부가 노출되지 않도록 할 수 있다.

결과적으로, DOX-CaP-NP는 혈청 함유 용액에서 충분한 세포 흡수 및 구조 안정성을 나타내었으므로, DOX-CaP-NP가 세포 흡수와 단백질 흡착 사이의 균형을 만족할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. poly DOPA (poly(L-dihydroxyphenylalanine)) 및 비이온성 친수성 폴리머로 구성되는 공중합체; 인산칼슘; 및 약물을 포함하며,
   상기 공중합체의 poly DOPA 및 상기 인산칼슘이 코어부를 형성하고,
   상기 공중합체의 비이온성 친수성 폴리머가 쉘부를 형성하며,
   상기 코어부에 약물이 담지되어 있는, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 친수성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥사졸린, 폴리(N-비닐피롤 리돈), 폴리비닐알콜, 폴리히드록시에틸메타크릴에이트, 덱스트란 또는 메틸셀룰로스인 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 공중합체는 수용액 상에서 자기조립 (self-assembly) 되는 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 공중합체는 AB형 블록 공중합체 또는 그라프트 공중합체인 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항염증제, 항산화제 또는 이들의 조합인 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 약물은 골재생 유도형 화합물, 펩타이드, 단백질 약물 또는 이들의 조합인 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 약물은 피부 미백제, 피부 보습제, 피부 주름 개선제 또는 이들의 조합인 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자는 pH 4 내지 7에서 용해되는 것인, 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자.
   
9. 하기 단계를 포함하는 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자의 제조방법:
   비이온성의 친수성 폴리머 및 poly DOPA로 구성되는 공중합체 수용액; 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계(단계 1);
   상기 단계 1의 혼합액에 약물을 첨가하여 혼합하는 단계(단계 2); 및
   상기 단계 2의 혼합액에 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄) 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계(단계 3).
   
10. 제9항에 있어서, 상기 단계 3 이후에 하기 단계를 추가로 포함하는 제조방법:
    상기 단계 3의 반응액을 침전하여 생성물을 회수하는 단계(단계 4);
    상기 단계 4의 상층액을 삼투 교환시키는 단계(단계 5); 및
    상기 단계 5의 삼투 교환된 용액을 동결건조시키는 단계(단계 6).
    
11. 제9항에 있어서, 상기 단계 1의 공중합체 내 DOPA기와 염화칼슘의 몰비는 1:0.1 내지 1:1인 것인, 제조방법.
    
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 약물 담지 인산칼슘 복합 나노입자를 포함하는, 약물 전달체 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 암, 알츠하이머, 심혈관 질환, 류마티스 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료 용도로 사용하는 것인, 약물 전달체 조성물.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 주사제 형태인, 약물 전달체 조성물.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백, 피부 보습 또는 피부 주름개선 용도로 사용하는 것인, 약물 전달체 조성물.
    

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