CN104983683A - 脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法，反相蒸发法制备脂质体流感病毒抗原疫苗，包括流感病毒抗原疫苗原液的制备，空脂质体的制备及脂质体的合成等步骤，通过本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所制得脂质体流感病毒抗原疫苗，相对于线性的表位疫苗，不仅可以同时携带多个或多种抗原，诱发多种细胞免疫反应并引起较强的免疫应答，而且脂质体疫苗性能较稳定，保存期较长，同时，可减少免疫原剂量的使用量。

Description

脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及流感病毒抗原疫苗领域，特别涉及一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法。

背景技术

现有技术中，用于治疗流行性感冒的表位疫苗主要由化学合成，由于抗原表位仅代表了蛋白抗原的一部分，很难像蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应；且表位疫苗通常是线性的，不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的立体构象。因而直接用表位肽免疫很难引起较强的免疫应答。虽然通过表位肽与载体分子连接后可在短期内诱导较好的免疫应答，但是很难保证其免疫应答的特异性，且为达到较好的免疫效果，一方面所需免疫原剂量大，另一方面需要联合使用佐剂，使其进一步临床应用受到很大限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中表位疫苗难以诱导出多种免疫反应，且难以引起较强的免疫应答，临床应用受到限制等缺陷，提供一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明提供了一种脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，采用反相蒸发法，包括以下步骤：

(1)流感病毒抗原疫苗原液的制备：

取任意一种或多种流感病毒毒株，分别将所述流感病毒毒株接种于病毒培养基上，在33℃～35℃的温度下培养48～72小时后，获得流感病毒体,经甲醛灭活,超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；

(2)空脂质体的制备：

将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，减压蒸发有机溶剂后，得到膜状的空脂质体；

(3)单相分散体系的制备：

向步骤(2)中获得的空脂质体中加入乙醚或与乙醚有相似溶解性和极性的有机溶剂溶解膜状空脂质体形成双相分散体系，然后加入碱性缓冲液，在水浴型超声波处理器上超声至混合物形成单相分散体系；

(4)成溶胶体系的制备：

将步骤(3)中获得的混合物通过减压蒸发去除乙醚至凝胶形成，然后继续减压蒸发形成水性悬浊液即脂质体悬液，继续干燥去除乙醚，得到空脂质体，然后加入步骤(1)获得的流感病毒抗原疫苗原液，获得粗制脂质体；

(5)高压匀浆

将步骤(4)获得的粗制脂质体高压匀浆,除菌过滤即可。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述步骤(4)中流感抗原疫苗原液在加入空脂质体之前还包括以下步骤：向流感病毒抗原疫苗原液中加入细胞保护剂。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述细胞保护剂为海藻糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1％。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述碱性缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述流感病毒毒株包括甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株；所述病毒培养基为5-10日龄健康鸡胚。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的一种或多种；

所述有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；

所述抗氧化剂为维生素E、维生素C、维生素A、类胡萝卜素中的一种或多种。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述空脂质体的制备过程为：

将大豆卵磷脂、维生素E、胆固醇分别按摩尔比(4-6)：1：(2-4)混合溶于100ml三氯甲烷中,置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,在60℃-100℃条件下水浴,真空旋转蒸发,成膜，获得膜状空脂质体。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，取300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,获得膜状空脂质体。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述高压匀浆过程为：将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa-30Kpa压力范围内，匀质5个循环，将脂质体颗粒粒径匀质至200-400nm，除菌过滤。

本发明进一步保护根据上述提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法所获得脂质体疫苗。

实施本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法，可以达到以下有益效果：相对于线性的表位疫苗，具有立体抗原表位的脂质体疫苗不仅可以同时携带多个或多种抗原，诱发多种细胞免疫反应并引起较强的免疫应答，而且脂质体疫苗性能较稳定，保存期较长，同时，可减少免疫原剂量的使用量。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对H3N2病毒株的标准抗原的ELISA检测；

图2为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对H1N1病毒株的标准抗原的ELISA检测；

图3为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对B型病毒株的标准抗原的ELISA检测。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗采用反相蒸发法进行制备，包括以下步骤：

(1)流感病毒抗原疫苗原液的制备：

取任意一种或多种流感病毒毒株，分别将所述流感病毒毒株接种于病毒培养基上，在33℃～35℃的温度下培养48～72小时后，获得流感病毒体,经甲醛灭活,超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；

其中，流感病毒毒株包括甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)及乙型三种目前最普遍的流感病毒毒株，使得流感病毒抗原疫苗原液更具实用性；

(2)空脂质体的制备：

将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，减压蒸发第一有机溶剂后，得到膜状的空脂质体；

其中，磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的一种或多种；

有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；

抗氧化剂为维生素E、维生素C、维生素A、类胡萝卜素中的一种或多种；磷脂、抗氧化剂、有机溶剂按摩尔比为(4-6)：1：(2-4)混合溶于100ml有机溶剂中；

(3)单相分散体系的制备：

向步骤(2)中获得的空脂质体中加入乙醚或与乙醚有相似溶解性和极性的有机溶剂溶解膜状空脂质体形成双相分散体系，然后加入碱性缓冲液，在水浴型超声波处理器上超声至混合物形成单相分散体系；

其中，碱性缓冲液pH值为7.2，碱性缓冲液可以为磷酸盐缓冲液等；

(4)成溶胶体系的制备：

将步骤(3)中获得的混合物通过减压蒸发去除乙醚至凝胶形成，然后继续减压蒸发形成水性悬浊液即脂质体悬液，继续干燥去除乙醚，得到空脂质体，然后加入步骤(1)获得的流感病毒抗原疫苗原液，获得粗制脂质体；

(5)高压匀浆

将步骤(4)获得的粗制脂质体高压匀浆,除菌过滤即可；

具体实施例为：

实施例1

(1)流感病毒抗原疫苗原液的制备

取三种流行性感冒病毒毒株(包括甲1型、甲3型及乙型),三种流感病毒分别接种于病毒培养基上，优选，5-10日龄健康鸡胚作为病毒培养基；在33℃～35℃培养48～72小时后,收获尿囊液病毒,经在36℃下缓慢加入0.15％-4％甲醛静置24小时，然后常温下静置24小时即可完成灭活；然后在100KD超滤离心管，3000g(g为重力加速度)离心条件下进行超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及通过Sephadex G-200(葡聚糖凝胶G-200)柱层析纯化后制成三价病毒亚单位流感病毒抗原疫苗原液；

每mL流感病毒抗原疫苗原液中含有如下活性成分:

甲1型(H1N1)相似株血凝素抗原约30ug

甲3型(H3N2)相似株血凝素抗原约30ug

乙型(B)相似株血凝素抗原约30ug

另外含有少量的流感病毒的NP蛋白(Nucleoprotein核蛋白)和MP(monoclonal Protein免疫球蛋白)蛋白、和来自鸡胚的卵清蛋白。

其中，尿囊液病毒提取过程为：用带有提取RNA专用枪头的移液枪取250ul病毒液+750ul Trizol(主要成分为苯酚和异硫氰酸胍的总RNA抽提试剂)，轻轻颠倒数次，混匀加入200ul氯仿，颠倒混匀15次，冰浴5min后在4℃下以13000转/分离心15min，吸取上清750ul加入新离心管，加入等量异丙醇(提前放在-20℃冰箱)，颠倒混匀，冰浴10min后在4℃下以13000转/分离心15min后弃上清，加入1mLl75％DEPC酒精(提前放在-20℃冰箱)，在4℃下以13000rpm离心5min后，弃上清，瞬离，黄枪头吸净上清，转一周，瞬离，白枪头吸净，风干5-10min，即可收获尿囊液病毒。

(2)空脂质体的制备过程

取300mg注射用大豆卵磷脂(SLI)、150mg胆固醇(CHol)、50mg维生素E(Ve)混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,即可获得膜状空脂质体；

(3)单相分散体系的制备

向步骤(2)中加入20ml乙醚,溶解空脂质体后,加入25ml pH7.2的磷酸盐缓冲溶液形成两相体系,在水浴型超声波处理器上超声2～5min至混合物形成单相体系,静置30min。

(4)成溶胶体系的制备

将步骤(3)中获得混合物在旋转蒸发仪上减压蒸发去除有机溶剂至凝胶形成；继续减压蒸发5～10min,形成水性悬浊液即脂质体悬液,凝胶块崩溃成液体,悬液形成后,继续在蒸发器上干燥5～10min,进一步去除残留有机溶剂,最后充氮气至乙醚味消失；

在步骤(1)中制成的流感病毒抗原疫苗原液中加入细胞保护剂，如海藻糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1％，然后取25ml含1％海藻糖的流感病毒抗原疫苗原液加入空脂质体中，获得粗制脂质体。

(5)高压匀浆

将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa～30Kpa压力范围内，匀质5-10个循环,将脂质体均质到200～400纳米的粒径,除菌过滤，即获得脂质体流感病毒抗原疫苗；

进一步地，反相蒸发法结合冷冻干燥法，即在步骤(5)之后，继续以下步骤：

(6)分装:将除菌后的脂质体以2m1/瓶,分装在西林瓶中；

(7)冷冻干燥:在冰箱中先进行预冻,然后在冻干机中进行真空冷冻干燥,形成冻干品；

(8)再水化溶解:将2m1无菌注射用水注入到冻干品,震荡至均匀的乳白

色溶液即可。

实施例2

该实施例与实施例1相比，除空脂质体的制备过程有所区别以外，其他制备过程均相同。

本实施例中，空脂质体的制备过程为：

400mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,即可获得膜状空脂质体。

实施例3

该实施例与实施例1相比，除空脂质体的制备过程有所区别以外，其他制备过程均相同。

本实施例中，空脂质体的制备过程为：

300mg注射用大豆卵磷脂、200mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,即可获得膜状空脂质体。

实施例4

该实施例与实施例1相比，除空脂质体的制备过程有所区别以外，其他制备过程均相同。

本实施例中，空脂质体的制备过程为：

300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、80mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,即可获得膜状空脂质体。

实施例5

该实施例与实施例1相比，除空脂质体的制备过程有所区别以外，其他制备过程均相同。

本实施例中，空脂质体的制备过程为：

200mg注射用大豆卵磷脂、100mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,即可获得膜状空脂质体。

上述实施例所获得的脂质体流感病毒抗原疫苗粒径测试分析及包封率、氧化指数测试结果如下表1：

脂质体粒径决定了脂质体的大小形态稳定性，由此来判断是否适合用于注射。在《中国药典》对于混悬型注射液的药物粒度应控制在15μm以下,含15～20μm者不超过10％,不得用于静脉注射和椎管注射,若用于静脉注射,90％粒度应该小于1μm。由表1可知，本发明所制备的脂质体粒度均控制在15μm以下，从而保证了脂质体的稳定性和适用性；虽然关于脂质体径距的要求暂无明文规定,但是本发明制备的脂质体颗粒的平均粒径和径距都有实际意义。

脂质体包封率的测定：包封率＝系统中包封的药物量/系统中包封与未包封的总药量，就是判断了被脂质体包裹起来的药物占总药量的比例，是脂质体剂型必须评价的一个指标。按照相关原则,由于药物与脂质体结合的形式有三种:被包裹在脂质体颗粒内水相、镶嵌在膜中,吸附在膜上，测定包封率需要进行脂质体药物和游离药物的分离,然后进行相应的定量测定。两种组分的分离,一般采用离心法、半透膜分离法、凝胶过滤法。由于流感抗原一般是40KD～70KD的蛋白质大分子，因此，本专利中采用离心法来测定脂质体包封率。本发明通过离心法测得相应实施例所制备的脂质体包封率，如表1。

氧化指数的测定参照《中国药典》微囊微球与脂质体指导性原则相关规定进行测定,用无水乙醇将待测脂质体溶液稀释到肉眼所见的澄明液体,以此作为待测样品,如果有沉淀未能溶解,在水浴超声波清洗仪处理1-2min；用无水乙醇作为空白对照,用日本岛津分光光度计,分别测定待测样品的233nm、215nm的吸光度,使用该仪器配套软件自动计算出A233/A215的比值。本发明所制备的脂质体氧化指数如表1所示，均小于《中国药典》中规定的标准值0.2，氧化指数越小，说明脂质体疫苗越稳定，保存期越久。

另外，免疫原性反应了疫苗进入机体后引起抗体产生免疫应答的强度和持续时间，影响免疫原性强弱的因素包括机体的因素和疫苗的因素,免疫原性实际检测疫苗的有效性的重要指标；因此本发明通过免疫原性的实验进一步验证实施本发明所获得的脂质体疫苗的免疫效果，下面以实施例制备的脂质体流感病毒抗原疫苗为实验依据进行详述：

具体地，本次研究方法是将疫苗免疫小鼠后,检测体内产生的抗流感病毒的抗体水平。将实施例1中制备得出的脂质体流感病毒抗原疫苗分别免疫接种于10只18～22克昆明小鼠,每只小鼠皮下接种0.2ml；另取对照组10只昆明小鼠,皮下接种生理盐水,置相同条件下饲养。免疫21天后,分组采血,分离血清。以血凝抑制试验方法测定抗体效价。

实验结果：本发明实施例1中制备的脂质体流感病毒抗原疫苗对于H3N2型病毒株产生的抗原免疫血清抗体滴度尤其高,滴度超过1000；对于H1N1滴度为950；对于乙/马来西亚/2056/2004(即B型)相似株滴度为900；H3N1、H1N1与B型三种纯抗原在小鼠机体内引起的免疫应答反应的强度依次为H3N2>H1N1>B。

为了进一步检测脂质体流感病毒抗原疫苗刺激小鼠机体产生IgG抗体水平,采用ELISA法对上述实验中免疫一定时间的小鼠血清进行测定,具体ELISA实验结果，如图1-3，图1为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对H3N2病毒株的标准抗原的ELISA检测；图2为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对H1N1病毒株的标准抗原的ELISA检测；图3为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对B型病毒株的标准抗原的ELISA检测。

在图1-3中，横坐标为抗原测定时间，单位为小时；纵坐标为ELISA检测血清中的抗体量，单位为mIU/mL，Flu-P(大)指利用平均粒径大于450nm的脂质体流感病毒抗原疫苗进行测试的实验组，Flu-P(小)指利用平均粒径小于450nm的脂质体流感病毒抗原疫苗进行测试的实验组，Flu-P(大)和Flu-P(小)均来源于实施例1中制备的流感病毒抗原疫苗；Blank-LP指利用没有加入流感病毒抗原疫苗原液的脂质体进行测试的实验组；空白对照为利用PBS缓冲液进行测试的对照组；阳性对照为利用普通流感病毒抗原疫苗进行测试对照组。其中，血清中的抗体量和脂质体粒径均为实验中所获得平均值。由附图1-3可知，H3N1、H1N1与B型三种纯抗原在小鼠机体内引起的免疫应答反应的强度依次为H3N2>H1N1>B；在42小时内，本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗刺激小鼠机体产生IgG抗体量随着时间的推移逐渐增加，且均远远大于普通疫苗所刺激产生的抗体量；脂质体粒径越小，免疫强度越高；故通过本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所获得脂质体疫苗具有较高的免疫应答强度。

综上所述，通过上述实验证明，本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所制得的脂质体流感病毒抗原疫苗可同时携带多个或多种抗原，能够刺激细胞免疫反应,而结合于脂质体表面的抗原能够相应刺激产生非T细胞依赖的IgM抗体等，总之，本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗不仅性能稳定，保存期久，而且可诱发多种免疫反应，免疫应答强度较高，促进免疫细胞的积累，从而提高治疗指数,减少治疗剂量和降低毒性。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，采用反相蒸发法，包括以下步骤：

(1)流感病毒抗原疫苗原液的制备：

取任意一种或多种流感病毒毒株，分别将所述流感病毒毒株接种于病毒培养基上，在33℃～35℃的温度下培养48～72小时后，获得流感病毒体,经甲醛灭活,超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；

(2)空脂质体的制备：

将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，减压蒸发有机溶剂后，得到膜状的空脂质体；

(3)单相分散体系的制备：

向步骤(2)中获得的空脂质体中加入乙醚溶解膜状空脂质体形成双相分散体系，然后加入碱性缓冲液，在水浴型超声波处理器上超声至混合物形成单相分散体系；

(4)成溶胶体系的制备：

将步骤(3)中获得的混合物通过减压蒸发去除乙醚至凝胶形成，然后继续减压蒸发形成脂质体悬液，继续干燥去除乙醚，得到空脂质体，然后加入步骤(1)获得的流感病毒抗原疫苗原液，获得粗制脂质体；

(5)高压匀浆

将步骤(4)获得的粗制脂质体高压匀浆,除菌过滤即可。

2.根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中流感病毒抗原疫苗原液在加入空脂质体之前还包括以下步骤：向流感病毒抗原疫苗原液中加入细胞保护剂。

3.根据权利要求2所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞保护剂为海藻糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1％。

4.根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1任一项所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述流感病毒毒株包括甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株；所述培养基为5-10日龄健康鸡胚。

6.根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的一种或多种；

所述有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；

所述抗氧化剂为维生素E、维生素C、维生素A、类胡萝卜素中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述空脂质体的制备过程为：

将大豆卵磷脂、维生素E、胆固醇分别按摩尔比(4-6)：1：(2-4)混合溶于100ml三氯甲烷中,置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,在60℃-100℃条件下水浴,真空旋转蒸发,成膜，获得膜状空脂质体。

8.根据权利要求7所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)空脂质体的制备过程为：

取300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100m l三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,获得膜状空脂质体。

9.根据权利要求1-8任一项所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于，所述高压匀浆过程为：将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa-30Kpa压力范围内，匀质5个循环，将脂质体颗粒粒径匀质至200-400nm，除菌过滤。

10.一种脂质体流感病毒抗原疫苗，其特征在于，包括如权利要求9任一项所述的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所制得的脂质体流感病毒抗原疫苗。