CN116808194A - 一种纳米疫苗载体、纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纳米疫苗载体、纳米疫苗及其制备方法和应用。本发明的纳米疫苗由磁性纳米颗粒和脂质体共同构建，利用脂质体表面的靶向性多肽可通过膜融合将抗原递送到细胞质参与抗原的呈递，也可通过胞吞将佐剂递送到溶酶体激活TLR9免疫信号通路，此外氧化铁纳米颗粒进入细胞后也可通过产生活性氧物质进一步增强免疫响应，该纳米疫苗载体增强了抗原和佐剂的协同免疫效果。该疫苗可同时递送抗原/佐剂到溶酶体和细胞质，激活树突状细胞并发生抗原呈递。
Description
技术领域
本发明所属技术领域为材料化学、纳米科学、化学生物学及生物医学领域。具体涉及一种纳米疫苗载体、可同时递送药物到不同细胞器中的纳米疫苗、及其制备方法和应用。
背景技术
纳米疫苗是以纳米颗粒为载体负载抗原和/或佐剂分子激活机体免疫反应的一种新型免疫治疗方法，在肿瘤等重大疾病的治疗上有广阔的应用潜力。利用纳米颗粒共递送抗原和佐剂分子到抗原呈递细胞，不仅可以提高抗原和佐剂在体内的稳定性，还能显著提高抗原和佐剂的免疫协同效果(M.S.Goldberg,Cell 2015,161,201)。纳米疫苗在生物医学领域已有广泛的应用，例如，同时负载抗原和佐剂的脂质体基纳米疫苗作为治疗型肿瘤疫苗已进入临床试验阶段(S.T.Reddy,M.A.Swartz,J.A.Hubbell,Trends inImmunology 2006,27,573)。此外，一些无机纳米颗粒也已被开发为递送抗原和佐剂的载体，如氧化铁纳米颗粒(L.Luo,M.Z.Iqbal,C.Liu,J.Xing,O.U.Akakuru,Q.Fang,Z. Li,Y.Dai,A.Li,Y.Guan,A.Wu,Biomaterials 2019,223,Unsp 119464)。尽管纳米疫苗在抗肿瘤和抗病原微生物等领域取得了一些进展，但大多数报道的纳米疫苗是通过内涵体介导的内吞作用进入细胞(Q.Zhou,Y.Zhang,J.Du,Y.Li,Y. Zhou,Q.Fu,J.Zhang,X.Wang,L.Zhan,Acs Nano 2016,10,2678；C.Lai,S.Duan, F.Ye,X.Hou,X.Li,J.Zhao,X.Yu,Z.Hu,Z.Tang,F.Mo,X.Yang,X.Lu, Theranostics 2018,8,1723)，随着内涵体与溶酶体发生融合，纳米疫苗负载的佐剂如CpG(含有非甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序的短单链寡核苷酸，简称CpG)寡核苷酸能与溶酶体内膜上的Toll-样受体(TLR)9分子结合激活下游的免疫通路(S.Akira,K.Takeda,Nature Reviews Immunology 2004,4,499)，但纳米疫苗负载的抗原将被溶酶体的酸性环境和水解酶破坏而无法进入细胞质参与内质网的抗原呈递过程(M.P.Stewart,A.Sharei,X.Y.Ding,G.Sahay,R.Langer,K.F. Jensen,Nature 2016,538,183)。因此，纳米疫苗在溶酶体环境中的不稳定性及较低的内涵体逃逸效率导致了较低的抗原呈递效率，从而减弱了抗原特异性免疫响应。纳米药物的溶酶体不耐受及内涵体逃逸效率低也导致了其在递送需要进入细胞质或细胞核发挥作用的药物时表现不佳，这类药物包括化疗药物阿霉素，或基因治疗药物如质粒、信使RNA，反义DNA等(C.Shi,M.L.Li,Z.Zhang, Q.C.Yao,K.Shao,F.Xu,N.Xu,H.D.Li,J.L.Fan,W.Sun,J.J.Du,S.Long,J.Y.Wang,X.J.Peng,Biomaterials 2020,233,119755；J.Zhou,Z.Shao,J.Liu,Q. Duan,X.Wang,J.Li,H.Yang,ACS applied bio materials 2020,3,2686)。
因此，提高纳米颗粒进入细胞质的效率将有效提高包载抗原或药物的疗效。以共负载抗原和佐剂的纳米疫苗为例，通过纳米疫苗与抗原呈递细胞发生膜融合直接将抗原递送到细胞质是递送抗原的理想选择，但不适合递送需要进入溶酶体的佐剂，如上文所述的CpG。因此，为了最大限度地发挥抗原和佐剂的功效，迫切需要一种能够同时将抗原和佐剂分别递送到抗原呈递细胞的细胞质和溶酶体的纳米疫苗载体以及可高效递送药物或疫苗到细胞质中的方式。
发明内容
本发明提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒为共负载抗原和佐剂的氧化铁纳米颗粒。
根据本发明的实施方案，所述抗原的来源包括但不限于肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原；
根据本发明的实施方案，所述抗原的种类包括但不限于多肽、核苷酸、多糖或蛋白质，优选为多肽；示例性地，所述抗原为OVA257-264多肽或多肽E749-57。
根据本发明的实施方案，所述佐剂选自包括但不限于TLR3，TLR4，TLR7/8，TLR9的配体分子，例如选自CpG。
根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒的平均粒径为5-20nm，例如7-15nm，示例性为10.6±2.0nm。
根据本发明的实施方案，抗原和佐剂的共负载是通过氧化铁纳米颗粒表面马来酰亚胺基团、与巯基修饰的佐剂和巯基修饰的抗原发生点击化学反应实现的。
根据本发明的实施方案，所述抗原和佐剂的数量之和以占据氧化铁颗粒表面的所有连接位点为佳。一个氧化铁颗粒表面大概有336个连接位点，抗原和佐剂的摩尔总数为336个，二者的具体比例可调。例如，以摩尔比计，氧化铁纳米颗粒:佐剂:抗原＝1:16:320，即一个氧化铁颗粒表面可以负载16个佐剂加320个抗原。
根据本发明示例性的实施方案，所述纳米颗粒为共负载抗原OVA257-264多肽和CpG佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为IONP-C/O；
或者为共负载抗原多肽E749-57和CpG佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为 IONP-C/E。
本发明还提供上述纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
水溶性的氧化铁纳米颗粒、巯基修饰的佐剂以及巯基修饰的抗原，发生点击化学反应，制备得到所述纳米颗粒；
所述水溶性的氧化铁纳米颗粒表面修饰有马来酰亚胺基团。
根据本发明的实施方案，所述水溶性的氧化铁纳米颗粒的制备过程包括：用带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇置换氧化铁纳米颗粒的油酸配体，获得水溶性的氧化铁纳米颗粒；
优选地，将油酸配位的氧化铁纳米颗粒用乙醇沉淀，分散于四氢呋喃中；向分散体系中加入带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇反应，反应完成后经后处理，得到所述水溶性的氧化铁纳米颗粒；
优选地，所述反应的温度为30-50℃，反应的时间为5-15h；
优选地，所述后处理包括向反应产物中加入溶剂(例如环己烷)沉淀、抽干溶剂、水分散、超滤。
根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：先将水溶性的氧化铁纳米颗粒与巯基修饰的佐剂振荡反应，反应完成后再向其中加入巯基修饰的抗原，进行振荡反应，得到所述纳米颗粒。
根据本发明示例性的实施方案，所述巯基修饰的佐剂为巯基修饰的CpG。
根据本发明示例性的实施方案，所述巯基修饰的抗原为半胱氨酸修饰的OVA257-264多肽或多肽E749-57。
根据本发明的实施方案，所述水溶性的氧化铁纳米颗粒、巯基修饰的佐剂、巯基修饰的抗原的摩尔比可以根据需要进行调整，以佐剂和抗原的数量能够完全占据氧化铁纳米颗粒表面的连接点为佳(如上文所述)，例如摩尔比为 1:16:320。
根据本发明的实施方案，所述振荡反应的温度为室温。所述室温指15-35℃。
根据本发明的实施方案，所述振荡反应的时间不低于1h，例如为1-5h，例如2h。
根据本发明的实施方案，所述振荡反应的溶剂体系为水。
根据本发明的实施方案，在向体系中加入巯基修饰的抗原之前，需要将多余的CpG从体系中去除。
根据本发明的实施方案，待巯基修饰的抗原的振荡反应完成后，需要将多余的巯基修饰的抗原从体系中去除。
本发明还提供上述纳米颗粒在纳米制剂中的应用。
根据本发明的实施方案，所述纳米制剂包括但不限于纳米疫苗。
示例性地，所述纳米颗粒用于制备纳米疫苗载体或者作为纳米疫苗载体。
根据本发明的实施方案，所述纳米制剂可以预防和/或治疗下述疾病：肿瘤、病毒感染、细菌感染或真菌感染引发的疾病。
本发明还提供一种纳米疫苗载体，含有上述纳米颗粒。
本发明还提供一种纳米疫苗，含有上述纳米颗粒或纳米疫苗载体。
根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗包括脂质体和上述纳米颗粒，所述纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽。
根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗中，每个脂质体内能够包裹一个或更多个所述纳米颗粒。其中，“更多个”可以为两个、三个、五个、十个、二十个、三十个等。
根据本发明的实施方案，所述脂质体由三种磷脂分子制备得到。
根据本发明的实施方案，所述的磷脂分子包括但不限于阴离子磷脂分子、阳离子磷脂分子、中性磷脂分子和/或可离子化磷脂分子。
示例性地，所述三种磷脂分子为DSPE-PEG-P30、大豆卵磷脂(SPC)和胆固醇(CHO)；
优选地，大豆卵磷脂(SPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-P30的质量比可以为(8-12):(4-7):1，例如10:6:1。
根据本发明的实施方案，所述靶向性的多肽为环状多肽，例如为多肽P30，用于靶向树突状细胞表面的CD11c受体。
根据本发明的实施方案，所述脂质体的厚度为2-20nm，例如为8-15nm。
根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗的水合粒径为100-300nm，例如为197.3nm。
根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗的形貌为均匀的球型。
根据本发明示例性的实施方案，所述纳米疫苗包括脂质体和IONP-C/O纳米颗粒，所述IONP-C/O纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽P30；
或者，所述纳米疫苗包括脂质体和IONP-C/E纳米颗粒，所述IONP-C/E纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽P30。
本发明还提供上述纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：通过薄膜水化法将所述纳米颗粒包裹在所述脂质体中，制备得到所述纳米疫苗。
根据本发明的实施方案，所述制备方法包括如下步骤：将所述纳米颗粒分散于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，向其中加入干燥的磷脂薄膜进行水化，磷脂分子发生自组装形成载有纳米粒子的脂质体，所述脂质体再经探针超声处理、挤出成型，得到所述纳米疫苗。
根据本发明的实施方案，所述磷脂薄膜由上述三种磷脂分子制备得到；例如，由大豆卵磷脂(SPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-环状多肽(例如 DSPE-PEG-P30)溶解于氯仿中，旋转蒸发得到所述磷脂薄膜。
根据本发明的实施方案，所述DSPE-PEG-环状多肽(例如DSPE-PEG-P30) 由下述方法制备得到：环状多肽(例如多肽P30)和DSPE-PEG-mal在水和甲醇的混合溶剂中室温避光反应；
例如，所述环状多肽和DSPE-PEG-mal的摩尔比为1:(0.1-10)，比如为1:1、 2:5、5:2。
根据本发明的实施方案，所述DSPE-PEG-环状多肽(例如DSPE-PEG-P30) 由下述方法制备得到：环状多肽(例如多肽P30)和DSPE-PEG-mal在水和乙腈的混合溶剂中室温避光反应；
例如，所述环状多肽和DSPE-PEG-mal的摩尔比为1:(0.1-10)，比如为1:1、 2:5、5:2。
根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒、干燥的磷脂薄膜和PBS的质量体积配比可调，优选配比为(5-15)mg:(70-90)mg:4mL，例如为12mg:85mg:4mL。
根据本发明的实施方案，所述水化的温度为40-50℃，例如45℃。
根据本发明的实施方案，所述探针超声处理的条件包括：200W，开启5秒，关闭5秒，总共10分钟。
根据本发明的实施方案，所述挤出成型包括：将脂质体悬浮液从孔径分别为450nm、220nm和100nm的聚碳酸酯膜挤出。
本发明还提供一种改变纳米制剂进入细胞通路的方法，包括使用环状多肽修饰纳米制剂的脂质体表面，将活性成分(例如抗原)递送至细胞质。
根据本发明的实施方案，所述环状多肽和纳米制剂均具有如上文所示的含义。
根据本发明的实施方案，所述脂质体包括但不限于上述由三种磷脂分子制备得到的脂质体。
根据本发明的实施方案，所述修饰包括：将环状多肽(例如多肽P30)与1,2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000] (DSPE-PEG-mal)偶联，并且将偶联后的反应产物DSPE-PEG-P30插入脂质体中。
本发明还提供环状多肽在改变纳米制剂进入细胞通路中的应用。
根据本发明的实施方案，所述环状多肽和纳米制剂均具有如上文所示的含义。
根据本发明的实施方案，所述改变纳米制剂进入细胞通路意指通过将环状多肽修饰到纳米制剂的脂质体表面，使活性成分(例如抗原)递送至细胞质。
本发明还提供氧化铁纳米颗粒作为佐剂的应用，即氧化铁纳米颗粒能够提高对象对抗原的免疫应答，促进免疫细胞成熟；
例如，氧化铁纳米颗粒作为上述纳米制剂中的佐剂；还如，氧化铁纳米颗粒作为上述纳米疫苗中的第二佐剂。
本发明的有益效果：
本发明所提供的氧化铁纳米颗粒为单分散性纳米颗粒，通过表面修饰带马来酰亚胺基团的聚乙二醇分子，与带巯基的抗原和带巯基的佐剂发生点击化学反应共负载抗原和佐剂，得到的纳米颗粒能够用于制备或作为纳米疫苗的载体。通过薄膜水化法将共负载抗原/佐剂的氧化铁纳米颗粒包裹在含有靶向性多肽的脂质体中，制得石榴样的脂质体纳米疫苗。本发明的纳米疫苗由磁性纳米颗粒和脂质体共同构建，利用脂质体表面的靶向性多肽可通过膜融合将抗原递送到细胞质参与抗原的呈递，也可通过胞吞将佐剂递送到溶酶体激活TLR9免疫信号通路，此外氧化铁纳米颗粒进入细胞后也可通过产生活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)进一步增强免疫响应，该纳米疫苗载体增强了抗原和佐剂的协同免疫效果，氧化铁纳米颗粒作为第二佐剂发挥三重协同作用。疫苗分散性好，生物相容性好，毒副作用低，可同时递送抗原/佐剂到细胞质和溶酶体，激活树突状细胞并发生抗原呈递。
具体优点如下：
(1)本发明提供了一种以氧化铁纳米颗粒和靶向性脂质体为基础的纳米疫苗，其制备方法所涉及的原料简单易得，化学反应条件温和，实验步骤简单。
(2)本发明提供一种可以改变纳米颗粒进入细胞路径的方法，通过环状多肽修饰到脂质体表面实现。制备得到的脂质体纳米疫苗可同时将抗原递送到细胞质，佐剂递送到溶酶体，极大提高了抗原和佐剂之间的协同免疫效率。
(3)本发明首次发现氧化铁纳米颗粒作为佐剂的应用，能够提高对象对抗原的免疫应答，促进免疫细胞成熟。具体地，纳米疫苗中的氧化铁纳米颗粒既可作为抗原和佐剂的载体，又可发挥佐剂作用增强免疫效果。
(4)本发明制备得到的脂质体纳米疫苗中的抗原和佐剂容易替代，可用于治疗更多的疾病。
附图说明
图1.本发明实施例1所得样品的透射电镜照片，标尺为50nm。
图2.本发明实施例2所得样品的透射电镜照片(a)及其在高放大倍数下的透射电镜照片(b)，标尺分别为500nm和100nm。
图3.本发明实施例1和例2所得样品的水合粒径正态分布曲线，包括水溶性氧化铁纳米颗粒(IONP)、共负载抗原和佐剂的氧化铁纳米颗粒(IONP-C/O)，不含氧化铁纳米颗粒的对照组(C/O@LP)，不含靶向性多肽的对照组 (IONP-C/O@L)，以及实验组(IONP-C/O@LP)。
图4.本发明实施例3所得的共聚焦激光扫描显微镜照片，树突状细胞与实验组(IONP-C/O@LP)和对照组(IONP-C/O@L)脂质体纳米疫苗共孵育后，脂质体荧光在细胞内的不同分布。
图5.本发明实施例4所得的流式细胞术检测结果，树突状细胞用膜融合或胞吞抑制剂处理后，对实验组(IONP-C/O@LP)和对照组(IONP-C/O@L)脂质体纳米疫苗的摄取效率表征。
图6.本发明实施例5所得的流式细胞术检测结果，小鼠免疫三次后肿瘤组织内的成熟树突状细胞和抗原特异性T细胞比例，以及脾脏内的抗原特异性T细胞比例。
图7.本发明实施例6所得的肿瘤生长曲线及生存期曲线。
图8.本发明实施例7所得的肿瘤生长曲线。
图9是实施例8各组小鼠的接种图示(a)、肿瘤生长曲线(b)和生存期曲线(c)。
图10是实施例9各组小鼠的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇购自北京万德高科技发展有限公司，PEG分子量2000；
巯基化修饰的OVA多肽、E749-57多肽和P30多肽由吉尔生化(上海)有限公司提供；
巯基修饰的CpG由深圳华大基因股份有限公司提供；
DSPE-PEG-mal中PEG分子量为2000。
(1)靶向性多肽同时介导胞吞和膜融合的验证
利用共聚焦激光扫描显微镜对脂质体纳米疫苗的递送行为进行追踪，并通过膜融合和胞吞抑制剂监测被抑制后的脂质体纳米疫苗的胞内递送效率。具体如下，将带有靶向性多肽的脂质体纳米疫苗设置为实验组，不带靶向性多肽的脂质体纳米疫苗设置为对照组，执行同样的实验操作。树突状细胞贴壁后与带有荧光染料的脂质体纳米疫苗共孵育后，对树突状细胞的溶酶体和细胞核进行荧光染色。通过不同的激发和发射波长在共聚焦显微镜下区分脂质体纳米疫苗，溶酶体和细胞核，并观察脂质体在树突状细胞内的分布。另外，通过提前将树突状细胞与膜融合或胞吞抑制剂共孵育来封闭或破坏树突状细胞的膜融合和胞吞能力，再加入脂质体纳米疫苗与树突状细胞共孵育，最后通过流式细胞术监测树突状细胞对脂质体纳米疫苗的摄取效率。
(2)氧化铁纳米颗粒具有佐剂作用及其机理研究
将含有氧化铁纳米颗粒的组分(IONP-C/O@LP，IONP)与其对应的不含氧化铁纳米颗粒的组分(C/O@LP，PBS)与树突状细胞共孵育，检测树突状细胞的成熟率(CD86，树突状细胞成熟的表面标志物)。此外，比较各组分与树突状细胞孵育后细胞内活性氧物质产生的含量(DCFH-DA：活性氧物质检测试剂)。
(3)脂质体纳米疫苗激活体内抗原特异性T细胞
脂质体纳米疫苗通过尾骨皮下注射打入荷瘤小鼠体内，免疫三次后将小鼠的肿瘤和脾脏取出制备成单细胞悬液，通过流式细胞术检测肿瘤组织中成熟DC 细胞和抗原特异性T细胞的比例，以及脾脏中的抗原特异性T细胞比例，从而判断脂质体纳米疫苗对局部免疫及系统免疫的激活效果。
(4)脂质体纳米疫苗在不同肿瘤模型上的抗肿瘤效果
在小鼠体内接种B16-OVA细胞建立黑色素瘤模型，或在小鼠体内接种TC-1 细胞建立人类乳头瘤病毒(HPV-16)肿瘤模型。脂质体纳米疫苗通过尾骨皮下注射打入荷瘤小鼠体内，每周注射一次，每两天测量一次免疫小鼠的肿瘤体积，监测肿瘤生长曲线和生存期，直至小鼠到达设定的死亡终点。
实施例1
S1，吸取15mg油酸配位的氧化铁纳米颗粒，用乙醇沉淀，并溶解于10mL 四氢呋喃；
S2，加入150mg带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇，40℃搅拌，反应12h；
S3，用环己烷沉淀，真空抽干溶剂后加入6mL去离子水溶解；
S4，100kDa超滤管超滤三次去除过量的带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇，得到水溶性磁性氧化铁纳米颗粒；
S5，取6mL S4所得的水溶性氧化铁纳米颗粒，加入0.64mg巯基修饰的CpG，室温振荡反应2h后用30kDa超滤管超滤三次除去多余CpG；
S6，加入2.44mg巯基修饰的OVA多肽(OVA257-264，标记为OVAp)，室温振荡反应2h后用30kDa超滤管超滤三次除去多余OVAp，得到共负载抗原OVA 多肽和CpG佐剂的氧化铁纳米颗粒(IONP-C/O)；
利用透射电镜(TEM)表征，图1为IONP-C/O的透射电镜照片。由电镜照片可知，IONP-C/O的平均粒径为10.6±2.0nm，单分散性较好。
实施例2
S1，靶向性多肽P30和DSPE-PEG-mal以2:1的摩尔比加入水和甲醇混合溶剂，反应物在室温下避光搅拌2h。之后用蒸馏水透析48h(MWCO＝3500Da)去除未反应的P30，得到产物DSPE-PEG-P30；
S2，大豆卵磷脂(SPC)，胆固醇(CHO)，DSPE-PEG-P30以10:6:1的质量比溶于氯仿，45℃旋转蒸发得到均匀的磷脂薄膜，在真空干燥箱中常温烘干 24h彻底除去有机溶剂；
S3，12mg实施例1制备的IONP-C/O分散在4mL PBS中，加入干燥的磷脂薄膜中水化，45℃水化30min，磷脂分子发生自组装形成载有IONP-C/O的脂质体IONP-C/O@LP；
S4，通过探针超声进一步处理所得的脂质体(200W，开启5秒，关闭5秒，总共10分钟)。再将脂质体悬液依次从孔径分别为450nm、220nm和100nm的聚碳酸酯膜挤出，以控制IONP-C/O@LP的尺寸；再将脂质体悬浮液以8000rpm 离心10分钟，去除未包封的IONP-C/O。
利用透射电镜(TEM)表征，图2为IONP-C/O@LP在10k(a)和60k(b) 放大倍数下的透射电镜照片。由电镜照片可知，该IONP-C/O@LP纳米疫苗为均匀的球型，每个脂质体内部包裹了几十个负载抗原和佐剂的氧化铁纳米颗粒，从TEM观察到脂质体膜的厚度约为8nm。图3为用动力学光散射(DLS)仪表征的IONP-C/O@LP及其对照组的水合粒径正态分布曲线，IONP,IONP-C/O, C/O@LP,IONP-C/O@L,IONP-C/O@LP的水合粒径分别为22.5nm,27.9nm,135.5nm,174.0nm,197.3nm。
实施例3
S1，将DiD标记的脂质体纳米疫苗IONP-C/O@LP及其不含P30靶向性多肽的对照组IONP-C/O@L以50μg Fe/mL的浓度加入树突状细胞(DC2.4细胞系)贴壁的12孔板中，在37℃孵育6h；
S2，按照说明书加入LysoTracker Green染料，鉴定溶酶体；
S3，细胞固定20min后加入10μL DAPI染料染细胞核。
用共聚焦激光扫描显微镜观察脂质体纳米疫苗在树突状细胞内的分布。使用共聚焦软件ZEN 2009和Image J进行共定位分析。图4为共聚焦激光扫描显微镜照片，IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗的荧光一部分分布在树突状细胞的细胞膜上，另一部分与溶酶体的荧光重合，而对照组IONP-C/O@L的荧光几乎完全与溶酶体的荧光重合，说明P30多肽可能改变了纳米疫苗的进细胞通路，不仅通过胞吞进入溶酶体，还有可能与细胞膜发生融合而将内容物递送到细胞质。
实施例4
S1，树突状细胞用膜融合抑制剂甲基-β-环糊精(简写为MBCD，12.5 mg/mL)、胞吞抑制剂沃特曼宁(简写为Wort，450ng/mL)和盐酸氯丙嗪(简写为CPM，4.5μg/mL)或三种抑制剂分别在37℃预处理1h；
S2，FITC标记的IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗及其不含P30靶向性多肽的对照组IONP-C/O@L以50μg Fe/mL的浓度加入预处理过的树突状细胞培养基中，在37℃孵育6h；
S3，将细胞用刮刀分离获得单细胞悬液，使用流式细胞仪分析细胞检测脂质体纳米疫苗被树突状细胞摄取的效率。
图5为IONP-C/O@LP(a)及其对照组IONP-C/O@L(b)被树突状细胞摄取的效率柱状图，IONP-C/O@LP的摄取效率既能被膜融合抑制剂显著抑制，也能被胞吞抑制剂显著抑制，而IONP-C/O@L的摄取效率仅被胞吞抑制剂显著抑制，膜融合抑制剂几乎不影响IONP-C/O@L被树突状细胞摄取，因此IONP-C/O@LP 能同时通过膜融和胞吞进入细胞，而IONP-C/O@L仅通过胞吞进入细胞，说明P30 改变了脂质体纳米疫苗的进细胞通路，从单一的胞吞模式到膜融合和胞吞双入胞模式，与共聚焦激光显微镜照片所得结论一致。
实施例5
S1，将PBS，IONP,C/O@LP,IONP-C/O@LP以50μg Fe/mL或者6.5μg OVAp/mL加入树突状细胞培养基中共孵育12h；
S2，弃去上清液，用刮刀收集树突状细胞得到单细胞悬液；
S3，树突状细胞单细胞悬液与CD16/32抗体4℃孵育10min后，用PE标记的 CD86抗体对成熟树突状细胞进行染色，4℃孵育45min；
S4，用流式细胞仪检测树突状细胞中CD86+细胞的比例。
图6为流式细胞术分析结果的柱状图，IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗提高了对DC细胞的成熟率，显著高于不含氧化铁纳米颗粒的脂质体纳米疫苗C/O@LP，此外氧化铁纳米颗粒IONP与空白对照PBS相比也能显著促进树突状细胞的成熟，说明氧化铁纳米颗粒在该脂质体纳米疫苗(IONP-C/O@LP)中起到了佐剂的作用。
实施例6
S1，同实施例5S1；
S2，弃去培养基，加入提前配制的活性氧物质染料DCFH-DA的染色工作液，终浓度为1mM，染色15min；
S3，弃去染色液，加入4％多聚甲醛固定细胞20min；
S4，加入细胞核染料DAPI染色10min；
S5，用荧光显微镜488nm光源激发，收集500nm-560nm范围的荧光信号，观察树突状细胞内活性氧物质的荧光。
图7为活性氧物质在树突状细胞内的荧光显微镜照片，IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗促进树突状细胞产生大量活性氧物质，显著高于不含氧化铁纳米颗粒的脂质体纳米疫苗C/O@LP。此外氧化铁纳米颗粒IONP与空白对照PBS相比也显著提高了树突状细胞产生的活性氧物质，说明氧化铁纳米颗粒可能通过产生活性氧物质提高了树突状细胞的成熟率。IONP与IONP-C/O@LP产生活性氧物质的差异可能是由于IONP-C/O@LP进入细胞的氧化铁纳米颗粒更多导致。
实施例7
S1，将20只B16-OVA黑色素瘤的C57BL/6荷瘤小鼠随机分为5组(n＝4)，每隔1周尾骨皮下注射100μL IONP-C/O@LP，IONP-C/O，IONP-C/O@L， C/O@LP的PBS分散液和PBS为对照组，共接种三次；
S2，最后一次接种24小时后安乐死小鼠，取出小鼠脾脏和肿瘤，消化成单细胞悬液；
S3，脾脏和部分肿瘤单细胞悬液与CD16/32抗体4℃孵育10min后，用APC 标记的H-2Kb/SIINFEKL四聚体、FITC标记的CD8a抗体、V450标记的CD3抗体对抗原特异性T细胞进行染色，4℃孵育45min；
S4，另一部分肿瘤细胞悬浮液与PE标记的CD11c抗体和APC标记的CD86抗体共孵育用于成熟树突状细胞染色，染色过程同S3；
S5，用流式细胞仪分析脾脏中的抗原特异性T细胞比例，肿瘤组织中的成熟树突状细胞和抗原特异性T细胞比例。
图8为流式细胞术分析结果的柱状图，IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗在肿瘤组织和脾脏中均诱导出了显著高于其它对照组的抗原特异性T细胞，且能提高肿瘤组织中的成熟树突状细胞比例，说明该疫苗组分可以强烈的体内免疫反应，有利于进行抗原特异性的免疫治疗。
实施例8
S1，将40只B16-OVA黑色素瘤的C57BL/6荷瘤小鼠随机分为5组(n＝8)，每隔1周尾骨皮下注射100μL IONP-C/O@LP，IONP-C/O，IONP-C/O@L， C/O@LP和PBS为对照组，共接种三次；
S2，每2天测量一次肿瘤大小，并根据V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积(V)，其中a和b分别代表肿瘤的长度和宽度；
S3，在第16天之后，各组小鼠均被继续喂养以计算生存期。
图9是各组小鼠的肿瘤生长曲线(b)和生存期曲线(c)，可以看出 IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗显著抑制了肿瘤的生长(16天肿瘤体积仅为511 mm3)并显著延长的小鼠的生存期至24天。
实施例9
S1，将IONP-C/O@LP脂质体纳米疫苗中的OVA多肽替换为HPV-16的抗原多肽E749-57，构建IONP-C/E@LP脂质体纳米疫苗，制备过程同实施例1，实施例2；
S2，24只TC-1肿瘤的C57BL/6荷瘤小鼠随机分为4组(n＝6)。每隔1周尾骨皮下注射100μL IONP-C/E@LP，C/E@LP，IONP-C/E@L及PBS，共接种三次；
S3，同实施例8S2；
S3，在第23天停止记录，绘制肿瘤生长曲线。
图10是各组小鼠的肿瘤生长曲线，可以看出IONP-C/E@LP脂质体纳米疫苗在这一肿瘤模型上也能显著抑制肿瘤的生长，16天肿瘤体积仅为22mm3)。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒为共负载抗原和佐剂的氧化铁纳米颗粒，
所述抗原和佐剂的共负载是通过氧化铁纳米颗粒表面马来酰亚胺基团、与巯基修饰的佐剂和巯基修饰的抗原发生点击化学反应实现的。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述抗原的来源包括但不限于肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原；
优选地，所述抗原的种类包括但不限于多肽、核苷酸、多糖或蛋白质，优选为多肽；还优选地，所述抗原为OVA257-264多肽或多肽E749-57。
优选地，所述佐剂选自包括但不限于TLR3，TLR4，TLR7/8，TLR9的配体分子，例如选自CpG。
优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为5-20nm。
优选地，所述纳米颗粒为共负载抗原OVA257-264多肽和CpG佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为IONP-C/O；
或者为共负载抗原多肽E749-57和CpG佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为IONP-C/E。
3.权利要求1-2任一项所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
水溶性的氧化铁纳米颗粒、巯基修饰的佐剂以及巯基修饰的抗原，发生点击化学反应，制备得到所述纳米颗粒；
所述水溶性的氧化铁纳米颗粒表面修饰有马来酰亚胺基团。
优选地，所述水溶性的氧化铁纳米颗粒的制备过程包括：用带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇置换氧化铁纳米颗粒的油酸配体，获得水溶性的氧化铁纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：先将水溶性的氧化铁纳米颗粒与巯基修饰的佐剂振荡反应，反应完成后再向其中加入巯基修饰的抗原，进行振荡反应，得到所述纳米颗粒。
优选地，所述巯基修饰的佐剂为巯基修饰的CpG。
优选地，所述巯基修饰的抗原为半胱氨酸修饰的OVA257-264多肽或多肽E749-57。
5.权利要求1-2任一项所述的纳米颗粒在纳米制剂中的应用；
优选地，所述纳米制剂包括但不限于权利要求7所述的纳米疫苗；
优选地，所述纳米颗粒用于制备纳米疫苗载体或者作为纳米疫苗载体。
6.一种纳米疫苗载体，含有权利要求1-2任一项所述的纳米颗粒。
7.一种纳米疫苗，含有权利要求1-2任一项所述的纳米颗粒或权利要求8所述的纳米疫苗载体。
优选地，所述纳米疫苗包括脂质体和所述纳米颗粒，所述纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性多肽。
优选地，所述纳米疫苗中，每个脂质体内能够包裹一个或更多个所述纳米颗粒。
优选地，所述靶向性的多肽为环状多肽，用于靶向树突状细胞。
8.根据权利要求7所述的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：通过薄膜水化法将所述纳米颗粒包裹在所述脂质体中，制备得到所述纳米疫苗。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：将所述纳米颗粒分散于PBS中，向其中加入干燥的磷脂薄膜进行水化，磷脂分子发生自组装形成载有纳米粒子的脂质体，所述脂质体再经探针超声处理、挤出成型，得到所述纳米疫苗。
9.一种改变纳米制剂进入细胞通路的方法，其特征在于，所述方法包括使用靶向性的多肽修饰纳米制剂的脂质体表面，将活性成分(例如抗原)递送至细胞质。
优选地，所述靶向性的多肽为环状多肽，优选为多肽P30；
优选地，所述纳米制剂包括但不限于权利要求7所述纳米疫苗。
10.氧化铁纳米颗粒作为佐剂的应用；
优选地，氧化铁纳米颗粒作为纳米制剂中的佐剂；
优选地，氧化铁纳米颗粒作为权利要求7所述纳米疫苗中的第二佐剂。
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