CN116785230A - 一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用 - Google Patents
一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用，属于生物医药技术领域。本发明针对三阴性乳腺癌治疗出现的问题，基于核酸滚环转录技术构建核酸纳米水凝胶体系，结合基因治疗、改善肿瘤微环境、仿生矿化、饥饿治疗等联合治疗手段对三阴性乳腺癌细胞的增殖进行抑制，同时达到共传递增强药物的靶向性，有效降低药物对正常细胞组织所产生的毒副损伤的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用。
背景技术
当今生活中，肿瘤严重威胁人类健康和人类生命。恶性肿瘤因其独特的生物学行为，对患者机体会产生较多的影响和危害，例如：（1）恶性肿瘤细胞比较活跃，生长迅速，在生长过程中会对周围组织器官造成压迫，产生疼痛感；（2）恶性肿瘤容易对周围的血管产生浸润侵袭，引起肿瘤相关的出血风险；（3）随着恶性肿瘤的不断发展，还会通过血液循环系统等机体正常生理机能转移到其他脏器，形成晚期恶性肿瘤，严重威胁患者生命。科研工作者将具有特定功能的核酸分子称为功能核酸，功能核酸作为了基因治疗的主要研究和设计对象，在人体细胞内具有生物相容性好、排异反应小等优点，但是因裸露的功能性DNA或RNA序列片段，在人体的血液循环中很容易被酶破坏或者降解。因此，开发优良的运输功能核酸的运输载体，成为当今科研工作者的一大研究方向。
乳腺癌超越肺癌，成为全球最常见的癌症病理类型，其中在女性患者最为常见，然而，虽然乳腺癌发病率较高，其预后却相对较好。但是缺乏表达雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）的三阴性乳腺（TNBCs），是乳腺癌中的特殊一员，却极具侵袭性，且其预后状况极差，晚期患者仅有12.2%的5年生存率。现如今，三阴性乳腺癌患者的治疗手段相对来说比较局限，早期以手术治疗为主，但因其具有较高的复发率，通常还要在术前和术后进行化疗。然而化疗因其药物的毒性和作用机理，对机体的肝、肾、心、肺等器官具有一定的损伤，严重者会引起器官衰竭、危及生命。针对手术治疗和化疗存在的这些弊端，新型治疗手段的研究具有重要意义。当前，光动力、光热及基因等治疗方法成为当今科研工作者的研究热潮，其中各个疗法均有其无法取代的优点。单纯的治疗手段虽然也可以达到一定的治愈作用,但由于癌症病人数量和肿瘤复杂度的逐渐增加，也导致其达不到预想的治愈效果。因此，同时整合多种疗法——联合治疗（协同治疗），不但能够互补不同治疗手段之间优势，而且还可以提高肿瘤治疗的效果，所以具有非常重要的临床价值和科学意义。
现今，在肿瘤的诊治过程中，水凝胶已成为药物输送的一种重要载体。因为核酸作为生物内源性物质，其在人体细胞内的生物相容性好，排异反应小，所以受到研究者的广泛关注。磷酸钙（CaP）被认为是具有高生物相容性和pH响应性的无机药物/基因载体。RNA干扰（RNAi）是由短干扰RNA（siRNA）或微小RNA（microRNA）触发的内源性调节途径，通过激活RNAi，siRNA可以高效沉默任何基因的表达，特别是，RNAi提供了一种通过抑制与人类疾病相关的特定基因的表达来达到治疗疾病这一目的的工具，如癌症、病毒感染和遗传疾病，因此利用siRNA作为潜在药物的方法已经引起了极大的关注。MicroRNAs在调控基因表达和细胞命运中起着重要作用。RNA纳米花结构由于其本身简单的结构设计，优良的生物相容性以及可以转录出大量的与肿瘤诊疗相关的siRNA和microRNA片段这些优势，已经被广泛应用于生物医学等领域。单纯的核酸材料在体内循环中很容易被清除和降解，向体内递送RNA的方式有很多种，如脂质体递送、纳米花递送、质粒递送等，甚至有的递送体系还存在光响应触发，即在红外光的照射下释放siRNA和光敏剂，协同基因治疗和光动力治疗，增加对肿瘤的治疗效果。
发明内容
本发明以RNA纳米水凝胶为载体，结合基因疗法(Gene therapy)、饥饿治疗(Starvation therapy, ST)以及细胞原位矿化（Cell in situ mineralization）等方法联合治疗恶性肿瘤。
本发明的目的之一在于提供一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，所述纳米水凝胶的制备方法包括以下步骤：
（1）分别吸取浓度都为8-12 μM的序列如SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子各8-12 μL混合，调节使其成为浓度分别为4-6μM的水溶液，RCA聚合结束后样品进行冷藏并静置，后加入18-22 μL 8-12 μM的DNA-胆固醇，其中DNA序列如SEQ ID NO.3所示，缓慢冷却并冷藏静置，后洗涤上述产物；
（2）RNF-Chol@CAP的合成
将步骤（1）中获得的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris-HCl buffer中，使其浓度为0.2-0.3 μM；将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按4-6:2-4体积比混合均匀，冷藏放置一段时间，再加入与NaH2PO4溶液等体积的4-6 mM的CaCl2溶液，并冷藏静置；
（3）RNF-Chol@CAPX的合成
步骤（2）中所得溶液40-44 μL离心去除上清液后，分散到135-145 μL 18-22 μM序列如SEQ ID NO.4所示的LXL-aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。
优选地，所述步骤（1）中RCA的聚合过程如下：95 ℃加热5 min，然后以0.3 ℃ /min 的梯度缓慢冷却至25 ℃，随后加入3 μL H2O，3 μL 10×T4 Ligase buffer和4 μL T4Ligase，充分震荡均匀后16 ℃反应12 h，隔夜后在65 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至25℃，将T4 Ligase灭活后，在反应体系中加5 μL 10×T7 Polymerase buffer，5 μL rNTPs，7μL H2O和3 μL T7 Polymerase，充分震荡混合均匀后，37 ℃ 孵育8 h。
更优选地，所述步骤（1）中SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ IDNO.2所示的T7启动子的浓度都为10μM，体积都为10μL，所述DNA-胆固醇的体积为20μL，浓度为10 μM。
更优选地，所述步骤（2）中步骤（1）中的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris-HClbuffer中，使其浓度为20 μM，将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按5:3体积比混合均匀，CaCl2溶液的浓度为4-6 mM。
更优选地，所述步骤（3）中步骤（2）中所得溶液154 μL离心去除上清液后，分散到140 μL 20 μM序列如SEQ ID NO.4所示的LXL-aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。
本发明的目的之二在于提供上述基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
更优选地，所述药物中基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶为唯一组分。
更优选地，所述药物为注射剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明针对三阴性乳腺癌治疗出现的问题，基于核酸滚环转录技术构建核酸纳米水凝胶体系，结合基因治疗、改善肿瘤微环境、仿生矿化、饥饿治疗等联合治疗手段对三阴性乳腺癌细胞的增殖进行抑制，同时达到共传递增强药物的靶向性，有效降低药物对正常细胞组织所产生的毒副损伤的目的。
附图说明
图1中（a）为基于RCT反应的RNF-Chol@CAPX纳米粒子的合成路线图；（b）为联合基因沉默和细胞表面矿化的调节机制示意图。
图2为实施例1中RNF-Chol@CAPX合成过程中多个中间产物的检测结果，其中（a），（b），（c）分别为RNF、RNF-Chol、RNF-Chol@CAPX的TEM图；（d），（e），（f）分别为RNF、RNF-Chol、RNF-Chol@CAPX的粒径图；（g）不同样品的Zeta电位图。
图3为实施例1中RNF-Chol@CAPX的肿瘤细胞靶向能力表征结果，其中（a）为细胞与RNF-Chol@CAPX共孵育0.5 h后的CLSM图像（比例尺：50 μm）；（b）为流式细胞术分析不同细胞0.5 h后对RNF-Chol@CAPX的摄取情况。
图4 为实施例1中RNF-Chol@CAPX的肿瘤细胞靶向能力表征结果，其中（a）为细胞与RNF-Chol@CAPX共孵育3 h后的CLSM图像（比例尺：50 μm）；（b）为流式细胞术分析不同细胞3 h后对RNF-Chol@CAPX的摄取情况。
图5为实施例1中细胞毒性试验结果，其中（a）为FA+RNF-Chol@CAPX处理后不同细胞的细胞存活率；（b），（c）为随着时间变化，样品对MDA-MB-231细胞的毒性；（d），（e），（f）为不同浓度的RNF-Chol、RNF-Chol@CAPX和FA+RNF-Chol@CAPX分别孵育MDA-MB-231、A549和L02细胞36 h后的细胞存活率。
图6 为实施例1中通过流式细胞术分析不同样品诱导MDA-MB-231细胞的凋亡情况，其中（a）样品浓度为100 nM；（b）样品浓度为300 nM。
图7为实施例1中荧光倒置显微镜拍摄MDA-MB-231细胞矿化前后的细胞形态变化图，其中（a）为矿化前，（b）为矿化后。
图8为实施例1中激光共聚焦拍摄细胞的矿化结果图，其中（a）MDA-MB-231@CaP；（b）是表面叶酸受体（FR）表达较少但经过相同矿化处理的 A549细胞的 CLSM 图像（比例尺：20 μm）。从左到右依次是明场，蓝色的是Hoechst 33342标记的细胞的核荧光信号，红色的是PKH26标记的细胞膜的荧光信号，绿色的是钙黄绿素标记的钙化层的荧光信号以及这四个的叠加图。
图9为实施例1中MDA-MB-231荷瘤小鼠的活体荧光图。
图10为实施例1中小鼠治疗阶段的规划示意图。
图11为实施例1四组小鼠肿瘤变化情况，其中（a）治疗周期内小鼠肿瘤体积生长曲线；（b）治疗周期内小鼠体重变化曲线；（c）不同实验组治疗前后小鼠肿瘤实体状态图；（d）不同实验组离体肿瘤对比；（e）瘤重及（f）体内抑瘤效率。
实施方式
实施例
1.实验部分
1.1试剂
表1 实验所用的DNA序列
| 名称 | 序列( 5’→3’) |
| ssDNA（SEQ ID NO.1） | 5’-PO4-ATA GTG AGT CGT ATT ATAA AAT CTT CCT GCC CAC CTTTCA CCA TTG CTA AAG TGC AAT TAAG GTG GGC AGG AAG ATT TTAATC TAA ATG TGG TGG TTG TGA TCC TAA AAATC CCT-3’ |
| T7 promotor（SEQ IDNO.2） | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA T-3’ |
| FAM-DNA-Chol（SEQ IDNO.3） | 5’-FAM-C TAA ATG TGG TGG TTG TGA TCC TAA-Chol-3’ |
| LXL-aptamer（SEQ IDNO.4） | 5’-GAA TTC AGT CGG ACA GCG AAG TAG TTT TCC TTC TAA CCT AAG AAC CCG CGG CAG TTT AAT GTA GAT GGA CGA A-3’ |
| Cy5.5-DNA-Chol（SEQID NO.5） | 5’-Cy5.5-C TAA ATG TGG TGG TTG TGA TCC TAA-Chol-3’ |
| micRNA367（SEQ IDNO.6） | 5’-AAUU GCA CUU UAG CAA UGG UGA-3’ |
| siRNA（SEQ ID NO.7） | 5’-UAAAAUCUUCCUGCCCACCdTdT-3’ |
注：红色序列：标记序列为T7启动子的互补序列；标记序列为沉默CXCR4表达的小干扰RNA序列及其互补序列；标记序列为任意序列，目的是结合FAM荧光和胆固醇；标记序列为干扰RYR3蛋白表达的micRNA367互补序列。
表2 实验所用试剂
| 试剂名称 | 化学式 | 生产厂家 |
| 氯化钙 | CaCl2 | 麦克林生化科技（上海）有限公司 |
| 磷酸氢二钠 | NaH2PO4 | 麦克林生化科技（上海）有限公司 |
| 氢氧化钠 | NaOH | 麦克林生化科技（上海）有限公司 |
| 三羟甲基氨基甲烷 | Tris | 阿拉丁试剂(上海)有限公司 |
| T4 连接酶 | T4 Ligase | 德国 Thermo scientific |
| T7 聚合酶 | T7 Polymerase | New England Biolabs 公司 |
| rNTPs混合液 | rNTPs | New England Biolabs 公司 |
| Cell Count Kit-8 试剂盒 | CCK-8 | 美国 CutoFLEX |
| Hoechst 33342 | Hoechst 33342 | 阿拉丁试剂(上海)有限公司 |
| 凋亡试剂盒 | 凋亡试剂盒 | 日本 DOJINDO |
注：实验所用试剂均为分析纯，实验中所用水均为二次去离子水。所有试验中使用的FA都为叶酸。
1.2仪器
表3 实验所用仪器
| 仪器名称 | 设备信息 | 条件/项目 |
| PCR 基因扩增仪 | TC-96/G/H(b)A, Bioer | RNA扩增 |
| 纳米电位粒度分析仪 | NaNo-ZS90，Malvern | 粒径、电位测试 |
| 流式细胞仪 | CutoFLEX，BackCoulter，USA | 细胞毒性分析、细胞摄取分析 |
| 透射电子显微镜 | TEM-2100EX，JEOL | 形貌分析 |
| 激光共聚焦扫描显微镜 | Leica TCS SP8 | 细胞成像分析 |
| 酶标仪 | Epoch 2，BioTek，USA | 细胞毒性测试 |
| 动物三维多模态成像系统 | IVIS SpectrumCT，PerkinElmer，USA | 药物活体追踪 |
| 荧光倒置显微镜 | Nikon，Ti-U | 化学发光成像 |
1.3 RNF-Chol的合成
实验所用的RNA纳米花水凝胶载体是通过RCT方式扩增的，其合成步骤如下：首先，分别吸取提前配置好的等量等浓度（10 μM）的转录模板单链DNA（ssDNA SEQ ID NO.1）和T7启动子（SEQ ID NO.2）各10 μL混合于200 μL PCR管中，调节使其成为ssDNA和T7启动子的浓终度都为5 μM的水溶液，使用PCR基因扩增仪95 ℃加热5 min，然后以0.3 ℃ / min的梯度缓慢冷却至25 ℃，随后加入3 μL H2O，3 μL 10×T4 Ligase buffer和4 μL T4 Ligase，充分震荡均匀后在16 ℃条件下反应12 h，其目的是将ssDNA和T7启动子互补结合后，形成的圆环DNA末端的切口闭合。隔夜后，在65 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至25 ℃。在将T4Ligase灭活后，在反应体系中加5 μL 10×T7 Polymerase buffer，5 μL rNTPs，7 μL H2O和3 μL T7 Polymerase，充分震荡混合均匀后，在37 ℃ 烘箱的摇床中孵育8 h。聚合结束后迅速将样品拿到在4 ℃冰箱，静置12 h后，加入20 μL羧基荧光素（FAM-DNA-胆固醇（Chol） SEQ ID NO.3）（10 μM），95 ℃加热5 min，以0.3 ℃/min 的梯度缓慢冷却至25 ℃后，立即静置于4 ℃冰箱过夜。过夜后，将上述产物在转速为8000 rpm，时间为5 min的条件下离心洗涤3次，并最终分散于水溶液中，置于4 ℃冰箱储存备用。
1.4 RNF-Chol@CAP的合成
将上述所得样品分散到Tris-HCl buffer (20 mM pH=9.0)里面，使其浓度为286nM；将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按5:3体积混合均匀，4 ℃放置一段时间，在缓慢加入与NaH2PO4溶液等体积的5 mM的CaCl2溶液，并置于4 ℃冰箱静置一夜。
1.5 RNF-Chol@CAPX的合成
将上述所得溶液154 μL于8000 rpm下离心5 min，去除上清液后，分散到140 μL20 μM的LXL-aptamer（SEQ ID NO.4）水溶液中，LXL-aptamer在Ca2+带正电荷的作用下，与前者相结合，在4 ℃放置一段时间，即得到最终样品。
1.6材料的表征
通过RCT编码模板 DNA制备RNA纳米花水凝胶。本文设计了含有编码micRNA-367（SEQ ID NO.6）和siRNA的单链模板DNA（ssDNA），用于制备RNA纳米花水凝胶。其中micRNA-367用于调节RYR3钙离子通道蛋白的表达，影响细胞内的钙离子浓度，在基因层面上促进细胞的钙化反应；siRNA（SEQ ID NO.7）用于干扰CXCR4蛋白的表达，从而抑制细胞的增殖与转移；叶酸为指导磷酸钙沉积到细胞膜表面提供羧基；磷酸钙提供钙源。利用PCR基因扩增仪通过RCT反应生成纳米粒子后，我们对其进行了透射电子显微镜拍摄，并对最终纳米粒子进行了相同表征。利用纳米电位粒度分析仪对其进行了粒径和电位的分析，其纳米粒子浓度为10 nM。
1.7细胞培养
在本方案实验过程中所用到的肿瘤细胞分别是人源三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人非小型肺癌细胞（A549）；所用到的正常细胞是人正常的肝细胞（L02）。其中，培养细胞所用到的培养基为含有牛血清（FBS）和双抗（P/S）的DMEM培养基。细胞培养箱条件为：温度为37 ℃，CO2浓度为5%。
细胞培养基的配制与保存：将500 mL DMEM培养基与50 mL FBS和5 mL P/S混匀，并用封口膜缠紧后储存于4 ℃冰箱备用。
细胞传代培养：将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，并在显微镜下观察，当细胞状态较好且增殖扩散到培养皿的80% - 90%时可以对细胞进行传代操作。操作步骤如下：将细胞培养瓶从细胞培养箱内取出，用75%酒精喷拭后放入提前用紫外灯灭好菌的超净台中，倒掉细胞培养瓶中的培养液并用1×磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 M）冲洗，目的是清洗掉培养瓶中多余的培养液以及状态不好的细胞，为下一步胰酶消化打好基础，随后加入1 mL胰酶（TE）来消化贴壁细胞并放入细胞培养箱中孵育1-2 min，使其变成游离状态，然后加入5 mL含有FBS和P/S的DMEM培养液，终止胰酶的消化过程，并将含有细胞的培养液收集到15 mL离心管中，在25 ℃下，以800 rpm，3 min的条件进行离心。结束离心后，小心倒掉上层包含细胞碎片的上清液，贴壁加入1 mL培养液并轻轻吹打，使细胞混合均匀，接下来可综合根据细胞状态、活性及实验需求等因素，吸取适当的细胞悬浮液转移到新的细胞培养瓶中进行传代培养。
1.8激光共聚焦实验
在激光共聚焦实验中，拍摄细胞所用的培养皿为玻底培养皿，其直径为30 mm。首先向每个玻底培养皿中加入1 mL细胞悬液，其中悬液包含有2×104个MDA-MB-231细胞，随后将其放入细胞培养箱中孵育10-12 h使其贴壁。在显微镜下观察到细胞显示出良好的细胞形态后，分别加入等量7.14 nM的RNF-Chol@CAPX纳米粒子，并分别孵育30 min和3 h。然后用pH为7.4的1×PBS缓慢冲洗细胞以去除RNF-Chol@CAPX纳米粒子，并更换新的细胞培养液。接下来在玻底培养皿中分别加入1 µL Hoechst 33342（10 mg/mL）细胞核染液，并将其放置培养箱中避光孵育30 min，其目的是对细胞进行标定。待孵育时间结束后，用1×PBS缓慢清洗细胞3次，并根据细胞状态选择加入1 mL的1×PBS缓冲溶液或不含有FBS和P/S的纯DMEM培养基以维持细胞形态，并立即对细胞进行激光共聚焦扫描成像，其中RNF-Chol@CAPX所用的荧光染料是FAM，其在488 nm的激光激发下发出绿色荧光，其荧光发射为500 nm -650 nm。
1.9细胞毒性分析
测试RNA纳米花水凝胶载体（RNF）的细胞毒性。本实验分别设置空白组，对照组和实验组，其中每组实验分别设置5个平行组，首先在96孔板中每孔添加100 µL含有20000个MDA-MB-231细胞的细胞悬液，并在加了细胞孔的四周各加入100 µL 1×PBS缓冲溶液，提供给细胞生长所需要的湿度，然后将96孔板置于37 ℃的恒温细胞培养箱中孵育10 h-12 h，待细胞贴壁后，再分别对其进行以下不同条件的处理：
首先，测试相同浓度，药物孵育不同时间对MDA-MB-231细胞所产生的细胞毒性：取相同浓度（600µg/mL）的FA 50µL孵育细胞30min，然后去除含有FA的培养液，重新更换新的培养液（添加量为100µL），并加入RNF-Chol@CAPX，添加RNF-Chol纳米粒子、RNF-Chol@CAPX的细胞并不经FA孵育，分别测试不同浓度的RNF-Chol纳米粒子、RNF-Chol@CAPX和FA（终浓度300µg/mL）+RNF-Chol@CAPX在36 h下对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，各组实验中RNF 纳米花水凝胶粒子的最终浓度分别为100 nM、150 nM、200 nM、250 nM、300 nM。当药物与细胞共孵育36 h后，吸出每个孔中的培养液以控制药物和细胞的孵育时间。然后将CCK-8溶液用细胞培养液稀释10倍后，向每个实验组以及对照组孔中加入100 µL混合溶液，并在空白组孔中加90 µL细胞培养液。在培养箱中避光孵育30min - 40 min后，接下来使用酶标仪对其进行吸光度检测，最后导出数据并进行细胞存活率计算（Cell viability（B：空白组；P：对照组 S：实验组））。
用上述同种方法分别检测RNF-Chol纳米粒子、RNF-Chol@CAPX、FA+RNF-Chol@CAPX与L02细胞和A549细胞孵育36 h后的细胞毒性。
1.10细胞凋亡实验
将含有105个MDA-MB-231细胞的细胞悬液接种于6孔板中，每孔2 mL，接下来将其放入37 ℃的恒温细胞培养箱中孵育10 h-12 h。待细胞贴壁后，加入同上述细胞毒性浓度相同的FA（1ml 600µg/mL）继续孵育30 min，然后去除含有FA的培养液并更换新的细胞培养液（2ml），加入RNF-Chol@CAPX（终浓度为300 nM），后将细胞置于培养箱中孵育36 h。然后，胰酶消化并分别收集每个孔中的细胞，用1×PBS 缓冲液洗涤3次后，加入AnnexinV-FITC/PI后，在37 ℃下避光孵育染色15 min。最后，对3万个细胞的荧光信号进行收集，并逐个分析每个实验组MDA-MB-231细胞的凋亡情况。
1.11流式细胞实验
将MDA-MB-231 细胞以每个孔2ml 105个细胞的浓度接种于6孔板中，随后放入细胞培养箱中孵育10 h-12 h。待细胞贴壁后，加入RNF-Chol@CAPX（终浓度为7.14 nM）后将细胞置于培养箱中孵育30 min和3 h。随后，胰酶消化并收集细胞，用1×PBS缓冲液洗涤3次后，对1万个细胞的荧光信号进行收集，并分析实验组细胞对药物的摄取情况。
1.12细胞矿化形态表征
在荧光倒置显微镜实验中，拍摄细胞所用的培养皿为玻底培养皿，其直径为30mm。首先向每个小培养皿中加入1 mL 细胞悬液，其中包含2×104个MDA-MB-231细胞，并在培养箱中孵育10-12 h，使其贴壁，并显示出良好的细胞形态。孵育结束后，向实验组加入500µL 600 µg/mL的FA继续孵育30 min，然后更换细胞培养液（添加量为1ml），加入RNF-Chol@CAPX（终浓度为300 nM）后将细胞置于培养箱中孵育30 min。孵育到一定时间后去除培养液并用1×PBS 缓冲液轻轻缓慢冲洗细胞2次，最后加入1 mL的1×PBS缓冲溶液后，立即用荧光倒置显微镜进行细胞形态拍摄，并观察实验组细胞与对照组细胞（对照组未加入FA、RNF-Chol@CAPX孵育的，仅用培养液培养后，去除培养液，加入1 ml 1×PBS缓冲液后进行拍摄）的形态差异。
1.13细胞表面矿化层拍摄
在此实验中，拍摄细胞所用的培养皿为玻底培养皿，其直径为30 mm。首先向每个玻底培养皿中加入1 mL细胞悬液，其中悬液包含有2×104个MDA-MB-231细胞，随后将其放入细胞培养箱中孵育10 h-12 h使其贴壁，并显示出良好的细胞形态。接下来加入1 µLHoechst 33342（10 mg/mL）细胞核染液，混合均匀，放置培养箱中避光孵育20 min，以实现对细胞的标定，待孵育时间结束后，用1×PBS冲洗细胞2次，然后用PKH26细胞膜试剂盒标记细胞膜，避光孵育2 min后，先用含有FBS的培养液洗涤细胞2次，再用1×PBS缓冲溶液缓慢清洗细胞2次，取500 µL浓度为600 μg/mL的FA和500 µL培养液混合孵育30 min，结束后加入RNF-Chol@CAPX纳米粒子（终浓度为300 nM）（合成时使用不修饰FAM荧光的DNA链，避免和后续的钙离子染料相干扰），并孵育30 min-60 min。孵育到一定时间后1×PBS缓冲溶液缓慢清洗细胞3次。最后加入1 mL 的1×PBS缓冲溶液立即进行激光共聚焦扫描成像，其中钙离子所用的荧光指示剂是钙黄绿素，其激发波长为495 nm，荧光发射为515 nm。
1.14小鼠实验
实验所用小鼠类型：雌性免疫缺陷型小鼠（BALB/c Nude，鼠龄4周），购自ShanghaiBioray Biotechnology。荷瘤小鼠模型制备前的准备工作：首先取预先冻存的MDA-MB-231细胞进行复苏并大量培养。当观察到细胞呈对数生长期时且细胞代数在三代左右时，开始对MDA-MB-231细胞进行收集并分散于1×PBS中成为细胞悬液，使其浓度为1×106个 mL-1。
荷瘤小鼠模型的制备：将上述细胞悬液在小鼠的右后肢位置进行皮下注射，注射体积为100 µL，建立带有异种移植肿瘤的MDA-MB-231荷瘤小鼠模型。在注射细胞后，每天观察肿瘤是否种植成功，当肿瘤开始生长后，每天对小鼠的体重以及肿瘤的长（Ltumor）、宽（Wtumor）进行测量，并按照相关公式对小鼠肿瘤体积（Vtumor）进行计算（Vtumor=Ltumor×W2 tumor÷2），当小鼠肿瘤体积达到100±10 mm3 时，开始对荷瘤小鼠进行给药治疗。小鼠分组为：对照组（PBS）、RNA纳米花水凝胶载体组（RNF-Chol）、矿化RNA纳米花水凝胶组（RNF-Chol@CAPX）以及叶酸+矿化RNA纳米花水凝胶（FA+RNF-Chol@CAPX）。以上动物实验均根据动物实验管理条例的相关规定进行。
1.15体内荧光成像及抑瘤实验
对照组：注射 PBS；实验组1：注射RNA纳米花水凝胶载体（RNF-Chol）；实验组2：注射矿化RNA纳米花水凝胶（RNF-Chol@CAPX）；实验组3：先瘤旁注射叶酸，半个小时待叶酸富集到肿瘤细胞表面后，再注射矿化RNA纳米花水凝胶（FA+RNF-Chol@CAPX），药物治疗过程中FA的注射浓度为1 mg/mL，注射剂量为100 μL，RNF-Chol和RNF-Chol@CAPX 的注射浓度都为1 mg/mL，注射剂量都为100 μL，实验周期为14 d，在实验周期的第1、3、5、7、9、11、13 d分别对小鼠进行PBS和纳米药物注射一次，每次对小鼠进行治疗所注射的药物均为100 µL。在治疗的第1 d、第7 d以及第14 d对小鼠活体进行拍照记录。实验期间，采用小型动物体内三维多模态成像系统对小鼠活体内的荧光进行成像，探究其各部位的荧光强度分布情况。待小鼠实验治疗周期治疗之后，采用CO2将其处死，并对所有实验用鼠进行解剖，将其心，肝，脾，肺和肾等组织完整地取出并保存于组织固定液中，以便后续进行组织脱水、组织包埋和组织切片等实验操作。接下来为探究治疗药物对小鼠主要组织器官的毒副损伤情况，通过苏木精和伊红（H&E）进行组织染色后，用荧光倒置显微镜进行成像拍摄，观察组织细胞状态。
2.结果与讨论
2.1实验原理
如图1（a）所示，模板DNA链（ssDNA）中包含micRNA 367反义互补序列和与抑制CXCR4表达相关的siRNA相关序列，RNA纳米花水凝胶载体通RCT合成，然后加载一条一端结合FAM荧光，一端结合胆固醇的任意序列，利用胆固醇的疏水作用，对转录出的RNA长链进行压缩，调节纳米水凝胶的粒径大小。碱基上的磷酸根会根据静电吸引吸附水中的钙离子，指导磷酸钙沉积到纳米花外面，最后添加LXL适配体，合成最终的纳米颗粒。如图1（b）所示，当纳米颗粒靠近肿瘤细胞时，其表面的LXL适配体会结合肿瘤细胞表面受体，然后通过胞吞作用进入细胞，纳米粒子在肿瘤微酸性环境中，外面的磷酸钙外壳会分解，释放钙离子和磷酸根离子，纳米花中的RNA序列，会在细胞内源性Dicer酶的剪切下，释放micRNA367和siRNA片段。其中转录出来的micRNA 367序列负责干扰乳腺癌细胞内RYR3蛋白的表达水平，RYR3是钙离子通道蛋白，RYR3蛋白被下调后，乳腺癌细胞的生长和迁移受到明显抑制。因为钙离子是细胞的第二信使，乳腺癌细胞内钙离子浓度的升高，会引起一系列细胞生物学的变化，可能参与乳腺癌细胞的钙化过程；siRNA会干扰细胞趋化因子受体-4（CXCR4）的表达，进而抑制细胞的增殖和转移；磷酸钙所分解出的Ca2+和PO4 2-，在提前注射叶酸的情况下，FA会和肿瘤细胞表面的FR结合，FA所带的两个-COOH，会结合游离Ca2+，进而指导磷酸钙沉积到肿瘤细胞表面，在肿瘤细胞表面形成一层钙化层，阻止血液中的营养物质进入肿瘤细胞，从而达到饥饿治疗的目的。本课题通过改善肿瘤微环境、基因治疗和饥饿治疗协同治疗，共同杀死肿瘤细胞。
其中，磷酸钙的目的是：（1）使纳米药物可以将Ca2+ 带入到肿瘤微环境中，提升肿瘤细胞内外的Ca2+ 浓度，细胞内的Ca2+ 可以引起线粒体应激，增加钙网蛋白（CRT）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、三磷酸腺苷（ATP）等细胞“吃我”信号的释放，引起机体的免疫反应；细胞外的Ca2+ 可以在后续添加叶酸的情况下，对肿瘤细胞进行原位矿化，切断肿瘤细胞的营养供给，来达到饥饿治疗的效果；（2）改善RNA纳米水凝胶表面的电负性，增强细胞摄取能力；（3）保护siRNA和microRNA-367的递送。
2.2 RNF-Chol@CAPX等纳米粒子的表征
RNF-Chol 纳米粒子通过RCT反应备，RNF-Chol@CAP采用氯化钙和磷酸氢二钠生成的磷酸钙和RNF-Chol通过静电吸引制得；RNF-Chol@CAPX通过RNF-Chol@CAP和LXL溶液的静电吸附制得。如透射电子显微镜（TEM）图2（a）所示，未经胆固醇压缩的RNF呈现花状；经过胆固醇压缩的RNF（RNF-Chol）如图2（b）所示，负载磷酸钙和适配体的RNF-Chol（RNF-Chol@CAPX）如图2（c）所示。如图2（d），（e），（f）所示，结合纳米电位粒度分析仪进行了粒径和电位表征，可看出RNF的粒径在1280 nm左右；RNF-Chol的粒径在200 nm左右；RNF-Chol@CAPX的粒径在250 nm左右。电位表征如图2（g）所示，首先RNF-Chol是转录出的一条RNA长链，显示负电，在表面结合一层磷酸钙后（RNF-Chol@CAP），会中和掉RNF-Chol的一部分负电性，在RNF-Chol@CAP与LXL适配体结合后，因LXL适配体为DNA，显示负电性，所以电位会再次降低一些。
2.3 RNF-Chol@CAPX的靶向递送能力
RNA纳米花水凝胶载体本质是核酸材料，在人体内具有良好的生物相容性。以A549细胞作为对照组，靶向MDA-MB-231细胞为实验组，对细胞摄取合成的最终纳米粒子的情况进行表征。在合成的RNA纳米花时的自组装过程中的辅链上修饰了FAM荧光染料，并且在激光共聚焦拍摄成像之前先对细胞核进行了标定。其中，发蓝色荧光的是经405 nm激光进行激发的细胞核，发绿色荧光的是经488 nm激光进行激发的RNF-Chol@CAPX中的FAM荧光集团。
如图3（a）所示，首先，RNF-Chol@CAPX与MDA-MB-231细胞孵育30 min，然后经Hoechst 33342染色处理，我们可以看到细胞核和细胞摄取药物后的细胞质有明显区别，说明药物已经被细胞成功内化入细胞质中，这表明我们所制备的负载磷酸钙的水凝胶是一种良好的药物载体。此外，还探索了孵育时间的长短对药物传递量的影响。如图4（a）所示，我们可以看到当孵育时间为3 h时，RNF-Chol@CAPX中FAM所产生的绿色荧光信号强度变强，说明随着孵育时间的延长，RNF-Chol@CAPX被细胞内化的量逐渐增多。
另外，我们结合流式细胞仪共同探索了细胞对RNF-Chol@CAPX的摄取情况，从收集到的图可以看出，在0.5 h时，靶向细胞荧光信号发生了稍微右移，表明细胞内已经积累有RNF-Chol@CAPX的绿色荧光，而非靶向细胞几乎没有摄入，所以其荧光信号基本不发生偏移，如图3（b）所示；3 h时，靶向细胞的荧光信号发生了明显右移，表明细胞内积累有大量RNF-Chol@CAPX的绿色荧光，而非靶向细胞摄入的较少，荧光信号发生稍微偏移，如图4（b）所示。
2.4细胞内治疗作用
细胞毒性分析：此外，本发明还进行了细胞毒性实验，以确定RNF-Chol@CAPX是否可以作为一种有效的抗肿瘤药物。在RNF-Chol@CAPX对MDA-MB-231细胞检测过程中，通常采用CCK-8法检测其细胞毒性。首先我们测试了相同浓度对不同细胞的毒性，如图5（a）所示，结果证实纳米颗粒对目标细胞的毒性较高，对正常细胞和非目标细胞的生物相容性较好；其次我们测试了孵育时间对MDA-MB-231 细胞的杀伤情况，如图5（b），（c）所示，当纳米颗粒与细胞孵育36 h时，对细胞的杀伤作用较强；最后我们测试了不同浓度的药物载体RNF-Chol、RNF-Chol@CAPX和FA+RNF-Chol@CAPX分别对MDA-MB-231细胞、A549细胞和L02细胞的杀伤作用，结果证实纳米载体RNF-Chol具有较低的细胞毒性，对机体损伤小。同时还探索了单独RNF-Chol@CAPX的细胞毒性，如图5（d）、（e）、（f）所示，发现当浓度达到200 nM，孵育时间达到36 h时，细胞存活率达到90%左右，此现象说明药物的生物相容性很好，此外，我们还探索了加入叶酸半个小时后，再加药物RNF-Chol@CAPX的细胞毒性，发现当药物浓度到达300 nM时，其对肿瘤细胞的杀伤性较高，细胞存活率仅有20%左右。
流式细胞仪进行细胞凋亡实验:为了进一步验证FA+RNF-Chol@CAPX的组合治疗效果，我们使用流式细胞仪对其进行了细胞凋亡检测，将MDA-MB-231细胞先与FA孵育30 min后，去除旧的培养液，更换新的培养液后加入RNF-Chol@CAPX孵育36 h。如图6（a）所示，当所用纳米颗粒浓度为100 nM时，FA+RNF-Chol@CAPX的细胞凋亡率仅有22%左右；如图6（b）所示，当所用纳米颗粒浓度为300 nM时，FA+RNF-Chol@CAPX 可使MDA-MB-231细胞的凋亡率提高到70%左右。
2.5细胞外矿化效果
荧光倒置显微镜拍摄细胞矿化情况：利用荧光倒置显微镜观察和分析了未经矿化处理的MDA-MB-231细胞和经过矿化处理的MDA-MB-231@CaP细胞的形态。由图7（a）可以看出，未经处理MDA-MB-231细胞呈现出黏附细胞的典型形态，大多数细胞都能很好地延展到培养皿的表面，并可以牢牢附着在细胞培养皿的皿底，除此之外，可以清楚地观察到细胞伪足的存在，这说明细胞生长状态良好。由图7（b）所示，MDA-MB-231@CaP细胞的荧光倒置显微镜图像中可以看出，经过原位靶向矿化处理后，大多数MDA-MB-231@CaP细胞呈圆形，与典型的黏附细胞有显著差异，更重要的是，在图中看不到细胞伪足的存在，这些结果表明，CaP在细胞表面的沉积的产生对MDA-MB-231细胞的正常生理形态、黏附和增殖有重要影响。
激光共聚焦拍摄细胞的矿化情况：为了检测磷酸钙在细胞膜表面的沉积情况，对其进行了激光共聚焦扫描拍摄。图8（a）MDA-MB-231@CaP和（b）是细胞膜表面FR表达较少但经过相同矿化处理的A549细胞的激光共聚焦图像，从左到右依次是明场，细胞核是蓝色荧光，PKH26标记的细胞膜是红色荧光，钙黄绿素标记的钙化层是绿色荧光，以及这四个的叠加图。如图8（b）所示，从激光共聚焦图像可知，在细胞膜表面FR表达较少的A549细胞上无法检测到CaP的存在。然而，如图8（a）所示，在MDA-MB-231@CaP组中可以清晰地看到钙的强绿色信号。除此之外，如图8（a）所示，红色的细胞膜信号与绿色的钙离子信号
实现了很好的重叠，说明CaP与细胞膜是在同一位置的，这些结果表明CaP成功地靶向并沉积矿化到MDA-MB-231细胞的细胞膜表面上。
2.6活体治疗效果分析
通过对活体MDA-MB-231荷瘤小鼠进行荧光成像，跟踪评价注射RNF-Chol@CAPX（Cy5.5-DNA-Chol）在肿瘤组织部位积累及其荧光强度的变化。如图9所示，可以看到注射4h时，由于LXL-aptamer的靶向作用，药物已经实现在肿瘤部位的富集，并在注射后10 h时，肿瘤处的RNF-Chol@CAPX荧光强度达到最高，之后RNF-Chol@CAPX在肿瘤中的荧光信号强度随着时间的推移，该区域逐渐减弱，48 h后几乎消失，说明RNF-Chol@CAPX在小鼠体内具有良好的代谢能力。接下来，评估了RNF-Chol@CAPX等实验组的体内治疗效果。小鼠治疗阶段的规划示意图，如图10所示，在这一治疗过程中，每天对小鼠的体重进行称量和对其肿瘤体积进行了详细的测量记录，并观察其变化规律。
如图 11（a）所示，在注射了PBS的对照组小鼠中，肿瘤体积随着时间的推移显著增加，而FA+RNF-Chol@CAPX组的肿瘤体积要明显的比前面三组小，另外，由肿瘤的生长曲线知，其肿瘤的生长速度是所有实验组中生长速度最慢的，说明该实验组对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。如图11（c），（d）所示，可以看出FA+RNF-Chol@CAPX联合治疗对肿瘤的生长有明显的抑制能力，从治疗前后的小鼠活体对比可以看出，从实验开始，FA+RNF-Chol@CAPX组的肿瘤体积变化较小，FA+RNF-Chol@CAPX组表现出良好的抗癌效果。此外，如图11（b）所示，在整个治疗过程期间小鼠的体重基本保持稳定，说明合成的药物具有较好的生物相容性，不会对小鼠机体造成损伤，11（e）为瘤重，11（f）为体内抑瘤效率。以下结果表明，本实验方案所构建的FA+RNF-Chol@CAPX纳米平台，可以有效抑制MDA-MB-231肿瘤细胞的生长增殖，并且不会对小鼠的机体产生副作用。
我们开发了一种以磷酸钙包裹的RNA纳米水凝胶，通过加载的LXL-aptamer精准靶向MDA-MB-231肿瘤细胞，实现精确治疗，在到达肿瘤细胞组织后，外面的磷酸钙外壳会分解，释放钙离子和磷酸根离子，然后在叶酸的两个羧基的指导下，使磷酸钙沉积到叶酸受体过表达的癌细胞的表面，形成一层矿化外壳，进而阻止血液中的营养物质进入肿瘤细胞，从而达到饥饿治疗的目的；RNA纳米水凝胶中含有通过滚环复制产生的大量的micRNA367和siRNA序列，会在体内细胞内源性Dicer酶的剪切下，释放micRNA367和siRNA片段，实现基因沉默，微观调节RYR3蛋白和CXCR4的浓度，来增强细胞内的Ca2+浓度，Ca2+是细胞的第二信使，当胞内Ca2+浓度增加时，会引起一系列细胞生物学的变化，可能参与乳腺癌细胞的钙化过程，与细胞外的矿化环环相扣，协同矿化细胞，进行饥饿治疗；siRNA会干扰细胞趋化因子受体-4（CXCR4）的表达，进而抑制了细胞的增殖和转移。
综上所述，本项目针对三阴性乳腺癌治疗出现的问题，基于核酸滚环转录技术构建核酸纳米水凝胶体系，结合基因治疗、改善肿瘤微环境、仿生矿化、饥饿治疗等联合治疗手段对三阴性乳腺癌细胞的增殖进行抑制，同时达到共传递增强药物的靶向性，有效降低药物对正常细胞组织所产生的毒副损伤的目的。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述纳米水凝胶的制备方法包括以下步骤：
（1）分别吸取浓度都为8-12 μM的序列如SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子各8-12 μL混合，调节使其成为浓度分别为4-6μM的水溶液，RCA聚合结束后样品进行冷藏并静置，后加入18-22 μL 8-12 μM的DNA-胆固醇，其中DNA序列如SEQ ID NO.3所示，缓慢冷却并冷藏静置，后洗涤上述产物；
（2）RNF-Chol@CAP的合成
将步骤（1）中获得的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris-HCl buffer中，调节使其浓度为0.2-0.3 μM；将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按4-6:2-4体积比混合均匀，冷藏放置一段时间，再加入与NaH2PO4溶液等体积的4-6 mM的CaCl2溶液，并冷藏静置；
（3）RNF-Chol@CAPX的合成
步骤（2）中所得溶液140-160 μL离心去除上清液后，分散到135-145 μL 18-22 μM序列如SEQ ID NO.4所示的LXL-aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。
2.根据权利要求1所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（1）中RCA的聚合过程如下：95 ℃加热5 min，然后以0.3 ℃ / min 的梯度缓慢冷却至25 ℃，随后加入3 μL H2O，3 μL 10×T4 Ligase buffer和4 μL T4 Ligase，充分震荡均匀后16℃反应12 h，隔夜后在65 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至25 ℃，将T4 Ligase灭活后，在反应体系中加5 μL 10×T7 Polymerase buffer，5 μL rNTPs，7 μL H2O和3 μL T7Polymerase，充分震荡混合均匀后，37 ℃ 孵育8 h。
3.根据权利要求1或2所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（1）中SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子的浓度都为10μM，体积都为10μL，所述DNA-胆固醇的体积为20μL，浓度为10 μM。
4.根据权利要求1或2所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（2）中步骤（1）中的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris-HCl buffer中，使其浓度为286 nM，将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按5:3体积比混合均匀，CaCl2溶液的浓度为4-6 mM。
5.根据权利要求1或2所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（3）中步骤（2）中所得溶液154μL离心去除上清液后，分散到140 μL 20 μM序列如SEQ IDNO.4所示的LXL-aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。
6.权利要求1或权利要求2中所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述药物中基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶为唯一组分。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| US20130266639A1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-10-10 | Baylor College Of Medicine | METHODS FOR TREATING TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER USING BIFUNCTIONAL SRC 3 shRNA |
| CN110038025A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-23 | 临沂大学 | 用于三阴性乳腺癌靶向治疗的rna三螺旋水凝胶的制备方法 |
| KR20190131797A (ko) * | 2018-05-17 | 2019-11-27 | 경희대학교 산학협력단 | 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 |
| WO2021196490A1 (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 中国人民解放军第四军医大学 | 核酸-磷酸钙纳米颗粒复合物及其在生物矿化中的应用 |
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2023
- 2023-06-28 CN CN202310774972.5A patent/CN116785230B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130266639A1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-10-10 | Baylor College Of Medicine | METHODS FOR TREATING TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER USING BIFUNCTIONAL SRC 3 shRNA |
| KR20190131797A (ko) * | 2018-05-17 | 2019-11-27 | 경희대학교 산학협력단 | 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 |
| CN110038025A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-23 | 临沂大学 | 用于三阴性乳腺癌靶向治疗的rna三螺旋水凝胶的制备方法 |
| WO2021196490A1 (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 中国人民解放军第四军医大学 | 核酸-磷酸钙纳米颗粒复合物及其在生物矿化中的应用 |
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