CN102973510B - 一种双功能靶向量子点脂质体制备方法 - Google Patents
一种双功能靶向量子点脂质体制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，包括如下步骤：单一量子点脂质体的制备：取磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物和NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，蒸干氯仿；再溶于量子点的硫酸铵溶液，震荡得到脂质体混悬液；挤压，以生理盐水洗脱即得含有量子点的主动靶向脂质体；将含有量子点的主动靶向脂质体，加入阿霉素生理盐水溶液，60℃水浴20min；以生理盐水洗脱通过SephadexG-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。该方法制备的脂质体能够对神经胶质瘤细胞进行标识与治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米材料技术领域的脂质体制备方法，特别是涉及一种双功能靶向量子点脂质体制备方法。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病，近年来其发病率呈明显的上升趋势。在治疗上，外科手术不能彻底清除肿瘤细胞和肿瘤转移淋巴结，从而导致肿瘤复发；化疗药物静注给药后，对肿瘤组织无选择性，具有严重的全身性毒副作用；放疗往往会引起患者严重的局部皮肤反应、血象变化、局部粘膜反应等。由于肿瘤组织对具有一定粒径的纳米颗粒(10-500 nm)具有EPR (高通透性和滞留) 效应，即处在血循环中的纳米颗粒可被动靶向至肿瘤组织，发挥所包载药物的抗肿瘤作用。目前，已有多种利用此效应用于肿瘤靶向治疗的纳米递药系统上市，如阿霉素脂质体、顺铂脂质体和紫杉醇白蛋白纳米粒，来实现对肿瘤组织的主动靶向递药。与被动靶向相比，主动靶向纳米递药系统显示出对肿瘤组织更好的靶向性和生长抑制作用，但是，由于主动靶向制剂复杂的处方和制备工艺、质量控制较难、未知的生物安全性等问题，至今仍只有少量产品进入I期或II期临床。
Neuropilin-1 (NRP-1)是细胞表面的一种I 型跨膜糖蛋白，通常表达在一些肿瘤细胞和血管内皮细胞表面，是血管内皮生长因子165 (VEGF165)的受体，在肿瘤转移、血管新生、调节血管通透性等方面发挥重要功能。专利CN 102516361 A中对NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统做了研究，证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性。
量子点是一种有着优良的荧光性能的半导体纳米晶，它具有窄的并且波长随粒子大小可调的荧光发射峰、连续的吸收光谱以及稳定且高亮度的荧光发射等优点，在生物标记中发挥着越来越重要的作用。发明专利CN 101327189 A对具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料的制备进行了研究，为癫痕和皮肤病的治疗提供了材料。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种双功能靶向量子点脂质体的制备方法。该方法制备的靶向量子点脂质体，具有诊断和治疗的双重功能。
一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a. 单一量子点脂质体的制备：分别称取磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物和NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，在旋转蒸发仪上蒸干氯仿；再溶于量子点的硫酸铵溶液，其中硫酸铵的浓度为0.32 M，在20～70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20～70℃水浴中依次挤压过400、200和100 nm核孔膜，以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱除去未包封的量子点，即得含有量子点的主动靶向脂质体；
b. 将含有量子点的主动靶向脂质体，加入阿霉素生理盐水溶液，60℃水浴 20min；以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
所述磷脂的浓度为2.5-3.5mg/ml，所述胆固醇的浓度为0.5-0.9mg/ml，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物的浓度为0.5-1.2mg/ml，所述NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物的浓度为0.05-0.5mg/ml。
所述的磷脂为蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆寇酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酸、二肉豆寇酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆莲酰磷脂酰乙二醇胺、二棕榈酰磷脂耽乙二醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆寇酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆寇酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一种。
所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇重均分子量为2000。
所述NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物中聚乙二醇重均分子量为3500。
所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一种。
所述量子点为水溶性的量子点，具体为直接水相合成的水溶性量子点，或通过相转移方法得到的水溶性量子点，
所述水溶性的量子点为CdSe，InCaP，InP，InAs，HgS，HgSe，CdTe，CdTe/CdS，CdTe/CdSe，CdTe/CdSe/ZnS，CdSe/ZnS，CdTe/CdS/ZnS，CdS/ZnS，ZnO，ZnTe，ZnSe，ZnSe/ZnS，InCaP/ZnS，CdTe/HgTe，CdSe/HgSe。
本发明的优点在于：(1) 包封率高；(2) 靶向类型为主动靶向，靶向性好。
本发明将水溶性的量子点和药物共同包裹在具有主动靶向功能的脂质体中，形成高包封率的双功能靶向量子点脂质体，可用于肿瘤的诊断与治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1中的双功能靶向量子点脂质体的动态光散射谱图。
图2为本发明实施例1所得的双功能靶向量子点脂质体与神经胶质瘤细胞共同培养1小时候的激光共聚焦照片。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限于本发明的范围。
实施例1：
RPARPAR 修饰的脂质体膜材料处方为氢化大豆磷脂/胆固醇/甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物/ RPARPAR-PEG-DSPE（60：40：2：0.5，mol/mol）。称取上述膜材料溶于氯仿，旋转蒸发除去有机溶剂，得均匀脂质膜。加入CdTe/CdS水溶液水化，60 ℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60 ℃水浴中，使用高压均质机依次将脂质体挤压过400、200和100核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的量子点，得到含有量子点的主动靶向脂质体。加入阿霉素生理盐水溶液，60 ℃水浴 20 min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
脂质体的大小采用动态光散射进行表征，其平均粒径约为110 nm，如附图1所示。采用紫外-可见吸收光谱，测定其包封率，其中量子点的包封率约为90 %，阿霉素的包封率约为95 %。细胞实验证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性，如附图2所示。
实施例2：
RPARPAR 修饰的脂质体膜材料处方为二棕榈酰磷脂酸/胆固醇/甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物/ RPARPAR-PEG-DSPE（90：10：2：0.5，mol/mol）。称取上述膜材料溶于氯仿，旋转蒸发除去有机溶剂，得均匀脂质膜。加入CdTe/CdS/ZnS水溶液水化，60 ℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60 ℃水浴中，使用高压均质机依次将脂质体挤压过400、200和100核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的量子点，得到含有量子点的主动靶向脂质体。加入阿霉素生理盐水溶液，60 ℃水浴 20 min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
脂质体的大小采用动态光散射进行表征，其平均粒径约为110 nm。采用紫外-可见吸收光谱，测定其包封率，其中量子点的包封率约为85 %，阿霉素的包封率约为95 %。细胞实验证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性。
实施例3：
RPARPAR 修饰的脂质体膜材料处方为二月桂酰磷脂酰甘油/胆固醇/甲氧基聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺/ RPARPAR-PEG-DSPE（85：15：2：0.5，mol/mol）。称取上述膜材料溶于氯仿，旋转蒸发除去有机溶剂，得均匀脂质膜。加入腺苷修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点水溶液水化，60 ℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60 ℃水浴中，使用高压均质机依次将脂质体挤压过400、200和100 nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的量子点，得到含有量子点的主动靶向脂质体。加入阿霉素生理盐水溶液，60 ℃水浴20 min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
脂质体的大小采用动态光散射进行表征，其平均粒径约为110 nm。采用紫外-可见吸收光谱，测定其包封率，其中量子点的包封率约为80 %，阿霉素的包封率约为90 %。细胞实验证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性。
实施例4：
RPARPAR 修饰的脂质体膜材料处方为氢化大豆磷脂/胆固醇/甲氧基聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺/ RPARPAR-PEG-DSPE（55：45：2：0.5，mol/mol）。称取上述膜材料溶于氯仿，旋转蒸发除去有机溶剂，得均匀脂质膜。加入5’-胞苷单磷酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点水溶液水化，60 ℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60 ℃水浴中，使用高压均质机依次将脂质体挤压过400、200和100 nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的量子点，得到含有量子点的主动靶向脂质体。加入阿霉素生理盐水溶液，60 ℃水浴20 min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
脂质体的大小采用动态光散射进行表征，其平均粒径约为110 nm。采用紫外-可见吸收光谱，测定其包封率，其中量子点的包封率约为85 %，阿霉素的包封率约为90 %。细胞实验证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性。
实施例5：
RPARPAR 修饰的脂质体膜材料处方为氢化大豆磷脂/胆固醇/甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物/ RPARPAR-PEG-DSPE（70：30：2：0.5，mol/mol）。称取上述膜材料溶于氯仿，旋转蒸发除去有机溶剂，得均匀脂质膜。加入巯基丙酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点水溶液水化，60 ℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60 ℃水浴中，使用高压均质机依次将脂质体挤压过400、200和100核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的量子点，得到含有量子点的主动靶向脂质体。加入阿霉素生理盐水溶液，60 ℃水浴 20 min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
脂质体的大小采用动态光散射进行表征，其平均粒径约为110 nm。采用紫外-可见吸收光谱，测定其包封率，其中量子点的包封率约为80 %，阿霉素的包封率约为90 %。细胞实验证明其对神经胶质瘤细胞具有良好的靶向性。
Claims (8)
1.一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a. 单一量子点脂质体的制备：分别称取磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物和NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，在旋转蒸发仪上蒸干氯仿；再溶于量子点的硫酸铵溶液，其中硫酸铵的浓度为0.32 M，在20～70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20～70℃水浴中依次挤压过400、200和100 nm核孔膜，以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱除去未包封的量子点，即得含有量子点的主动靶向脂质体；
b. 将含有量子点的主动靶向脂质体，加入阿霉素生理盐水溶液，60℃水浴 20min；以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得双功能靶向量子点脂质体。
2.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述磷脂的浓度为2.5-3.5mg/ml，所述胆固醇的浓度为0.5-0.9mg/ml，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物的浓度为0.5-1.2mg/ml，所述NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物的浓度为0.05-0.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述的磷脂为蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆寇酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酸、二肉豆寇酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆莲酰磷脂酰乙二醇胺、二棕榈酰磷脂耽乙二醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆寇酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆寇酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一种。
4.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇重均分子量为2000。
5.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述NRP-1配体多肽聚乙二醇磷脂复合物中聚乙二醇重均分子量为3500。
6.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一种。
7.根据权利要求1所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述量子点为直接水相合成的水溶性量子点，或通过相转移方法得到的水溶性量子点。
8.根据权利要求6所述一种双功能靶向量子点脂质体制备方法，其特征在于，所述水溶性的量子点为CdSe，InCaP，InP，InAs，HgS，HgSe，CdTe，CdTe/CdS，CdTe/CdSe，CdTe/CdSe/ZnS，CdSe/ZnS，CdTe/CdS/ZnS，CdS/ZnS，ZnO，ZnTe，ZnSe，ZnSe/ZnS，InCaP/ZnS，CdTe/HgTe，CdSe/HgSe。
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