JP2014513072A - 腫瘍特異的な細胞表面受容体を認識する抗体に融合された非自己t細胞エピトープおよびその使用 - Google Patents
腫瘍特異的な細胞表面受容体を認識する抗体に融合された非自己t細胞エピトープおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
Description
本発明は、疾患の予防および治療での使用に適切な組成物およびその使用に関する。
序論
がんは、いまだに満たされていない医療の要求がほとんどであり、先進工業国における死亡の主な原因である。免疫系は、適切に活性化されれば、迅速な免疫学的攻撃および拒絶を受ける不適合の移植臓器から明らかなように、非常に大きな可能性を有する。免疫系は、がんの前駆細胞およびがん細胞を認識して殺すことができる。しかしながら、がん治療のための免疫戦略の開発は、これまで成功はあまりしていない。
がんは、いまだに満たされていない医療の要求がほとんどであり、先進工業国における死亡の主な原因である。免疫系は、適切に活性化されれば、迅速な免疫学的攻撃および拒絶を受ける不適合の移植臓器から明らかなように、非常に大きな可能性を有する。免疫系は、がんの前駆細胞およびがん細胞を認識して殺すことができる。しかしながら、がん治療のための免疫戦略の開発は、これまで成功はあまりしていない。
がんワクチンの開発は、いまだに多くの障害と挑戦で特徴付けられる。がんワクチンは、一般に、腫瘍関連抗原(TAA)の認識に基づく。
腫瘍抗原は、以下のような分子である。
1)正常組織に比べてがん細胞でより高濃度でしばしば存在し、一般に自己抗原であり;
2)がん細胞の発生、生存または進行において極めて重要な役割を果たす。
現在のがんワクチン候補の作用機序は、以下に基づくものと考えられる:
1)TAAに対する免疫学的応答の誘導;
2)分子反応の連鎖を引き起こして、がん細胞の死で終わる、腫瘍抗原特異抗体または腫瘍抗原特異的T細胞とがん細胞との間の相互作用。
腫瘍抗原は、以下のような分子である。
1)正常組織に比べてがん細胞でより高濃度でしばしば存在し、一般に自己抗原であり;
2)がん細胞の発生、生存または進行において極めて重要な役割を果たす。
現在のがんワクチン候補の作用機序は、以下に基づくものと考えられる:
1)TAAに対する免疫学的応答の誘導;
2)分子反応の連鎖を引き起こして、がん細胞の死で終わる、腫瘍抗原特異抗体または腫瘍抗原特異的T細胞とがん細胞との間の相互作用。
この方法の主な制限は、非自己抗原に対するT細胞の認識の、本来備わっている制限と関係がある。エフェクターT細胞は、大きい臓器および外来組織の拒絶に効果的であるが、腫瘍抗原は、がんを保持している生物により「コード」されている:つまり自己抗原であるために、がん治療のための腫瘍特異的T細胞の広い適用は制限される。典型的に、免疫系は、いわゆる「寛容」のため、自己抗原に対しては反応しにくく、自己抗原でのワクチン接種は、通常、抗原に対して低結合性での、または非機能性の表現型での、T細胞レパートリーの活性化を導く。これは、がんワクチンに対する挑戦を示す[1]。
腫瘍細胞は、その表面上での抗原提示の比率および範囲が人為的に増加されれば、より良いインデューサーになることができ、最終的にはT細胞免疫の攻撃の標的となることができることが知られている[2]。
最近の報告は、適応免疫応答の誘導は、がんにおけるハーセプチン(トラスツズマブ)のように、治療的抗体の全体的な有効性に寄与する重要なメカニズムであることを示唆する[3]。腫瘍特異的抗体での治療中の抗腫瘍の適応免疫応答の誘導の原因となるメカニズムは、細胞内プロセシングのメカニズムに基づくと考えられる。ハーセプチン抗体でのHER−2陽性腫瘍の治療中、腫瘍細胞は、HER−2特異的T細胞の標的となる[4−5]。感作抗体の存在下では、健常ドナーおよび乳がん患者から生産されるHER2応答性の低結合性T細胞クローンは、クラスI適合、HER−2過剰発現腫瘍細胞を殺すことが示された[6]。さらに、抗−HER−2抗体およびHER−2由来ペプチドでのワクチン接種の併用療法が、第I相臨床試験で試験された[7]。EphA2陽性腫瘍の、特異的CD8 T細胞の認識の亢進は、EphA2リガンドアゴニストでの治療後に、インビトロとインビボの両方で生じる。SCIDマウスでの腫瘍の完全な根絶は、アゴニストリガンドまたはアゴニスト抗−EphA2抗体の投与と、わずかな機能活性のEphA2特異的T細胞の受動伝達とを組み合わせることにより得られた[8]。さらなる免疫原性配列と融合された抗体が、第24回および第25回国際バイオセラピー学会の年次集会に開示されている(CDX−1307およびCDX−1401)[9−11]。
本発明は、制限されないが、がんを含む疾患の治療のための方法に関する。
本発明は、以下に関する:
第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物と組み合わせた、本明細書に記載の第一組成物。
疾患の治療での使用のための、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いるためであり、または用いられる。
以下を生物に投与することによる、疾患を治療する方法:
a)本明細書に記載の第一組成物、および場合により、
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
a)本明細書に記載の第一組成物、および場合により、
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
以下を含む、パーツのキット:
a)本明細書に記載の第一組成物;および
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
a)本明細書に記載の第一組成物;および
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の細胞またはウイルス内に含まれる。
本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記エピトープ部分は、非自己エピトープをコードする核酸を含む。
疾患の治療での使用のための第一組成物であって、ここで、コンジュゲートは、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記組成物は、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質、例えば、抗体またはT細胞集団とともに用いられる、
第一組成物。
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記組成物は、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質、例えば、抗体またはT細胞集団とともに用いられる、
第一組成物。
薬物療法の方法であって、それを必要とする個体に、有効量の本明細書に記載の第一組成物を、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質、例えば抗体またはT細胞集団とともに送達するステップを含む。
がんの予防または治療での使用のための、非自己抗原を含む免疫原性組成物。
がんの予防または治療のための、腫瘍関連抗原でない抗原を含む免疫原性組成物。
ヒトまたは非ヒト動物の疾患の予防または治療のための、いかなるヒトまたは非ヒト動物の疾患とも関連しない抗原を含む免疫原性組成物。
以下を含むパーツのキット:
a)第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、第一組成物;および、
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
a)第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、第一組成物;および、
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
疾患の予防または治療のための薬剤の調製での、または疾患の予防または治療での使用のための、第一組成物の使用であって、ここで前記組成物は、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分;
を含み、
前記標的は、前記第一組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記第一組成物は、内部移行後に提示される際の前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達される。
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分;
を含み、
前記標的は、前記第一組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記第一組成物は、内部移行後に提示される際の前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達される。
前記第一組成物は、リガンド−エピトープコンジュゲートであってよく、前記リガンド−エピトープコンジュゲートは、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
ここで前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される。
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
ここで前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される。
本発明は、一般に、疾患の予防または治療のための方法に関し、その方法は、寛容非感受性(tolerance−insensitive)の免疫応答を誘導するための非自己抗原、および特定の受容体に対する特異性を有するリガンドを使用し、後者は、特定の細胞への寛容非感受性の免疫応答の標的化が可能である。
リガンドは関連する(cognate)受容体(R)に結合して複合体(LR複合体)を形成し、それは内部移行して細胞内の分解経路に向かうことができて、その複合体はペプチドにフラグメント化されることが知られている。これらのペプチドは、次々に、MHCクラスIまたはクラスIIとの複合体で、細胞表面上に提示される。したがって、関連する受容体Rを発現する細胞へのリガンドLの投与は、リガンドのプロテアソームプロセシングの増大をもたらし、その結果として、がん細胞などの細胞の表面上に提示される、LR由来ペプチドの濃度増加をもたらす。
本発明では、細胞は、リガンド−エピトープコンジュゲートなどの第一組成物を細胞へ送達することにより治療の標的として、コンジュゲートなどの組成物は、取り込まれて、それから、その全てまたは一部がプロセシングされて細胞により提示される。エピトープの提示は、細胞を治療の標的とし、それは、免疫応答、または提示されるエピトープを結合することが可能な他の特定の方法によって達成され得る。特に、リガンドが自己標的に結合して、エピトープが非自己エピトープである場合、提示される非自己エピトープに対して生じる免疫応答は、寛容により影響を受けない。
免疫応答は、非自己抗原、またはそのミメトープ(mimetope)を含む免疫原性組成物の送達により、提示される非自己のエピトープに対して生じ得る。免疫原性第二組成物が、第一組成物の前に個体に送達される場合、その個体は、提示されるエピトープと反応する準備のできているT細胞などの免疫細胞の集団を含み得る。要するに、その個体は、非自己エピトープに対してワクチン接種される。
本発明はまた、本明細書に記載の使用または方法に関し、ここで、免疫原性第二組成物は、第一組成物の後に送達され、または第一組成物は免疫原性第二組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に送達される。
本発明では、標的細胞に対する免疫応答の特異性は、リガンド結合により調節され、また、プロセシングされて提示されるエピトープとT細胞との相互作用のレベルで調整することができる可能性もある。
本発明は、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは生物により天然にコードされていないものである;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
組成物を開示する。
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは生物により天然にコードされていないものである;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
組成物を開示する。
前記組成物は、本明細書中で、第一組成物とも呼ばれ得る。
前記組成物のリガンド部分およびエピトープ部分は、異常細胞へのリガンドの結合がエピトープ部分を異常細胞中へ内部移行させて、それから、エピトープを細胞表面上に提示させるように、お互いに適切に関連している。
一態様では、前記第一組成物は、リガンドエピトープコンジュゲートを含んでよく、そのコンジュゲートは、リガンド部分およびエピトープを含む。
前記コンジュゲートのリガンド部分は、化学的架橋によりエピトープ部分に結合されてよい。あるいは、前記コンジュゲートは、リガンド部分およびエピトープ部分を含む融合タンパク質であってよい。別の実施態様では、それらの部分は、ロイシンジッパーのようなタンパク質−タンパク質相互作用により関連があってよい。リガンド部分およびエピトープ部分は、直接結合していてよく、またはリンカーを介してもよい。
別の実施態様では、前記コンジュゲートは、単一の分子であってもよく、その場合、エピトープはリガンド全体の一部分を形成し、例えば、リガンドは合成であり、および/または、リガンドは非自己抗原である。このように、本発明のコンジュゲートは、二重機能性、すなわち、標的および標的細胞により提示され得るエピトープに結合する能力を適切に最小限に含むが、いかなる特異的なコンジュゲーション活性、または、コンジュゲートの2つの異なる要素を結合させる、またはさもなければ関連付けるために行われる方法も、必ずしも必要でない。非自己抗原配列に対する適切なリガンドのコンジュゲーションは、受容体結合、内部移行およびプロテアソーム分解を妨げない。
一態様では、前記組成物は、コンジュゲーション以外によって関連付けられるリガンドおよびエピトープを含んでよい、例えば、エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の生物、例えば細胞またはウイルス内に含まれてよい。本態様では、ウイルスまたは細胞は、リガンドおよびエピトープ部分の両方を提供する。例えば、リガンドおよびエピトープ部分は、ウイルスの2つの要素を形成してよく、天然起源または遺伝子操作のいずれかであり、ウイルスは異常細胞上の標的に結合することができる。ウイルスは、非自己エピトープを含んでよく、またはそれをコードしてよく、したがって、細胞へのウイルスの結合の結果として、非自己エピトープは、異常細胞の表面上に提示されることができる。一態様では、ウイルスはアデノウイルスであってよい。
したがって、一態様では、リガンド部分は、標的細胞の表面上に存在する標的(例えば受容体)と相互作用可能で内部移行可能な、ペプチド、タンパク質、抗体またはウイルスベクターであってよい。
したがって、一態様では、エピトープ部分は、非自己エピトープをコードするDNAまたはRNAのような核酸種を含んでよい。この場合、非自己エピトープの提示は、異常細胞内での核酸種の転写および/または翻訳後に適切に生じる。核酸はリガンドに直接結合または結合してよく、または、例えば同一の種または生物の一部であることにより関連付けられてもよい。
一態様では、エピトープ部分は、1つのペプチドまたは一連のペプチド、またはタンパク質である。
一態様では、第一組成物は、トランスロケーションドメインを含まない。
リガンドに関する標的は、細胞上の受容体または抗原であってよい。一実施態様では、標的は、腫瘍細胞のような異常細胞に特異的であり、または、野生型細胞とは異なる発現パターンを有し、例えば特定の抗原の過剰発現を有する。
一態様では、受容体は腫瘍特異的である。適切な標的であり得る細胞表面腫瘍抗原の1クラスは、受容体型チロシンキナーゼ(RTK)のファミリーである[2]。RTKは、一般に、幅広い範囲のがんタイプにより発現され、疾患の進行に寄与し、増殖性、生存、血管新生および遊走の利益をがん細胞にもたらす。RTKのがん増強機能を考慮すれば、それは、シグナルカスケードを阻害してその発現レベルを減少させるように設計される抗がん治療のための良く知られた標的である。リガンド/RTK結合の通常の条件下では、受容体は細胞膜中で二量体化し、細胞質のチロシン残基を自己リン酸化する。リン酸化RTKは、その結果、E3−リガーゼなどのアダプタータンパク質と相互作用することができ、ユビキチン化およびクラスリン被覆ピットを介した内部移行をもたらす。取り込まれたRTKは、プロテアソーム分解の基質になり得る。RTKの間では、リガンド誘導性の細胞内プロセシングが示されているので、適切な受容体としてHer2/neuおよびEphA2の選択が実験的データにより支持される。他のRTK、例えばEGFR、c−Met、VEGFR1およびVEGFR2もまた、がん細胞でのこれらの受容体に関してリガンド誘導性の受容体分解が示されているので、適切な標的である。
リガンドに関する細胞の標的は、したがって、以下からなる群から選択される受容体型チロシンキナーゼを含んでよい:
受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の、ErbBまたは上皮成長因子(EGF)ファミリー、例えば:EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4;
受容体型チロシンキナーゼのEPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10;EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6);
c/METファミリー(MetおよびRON)およびVEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(KDR/Flk−1)、VEGFR−3(Flt−4)。
さらに、がんなどの疾患で過剰発現して同様の経路の内部移行誘導性の分解を示す他のクラスの受容体もまた、本発明で用いてよい。
標的は、MHC分子と共に提示される抗原であってよい。
非自己(NS)リガンドを結合することが可能で標的細胞へNS−リガンドを送達することが可能な細胞表面分子を同定するために、内部移行および分解の分析を行うことができる。一実施態様では、分析は以下のように行う:受容体を発現する細胞を、異なる濃度(例えば1〜100μg/mL)で異なる時間(例えば1、2、4および6時間)、コントロールリガンドまたはNS−リガンドとともにインキュベートする。細胞をそれから、4℃で10分、TPERバッファー(Pierce)中で溶解させる。30μgの細胞溶解物をSDS PAGEゲル上にロードして電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース上に移して、標準的な技術を用いて、受容体に対する第一抗体でプローブする。HRPまたはAPに結合した第二抗体を、検出試薬として用いることができる。NS−リガンド処理時に細胞上に見られる受容体の量を、濃度測定スキャニングにより定量化する。このタイプの分析の例として、図2を参照のこと:Ansuini H et al.Anti−EphA2 Antibodies with Distinct In Vitro Properties Have Equal In Vivo Efficacy in Pancreatic Cancer.J Oncol.2009;2009:951917。
コンジュゲートなどの前記第一組成物のリガンド部分は、目的とする標的に、特異的にコンジュゲートなどの第一組成物を結合させることを指示可能な、任意の構成要素である。それは、抗体、または、特に標的が細胞の表面上の抗原である場合は抗体の抗原結合フラグメントであってよい。
抗体結合フラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および抗原結合性の誘導体またはそれらのフラグメントを含むことができる。抗体は、IgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDのような任意のクラスであってよい。よく知られた抗原結合フラグメントは、例えば、単一ドメイン抗体(dAb;単一のVLまたはVH抗体ドメインから本質的になる)、単一鎖Fvフラグメント(scFv)、Fabフラグメント、およびF(ab’)2フラグメントを含むFvフラグメントを含む。そのような抗体分子を構築するための方法は、当技術分野でよく知られている。
より詳細には、抗体とは、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、および、免疫グロブリンの抗体結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFvおよびdAbを含む。修飾抗体型が開発されて、それは結合特異性を維持するが、例えば、生物学的特異性、多価性(2より多い結合部位)、および小さなサイズ(例えば、結合ドメインだけ)を含む、望ましい他の特性を有する。単鎖抗体は、通常、由来した元の抗体全体のいくらかのまたは全ての定常領域が欠如している。したがって、単鎖抗体は、抗体全体の使用と関連するいくつかの問題を克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生物学的分子との間の、特定の望ましくない相互作用がない傾向がある。さらに、単鎖抗体は、抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも高い透過性を有することができ、単鎖抗体を、より効率的に、標的の抗原結合部位に局在および結合させることができる。さらに、比較的小さなサイズの単鎖抗体は、レシピエント内でそれが望まない免疫応答を引き起こす可能性を、抗体全体よりも低くする。
各単鎖が第一ペプチドリンカーにより共有結合された1つのVHと1つのVLドメインを有する多重単鎖抗体は、少なくとも1つまたは複数のペプチドリンカーにより共有結合して多重単鎖抗体を形成することができ、単一特異性または多重特異性であり得る。多重単鎖抗体の各鎖は、可変の軽鎖フラグメントと可変の重鎖フラグメントを含み、ペプチドリンカーにより、少なくとも1つの他の鎖に結合している。ペプチドリンカーは、少なくとも15のアミノ酸残基からなる。リンカーアミノ酸残基の最大数は、およそ100である。2つの単鎖抗体は、組み合わさって、二価の二量体としても知られるダイアボディ(diabody)を形成することができる。ダイアボディは2つの鎖と2つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であり得る。ダイアボディの各鎖は、VLドメインに結合されたVHドメインを含む。これらのドメインは、同一鎖上のドメイン間でペアになるのを防ぐのに十分短いリンカーで結合されていて、このようにして、異なる鎖上の相補ドメイン間でのペアリングをもたらして、2つの抗原結合部位を作り出す。
3つの単鎖抗体は、組み合わさって、三価の三量体としても知られるトリアボディ(triabody)を形成することができる。トリアボディは、VLまたはVHドメインのアミノ酸末端が、VLまたはVHドメインのカルボキシル末端に直接融合されて、すなわち、いかなるリンカー配列も無く、構築される。トリアボディは、環状にヘッド−トゥ−テイル(head−to−tail)の形状で配列したポリペプチドを有する3つのFvヘッドを持つ。トリアボディの取り得る構造は、3つの結合部位をお互いから120度の角度で平面内に位置して平面的である。トリアボディは、単一特異性、二重特異性または三重特異性であることができる。
このように、本明細書に記載の方法で有用な抗体は、限定されないが、天然起源の抗体、(Fab’)2のような二価フラグメント、Fabのような単価フラグメント、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、抗原に特異的に結合する同様のものを含む。抗体はまた、当業者に知られた方法で、ポリペプチドまたはポリペプチドの部分に対して生じさせることができる。抗体は、遺伝子産物、またはそのフラグメントでの免疫化により、ウサギまたはマウスなどの動物中に容易に生じる。免疫化マウスは、次々培養されて大量のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造のためのB細胞の元を提供するのに特に有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方とも、本明細書に記載の方法に用いることができるが、特定のタンパク質に対する高い特異性を必要とする条件では、モノクローナル抗体が使用されることが好ましい。
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野で知られている任意の技術を用いることができる(例えば、Kohler&Milstein,Nature 256:495−497(1975);Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983);Cole et al.,pp.77−96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)を参照)。単鎖抗体の生産のための技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために用いることができる。また、遺伝子導入マウス、または他の生物、例えば他の哺乳類を、ヒト化抗体発現のために用いてもよい。あるいは、ファージディスプレイの技術を、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Fabフラグメントを同定するために用いることができる(例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554(1990);Marks et al.,Biotechnology 10:77 O−7’83(1992)を参照)。
標的が受容体の場合、リガンド部分もまた、その受容体に関する天然リガンドまたはその受容体結合フラグメントであってよく;その受容体に結合することが可能なペプチドまたは合成分子のような天然リガンドの模倣物であってよく;または、その受容体に結合することが可能な非天然リガンドまたはその模倣物であってよい。後者の例は、宿主受容体型チロシンキナーゼMetに結合する、リステリア由来の細菌性タンパク質インターナリンBを含む。
第一組成物(例えば、リガンドエピトープコンジュゲート)のリガンド部分は、以下のうちの一つであってよい:EGF、TGF−a、HB−EGF、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン1、2、3、4、EFNA1、2、3、4、5、EFNB1、2、3、幹細胞増殖因子(HGF)、マクロファージ刺激タンパク質(MSP)、VEGF−A、VEGF−CおよびVEGF−D。細胞の受容体(特に、がんの表現型と関連するこれらの受容体)に関する他のリガンドはよく知られている。
一実施態様での第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)のリガンド部分は、本明細書に記載のRTK受容体、例えば以下のRTK受容体のうちの一つ:Her2/neu、EphA2、EGFR、c−Met、VEGFR1およびVEGFR2、または、がんでの過剰発現およびリガンド誘導性の内部移行および分解が立証される任意の他の受容体の、内部移行を誘導することができる。
第一組成物(例えばリガンド−エピトープコンジュゲート)のリガンド部分は、標的に特異的に結合することができる。語句「に特異的に結合する」、「に特異的」または「と特異的に免疫反応性」は、抗体またはリガンドの標的への結合性について言及する場合、一般に、タンパク質および他の生物製剤のような他の可能性のある標的の不均一集団の存在下で、ポリペプチドのような、標的の存在を決定する結合反応を指す。したがって、所定の免疫測定条件下では、特定の結合分子は、特定のペプチドに優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には大量には結合しない。そのような条件下でのポリペプチドまたは他の標的への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される結合分子を必要とする。様々な免疫測定の形式を、特定のタンパク質または他の標的と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために用いてよい。例えば、固相ELISA免疫測定は、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。免疫測定の形式および特異的な免疫反応性を決定するために用いることができる条件の説明に関しては、Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New Yorkを参照のこと。典型的に、特異的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍であり、より典型的には、バックグラウンドの10倍、20倍または100倍よりも多い。
任意の第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)のリガンド部分は、アンキリンタンパク質、またはアンキリンドメインを含むようなその一部分であってよく、またはそれらを含む。ANKドメインは、典型的に、短いループにより結合された2つの逆平行のαへリックスを含む33残基モチーフである。
異常細胞は、野生型の表現型を有さない細胞であり、疾患の表現型と関連する。一態様では、異常細胞はがん細胞である。一態様では、標的細胞は、過剰発現の抗原、例えば、2、3、4、5、10倍またはそれ以上の過剰発現の抗原、例えば腫瘍関連抗原または他の抗原を有する。
第一組成物(例えば、リガンド−エピトープコンジュゲート)のエピトープ部分は、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせであってよい。第一組成物(例えばコンジュゲート)の一部分として含まれるエピトープは、天然または合成の非自己配列を含んでよい。一態様では、エピトープは、細胞傷害性T細胞応答を引き起こすことが可能であってよい。
誤解を避けるために、エピトープ部分内のエピトープは、機能的に、プロセシングおよび提示に対する、T細胞エピトープのようなエピトープの機能を発揮するためだけに必要とされ、第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)の形態でのエピトープとして特異的に提示または作用はしなくてよいが、これもまた可能である。一態様では、第一組成物(例えばリガンド−エピトープコンジュゲート)のエピトープは、第一組成物(例えばコンジュゲート)の関連でエピトープとして作用しない。
上記のとおり、エピトープは、リガンド構成要素の一部分を形成することができ、例えばリガンドが非自己抗原である場合、リガンドとエピトープを一緒にコンジュゲート化させるためのいかなる処置も必要ではないが、それらはコンジュゲートとして予め存在する。
エピトープ部分は、ウイルスまたは細菌のエピトープ、例えば、以下からなる群から選択されるエピトープ:マラリアエピトープ、狂犬病エピトープ、黄熱病エピトープ、インフルエンザウイルスエピトープ、CMVエピトープ、EBVエピトープ、VZVエピトープ、HCVエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、おたふく風邪エピトープ、風疹ウイルスエピトープ、HPVエピトープ、HBVエピトープ、または疾患と関係ない抗原由来のエピトープ、例えばオボアルブミンエピトープ、または合成エピトープを含んでよい。一態様では、エピトープは、FDAまたはEMEAにより承認されたワクチン中に見られる抗原を含む。
エピトープ部分は、T細胞免疫応答が生物中に既に存在する1つまたは複数のエピトープを含んでよい。例えば、エピトープは、小児期のワクチン接種の一環として与えられる抗原であってよく、またはそのような抗原の一部であってよい。
エピトープは、細胞によるエピトープのプロセシングおよび/または提示に役立つと知られている配列と隣り合ってよく、例えば、J Gen Virol.2004 Mar;85(Pt 3):563−72の、「Influence of flanking sequences on presentation efficiency of a CD8+ cytotoxic T−cell epitope delivered by parvovirus−like particles」を参照のこと。
一態様では、第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)は、抗体の重鎖または軽鎖、またはそれらの部分、例えば重鎖、またはその部分、抗体配列または所望の標的に対する結合活性を維持するそれらの部分を有する、融合タンパク質の形態でのインフルエンザエピトープを含む。
融合は、抗体鎖のC末端で行われてよい。
抗体鎖に融合されたエピトープ、またはその部分は、配列GGSGSのようなフレキシブルであり得るリンカー配列を介して結合されてよい。
インフルエンザタンパク質は、以下のようなNPタンパク質の全てまたは一部であってよい:
インフルエンザ核タンパク質由来の、別の第二の、より短いアミノ酸配列は、
である。
である。
あるいは、オボアルブミン配列を使用してよく、例えば、配列
は、抗体鎖または抗体鎖の一部分のC末端に適切に融合される。
は、抗体鎖または抗体鎖の一部分のC末端に適切に融合される。
オボアルブミン由来の、別の第二の、より短いアミノ酸配列は、
である。
である。
本発明はまた、以下に関する:
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、MHC分子と共に前記標的細胞の表面上に提示されることが可能である。
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、MHC分子と共に前記標的細胞の表面上に提示されることが可能である。
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、MHC分子と共に提示されると、エピトープ特異的なT細胞を刺激することが可能である。
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、MHC分子と共に提示されると、T細胞応答を引き起こすことが可能である。
前記MHC分子は、MHCクラス1またはMHCクラス2分子であってよい。
本発明の第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)は、本明細書に記載の第一組成物、および免疫原性組成物(前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む免疫原性組成物)を、適切に個体に投与することにより、疾患を予防または治療する方法で用いられる。
第一組成物を第二組成物からより明確に区別するために、免疫原性組成物は、本明細書中で免疫原性第二組成物と呼ぶことができる。誤解を避けるために、第一および第二組成物は両方とも免疫原性であってよい。
本発明はまた、疾患の治療での使用のための、本明細書に記載の第一組成物(例えばリガンドエピトープコンジュゲート)に関し、ここで、前記第一組成物は、免疫原性第二組成物とともに使用されて、前記免疫原性第二組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含み、または、前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む。
本発明はまた、疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載の第一組成物(例えばリガンド−エピトープコンジュゲート)に関し、ここで、前記第一組成物は、免疫原性第二組成物とともに使用されて、前記免疫原性第二組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含み、または、前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む。
交差反応性とは、前記免疫原性第二組成物の非自己エピトープに対して生じる免疫応答が、リガンド−エピトープコンジュゲートなどの前記第一組成物の、提示された非自己抗原を認識することができることを意味する。
また、そのようなエピトープを共有する、または前記第一組成物(例えばコンジュゲート)とのそのような交差反応性のエピトープを有する免疫原性第二組成物は、第一組成物と「同族の(cognated)」または「同族(cognate)」として本明細書に記載されることができ(例えば、同族の免疫コンジュゲート)、すなわち、そのような免疫原性第二組成物は、コンジュゲートなどの特定の第一組成物との使用に適切である。
一態様では、前記免疫原性第二組成物に対して生じる免疫応答は、コンジュゲートなどの前記第一組成物の提示されるエピトープと特異的に反応性のT細胞を産生する。
本発明はまた、本明細書に記載の使用または方法に関し、ここで、前記免疫原性第二組成物は:先行するいずれかの請求項に記載の第一組成物の前に、または先行するいずれかの請求項に記載の第一組成物の後に送達され、または;
同時に、または実質的に同時に、例えば前記第一組成物と同日に送達される。
同時に、または実質的に同時に、例えば前記第一組成物と同日に送達される。
一態様では、非自己エピトープまたはそのミメトープが、前記第一組成物の一部として送達されて細胞により提示されるとすぐに個体の免疫応答が任意の提示される非自己エピトープに対して反応する準備がされているように、前記免疫原性組成物は前記第一組成物の前に送達される。
一態様では、前記第一組成物は、エピトープに対する既存の免疫を有する個体で使用される。そのような態様では、個体は、非自己エピトープの提示に反応するように免疫学的に準備されているので、前記第一組成物を免疫原性第二組成物とともに送達する必要がないであろう。このように、本態様では、前記第一組成物は、本明細書に記載の免疫原性第二組成物無しで用いられる。
提示エピトープに対する免疫応答を産生するために用いられる免疫原性第二組成物は、免疫療法を与える受動的方法により、例えば提示エピトープに特異的な抗体などの提示エピトープに特異的な作用物質をもたらすことにより、または、提示エピトープに特異的なT細胞集団をもたらすことにより、または、溶解性のT細胞受容体のような身体への送達に適切な形態での提示エピトープに関するT細胞受容体をもたらすことにより、補われ、または置き換えることができる(Molloy et al Current Opinion in Pharmacology 2005,5:438−443およびImmunocore,http://www.immunocore.com/を参照)。一態様では、前記作用物質は、異常細胞に対して細胞障害性であり、または、異常細胞に対する細胞傷害性の応答を指示することができる。任意の受動的方法は、リガンドエピトープコンジュゲートなどの前記の第一組成物と同族の、本明細書に記載の免疫原性第二組成物の前、後、同時に、または実質的に同時に、用いることができる。
一態様では、免疫原性第二組成物は、ユニバーサルで、異なる疾患の治療に適用可能なように設計される。免疫原性第二組成物は、適切に、CD8およびCD4 T細胞免疫応答のインデューサーであり、そして非自己免疫原である。第一組成物および免疫原性第二組成物中のエピトープは、一般的な配列を共有してよく、および/または同一であってよく、および/または、同一の抗原由来であってよい。第一組成物中、および免疫原性第二組成物内に含まれる免疫原中のエピトープは、感染因子、例えば、リガンドに関して本明細書に記載の任意のもの由来であってよい。免疫原性第二組成物はインフルエンザ核タンパク質のような感染因子由来であってよく、またはオボアルブミンのような他の非自己タンパク質由来であってよい。生の弱毒化病原体は、CD8およびCD4免疫応答の優れたインデューサーであると考えられ、生の弱毒化ウイルスに基づく免疫原は、本発明の実施態様を形成し、場合によりFDAまたはEMEA承認のワクチンの形態での、生の弱毒化麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルス、水痘ウイルス、黄熱病ウイルスおよび狂犬病ウイルスを含む。
免疫原性第二組成物は、抗原性タンパク質全体または免疫原性エピトープを含むその部分を含むことができる。エピトープとは、免疫応答を刺激することが可能な抗原の一部を指す。
前記免疫原性第二組成物は、ヒト集団での使用について適切に承認されたワクチンであってよい。
前記免疫原性第二組成物は、免疫原だけを含んでよく、または、さらなる構成要素、例えば薬学的に許容できる担体または添加剤を含んでよい。
前記免疫原性第二組成物は、タンパク質またはその部分を含むことができ、組み換えタンパク質を含み、または、タンパク質をコードする核酸、例えばDNAまたはRNAを含んでよい。
核酸に基づく免疫原性第二組成物に関して、その核酸は、プロモーター、抗原ペプチドをコードする目的の遺伝子およびポリアデニル化/転写終止配列が挿入された細菌プラスミドベクターの形態で送達されてよい。目的の遺伝子は、タンパク質全体、または免疫応答を引き起こすことが意図される抗原ペプチド配列だけをコードしてよい。プラスミドは、E.coliなどの細菌内で増殖することができ、それから単離されて、宿主へ投与される前に、意図する投与経路に応じた適切な媒体中に調製される。投与に続いて、プラスミドは宿主の細胞により取り込まれ、または、宿主細胞中に直接送達されて、そこで、コードされたペプチドが生産される。プラスミドベクターは、哺乳類の宿主内でのプラスミド複製および関係する動物の染色体DNA内での組み込みを避けるために、好ましくは、真核生物細胞内で機能性がある複製起点を伴わずに作成される。DNAワクチン接種に関する役に立つ背景情報は、Donnellyらの「DNA vaccines」Ann.Rev Immunol.1997 15:617−648に示され、その開示は、その全体で参照により本明細書中に含まれる。核酸は、担体としてゴールドビーズ(gold beads)を用いて送達されてよい。
核酸はまた、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたはMVAを用いて送達されてもよい。アデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスベクター、例えば複製欠損チンパンジーアデノウイルスであってよい。
組み換えウイルスに基づく、免疫原性第二組成物を送達するためのこれらの方法は、現在のところ診療所で試験されており、生の弱毒化の方法よりもさらに強い、CD8およびCD4免疫応答のインデューサーである見込みがある。アデノウイルスベクターおよびHCVおよびマラリア抗原をコードするMVAは、特に異種のプライム・ブースト法での使用の場合に、非常に強力なCD8およびCD4免疫応答を誘導することが証明されている。多くの他の非自己タンパク質を、そのような方法で用いることができる。特に治療方法に関しては、核酸は、抗原部分、またはCMV、EBVまたはインフルエンザ抗原の全部をコードすることができる。これらのウイルスは、ヒト集団においてメモリー型CD8応答を誘導することが知られている。これらの3つの病原体のうちの1つのような、ヒト集団中に常在する病原体に対する既存のT細胞のブーストは、治療用途の一つの選択肢である。
プライム・ブースト法は、免疫原性組成物の送達のために用いてよく、タンパク質またはそのフラグメントが個体へ送達されて、その後に前記タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸が送達される。あるいは、タンパク質またはそのフラグメントの前に核酸が送達されてよい。構成要素は、それぞれ1回または複数回、送達されてよい。
免疫原性第二組成物は、アジュバントと組み合わせて用いて、所望の抗原に対する免疫応答を高めて、長期にわたる保護的で治療的な免疫を誘導することができる。アジュバントは、一般に、抗原に対する特異的な免疫応答を高める、ワクチンまたは免疫原性組成物中の構成要素を指す(例えば、Edelman,AIDS Res.Hum Retroviruses 8:1409−1411(1992)を参照)。
アジュバントは、Th1タイプおよびTh2タイプ応答の免疫応答を誘導する。Th1タイプのサイトカイン(例えば、IFN−γ、IL−2、およびIL−12)は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を好む傾向があり、一方でTh2タイプのサイトカイン(例えば、IL−4、IL−5、II−6、IL−10)は、液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。Th1細胞性免疫応答の選択的刺激が可能なアジュバントは、WO94/00153およびWO95/17209に開示されている。
適切なアジュバントは、サポニン、例えばQS21、リピドA誘導体、例えばMPLまたは3D−MPL、水中油エマルション、例えばMF59およびAS03、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、CpGオリゴヌクレオチド、およびそれらの混合物を含んでよい。また、AGPのような合成アジュバントも用いることができる(Curr Top Med Chem.2008;8(2):64−79,Synthetic TLR4−active glycolipids as vaccine adjuvants and stand−alone immunotherapeutics,Johnson DA)。アジュバントは、TLRアゴニスト、例えばTLR2、TLR3、TLR4、TLR8およびTLR9アゴニストであってよい。組み合せは、GSK社のアジュバント組み合わせであるQS21および3D MPLを有するAS01を含む。
いくつかのアジュバントの総括が、「Expert Rev Vaccines.2007 Oct;6(5):723−39.GlaxoSmithKline Adjuvant Systems in vaccines:concepts,achievements and perspectives.Garcon N et al.に開示されている。他のアジュバントは、VACCINE ADJUVANTS,Infectious Disease,2006,235−255,DOI:10.1007/978−1−59259−970−7_12」に開示されている
Th1タイプ優位の応答を引き起こすのに用いるための好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドA(MPL(登録商標))の組み合わせ、好ましくは3−O−脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL(登録商標))を、場合によりアルミニウム塩とともに含む(例えば、Ribi,et al.,1986,Immunology and lmmunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,pp.407−419;GB2122204B;GB2220211;およびUS4,912,094を参照)。3D−MPL(登録商標)の好ましい形態は、直径が0.2mm未満の小さな粒子サイズを有するエマルションの形態であり、その製造方法はWO94/21292に開示されている。モノホスホリルリピドAおよび界面活性剤を含む水性製剤は、WO98/43670に記載されている。好ましいアジュバントの例は、AS01 B(リポソーム製剤中のMPL(登録商標)およびQS21)、リポソーム製剤中の3D−MPL(登録商標)およびQS21、AS02A(MPL(登録商標)およびQS21および水中油エマルション)、3D−MPL(登録商標)およびQS21および水中油エマルション、およびAS15を含み、GlaxoSmithKlineから入手可能である。MPL(登録商標)アジュバントは、GlaxoSmithKlineから入手可能である(米国特許第4,436,727号;第4,877,611号;第4,866,034号および第4,912,094号を参照)。
CpG含有オリゴヌクレオチド(CpGジヌクレオチドは脱メチル化されている)もまた、Th1優位の応答を誘導する。CpGは、DNA中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略称である。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られていて、例えば、WO96/02555、WO99/33488および米国特許第6,008,200号および第5,856,462号に記載されている。免疫刺激DNA配列もまた、例えば、Satoらによって、Science 273:352(1996)に記載されている。CpGは、免疫原性組成物中に製剤化される場合、一般に、遊離抗原(free antigen)とともに自由溶液(free solution)で投与されて(上記のWO96/02555;McCluskieおよびDavis)、または、抗原に共有結合して(WO98/16247)、または、担体、例えば水酸化アルミニウムとともに製剤化される((肝炎表面抗原)上記のDavisら;Brazolot−Millanら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1998,95(26),15553−8)。CpGは、全身性および粘膜経路の両方で投与することができるアジュバントとして当技術分野で知られている(WO96/02555,EP468520、Davisら、J.Immunol,1998,160(2):870−876;McCluskie and Davis,J.Immunol.,1998,161(9):4463−6)。
別の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣物または誘導体、例えばQuil A、好ましくはQS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.,Framingham,MA)であり、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いてよい。例えば、強化されたシステムは、モノホスホリルリピドA(MPL(登録商標))とサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、WO94/00153に記載のQS21と3D−MPL(登録商標)の組み合わせ、または、WO96/33739に記載の、QS21がコレステロールでクエンチングされた、より小さい反応原性(reactogenic)の組成物を含む。他の好ましい製剤は、水中油エマルションおよびトコフェロールを含む。QS21、3D−MPL(登録商標)およびトコフェロールを水中油エマルション中に含む、特に強力なアジュバント製剤が、WO95/17210に記載されている。本発明での使用のさらなるサポニンアジュバントは、QS7(WO96/33739およびWO96/11711に記載)およびQS17(米国特許第5,057,540号および欧州特許第0362279B1に記載)を含む。
あるいは、サポニン製剤は、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド(polylactide−co−glycolide)粒子、ポリ−N−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖類または化学修飾多糖類からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などと組み合わせてよい。サポニンはまた、コレステロール存在下で製剤化して、微粒子構造、例えばリポソームまたはイスコムの構造(ISCOM’s)を形成することができる。さらに、サポニンは、非微粒子溶液または懸濁液のいずれかで、または、微粒子構造、例えば小層状(paucilamelar)リポソームまたはイスコム(ISCOM(登録商標))で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルとともに製剤化してよい。サポニンはまた、CARBOPOL(登録商標)のような賦形剤とともに製剤化して粘性を高めてもよく、または、ラクトースのような粉状賦形剤とともに、乾燥パウダー形状で製剤化されてよい。
一実施態様では、アジュバントシステムは、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、WO94/00153に記載のQS21と3D−MPL(登録商標)アジュバントの組み合わせ、または、WO96/33739に記載の、コレステロールを含むリポソームでQS21がクエンチングされた、より小さい反応原性の組成物を含む。他の適切な製剤は、水中油エマルションおよびトコフェロールを含む。QS21、3D−MPL(登録商標)アジュバントおよびトコフェロールを水中油エマルション中に用いた、別の適切なアジュバント製剤は、WO95/17210に記載されている。
別の、増強されたアジュバントシステムは、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、WO00/09159に記載の、CpGとQS21の組み合わせを含む。好ましくは、製剤は、水中油エマルションとトコフェロールをさらに含む。
他の適切なアジュバントは、MONTANIDE(登録商標)ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,California,United States)、ISCOMS(登録商標)(CSL)、MF−59(Chiron)、アジュバントのASシリーズ(GlaxoSmithKline,Rixensart,Belgium)、Detox(Corixa)、RC−529(Corixa)および他のアミノアルキルグルコサミニド4−ホスフェート(AGP)、例えば、係属中の米国特許出願番号08/853,826および09/074,720に記載のもの、その開示は、その全体で参照により本明細書中に援用され、および、ポリオキシエチレンエーテルアジュバント、例えばWO99/52549A1に記載のものを含む。Corixa社は、現在GlaxoSmithKlineの子会社である。
他の適切なアジュバントは、MONTANIDE(登録商標)ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,California,United States)、ISCOMS(登録商標)(CSL)、MF−59(Chiron)、アジュバントのASシリーズ(GlaxoSmithKline,Rixensart,Belgium)、Detox(Corixa)、RC−529(Corixa)および他のアミノアルキルグルコサミニド4−ホスフェート(AGP)、例えば、係属中の米国特許出願番号08/853,826および09/074,720に記載のもの、その開示は、その全体で参照により本明細書中に援用され、および、ポリオキシエチレンエーテルアジュバント、例えばWO99/52549A1に記載のものを含む。Corixa社は、現在GlaxoSmithKlineの子会社である。
他の適切なアジュバントは、以下の一般式(I)のアジュバント分子を含む:
HO(CH2CH2O)n−A−R
ここで、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1〜50アルキルまたはフェニルC1〜50アルキルである。
興味深いさらなるアジュバントは、例えばWO2005/112991に記載のように用いられる志賀毒素b鎖である。本発明の一実施態様は、一般式(I)のポリオキシエチレンエーテルを含む免疫原性組成物からなり、ここで、nは1〜50、好ましくは4〜24、最も好ましくは9であり;R構成要素はC1〜50、好ましくはC4〜C20アルキル、最も好ましくはC12アルキルであり、Aは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、0.1〜20%、好ましくは0.1〜10%の範囲であるべきであり、最も好ましくは0.1〜1%の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Merck index(第12版:エントリー7717)に記載されている。これらのアジュバント分子は、WO99/52549に記載されている。
HO(CH2CH2O)n−A−R
ここで、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1〜50アルキルまたはフェニルC1〜50アルキルである。
興味深いさらなるアジュバントは、例えばWO2005/112991に記載のように用いられる志賀毒素b鎖である。本発明の一実施態様は、一般式(I)のポリオキシエチレンエーテルを含む免疫原性組成物からなり、ここで、nは1〜50、好ましくは4〜24、最も好ましくは9であり;R構成要素はC1〜50、好ましくはC4〜C20アルキル、最も好ましくはC12アルキルであり、Aは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、0.1〜20%、好ましくは0.1〜10%の範囲であるべきであり、最も好ましくは0.1〜1%の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Merck index(第12版:エントリー7717)に記載されている。これらのアジュバント分子は、WO99/52549に記載されている。
一態様では、アジュバントは、標的細胞を殺傷するように細胞傷害性T細胞応答を促進するのに効果的である。
核酸の場合、アジュバントは、核酸構成要素自体にコードされた配列であり得る。
本明細書に記載の免疫原性組成物では、アジュバント組成物は、好ましくは、Th1タイプ優位の免疫応答を誘導するように意図されている。本明細書に記載の免疫原性組成物の適用に続いて、患者は、典型的に、Th1およびTh2タイプの応答を含む免疫応答をサポートする。好ましい実施態様では、応答がTh1タイプ優位の場合、Th1タイプのサイトカインのレベルは、Th2タイプのサイトカインのレベルよりも大きな程度までに増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的な分析を用いて容易に評価され得る。サイトカインファミリーの総説に関しては、Janewayらの、Immunobiology,5th Edition,2001を参照。
本発明はまた、疾患、例えば非感染性疾患およびがんの治療または予防での使用のための、非自己エピトープを含む免疫原性組成物などの、ある特定の免疫原性組成物、およびその使用に関する。本発明はまた、がんの治療または予防のための、腫瘍関連抗原ではない非自己エピトープを含む免疫原性組成物に関する。一実施態様では、前記組成物は、腫瘍関連抗原またはエピトープを含まない。一態様では、前記免疫原性組成物は、エピトープを発現する細胞を有する個体において用いられてよい。
本発明はまた、場合により薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、ヒトまたは動物のいかなる疾患とも関連しない抗原またはエピトープを含む免疫原性組成物に関する。一実施態様では、前記抗原は自己抗原ではない。前記抗原は、例えば合成抗原であってよい。前記抗原またはエピトープは、非ヒト、非細菌、非ウイルスのエピトープまたは抗原であってよい。この意味では、免疫原性組成物は、治療が望まれる疾患が何であろうと、全てのヒトで普遍的に用いることができるように生産され得る。前記免疫原性組成物は、非自己抗原に対する免疫応答を産生することが意図されているが、疾患の特異性は、異なる異常細胞を標的化するように選択することのできる、前記第一組成物の前記リガンド部分により達成される。
前記免疫原性第二組成物は、ヒトでの使用に適切であり、薬学的に許容できるアジュバントまたは担体または賦形剤を含んでよい。
細胞によるプロセシングおよび提示は、リガンドエピトープコンジュゲートなどの第一組成物を、前記第一組成物のリガンド部分が標的に結合することを可能にするのに適切な条件下で、細胞に提供することにより、および、同族の免疫原性第二組成物に対して生産された適切なT細胞集団との、細胞の反応性を評価することにより、経験的に評価してよい。
本発明の方法および組成物は、自己抗原の異常な発現と関連する任意の疾患の治療のためであり得ることが理解されよう。本発明の方法および組成物は、固形腫瘍または血液がんであり得るがんの治療のためであってよい。
本発明はまた、以下を含むパーツのキットに関する:
a)リガンド−エピトープコンジュゲートなどの本明細書に記載の第一組成物、および、
b)本明細書に記載の免疫原性第二組成物。
a)リガンド−エピトープコンジュゲートなどの本明細書に記載の第一組成物、および、
b)本明細書に記載の免疫原性第二組成物。
前記第一組成物に関する濃度範囲は、産物の結合特性およびインビボでの親和性および半減期により変更することができ、例えばハーセプチンは、2〜4mg/体重kgで投与される。
本発明の組成物、化合物およびコンジュゲートは、約0.005mg〜約100mg/動物の体重kgの1日投与量で投与してよく、例えば、単回の1日投与量として、または1日当たり2〜6回の分割した投与量で、または徐放性の形態で与えられる。1日投与量の合計は、約0.01mg〜約2000mg、好ましくは約0.1mg〜約20mg/体重kgである。この投与計画は、最適な治療反応を与えるために調節してよい。化合物は、1〜4回/日、好ましくは1回または2回/日の投与計画で投与してよい。
コンジュゲートなどの第一組成物および免疫原性第二組成物の投与量は、異なってよく、それぞれ同一または異なる投与経路により送達されてよい。
任意の特定の患者に関する、特定の投与量レベルおよび投与の頻度は、変更してよく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与の方法および時間、排泄率、薬の組み合わせ、特定の状態の重症度、および治療を受ける宿主を含む様々な要因に依存することが理解されよう。
コンジュゲートなどの第一組成物および免疫原性第二組成物は、それを必要とする患者に、制限されないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口の送達を含む、任意の従来の投与経路によって投与してよい。
免疫原性第二組成物の投与は、その組成物中の材料に依存する。例えば、アデノウイルスに基づくワクチンは、108〜1011ウイルス粒子の範囲での投与量で投与してよく、一方で、MVAに基づくワクチンは、107〜5×108プラーク形成単位の範囲での投与量で投与してよい。複合エピトープなどの第一組成物に対応するワクチンが既に存在する場合は(インフルエンザなど)、推奨される濃度/投与量で投与してよい。
第一組成物または免疫原性第二組成物の各投与量での抗原の量は、典型的な対象で、重大な有害の副作用を起こさずに、免疫防御性の応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の抗原を用いるかによって変化する。一般に、各投与量は、全抗原の1〜1000μg、好ましくは2〜200μgを含むことが予想される。特定の第一組成物または免疫原性第二組成物に関する最適量は、抗体価および対象における他の応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は、例えば2か月後および6か月後に、1または複数のブースター投与を受けてよい。
免疫原性組成物は、ワクチン製剤化(Vollerらにより編集された(University Park Press,Baltimore,Md.U.S.A.1978)、「New Trends and Developments in Vaccines」に一般に記載されるワクチン製剤化)に従って調製してよい。
本発明の特定の態様は以下を含む:
リガンド−エピトープコンジュゲートであって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にあり;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
リガンド−エピトープコンジュゲート。
リガンド−エピトープコンジュゲートであって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にあり;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
リガンド−エピトープコンジュゲート。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、化学的架橋により前記エピトープ部分に結合される。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド部分と前記エピトープ部分とを含む融合タンパク質を発現することにより生産される。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、受容体または抗原である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、腫瘍細胞に特異的であり、または、野生型細胞と異なる発現を有し、例えば過剰発現である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、受容体型チロシンキナーゼである。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記受容体型チロシンキナーゼは、以下からなる群から選択される:
受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の、ErbBまたは上皮成長因子(EGF)ファミリー、例えば:EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4;
受容体型チロシンキナーゼのEPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10;EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6);
c/METファミリー(MetおよびRON);
VEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(KDR/Flk−1)およびVEGFR−3(Flt−4)を含むVEGFファミリー。
受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の、ErbBまたは上皮成長因子(EGF)ファミリー、例えば:EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4;
受容体型チロシンキナーゼのEPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10;EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6);
c/METファミリー(MetおよびRON);
VEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(KDR/Flk−1)およびVEGFR−3(Flt−4)を含むVEGFファミリー。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、抗体、または抗体の抗原結合フラグメントである。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は受容体であり、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、受容体に関するリガンドである。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドは、以下から選択される:
a)天然リガンドまたはその受容体結合フラグメント;
b)リガンドの模倣物、例えばペプチドまたは合成分子;
c)非天然リガンドおよびその模倣物。
a)天然リガンドまたはその受容体結合フラグメント;
b)リガンドの模倣物、例えばペプチドまたは合成分子;
c)非天然リガンドおよびその模倣物。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドに関する前記標的は、受容体型チロシンキナーゼである。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドは、EGF、TGF−a、HB−EGF、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン1、2、3、4、EFNA1、2、3、4、5、EFNB1、2、3、幹細胞増殖因子(HGF)、マクロファージ刺激タンパク質(MSP)、VEGF−A、VEGF−CおよびVEGF−Dから選択される。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記異常細胞は、がん細胞である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせである。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、MHC分子とともに提示されると、細胞傷害性T細胞応答を引き起こすことが可能である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、通常の小児期ワクチン接種が存在する抗原の一部を形成する。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、リガンド構成要素の一部を形成し、およびここで、前記リガンドは非自己抗原である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープ部分は、インフルエンザウイルスエピトープ、CMVエピトープ、EBVエピトープ、VZVエピトープ、HCVエピトープ、HBVエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、風疹ウイルスエピトープ、狂犬病ウイルスエピトープ、黄熱病ウイルスエピトープ、疾患と関連しない抗原、例えばオボアルブミン由来のエピトープ;および合成エピトープからなる群から選択される1つまたは複数のエピトープを含む。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープ部分は、T細胞免疫応答が生物中に既に存在するエピトープを含む。
疾患の治療での使用のための本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物とともに使用される。
疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物とともに使用される。
以下を生物に投与することによる、疾患を治療する方法:
a)本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート、および、
b)前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物。
a)本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート、および、
b)前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物。
本明細書に記載のコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記免疫原性組成物は、
先行するいずれかの請求項に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートの前に、または、
先行するいずれかの請求項に記載のリガンドエピトープコンジュゲートの後に、または、
前記免疫原性組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に、
送達される。
先行するいずれかの請求項に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートの前に、または、
先行するいずれかの請求項に記載のリガンドエピトープコンジュゲートの後に、または、
前記免疫原性組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に、
送達される。
前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で使用される、本明細書に記載のコンジュゲートまたは方法。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で使用され、同族の免疫原性組成物を使用しない。
疾患の予防または治療の方法であって、前記方法は、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートを、同族の免疫原性組成物を使用せずに、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達することを含む。
疾患の治療での、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに用いられる。
薬物療法の方法であって、それを必要とする個体に、有効量の本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートを、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに送達するステップを含む。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記作用物質は、抗体、または抗体全体と同一の標的に結合するそのフラグメント、または細胞傷害性T細胞の集団である。
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記コンジュゲートおよび作用物質は、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む免疫原性組成物とともに用いられる。
非感染性疾患の治療または予防での使用のための、非自己抗原を含む免疫原性組成物。
がんの治療または予防のための、腫瘍関連抗原ではない抗原を含む、本明細書に記載の免疫原性組成物。
本明細書に記載の免疫原性組成物であって、ここで、前記免疫原性組成物は、腫瘍関連抗原を含まない。
いかなる疾患とも関連しない非自己抗原を含む、薬学的に許容できる免疫原性組成物。
本明細書に記載の方法またはコンジュゲートまたは免疫原性組成物であって、ここで、前記免疫原性組成物は、さらにアジュバントを含む。
本明細書に記載の方法または使用または免疫原性組成物であって、ここで、前記アジュバントは、細胞傷害性T細胞応答を促進するのに効果的である。
本明細書に記載の方法または使用であって、ここで、前記使用は、自己抗原の異常な発現と関連する疾患のためである。
本明細書に記載の方法または使用であって、ここで、前記使用は、固形腫瘍または血液がんの治療のためである。
以下を含むパーツのキット:
a)本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート;および、
b)本明細書に記載の免疫原性組成物。
a)本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート;および、
b)本明細書に記載の免疫原性組成物。
本特許明細書中に引用された全ての引用文献または特許出願は、本明細書中に参照により援用される。
本明細書に記載の特定の実施態様は、説明のために示され、本発明の限定としてではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、様々な実施態様において、本発明の範囲から逸脱することなく用いることができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の方法の非常に多くの同等物を、日常的な試験を超えずに認識し、または確認することが可能であろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、請求項により包含される。本明細書で示された全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業者の技術水準を示す。全ての刊行物および特許出願は、それぞれの刊行物または特許出願があたかも具体的に個々に示されて参照により援用されるのと同程度まで、本明細書中に参照により援用される。語句「a」または「an」の使用は、請求項および/または明細書で用語「含む(comprising)」とともに使用される場合、「1つの」を意味し得るが、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」および「1つまたは1より多い」の意味とも一致する。請求項での用語「または」の使用は、明確に代替のみを言及することを指示しない限り、または代替が互いに排他的でない限り、「および/または」を意味するために用いられるが、その開示は、代替のみ、および「および/または」を言及する定義を支持する。本出願全体にわたって、関連のある場合、用語「約」は、ある数値が、デバイス、数値決定に用いられる方法に関する固有の誤差変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
本発明の任意の特徴は、文脈から明らかに別段でない限り、本発明の任意の他の特徴(単数または複数)との慎重な組み合わせとして開示される。
本明細書および請求項(単数または複数)で用いられる語句「含む(comprising)」(およびcomprisingの任意の形、例えば「comprise」および「comprises」)、「有する(having)」(およびhavingの任意の形、例えば、「have」および「has」)、「含む(including)」(およびincludingの任意の形、例えば、「includes」および「include」)または「含む(containing)」(およびcontainingの任意の形、例えば、「contains」および「contain」)は、包含的またはオープンエンド型であり、追加の、列挙されない要素または方法ステップを排除しない。
本明細書において用いられる用語「またはその(それらの)組み合わせ」は、用語の前に挙げられた事項の全ての置換および組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、またはその(それらの)組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つを含むことが意図され、特定の文脈において順番が重要な場合は、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことが意図される。この例で続けて、1つまたは複数の事項または用語の繰り返し、例えば、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から明らかに別段でない限り、典型的に、いかなる組み合わせにおいても事項または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
本明細書に開示されて特許請求の範囲に記載される、全ての組成物および/または方法は、本開示に照らして、過度の実験をせずに作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の観点から記載されているが、そのバリエーションが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱せずに、組成物および/または方法に、および、ステップにおいて、または本明細書に記載の方法の一連のステップにおい、適用され得ることが、当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかな、全てのそのような同様の代替および修飾は、添付の請求項により定められるように、本発明の主旨、範囲および概念内であると見なされる。
本発明がより良く理解され得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は説明の目的のみであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
[実施例]
概念は以下の実験により確認される。
[実施例]
概念は以下の実験により確認される。
リガンドエピトープコンジュゲートは、内部移行特性に関して良く特徴付けられて非自己ペプチド抗原配列に結合された抗体またはリガンドを含む。
免疫原性組成物は、よく知られて確立された免疫原性の形式での非自己配列ペプチドを含む。
インビトロ実験:
非自己リガンドの予備スクリーニングは、インビトロで行うことができる:
腫瘍細胞によってMHC分子上にロードされた非自己ペプチドの直接の測定は、非自己ペプチドとMHCとで形成されたコンジュゲートを認識する特異的な試薬(可溶性TCRまたはTCR模倣抗体)を用いて達成することができる(例えば、非自己エピトープがオボアルブミンポリペプチド内に含まれ、実験がC57Bl/6マウスで行われる場合、抗体は、マウスC57Bl/6 MHCとの関連でovaペプチドを認識し得る)。シンジェニック腫瘍細胞は、リガンド−エピトープコンジュゲートとともにインキュベートされて、細胞表面上のMHCとのペプチド複合体の存在に関して試験される。
非自己リガンドの予備スクリーニングは、インビトロで行うことができる:
腫瘍細胞によってMHC分子上にロードされた非自己ペプチドの直接の測定は、非自己ペプチドとMHCとで形成されたコンジュゲートを認識する特異的な試薬(可溶性TCRまたはTCR模倣抗体)を用いて達成することができる(例えば、非自己エピトープがオボアルブミンポリペプチド内に含まれ、実験がC57Bl/6マウスで行われる場合、抗体は、マウスC57Bl/6 MHCとの関連でovaペプチドを認識し得る)。シンジェニック腫瘍細胞は、リガンド−エピトープコンジュゲートとともにインキュベートされて、細胞表面上のMHCとのペプチド複合体の存在に関して試験される。
また、腫瘍細胞表面上に非自己(NS)ペプチドをロードしていることは、適切なMHCとの関連で非自己ペプチドを特異的に認識するT細胞の活性化状態をモニタリングすることにより、間接的に測定することができる。インビトロでの、一連のシンジェニック腫瘍細胞と非自己ペプチドに特異的なT細胞の共−インキュベーションは、リガンドエピトープコンジュゲートの存在下でのみ、特異的なT細胞の機能の活性化をもたらし、その後、適切なプロセシングおよび提示をもたらす。
NSに特異的なT細胞は、シンジェニックマウスを、上述の免疫原性組成物で免疫化することにより得ることができる。
T細胞活性化を測定するために、様々な分析を用いることができる。
関連のあるIFN−γまたは他のサイトカインは、リガンドエピトープコンジュゲートの存在下でNS特異的T細胞を標的腫瘍細胞とともにインキュベーションした後に、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)または他の分析により測定することができる。
標的腫瘍細胞に対する細胞毒性は、リガンドエピトープコンジュゲート存在下で、活性化T細胞と51Cr標識された標的腫瘍細胞を共−インキュベーションした後に、伝統的な51Cr放出アッセイにより測定することができる。
T細胞増殖は、リガンドエピトープで処理されたシンジェニック腫瘍細胞と、非自己特異的T細胞をインキュベーションした後に観測することができる。
インビボ実験:
免疫療法を試験するために、その方法は、確立されたマウスモデルを用いてインビボで最終的に試験することができる。
免疫療法を試験するために、その方法は、確立されたマウスモデルを用いてインビボで最終的に試験することができる。
2つの構成要素の方法の活性は、自然発生の(すなわちBALB−neuT)および移植マウス腫瘍で試験することができる。免疫原性組成物は、予防的または治療的方法のいずれかで、良く知られ確立された免疫原性の形式で、マウスに送達される。コンジュゲート(例えば、rat−neuに対して反応性の抗体または抗−EPHA2抗体)は、それから、注入されて、自然発生の乳腺腫瘍の増殖がモニターされる。移植腫瘍についての概念を試験するために、様々なマウス腫瘍細胞株が利用可能である。移植モデルでは、マウスは、予防的または治療的方法のいずれかで、免疫原性組成物で免疫化されて、それから、リガンドエピトープコンジュゲート(すなわち、rat−neuに対して反応性の抗体または抗−EPHA2抗体)で処理される。
また、この方法の有効性は、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍でも試験できる。リガンドエピトープコンジュゲートは、内部移行を誘導することが可能なヒト腫瘍受容体に対する(例えば、ヒトHER−2、EphA2またはその他に対する)、抗体またはリガンドを含んでよい。この実験的な設定では、特異的なHLAとの関連(すなわちHLA−A2)で非自己ペプチドを認識するT細胞クローンは、腫瘍移植マウス内で受動的に移行されて、NS−ワクチンのサロゲートとしての役割を果たす。
(実施例1)
CD8 T細胞エピトープを再生するオボアルブミン(OVA)ペプチドに融合した抗−EphA2および抗−ErbB2モノクローナル抗体の、がん細胞への結合は、OVA−特異的CD8 T細胞を刺激する。
CD8 T細胞エピトープを再生するオボアルブミン(OVA)ペプチドに融合した抗−EphA2および抗−ErbB2モノクローナル抗体の、がん細胞への結合は、OVA−特異的CD8 T細胞を刺激する。
細胞株および抗体
細胞株MC38(マウス大腸がん)、C35 Luc(マウスHepa−1c1c7ルシフェラーゼ発現細胞株の突然変異体)、HCT 116(ヒト大腸がん)、A549(ヒト肺腺がん)およびHEK−293−EBNA(ヒト胚腎臓由来)を、ダルベッコ変法イーグル培地(DMeM)(GIBCO)中で培養した。4T1(マウス乳がん)、SKBR3(マウス乳がん)およびTUBO細胞株(BALB−neuTマウス由来の乳腺小葉がん)を、RPMI培地(GIBCO)中で培養した。培地を、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、TUBO細胞に関して20%のFBS、2mMのL−グルタミン、100unit/mLのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンで補充した。
細胞株MC38(マウス大腸がん)、C35 Luc(マウスHepa−1c1c7ルシフェラーゼ発現細胞株の突然変異体)、HCT 116(ヒト大腸がん)、A549(ヒト肺腺がん)およびHEK−293−EBNA(ヒト胚腎臓由来)を、ダルベッコ変法イーグル培地(DMeM)(GIBCO)中で培養した。4T1(マウス乳がん)、SKBR3(マウス乳がん)およびTUBO細胞株(BALB−neuTマウス由来の乳腺小葉がん)を、RPMI培地(GIBCO)中で培養した。培地を、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、TUBO細胞に関して20%のFBS、2mMのL−グルタミン、100unit/mLのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンで補充した。
DMEMコンプリート培地に加えて、400μg/mlおよび250μg/mLのG418を、それぞれC35 LucおよびHEK−293−EBNAに関して用いて、0.1mMの非必須アミノ酸(GIBCO由来のNEAA)を、HEK−293−EBNAに関して加えた。
EBNA−293/EphA2細胞(誘導性プロモーターの制御下で、ヒトEphA2遺伝子で安定的にトランスフェクトされた293細胞株)を、G418(250μg/mL)、ピューロマイシン0.5μg/mlおよびハイグロマイシン50μg/mlを有するコンプリートDMEM中で培養した。
全ての細胞株は、5% CO2雰囲気中37℃で培養した。
全ての細胞株は、5% CO2雰囲気中37℃で培養した。
使用した抗体は以下であった:
ウサギポリクローナル抗−EphA2(Santa Cruz Biotechnology);
ウサギポリクローナル抗−アクチン(Santa Cruz Biotechnology);
ヤギ抗−ヒトIgG1ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート;(Promega);
抗−マウスIgGホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート(Techno Scientific);
抗−ウサギIgGホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート(Sigma);
主要組織適合クラスIとのオボアルブミンのH−2Kb−SIINFEKLペプチドに特異的な25 D1.16(PEコンジュゲート)(eBioscience);
モノクローナル抗−ErbB2(Cell Signaling Tecnology);
抗−EphA2抗体:mAb15および結果として生じるOVAペプチド融合抗体、mAb15−OVApep2およびmAb15−OVApep1[その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基257−264(SIINFEKL)または残基253−267(EQLESIINFEKLTEW)に融合している]は、以下のようにして調製された。
抗−ErbB2(ハーセプチン)および結果として生じるOVAペプチド融合抗体、ハーセプチン−OVAPep2[その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基257−264(SIINFEKL)に融合している]は、以下のようにして調製された。
ウサギポリクローナル抗−EphA2(Santa Cruz Biotechnology);
ウサギポリクローナル抗−アクチン(Santa Cruz Biotechnology);
ヤギ抗−ヒトIgG1ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート;(Promega);
抗−マウスIgGホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート(Techno Scientific);
抗−ウサギIgGホースラディッシュ ペルオキシダーゼ−コンジュゲート(Sigma);
主要組織適合クラスIとのオボアルブミンのH−2Kb−SIINFEKLペプチドに特異的な25 D1.16(PEコンジュゲート)(eBioscience);
モノクローナル抗−ErbB2(Cell Signaling Tecnology);
抗−EphA2抗体:mAb15および結果として生じるOVAペプチド融合抗体、mAb15−OVApep2およびmAb15−OVApep1[その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基257−264(SIINFEKL)または残基253−267(EQLESIINFEKLTEW)に融合している]は、以下のようにして調製された。
抗−ErbB2(ハーセプチン)および結果として生じるOVAペプチド融合抗体、ハーセプチン−OVAPep2[その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基257−264(SIINFEKL)に融合している]は、以下のようにして調製された。
プラスミドおよびアデノウイルスベクター
使用したプラスミドは以下であった:ヒトγ1重鎖に関する発現カセットを含む9.3kbプラスミドであるpEU 1.2 gateway、および、ヒトκ軽鎖に関する発現カセットを含む6.4kbプラスミドであるpEU 3.2。
発現カセットは、EF−1αプロモーター、SV40/ポリA配列および分泌リーダー配列:MGWSCIILFLVATATGを含む。
使用したプラスミドは以下であった:ヒトγ1重鎖に関する発現カセットを含む9.3kbプラスミドであるpEU 1.2 gateway、および、ヒトκ軽鎖に関する発現カセットを含む6.4kbプラスミドであるpEU 3.2。
発現カセットは、EF−1αプロモーター、SV40/ポリA配列および分泌リーダー配列:MGWSCIILFLVATATGを含む。
これらのプラスミドはまた、遺伝子のコピー数およびHEK 293−EBNA由来の一過性発現のレベルを増やすための、エプスタイン・バー複製起点(oriP)も含む。
ヒト抗−EphA2 mAb 15の重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLをコードするDNAフラグメントを、それぞれ、pEU 1.2およびpEU 3.2プラスミドのポリリンカー領域内に、分泌リーダー配列およびγ1またはκ定常領域配列の間にクローニングした。結果として生じたプラスミドを、pEU 1.2 VH15およびpEU 3.2 VL15と命名した。ペプチドSIINFEKL(OVAPep2)またはペプチドEQLESIINFEKLTEW(OVAPep1)を重鎖のC末端にコードするDNAフラグメントをサブクローニング(SfiI/HindIII)するために、プラスミドpEU 1.2 VH15を用いた。前記遺伝子を、ヒト細胞株でのその発現を増やすために、コドン最適化した。結果として生じたプラスミドを、pEU 1.2 VH15−OVAPep2およびpEU 1.2 VH15−OVAPep1と命名した。
ヒト抗−ErbB2ハーセプチンの重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLをコードするDNAフラグメントを、それぞれpEU 1.2およびpEU 3.2プラスミドのポリリンカー領域中に、分泌リーダー配列およびγ1またはκ定常領域配列の間にクローニングした。結果として生じたプラスミドを、pEU 1.2 HHおよびpEU 3.2 HVLと命名した。ペプチドSIINFEKL(OVAPep2)をCH3 C末端配列にコードするDNAをサブクローニング(BsrGI/XbaI)するために、プラスミドpEU 1.2 HHを用いた。その遺伝子を、ヒト細胞株でのその発現を増やすために、コドン最適化した。結果として生じたプラスミドを、pEU 1.2 HH−OVAPep2と命名した。
鶏オボアルブミンを発現する組み換えヒトアデノウイルス血清型5(Ad5 OVA TAG)を、連続継代により増殖して、前述のようにCsCl勾配により精製した。すなわち、15cm培養皿上に植え付けられた2,5×106 HEK 293細胞を、100VP/細胞のMOIで、Ad5OVA TAGで感染させた。完全な細胞変性効果が、感染後約2日で観察された。細胞および上清を回収して、3回凍結融解して、室温(RT)で20分間、2,000rpmでの遠心分離により浄化した。結果として生じた溶解物を、HEK 293細胞上で連続的に継代培養して、レスキューウイルスの力価を増加させた。2つのセルファクトリー(Nunc)の感染およびCsCl勾配での細胞溶解物の精製により、大量調製物を得た。CsCl精製により得られたウイルスを、スライドカセット内に移して、バッファーA195(10mM TRIS、10mM ヒスチジン、5%スクロース、75mM NaCl、1mM MgCl2、0.02% PS−80、0.1mM EDTA、0.5%(v/v)エタノール)に対して透析した。ウイルス粒子の数(VP)を決定するために、CsCl精製されたウイルスを、0.1%ナトリウムドデシルサルフェート−リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、100分の1に希釈した。コントロールとして、バッファーA195を用いた。これらの希釈物を、56℃で10分間インキュベートした。VP/mLの数を、CMV配列内のプライマー/プローブ(6−FAM−TAMRA)を用いた定量リアルタイム逆転写PCR(Taqman)により計算した。同一配列を含むプラスミドを用いて、検量線を準備した。
DNAプラスミド調製
100ngの各プラスミド(pEU1.2 VH15、pEU 1.2 VH15−OVAPep2、pEU 1.2 VH15 OVAPep1、pEU3.2 VL15、pEU 1.2 HHおよびpEU 3.2 HVL)を、E.coli株(DH5α、Invitrogen)に形質転換した。抗生物質選択培地上にストリーキングしたばかりの細菌からシングルコロニーを採取し、アンピシリン(100μg/ml)を含む5mlのLB培地中でインキュベートした。細胞は、激しく振とうして37℃でおよそ6時間インキュベートした。スターター培養を、選択を有する(with selection)LB培地1L中に1:200希釈して、絶え間なく撹拌して一晩培養した。
真核生物細胞のトランスフェクションに必要な大量のプラスミドを、エンドトキシンフリーのPlasmid Giga Kit(Qiagen)によってメーカーの説明書に従って取得した。
100ngの各プラスミド(pEU1.2 VH15、pEU 1.2 VH15−OVAPep2、pEU 1.2 VH15 OVAPep1、pEU3.2 VL15、pEU 1.2 HHおよびpEU 3.2 HVL)を、E.coli株(DH5α、Invitrogen)に形質転換した。抗生物質選択培地上にストリーキングしたばかりの細菌からシングルコロニーを採取し、アンピシリン(100μg/ml)を含む5mlのLB培地中でインキュベートした。細胞は、激しく振とうして37℃でおよそ6時間インキュベートした。スターター培養を、選択を有する(with selection)LB培地1L中に1:200希釈して、絶え間なく撹拌して一晩培養した。
真核生物細胞のトランスフェクションに必要な大量のプラスミドを、エンドトキシンフリーのPlasmid Giga Kit(Qiagen)によってメーカーの説明書に従って取得した。
ペプチド
鶏オボアルブミンのアミノ酸配列257−264(SIINFEKL)に対応する合成ペプチド、および関係のないコントロールペプチドNS3 1480(GAUQNEVTL)を、Peptide Chemistry Unit at IRBM Science Park,Italyにより合成した(95%純度)。ペプチドは、20mg/mLで100%DMSO中に再構成した。
鶏オボアルブミンのアミノ酸配列257−264(SIINFEKL)に対応する合成ペプチド、および関係のないコントロールペプチドNS3 1480(GAUQNEVTL)を、Peptide Chemistry Unit at IRBM Science Park,Italyにより合成した(95%純度)。ペプチドは、20mg/mLで100%DMSO中に再構成した。
α−EphA2およびα−ErbB2 mAbの生産と精製
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen,USA)を用いて、メーカーの説明書に従って、野生型mAbおよびOVAペプチドへのmAb融合物をコードする発現プラスミドで、HEK 293−EBNA細胞を一過的に共−トランスフェクトした。
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen,USA)を用いて、メーカーの説明書に従って、野生型mAbおよびOVAペプチドへのmAb融合物をコードする発現プラスミドで、HEK 293−EBNA細胞を一過的に共−トランスフェクトした。
トランスフェクションの2日前に細胞をまいて、およそ90%の密集度でトランスフェクトした。通常通りに、90μlのLipofectamine 2000および60μgの各プラスミドDNAを、2mlずつの最終容量で、Opti−MEM I 低血清培地(Invitrogen)で別々に希釈した。5分のインキュベーション後、DNAとリポソーム剤を混合して、リポソーム−DNA複合体の形成を可能にするために、一緒に20分間インキュベートした。この時間の間、細胞を一度PBSで洗い、そして一度Opti−MEM培地で洗って、血清と抗生物質を除去した。リポソーム−DNA混合物を、37℃で6時間、16mlのOpti−MEM培地中で細胞に添加した。それから、オーバーレイをIgG産生培地(FBS無しのCD−CHO培地)(GIBCO)で置き換えて、5%のCO2加湿雰囲気中で37℃にてインキュベートした。培養培地は通常、トランスフェクション後10〜12日に回収して、遠心分離(1200rpm、10分間)により浄化して、4〜12%の勾配のSDS−PAGEに続いてクーマシー・ブルー染色により、免疫グロブリン(IgG)産生に関して検査した。
培地中に分泌されたヒトIgG全体(見積もりのIgG濃度が約100〜150mg/L)を、以下のようにしてアフィニティクロマトグラフィーにより精製した:浄化した培養培地(50〜100mL)を、20mMリン酸ナトリウムpH7に平衡化した1mL HiTrap Protein A HP Columns(GE Healthcare)上に、0.5ml/分でローディングした。6カラムボリューム(CV)の20mMリン酸ナトリウムpH7での洗浄ステップに続いて、結合IgGを、6CVの0.1Mグリシン−HClバッファー、pH2.7で溶出した。溶出物質を直ちに1/5容量の1M Tris−HCl、pH9.0で中和した。
製剤の純度を、還元条件下での4〜12%勾配SDS−PAGEに続くクーマシー染色により評価した。タンパク質濃度をBCAアッセイキット(PIERCE)により決定し、プール画分は、使用するまで−80℃で保管した。
細胞溶解物およびウエスタンブロット分析
MC38、4T1、HCT 116およびTUBO細胞を、細胞解離溶液(Sigma)を用いて分離して、PBSで洗浄した。溶解物は、4×10^6の細胞を150uLの溶解バッファー[コンプリートプロテアーゼインヒビター(Roche)を含む、10mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、および0.5%NP40]中に再懸濁することにより調製した。0℃で20分後、抽出物を12,000rpmで10分間、遠心分離により浄化した。タンパク質抽出物は、メーカーの説明書に従ってBCAアッセイキットを用いて定量化した。50μgの各サンプルを、4〜12%のSDS−PAGEにより分解して、ニトロセルロース膜(Millipore Corporation)上に電気ブロットして、同等のサンプルローディングを確認するために抗−EphA2およびα−アクチンでプローブし、続いて抗−ウサギIgG HRPコンジュゲートでプローブした。
MC38、4T1、HCT 116およびTUBO細胞を、細胞解離溶液(Sigma)を用いて分離して、PBSで洗浄した。溶解物は、4×10^6の細胞を150uLの溶解バッファー[コンプリートプロテアーゼインヒビター(Roche)を含む、10mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、および0.5%NP40]中に再懸濁することにより調製した。0℃で20分後、抽出物を12,000rpmで10分間、遠心分離により浄化した。タンパク質抽出物は、メーカーの説明書に従ってBCAアッセイキットを用いて定量化した。50μgの各サンプルを、4〜12%のSDS−PAGEにより分解して、ニトロセルロース膜(Millipore Corporation)上に電気ブロットして、同等のサンプルローディングを確認するために抗−EphA2およびα−アクチンでプローブし、続いて抗−ウサギIgG HRPコンジュゲートでプローブした。
免疫反応性タンパク質を、高化学発光のホスフォイメージャー分析(Super Signal(登録商標)West−Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce)により可視化した。
EphA2およびErbB2陽性細胞でのELISA分析
EphA2陽性細胞でのELISA分析は、ドキシサイクリン(50ug/mL、16時間)で処理された、または処理されていない、MC38、C35 LucおよびEBNA−293/EphA2について行った。
ErbB2陽性細胞でのELISA分析は、SKBR3、MC38およびC35 Lucについて行った。
EphA2陽性細胞でのELISA分析は、ドキシサイクリン(50ug/mL、16時間)で処理された、または処理されていない、MC38、C35 LucおよびEBNA−293/EphA2について行った。
ErbB2陽性細胞でのELISA分析は、SKBR3、MC38およびC35 Lucについて行った。
細胞を非酵素的解離溶液中に回収し、洗浄して、U底96ウェルマイクロタイタープレート(2×105細胞/ウェル)へ移した。6%BSAを含むPBSでブロッティング後、プレートを洗浄して、精製された抗−EpHA2 mAb(mAb15、mAb15−OVAPep2およびmAb15−OVAPep1)または抗−ErbB2 mAb(ハーセプチンおよびハーセプチン−OVAPep2)を、トリプリケートウェルで、ELISAバッファー(PBS/BSA 3%)中、増加する濃度(0.2〜2μM)で添加して、PBSのブランクコントロールとともに、室温で2時間インキュベートした。インキュベーションと遠心分離と上清の除去後、ペレット細胞をPBSで2度洗浄して、抗体検出のために、ペルオキシダーゼコンジュゲート型抗−ヒトIgG1(ELISAバッファー中、1/2500)とともにインキュベートした。1時間後、プレートを遠心分離して、PBSで洗浄して、基質として3,3’,5,5−テトラメチルベンジジン(TMB)(Sigma)を用いて結合抗体を検出した。結合値は、マイクロプレートリーダー(Multilabel Counter Victor 3, Perkin Elmer)を用いた450nmでの吸光度から決定し、少なくとも3つの決定の平均として報告した。
フローサイトメトリーによる抗原提示アッセイ
EphA2およびErbB2陽性細胞に特異的なmAb−OVA融合物によるOVA257−264/H−2Kb複合体の提示を、以下のようにして決定した。
EphA2およびErbB2陽性細胞に特異的なmAb−OVA融合物によるOVA257−264/H−2Kb複合体の提示を、以下のようにして決定した。
マウスのEphA2陽性およびErbB2陽性細胞のMC38およびC35 Luc(アプロタイプ(aplotype)H−2Kb)を、非酵素的解離溶液中に回収して、洗浄して、6ウェルのマイクロタイタープレート(4×105細胞/ウェル)へ移した。細胞を、増加する濃度(50nM〜4uM)の精製された野生型またはOVA−抗体融合物で、37℃で48時間処理した。陽性コントロール細胞として、2μMのペプチドSIINFEKL(OVA257−264)で、37℃で1時間処理した。
インキュベーション後、細胞を回収してFACSチューブ内に移して、FACSバッファー(2mM Hepes、BSA 2%を含むPBS)で洗浄して、1200rpmで10分間遠心分離した。
インキュベーション後、細胞を回収してFACSチューブ内に移して、FACSバッファー(2mM Hepes、BSA 2%を含むPBS)で洗浄して、1200rpmで10分間遠心分離した。
細胞を、MHCクラスIとのOVA257−264/Kb複合体に特異的な25 D1.16抗体PE−コンジュゲートとともにインキュベートした。
室温で1時間、および、激しく振とうして37℃で1時間の後、細胞を、FACSバッファーで2度洗浄した。サンプルを200μlのPBS中に再懸濁して、Becton Dickinson calibur flow cytometer(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
マウス
C57BL/6(H−2Kb)マウスは、Charles River Laboratoryから取得した。全てのマウスは、温度、空気、および光の制御条件下(午前7時〜午後7時に光を当てる)に管理して、適宜、餌と水を与えた。全ての動物は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに概説される基準に従った人道的な世話を受けた。
C57BL/6(H−2Kb)マウスは、Charles River Laboratoryから取得した。全てのマウスは、温度、空気、および光の制御条件下(午前7時〜午後7時に光を当てる)に管理して、適宜、餌と水を与えた。全ての動物は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに概説される基準に従った人道的な世話を受けた。
マウスの免疫化
6週齢の雌C57BL/6(H−2b)マウスを、100μlの滅菌A195バッファー(上記参照)中108 vpのAd5OVATAGで免疫化した。特に、マウスは、125〜250mg/体重kgIP(腹腔内)でのトリブロモエタノール(Avertin)で完全に麻酔して、各後肢の大腿四頭筋へ2回の注射を行った。注射後10日および21日にマウスを安楽死させて、脾臓を回収して、IFN−γ ELIspot分析によるT細胞応答の検出のために処理した。
6週齢の雌C57BL/6(H−2b)マウスを、100μlの滅菌A195バッファー(上記参照)中108 vpのAd5OVATAGで免疫化した。特に、マウスは、125〜250mg/体重kgIP(腹腔内)でのトリブロモエタノール(Avertin)で完全に麻酔して、各後肢の大腿四頭筋へ2回の注射を行った。注射後10日および21日にマウスを安楽死させて、脾臓を回収して、IFN−γ ELIspot分析によるT細胞応答の検出のために処理した。
生体外でのIFN−γ ELISPOT
抗原−特異的T細胞が分泌するIFN−γを、標準的な酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いて検出した。PVDF膜を有する96ウェルプレート(Millipore)を、PBS中10μg/mlに希釈した抗−マウスIFN− 抗体(U−Cytech)100μl/ウェルでコーティングして、4℃で一晩保管した。翌日、200μl/ウェルのR10培地(10%熱不活化FBS、1:100に希釈した1M HEPESバッファー、1:100に希釈した200mM L−グルタミン、1:100に希釈した100×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、1:1000に希釈した55mM 2−メルカプトエタノール(全てGIBCO由来)を有するRPMI培地1640)でウェルをブロッキングして、37℃で2時間インキュベートした。
抗原−特異的T細胞が分泌するIFN−γを、標準的な酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いて検出した。PVDF膜を有する96ウェルプレート(Millipore)を、PBS中10μg/mlに希釈した抗−マウスIFN− 抗体(U−Cytech)100μl/ウェルでコーティングして、4℃で一晩保管した。翌日、200μl/ウェルのR10培地(10%熱不活化FBS、1:100に希釈した1M HEPESバッファー、1:100に希釈した200mM L−グルタミン、1:100に希釈した100×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、1:1000に希釈した55mM 2−メルカプトエタノール(全てGIBCO由来)を有するRPMI培地1640)でウェルをブロッキングして、37℃で2時間インキュベートした。
免疫化されたマウス由来の脾臓をホモジナイズして、ACK溶解バッファー(0.15M NH4Cl、1.0mM KHCO3、0.1M Na2EDTA、pH7.2)(GIBCO)で赤血球を溶解することにより、単一細胞の懸濁液を調製した。細胞を、コンプリートR10培地中に8×106細胞/mlで再懸濁して、2×105および4×105/細胞に相当する25または50μl/ウェルを、デュプリケートでウェルに添加した。
マウス脾細胞由来のOVA−特異的CD8 T細胞を、以下で刺激した:
増加する濃度(50nM〜4μM)の精製抗−EphA2 mAb(mAb15、mAb15−OVAPep2およびmAb15−OVAPep1)で37℃にて48時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、SIINFEKLペプチド(2μM)で37℃にて1時間パルスされた、EphA2陽性細胞C35 Luc(2×105);
精製抗−ErbB2 MAb(ハーセプチンおよびハーセプチン−OVAPep2)4μMで37℃にて48時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、SIINFEKLペプチド(2μM)で37℃にて1時間パルスされた、ErbB2陽性細胞C35 Luc(2×105);
R10培地中に希釈された、50μl/ウェルのSIINFEKLペプチドまたは関係のないコントロールペプチド(最終濃度50ng/ml)もまた、試験ウェルに添加した;50μl/ウェルのR10培地およびDMSO(Sigma)コントロールを、ネガティブ無刺激ウェルへ添加して、10 g/mlでのコンカナバリンA(Sigma)を50μl/ウェル、ポジティブコントロールウェルに添加した。
増加する濃度(50nM〜4μM)の精製抗−EphA2 mAb(mAb15、mAb15−OVAPep2およびmAb15−OVAPep1)で37℃にて48時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、SIINFEKLペプチド(2μM)で37℃にて1時間パルスされた、EphA2陽性細胞C35 Luc(2×105);
精製抗−ErbB2 MAb(ハーセプチンおよびハーセプチン−OVAPep2)4μMで37℃にて48時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、SIINFEKLペプチド(2μM)で37℃にて1時間パルスされた、ErbB2陽性細胞C35 Luc(2×105);
R10培地中に希釈された、50μl/ウェルのSIINFEKLペプチドまたは関係のないコントロールペプチド(最終濃度50ng/ml)もまた、試験ウェルに添加した;50μl/ウェルのR10培地およびDMSO(Sigma)コントロールを、ネガティブ無刺激ウェルへ添加して、10 g/mlでのコンカナバリンA(Sigma)を50μl/ウェル、ポジティブコントロールウェルに添加した。
加湿インキュベーター中、5% CO2、37℃で18〜20時間、プレートをインキュベートした。広範な洗浄(1×PBS、0.005% Tween)後、PBS中のビオチン化抗−マウスIFN− 抗体(U−Cytech)を50ng/ウェル、添加した。プレートを室温で2時間インキュベートして、洗浄バッファーで6回洗浄した。現像液を添加してスポットを現像した:100μl/ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(PharMingen)および1ステップNBT−BCIP(Pierce)。プレートを室温で1時間インキュベートして、再び6回洗浄した。ELISPOTカウンター(AELVIS)を用いて計測された100万脾細胞あたりのIFN−γスポット形成単位(SFU)として結果を表した。培地のみのウェルでのバックグラウンド応答は、ほとんど常に20スポット未満であり、刺激されたウェルで測定されたものから差し引かれた。
結果
抗−EphA2および抗ErbB2 IgG−OVA抗体の生産および特性化
抗−EphA2−OVAおよび抗−ErbB2−OVA融合mAbを生産するために、鶏オボアルブミンOVA257−264(SIINFEKL)または残基OVA253−267(EQLESIINFEKLTEW)由来のよく特徴付けられたH−2Kb−抑制CD8+ T細胞エピトープをコードするDNAを、抗−ヒトEphA2 mAb 15および抗−ErbB2ハーセプチンのCH3 C末端配列に遺伝子的に融合した。
抗−EphA2および抗ErbB2 IgG−OVA抗体の生産および特性化
抗−EphA2−OVAおよび抗−ErbB2−OVA融合mAbを生産するために、鶏オボアルブミンOVA257−264(SIINFEKL)または残基OVA253−267(EQLESIINFEKLTEW)由来のよく特徴付けられたH−2Kb−抑制CD8+ T細胞エピトープをコードするDNAを、抗−ヒトEphA2 mAb 15および抗−ErbB2ハーセプチンのCH3 C末端配列に遺伝子的に融合した。
結果として生じた融合タンパク質、mAb15−OVAPep2(SIINFEKL)、mAb15−OVAPep1(EQLESIINFEKLTEW)およびハーセプチン−OVAPep2(SIINFEKL)を、HEK293−EBNA1細胞株中に一過的に発現させた。野生型mAb15およびハーセプチンもまた、一過的に発現させた。
培養培地中に分泌産物として発現されるコードタンパク質を回収して、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ワンステップのプロテインAアフィニティクロマトグラフィーは、99%より高い純度のタンパク質を産出した。野生型およびOVA−融合抗体は、同程度の発現を示した。およそ55kDaおよび27kDa(図3および図8)の目に見えるタンパク質バンドは、IgGの重鎖および軽鎖を示す。予想どおり、OVA融合抗体の重鎖は、野生型の重鎖に対して遅い移動を示した。
発現されたmAbの収量は、100〜150mg/Lであった。
発現されたmAbの収量は、100〜150mg/Lであった。
がん細胞上のEphA2受容体の発現
異なる腫瘍細胞株で、ウエスタンブロット分析によりEphA2の発現レベルを試験した。高発現レベルの細胞モデルとして293/EphA2を用いた。図4は、異なる細胞株でのEphA2の発現レベルを示す。ヒト(HCT 116)およびマウス(TUBO、MC38および4T1)EphA2陽性細胞は、同レベルのEphA2受容体を発現した。
異なる腫瘍細胞株で、ウエスタンブロット分析によりEphA2の発現レベルを試験した。高発現レベルの細胞モデルとして293/EphA2を用いた。図4は、異なる細胞株でのEphA2の発現レベルを示す。ヒト(HCT 116)およびマウス(TUBO、MC38および4T1)EphA2陽性細胞は、同レベルのEphA2受容体を発現した。
EphA2/ErbB2陽性がん細胞株への、抗−EphA2および抗−ErbB2 mAbの結合
ヒトEphA2への結合について、および、がん細胞株上に提示されたマウスEphA2との交差反応性について、組み換え抗−EphA2 mAbを試験した。同様に、がん細胞株上に提示されたマウスErbB2との交差反応性について、組み換え抗−ヒトErbB2 mAbを試験した。
ヒトEphA2への結合について、および、がん細胞株上に提示されたマウスEphA2との交差反応性について、組み換え抗−EphA2 mAbを試験した。同様に、がん細胞株上に提示されたマウスErbB2との交差反応性について、組み換え抗−ヒトErbB2 mAbを試験した。
mAb15−OVAPep2およびwt mAb15は、マウスおよびヒトEphA2過剰発現細胞株に対して同程度の結合を示した(マウスC35lucおよびMC38細胞株での、およびヒトEBNA−293/EphA2での細胞ELISA)。mAb15−OVAPep1は、野生型mAb15よりも、EphA2陽性細胞への結合が低かった(図5A〜C)。
ハーセプチン−OVApep2は、マウスおよびヒトErbB2過剰発現細胞株に対する親ハーセプチンの親和性と同程度の親和性を維持することが分かった(マウスC35luc、MC38およびヒトSKBR3細胞株での細胞ELISA)(図9A〜C参照)。
抗体の結合は、ヤギ抗ヒトIgG1ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化抗体で検出した。
抗体の結合は、ヤギ抗ヒトIgG1ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化抗体で検出した。
OVAPep2は、腫瘍細胞の表面上に、MHC−Iとの複合体で提示される
抗−EphA2または抗−ErbB2融合OVA mAbで処理されたEphA2−またはErbB2−発現細胞がOVA257−264/Kb複合体を細胞表面上に提示することができるかどうか確認するために、増加する濃度の抗体−OVA融合物とともに、C35 lucおよびMC38細胞をインキュベートした。48時間後に細胞を収集し、特異的なmAb 25D1.16で染色することにより表面OVA257−264/Kb複合体を検出した。
図6および図10に示すように、抗体−OVA融合物との細胞のインキュベーションは、C35 LucおよびMC38細胞における平均蛍光強度(MFI)の用量依存的な増加をもたらした。
これらの結果は、抗体−OVA融合物は、その標的分子(EphA2およびErbB2)に結合すると、標的細胞で効率的に内部移行し、プロセシングされて放出されて、MHCIとの複合体でのOVAペプチド(SIINFEKL)をがん細胞の表面上に提示することを示す。
抗−EphA2または抗−ErbB2融合OVA mAbで処理されたEphA2−またはErbB2−発現細胞がOVA257−264/Kb複合体を細胞表面上に提示することができるかどうか確認するために、増加する濃度の抗体−OVA融合物とともに、C35 lucおよびMC38細胞をインキュベートした。48時間後に細胞を収集し、特異的なmAb 25D1.16で染色することにより表面OVA257−264/Kb複合体を検出した。
図6および図10に示すように、抗体−OVA融合物との細胞のインキュベーションは、C35 LucおよびMC38細胞における平均蛍光強度(MFI)の用量依存的な増加をもたらした。
これらの結果は、抗体−OVA融合物は、その標的分子(EphA2およびErbB2)に結合すると、標的細胞で効率的に内部移行し、プロセシングされて放出されて、MHCIとの複合体でのOVAペプチド(SIINFEKL)をがん細胞の表面上に提示することを示す。
腫瘍細胞の表面上のOvaPep2ペプチド/MHC−I複合体は、遺伝子的ワクチン接種により誘導されたエフェクターCD8 T細胞により認識される。
抗体−OVA融合物の結合に続く、EphA2およびErbB2発現腫瘍細胞上の表面上でのOVA257−264/Kb複合体の形成が、遺伝子的ワクチン接種により誘導されたOVA−特異的CD8 T細胞により認識されるかどうか調べた。この目的を達成するために、マウスをAd5OVA TAG(SIINFEKLペプチドをコードする)で免疫化した。mAb15−OVAPep2またはハーセプチン−OVAPep2で処理したC35 Luc細胞でのインキュベーション時のIFN−γ ELISPOTにより、免疫化マウス由来の脾細胞(ワクチン接種から10日または24日)を試験した。ワクチン誘導OVA−特異的CD8 T細胞は、陽性IFN−γ ELISPOTアッセイにより示されるように(図7および図11)、mAb15−OVAPep2またはハーセプチン−OVAPep2で処理されたEphA2またはErbB2陽性C35 Luc細胞により特異的に認識され、そして活性化された。
結論
結論として、この研究において、本発明者らは、腫瘍特異的な細胞表面受容体を認識するmAbのCH3 C末端配列に融合したT細胞エピトープを用いて、その融合抗体が、露出した腫瘍関連抗原に結合すると標的細胞内に内部移行して、T細胞エピトープがMHC−Iとの複合体で腫瘍細胞表面上に効率的に提示されて、それはワクチン誘導CD8 T細胞の細胞溶解活性の特異的な標的となることを示した。
結論として、この研究において、本発明者らは、腫瘍特異的な細胞表面受容体を認識するmAbのCH3 C末端配列に融合したT細胞エピトープを用いて、その融合抗体が、露出した腫瘍関連抗原に結合すると標的細胞内に内部移行して、T細胞エピトープがMHC−Iとの複合体で腫瘍細胞表面上に効率的に提示されて、それはワクチン誘導CD8 T細胞の細胞溶解活性の特異的な標的となることを示した。
(実施例2)ベクター仲介の、OVAエピトープの提示
本発明者らは、本発明によるTMEMは、標的化部分がウイルスベクター(本実施例ではアデノウイルス血清型5−Ad5を用いた)でありエピトープ部分が細胞−および受容体−特異的な方法でウイルスベクターにより標的細胞中に送達される核酸(DNA)にコードされるものであり得ることを示した。
本発明者らは、本発明によるTMEMは、標的化部分がウイルスベクター(本実施例ではアデノウイルス血清型5−Ad5を用いた)でありエピトープ部分が細胞−および受容体−特異的な方法でウイルスベクターにより標的細胞中に送達される核酸(DNA)にコードされるものであり得ることを示した。
ヒトコクサッキーおよびアデノウイルス受容体(CAR)をコードする発現プラスミドで、マウスJAWSII細胞(アプロタイプH−2Kb)をトランスフェクトした。プラスミドDNAトランスフェクションは、メーカーにより説明されるとおりに、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて行なった。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクトされた細胞および模擬的にトランスフェクトされた細胞を計測して、1〜2×105細胞を96ウェルプレートにまいた(平底プレート;NUNC260860プレートであれば最適である)。細胞をそれから、200のMOI(ifu/mlで計算されたMOI)で48時間、Ad5−OVAベクターで感染させた。
感染後、細胞を回収し、FACSチューブ中に移して、FACSバッファー(2mM Hepes、BSA2%を含むPBS)で洗浄して、1200rpmで10分間遠心分離した。
MHCクラスIとの関連でOVA257−264/Kb複合体に特異的な25 D1.16抗体PE−複合物とともに、細胞をインキュベートした。
室温で1時間および37℃で激しく振とうして1時間後、FACSバッファーで細胞を2度洗浄した。サンプルを200μlのPBSに再懸濁し、Becton Dickinson calibur flow cytometer (BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図12に示す。
結果を図12に示す。
結果は、CAR発現細胞のAd5−OVA感染は、car陰性細胞ではそうでないが、OVA257−264の提示のレベルの増大をもたらすことを示した。
[参考文献]
[参考文献]
Claims (45)
- 第一組成物であって、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある;および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである;
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。 - 疾患の治療での使用のための、請求項1に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いるため、または用いられることを特徴とする、
第一組成物。 - 疾患の治療のための薬剤の調製で用いるための請求項1に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物。 - 疾患を治療する方法であって、
a)請求項1に記載の第一組成物、および、
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物を、
生物に投与することによる、
方法。 - 請求項1に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物と組み合わせた、
第一組成物。 - パーツのキットであって、以下:
a)請求項1に記載の第一組成物;および
b)前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物
を含む、
キット。 - 請求項2から6に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記免疫原性第二組成物は:
請求項1に記載の第一組成物の前に、または
請求項1に記載の第一組成物の後に、または
請求項1に記載の免疫原性第一組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に、
送達される、または送達のためであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第二組成物の前記エピトープに対する既存の免疫を有する個体での使用のためのものである、または前記第二組成物の前記エピトープに対する既存の免疫を有する個体で使用される、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物はリガンド−エピトープコンジュゲートであって、
前記リガンド−エピトープコンジュゲートは、以下:
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にあり;および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
ことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項9に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、化学的架橋により前記エピトープ部分に結合されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項9または10に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記コンジュゲートは、前記リガンド部分および前記エピトープ部分を含む融合タンパク質を発現することにより生産されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の細胞またはウイルス内に含まれることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープ部分は、非自己エピトープをコードする核酸を含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、受容体または抗原であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、腫瘍細胞に特異的であり、または、野生型細胞とは異なる発現を有し、例えば過剰発現であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、受容体型チロシンキナーゼであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項16に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記受容体型チロシンキナーゼは、以下:
受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の、ErbBまたは上皮成長因子(EGF)ファミリー、例えば:EGF R/ErbB1/HER1、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3、およびErbB4/HER4;
受容体型チロシンキナーゼのEPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10;EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6)
c/METファミリー(MetおよびRON);
VEGFR−1(Flt−1)、VEGFR−2(KDR/Flk−1)、およびVEGFR−3(Flt−4)を含む、VEGFファミリー
からなる群から選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンド部分は、抗体、または、抗体の抗原結合フラグメントであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は受容体であり、前記組成物の前記リガンド部分は、前記受容体に関するリガンドであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンドは、以下:
d)天然リガンドまたはその受容体結合フラグメント;
e)ペプチドまたは合成分子のような、リガンドの模倣物;
f)非天然リガンドおよびその模倣物
から選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物のリガンドに関する標的が、受容体型チロシンキナーゼであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンドは、EGF、TGF−a、HB−EGF、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン1、2、3、4、EFNA1、2、3、4、5、EFNB1、2、3、幹細胞増殖因子(HGF)、マクロファージ刺激タンパク質(MSP)、VEGF−A、VEGF−CおよびVEGF−Dから選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記異常細胞は、がん細胞であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、MHC分子とともに提示されると、細胞傷害性T細胞応答などのT細胞応答を引き起こすことが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、MHC分子と共に標的細胞の表面上に提示されることが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、MHC分子と共に提示されると、エピトープ特異的なT細胞を刺激することが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、それに対する通常の小児期ワクチン接種が存在する抗原の一部分を形成することを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、リガンド構成要素の一部を形成し、
前記リガンドは非自己抗原であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記エピトープ部分は、インフルエンザウイルスエピトープ、CMVエピトープ、EBVエピトープ、VZVエピトープ、HCVエピトープ、HBVエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、風疹ウイルスエピトープ、狂犬病ウイルスエピトープ、黄熱病ウイルスエピトープ、疾患と関連しない抗原、例えばオボアルブミン由来のエピトープ、および合成エピトープからなる群から選択される1つまたは複数のエピトープを含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記エピトープ部分は、それに対するT細胞免疫応答が既に前記生物中に存在するエピトープを含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 請求項1および請求項9から31のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記組成物は、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で、同族の免疫原性組成物を使用せずに用いられる、または用いるためであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。 - 疾患の予防または治療の方法であって、
前記方法は、請求項1および請求項9から31のいずれか一項に記載の第一組成物を、同族の免疫原性第二組成物を使用せずに、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達することを含むことを特徴とする、
方法。 - 疾患の治療での使用のための、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、請求項1および請求項9から31のいずれか一項に記載の第一組成物であって、
ここで、前記第一組成物は、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物。 - 薬物療法の方法であって、
それ必要とする個体に、有効量の請求項1および請求項9から31のいずれか一項に記載の第一組成物を、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに送達するステップを含むことを特徴とする、
方法。 - 請求項34または35に記載の第一組成物または方法であって、
前記作用物質は、抗体、または抗体全体と同一の標的に結合するそのフラグメント、または細胞傷害性T細胞の集団であることを特徴とする、
第一組成物または方法。 - 請求項34から35に記載の第一組成物または方法であって、
前記第一組成物および作用物質は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物または方法。 - 免疫原性組成物であって、
非自己抗原を含むことを特徴とする、非感染性疾患の治療または予防での使用のための、免疫原性組成物。 - 請求項38に記載の免疫原性組成物であって、
腫瘍関連抗原でない抗原を含むことを特徴とする、がんの治療または予防のための、
免疫原性組成物。 - 請求項37または38に記載の免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、腫瘍関連抗原を含まないことを特徴とする、
免疫原性組成物。 - 薬学的に許容できる免疫原性組成物であって、
いかなる疾患とも関連しない非自己抗原を含むことを特徴とする、
免疫原性組成物。 - 請求項2から31に記載の組成物、キットまたは方法であって、
前記免疫原性第二組成物は、アジュバントをさらに含むことを特徴とする、
組成物、キットまたは方法。 - 請求項42に記載の組成物、キットまたは方法であって、
前記アジュバントは、細胞傷害性T細胞応答の促進に効果的であることを特徴とする、
組成物、キットまたは方法。 - 先行するいずれかの請求項に記載の組成物、方法またはキットであって、
自己抗原の異常な発現と関連する疾患の治療での使用のための、
組成物、方法またはキット。 - 請求項44に記載の方法または使用であって、
前記使用は、固形腫瘍または血液がんの治療のためであることを特徴とする、
方法または使用。
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