ES2274584T3 - Anticuerpos monoclonales anti-idiotipicos, su uso en inmunoterapia activa de tumores malignos y composiciones que contienen los mismos. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales anti-idiotipicos, su uso en inmunoterapia activa de tumores malignos y composiciones que contienen los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que es específico contra anticuerpos murinos gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado, particularmente contra aquellos que son expresados por células tumorales. El anticuerpo monoclonal es útil como inmunomodulador para el tratamiento del cáncer. Específicamente, el anticuerpo monoclonal anti-idiotipo de la presente invención es capaz de inducir una respuesta predominantemente anti-idiotípica en modelos xenogénicos. El anticuerpo monoclonal anti-idiotipo también ejerce un efecto protector contra tumores malignos en animales.
Description
Anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos, su uso en inmunoterapia activa de
tumores malignos y composiciones que contienen los mismos.
La presente invención se refiere de forma
general a anticuerpos monoclonales anti-idiotípicos
y su uso como inmunomoduladores. Más particularmente, la presente
invención implica un anticuerpo monoclonal murino que fue
desarrollado contra un anticuerpo monoclonal murino reactivo con
gangliósidos que contienen N-glicolil y con
antígenos expresados en células de cáncer; y su efecto inhibitorio
sobre el crecimiento tumoral.
Una de las estrategias para el tratamiento del
cáncer ha sido el uso de inmunoterapia activa, una modalidad de
tratamiento que tiene el objetivo de activar el potencial natural
del sistema inmunológico del huésped contra el tumor.
Desde que Niels Jerne propusiera su teoría de la
red idiotípica en 1974 (Jerne, N. K. 1974. Ann. Immunol.
125C, 373-389), han surgido nuevas
posibilidades en el estudio de terapias eficaces contra el cáncer.
La teoría de Jerne presentaba, por primera vez, el sistema
inmunológico como una red de anticuerpos que pueden interactuar
entre sí y con un gran número de epítopos naturales, a través de sus
regiones variables o idiotipos. (Id).
Este complejo grupo de interacciones
idiotipo-anti-idiotipo funciona para
regular las respuestas inmunes frente a antígenos. Los anticuerpos
hechos en respuesta al antígeno original, llamados Ab1, se vuelven
ellos mismos antígenos y generan la producción de un segundo grupo
de anticuerpos, llamados anticuerpos anti-idiotipo
(anti-Id) o Ab2, que también pueden ser regulados
por otros anticuerpos que son denominados
anti-anti-idiotipo (Ab1' o
Ab3).
La teoría original de Jerne sigue siendo
revisada y se ha mencionado que el resultado de la interacción de
Ab2 con linfocitos que llevan Ab1 no tiene que ser la supresión
necesariamente de la respuesta inmune, pero puede ser la
estimulación de esta respuesta. Además, Jerne limitó su teoría a los
linfocitos B y a los anticuerpos, pero está ahora claro que las
células T juegan un importante papel en la regulación a través de
los idiotipos de receptores de células T (Teitelbaum, D. et
al. 1984 J. Immunol 132,
1282-1285, Zanetti, M, et al. (1986) J.
Immunol. 137, 3140-3196; Powell, J. et
al. (1988) 140, 3266-3272; Baskin, J. G.
et al. (1990) J. Immunol. 145,
202-208; Furuyama, A. et al. (1992)
Anticancer. Res. 12, 27-32;
Raychaudhuri, S. et al. J. Immunol. 131,
271-278; Raychaudhuri et al. (1987) J.
Immunol. 139, 3902-3910, Durrant et
al. (1994) Cancer. Res. 54,
4837-4840).
Un idiotipo se define inmunológicamente por la
reactividad con más de un anti-Id que reconoce a un
determinante idiotípico o idiotopo dentro de un idiotipo dado. Así,
cuando un Ab1 particular expresa múltiples idiotopos, cuando este
Ab1 se administra a animales singeneicos, es obtenida una población
heterogénea de anticuerpos anti-Id.
La clasificación de los anticuerpos
anti-Id se basa en su unión dentro del sitio de
unión del antígeno o a alguna otra región del idiotipo. Si la unión
del Ab2 con el Ab1 es inhibida por el antígeno relevante y si el
Ab2 es también capaz de inducir una respuesta del anticuerpo de la
misma especificidad que el Ab1, éste imita al antígeno natural y es
clasificado como Ab2\beta; este tipo de Ab2 se denomina
anti-idiotipo de imagen interna y pueden actuar
como antígenos sustitutos. Los anti-Id que no son
inhibidos por el antígeno son designados Ab2\alpha, estos Ab2
reaccionan con idiotopos de Ab1 que estructuralmente no están
emparentados con el sitio de unión al antígeno.
En 1984, Bona y Köhler propusieron un tercer
tipo de anticuerpos anti-Id (Ab2\gamma), que se
inhiben por el antígeno debido a interferencias estéricas, este
tipo de anti-Id reacciona con idiotopos
estructuralmente asociados con el sitio de unión del antígeno, pero
no imitan al epítopo antigénico reconocido por el Ab1 (Bona y Köhler
(1984) Anti-idiotypic antibodies and internal
image. En "Monoclonal and anti-idiotypic
antibodies: Probes for receptor structure and function", Venter
J.C., Frasser, C.M., Lindstrom, J. (Eds.) Nueva York, Alan R.
Litises, págs. 141-149, 1984).
Basado en la teoría de Jerne, dos logros
principales han sido desarrollados en el desarrollo de vacunas para
un gran número de antígenos, incluyendo antígenos asociados a
tumores. El primer enfoque está basado en la presentación de
epítopos en un ambiente molecular diferente, usando Ab2\beta. Las
vacunas que contienen este tipo de anticuerpos
anti-Id han sido capaces de inducir respuestas
protectoras contra virus, bacterias, y parásitos (Kennedy et
al. (1986) 232, 220-223; 1047; McNamara
et al. (1985) Science 226,
1325-1326). Los Ab2\beta también han sido usados
para inducir respuestas inmunes frente a antígenos asociados a
tumores y han sido obtenidos resultados positivos en modelos de
animal y en ensayos clínicos (Raychauhuri et al. (1986) J.
Immunol. 137, 1743-1749; Raychauhuri
et al. (1987) J. Immunol. 139,
3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee
et al. (1987) J. Immunol. 139,
1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee
et al. (1988) J. Immunol. 141,
1398-1403; Herlyn, D. et al. (1989)
Intern. Rev. Immunol. 4, 347-357;
Chen, Z-J et al. Cell Imm. Immunother.
Cancer (1990) 351-359; Herlyn, D. et al.
(1991) In Vivo 5, 615-624; Furuya
et al. (1992) Anticancer. Res. 12,
27-32; Mittelman, A. et al. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 89, 466-470;
Durrant, L. G. et al. (1994) Cancer. Res. 54,
4837-4840; Mittelman, A. et al. (1994)
Cancer. Res. 54, 415-421; Schmitt,
H. et al. (1994) Hybridoma 13,
389-396; Chakrobarty, M. et al. (1995) J.
Immunother. 18, 95-103; Chakrobarty, M.
et al. (1995) Cancer. Res. 55,
1525-1530; Foon, K. A. et al. (1995) Clin.
Cancer. Res. 1, 1205-1294; Herlyn, D,
et al. (1995) Hybridoma 14,
159-166; Sclebusch, H. et al. (1995)
Hybridoma 14, 167-174; Herlyn, D.
et al. (1996) Cancer Immunol. Immunother. 43,
65-76). Sin embargo, ha sido demostrado que el
carácter \beta de un Ab2 no es suficiente para predecir el efecto
biológico que podría inducir el Ab2 (Raychauhuri et al.
(1986) J. Immunol. 137, 1743-1749;
Raychauhuri et al. (1987) J. Immunol 139,
231-278; Maruyama et al. (1996) Int. J.
Cancer 65, 547-553).
El segundo enfoque está basado en la
manipulación de la red a través de idiotopos reguladores, que no
están asociados a la unión del antígeno, pero que implican
idiotopos compartidos con otros anticuerpos o células T. Se han
acumulado pruebas de que estos anticuerpos anti-Id
son también capaces de producir respuestas inmunes y efectos
protectores (Paul, W. E. y Bona, C. (1982) Immunology Today
3, 230-234; McNamara M. K. et al.
(1985) Science 226, 1325-1326; Köhler
y col. (1992) Proc. 8º Inter. Cong. Immunol. Budapest, págs.
619).
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que
contienen ácido siálico y que se expresan en la mayoría de las
membranas de células de mamíferos. Aunque estos antígenos estén
presentes en los tejidos normales, pueden ser encontrados en
cantidades más grandes y expresarse en una organización y
conformación diferentes sobre la superficie de células malignas
(Hakomori, S. (1985), Cancer. Res. 45,
2405-2415; Miraldi, F. (1989) XIX Seminarios en
Medicina Nuclear, 282-294; Hamilton et
al. (1993) Int. J. Cancer 53,
1-81).
Aunque los gangliósidos sean objetivos útiles
para las respuestas inmunes, su inmunogenicidad es extremadamente
pobre, debido a su naturaleza de carbohidrato y a su condición de
autoantígeno (Livingston, P. et al., (1995) 6º Seminario
en Biología del Cáncer, 357-366).
La variante de N-glicolil del
ácido siálico se expresa en los tejidos normales de la mayor parte
de mamíferos, pero es muy difícil detectarla en tejidos normales de
humanos (Watarai, S. et al. (1995) J. Biochem.
117, 1062-1069). Por otra parte, la
presencia de estos antígenos ha sido publicada en el cáncer de
colon, melanoma, retinoblastoma y cáncer de mama, entre otros
(Higachi, H. et al. (1984) Jpn. J. Cancer. Res. (Gann)
75, 1025-1029; Higachi, H. et al.
(1985) Cancer. Res. 45, 3796-3802;
Hirabayashi, I et al. (1987) Jpn. J. Cancer. Res.
(Gann) 78, 1614-1620, Higachi, H. et
al. (1980) Jpn. J. Cancer. Res. (Gann) 79,
952-956, Miyake, M. et al. (1990)
Cancer 65, 499-505; Devine, P. L.
et al. (1991) Cancer. Res. 51,
5826-5306; Vázquez, A. M. et al. (1995)
Hybridoma 14, 551-556; Marquina, G. et
al. (1996) Cancer. Res. 56,
5165-5171).
La inmunización con vacunas que contienen
gangliósidos ha causado una supervivencia prolongada de pacientes
de melanoma que desarrollaron anticuerpos
anti-gangliósido (Livingston, P. et al.
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
2911-2915, Livingston, P. et al. (1989)
Cancer. Res. 49, 7045-7050;
Livingston, P. (1995) Immunological Reviews 145,
147-166). Sin embargo, los problemas de los
antígenos, juntos con su pobre inmunogenicidad, han hecho del uso
de los anticuerpos anti-Id una alternativa atractiva
para la inmunoterapia activa en este modelo antígeno. Un anticuerpo
monoclonal anti-Id murino (4C10) fue generado contra
un anticuerpo monoclonal de IgM humano (L612) que reconocía GM3 en
melanoma humano. Sueros de ratones inmunizados con este anticuerpo
monoclonal anti-Id acoplado a hemocianina de lapa
californiana (KLH) reaccionaron fuertemente con una línea celular de
melanoma positiva de antígeno y con GM3 purificado, lo que sugirió
que este anticuerpo monoclonal anti-Id, que lleva
la imagen interna de GM3 (Ab2\beta), puede ser una herramienta
eficaz para inmunoterapia activa específica en pacientes con
melanoma (Yamamoto, S. et al. (1990) J. Natl. Cáncer.
Inst. 82, 1757-1760; Irie, R. F. patente
de EE.UU. Nº. 5.208.146). El VL y VH de este anticuerpo monoclonal
anti-Id ha sido clonado, secuenciado y expresado
como un anticuerpo de IgG1 quimérico de ratón/humano (Hastings, A.
et al. (1992) Cancer. Res. 52,
1681-1686).
También, un anticuerpo monoclonal
anti-idiotipo del tipo alfa, que es útil en
procedimientos inmunodiagnosticos, fue generado contra el
anticuerpo monoclonal humano 1612 (Irie, R. F., patente de EE.UU.
Nº. 5.208.146).
El anticuerpo monoclonal BEC-2,
un anticuerpo monoclonal anti-Id murino generado
contra un anticuerpo monoclonal de ratón que reconocía el
gangliósido GD3 (mAbR24), puede imitar a GD3 e inducir anticuerpos
contra este gangliósido a pesar de la expresión de GD3 en el tejido
de conejo normal (Chapman, P. B. y Houghton, A. N. (1991) 88,
186-192). Los resultados de un estudio piloto
mostraron que BEC-2 más adyuvante BCG aumentaban
considerablemente la supervivencia de pacientes con cáncer de
pulmón de células pequeñas (Scrip Magazine (1996) págs.
56-59; 33ª "American Society of Clinical Oncology
annual meeting" (1997)).
La inmunización de ratas con un anticuerpo
monoclonal murino específico contra GD2 (3F8) generó anticuerpos
monoclonales anti-Id que, cuando se analizaron
inmunógenos en ratones, pudieron estimular anticuerpos que
reaccionaron con el gangliósido GD3. Se sugirió que estos
anticuerpos monoclonales anti-Id podrían ser útiles
en la construcción de vacunas (Cheung, N-K. V. et
al. (1993) Int. J. Cancer 54,
499-505).
También, un anticuerpo monoclonal
anti-Id humano fue generado usando células
mononucleares de sangre periférica de un paciente que fue tratado
con el anticuerpo monoclonal murino 14G2 específico contra GD2. La
inmunización de conejos con este anticuerpo monoclonal
anti-Id humano indujo anticuerpos
anti-GD2 y una respuesta DTH frente a células
tumorales antígeno-positivas. Se sugirió que este
anticuerpo podía ser usado potencialmente como una vacuna
anti-Id humana en pacientes con melanoma maligno
(Saleh, M. N. et al. (1993) J. Immunol 151,
3390-
3398).
3398).
El documento
EP-A-0 657 471 se refiere a
anticuerpos monoclonales anti gangliósido y a su uso en
inmunoterapia activa específica frente a tumores malignos. En
particular, dicho documento describe la generación de un anticuerpo
anti-gangliósido P3 que se une específicamente a
NGcGM3 (el ácido
N-glicolil-neuramónico se unió a la
galactosa interna del gangliósido GM3) y anticuerpos
anti-idiotípicos generados contra dicho anticuerpo
anti-gangliósido P3, cuyos anticuerpos
anti-idiotípicos reconocen el antígeno original,
NGcGM3.
En el artículo "Ganglioside vaccine:
anti-idiotypic monoclonal antibodies as antigen
surrogates" (Iglesias, E., et al. Biotecnologia
Aplicada, vol. 14, Nº. 1, 1997, página 50,
XP-002091466) son descritos siete anticuerpos
monoclonales (MAbs) anti-idiotípicos de lgG1 que
reaccionaron fuertemente con el MAb P3 y no fue observada ninguna
reactividad con los otros Mabs de IgM
anti-gangliósido analizados. Los siete MAbs
anti-idiotípicos tenían la capacidad de bloquear la
unión de P3 a NGcGM3 en un intervalo de concentración entre 1 a 10
\mug/ml. Cinco de estos anti-idiotípicos fueron
capaces de generar una respuesta humoral contra NGcGM3, siendo
clasificados como anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos Ab2\beta y Ab2\alpha.
Por otra parte, Pérez et al. ("What
gangliosides show us about idiotypic networks". Biotecnologia
Aplicada, vol. 14, Nº. 1, 1997, página 42,
XP-002091467) también describe que el anticuerpo
anti-gangliósido P3 generó respuestas fuertes de
anti-idiotípicas IgG (Ab2, títulos de 1/10 000 a
1/50 000) en ratones Balb/c. La mayor parte de estos clones de Ab2
específicos obtenidos fueron capaces de bloquear la unión del MAb P3
a GM3 (NeuGc). Estos anticuerpos, como en el caso anterior
referido, fueron capaces de inducir una respuesta del autoanticuerpo
natural frente a gangliósidos, siendo también clasificados como
anticuerpos anti-idiotípicos Ab2\beta.
Como es evidente a partir de estos antecedentes,
hasta ahora, ningún anticuerpo monoclonal
anti-idiotipo tipo gamma ha sido generado contra
anticuerpos monoclonales que reconocen gangliósidos que contienen
N-glicolilo que, al mismo tiempo, sea capaz de
generar un efecto anti-tumoral en un modelo
animal.
La presente invención se refiere de forma
general a anticuerpos monoclonales (mAb)
anti-idiotípicos (anti-Id) y a su
uso como inmunomoduladores para el tratamiento del cáncer. Más
particularmente, la invención implica un anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico tipo gama (Ab2\gamma) generado
contra un anticuerpo murino contra gangliósidos que contienen
N-glicolilo producidos por el hibridoma depositado
con el número de entrada ECACC 94113026, siendo obtenido el
Ab2\gamma a partir de la línea celular de hibridoma depositada con
el número de entrada ECACC 97112901. Además, la invención implica
dicho hibridoma depositado con el número de entrada ECACC 97112901,
una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de
dicho anticuerpo monoclonal anti-idiotípico, junto
con un diluyente, un adyuvante o una molécula transportadora; y el
uso de dicho anticuerpo monoclonal para la fabricación de un
medicamento para tratar neoplasias malignas.
Conforme a la presente invención, un objeto de
esta invención es proporcionar un nuevo anticuerpo monoclonal
anti-Id capaz de inducir una respuesta
anti-idiotípica predominante en modelos
xenogenéticos y ejercer un efecto protector en ratones u otras
especies de animales que padezcan tumores malignos.
Se inmunizan ratones y otras especies de
mamífero con dosis de 25-200 \mug de anticuerpos
monoclonales anti-gangliósido purificados con o sin
adyuvante y, opcionalmente, acoplados a una proteína de
transporte.
Los animales reciben 2-6 dosis
de anticuerpos monoclonales anti-gangliósido en
intervalos de 14 a 30 días entre dosis. Las rutas de inmunización
posibles son intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o una de sus
combinaciones.
Antes y durante el período de inmunización, son
tomadas muestras de suero de sangre del animal y la respuesta del
nivel de anticuerpo Ab2 es determinada por cualquier método de
inmunoensayo conocido. Las diluciones de suero del animal son
incubadas con el anticuerpo monoclonal
anti-gangliósido usado como inmunógeno, u otros
anticuerpos monoclonales anti-gangliósido que no
sean usados en el protocolo de inmunización.
Los experimentos también fueron realizados para
definir la capacidad del suero de los animales inmunizados para
bloquear la unión del anticuerpo monoclonal
anti-gangliósido usado como inmunógeno respecto a su
antígeno.
Los ratones con altos títulos de anticuerpo Ab2
reciben una nueva inmunización con el anticuerpo monoclonal usado
como inmunógeno tres días antes de la obtención de las células que
producen el anticuerpo. Preferencialmente deberían ser usadas
células de bazo, aunque pueden ser seleccionadas otras células que
produzcan el anti-
cuerpo.
cuerpo.
Estas células son fusionadas con células de
mieloma que proporcionan a las células híbridas o hibridomas la
propiedad de reproducirse in vitro e in vivo. La
fusión celular puede ser realizada por cualquiera de los métodos
conocidos.
Los anticuerpos producidos por los hibridomas
son analizados por métodos de inmunoensayo, preferiblemente por un
ensayo inmuno-enzimático en el cual los
sobrenadantes de hibridoma son incubados con el anticuerpo
monoclonal usado como inmunógeno y con otros anticuerpos
monoclonales anti-gangliósido no usados en las
inmunizaciones.
La capacidad del sobrenadante de hibridoma de
bloquear la unión del anticuerpo monoclonal
anti-gangliósido usado como inmunógeno frente a su
antígeno es determinada incubando los sobrenadantes con diluciones
adecuadas del anticuerpo monoclonal
anti-gangliósido, seguido por la incubación de dicho
anticuerpo con su antígeno.
Los hibridomas seleccionados son clonados al
menos dos veces y los anticuerpos monoclonales resultantes son
producidos in vitro e in vivo, como se describe
anteriormente.
Los anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos obtenidos reconocen a los
anticuerpos monoclonales anti-gangliósido y pueden
poseer la capacidad de bloquear la unión del anticuerpo monoclonal
anti-gangliósido frente a su antígeno.
Se inmunizan monos u otras especies heterólogas
con anticuerpos monoclonales anti-idiotípicos. Estos
anticuerpos monoclonales pueden ser administrados con o sin
adyuvante y opcionalmente pueden ser acoplados a una proteína de
transporte antes de ser usados como inmunógeno.
Cada animal recibió de 2 a 8 dosis de 250 \mug
a 2 mg del anticuerpo monoclonal anti-idiotípico en
intervalos de tiempo de 7 a 30 días entre dosis.
Las rutas de inmunización pueden ser
intradermal, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o una
combinación de estas.
Muestras de sangre del animal son obtenidas
antes y durante el protocolo de inmunización, y la presencia de la
respuesta del anticuerpo Ab3 es controlada usando cualquiera de los
métodos de inmunoensayo conocidos.
La administración del anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico, producido por la inmunización con
anticuerpos monoclonales anti-gangliósido, a
animales puede inducir una respuesta del anticuerpo predominante
contra el idiotipo del anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico usado como inmunógeno, sin la
inducción de la respuesta del anticuerpo específica del
antígeno.
Se administran anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos en una cantidad eficaz con o sin
adyuvantes y opcionalmente acoplados a una proteína de transporte
antes de ser usados. La expresión "cantidad eficaz" debe ser
entendida como una cantidad del anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico requerido para alcanzar un efecto
antitumoral. El tratamiento con los anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos se lleva a cabo antes o después de
la administración experimental de células malignas en animales.
Los animales reciben 1-5 dosis
de 10-200 \mug de los anticuerpos monoclonales
anti-idiotípicos en intervalos de tiempo de
7-30 días entre dosis.
Las rutas de inmunización pueden ser
intradermal, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o una
combinación de estas.
Después del tratamiento con los anticuerpos
monoclonales anti-idiotípicos, la incidencia del
tumor y la supervivencia en el grupo tratado con los anticuerpos
monoclonales anti-idiotípicos puede ser comparada
con los grupos control, tratados de otra manera y mantenidos de la
misma manera.
El tratamiento con anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico aumentó considerablemente la
supervivencia de animales que padecían tumores y disminuyó las
metástasis pulmonar.
Ejemplo
I
Ratones hembra Balb/c, de 6-8
semanas, fueron inmunizados con dos dosis de 50 \mug de anticuerpo
monoclonal purificado P3 (anti-gangliósidos que
contienen N-glicolilo) (Número de entrada del ECACC
94113026, solicitud de patente EP 657471 A1, Vázquez, A. M. et
al., Hybridoma (1995) 14, 551-556)
acoplado a KLH, en intervalos de 14 días entre dosis.
Tres días después de la última inmunización, los
bazos de los ratones con altos niveles de suero de anticuerpos Ab2
contra el anticuerpo monoclonal P3 fueron retirados y fue preparada
una suspensión celular presionando el tejido por un tamiz de acero
inoxidable o inundando el bazo.
La fusión fue realizada por el método descrito
por Köhler y Milstein (1975, Nature (Londres) 256,
495-497), con leves modificaciones.
Células de bazo murinas fueron fusionadas con
las células del mieloma murino no secretantes P3/X63 Ag8 6.5.3,
obtenibles a partir de la ECACC, número de entrada 85011420, en una
relación de 10:1, en 0,5 ml de medio de fusión que contenía
polietilenglicol del 42% en medio RPMI-1640.
Después de la fusión, las células fueron
cultivadas en un medio selectivo de HAT
(hipoxantina-aminopterina y timidina) a 37ºC en una
atmósfera húmeda de CO_{2} del 5%.
Diez a quince días después de la fusión, fue
determinada la evolución de la presencia de anticuerpos en
sobrenadantes de hibridoma por ELISA (ensayo de inmunoabsorción con
enzimas ligadas). Las placas ELISA (de alta unión
COS-TAR) fueron incubadas de la noche a la mañana a
4ºC con 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal P3 y otro anticuerpo
monoclonal anti-gangliósido IgM, en tampón de
carbonato-bicarbonato que tenía un pH de
aproximadamente 9,8.
Las placas, después del lavado con PBS que
contenía TWEEN 20 del 0,05% fueron bloqueadas con el mismo tampón,
que contenía BSA del 1%, durante una hora a 37ºC.
La etapa de lavado fue repetida y fueron
añadidos 50 \mul/pocillo de los sobrenadantes. Después de la
incubación durante 2 horas, las placas fueron lavadas de nuevo, y
fue añadido un antisuero conjugado de la región Fc de IgG
antimurino de cabra de fosfatasa alcalina. Después del lavado,
fueron añadidos 100 \mul/pocillo de la solución de sustrato (1
mg/ml de p-nitrofenilfosfato diluido en tampón de
dietanolamina, pH 9,8). La absorbancia fue medida a 405 nm en un
lector ELISA.
También, la capacidad de los sobrenadantes para
bloquear la unión del anticuerpo monoclonal P3 a NeuGcGM3 fue
determinada por ELISA indirecto realizado sobre placas activadas con
poli(cloruro de vinilo) (ICN-FLOW) con
NeuGcGM3 inmovilizado, de acuerdo con el método siguiente: Cincuenta
microlitros del gangliósido en metanol (4 \mug/ml) fueron
añadidos a cada pocillo. El metanol fue evaporado colocando las
placas a 37ºC durante una hora. Más tarde, fueron añadidos 150
\mul/pocillo de tampón TRIS-HCl 0,05 M, pH 7,8 que
contenía BSA del 1% a cada pocillo y las placas fueron incubadas a
37ºC durante 30 minutos.
Sobrenadantes del hibridoma fueron incubados con
4 \mug/ml de anticuerpo monoclonal P3 durante 3 horas a 37ºC y
después fueron añadidos a cada pocillo 50 \mul de las mezclas, y
las placas fueron incubadas a 37ºC durante 90 minutos.
Los pocillos fueron lavados 4 veces con 200
\mul de PBS, y fueron añadidos 50 \mul de antisuero de conjugado
de inmunoglobulinas antiratón de fosfatasa alcalina,
suficientemente diluidos. Después del lavado con PBS, los pocillos
fueron incubados con la solución del sustrato como se describe
anteriormente.
Fue obtenido un anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico, llamado 1E10, de la subclase IgG1.
Este anticuerpo monoclonal anti-IdP3 1E10 era muy
específico al anticuerpo monoclonal P3 usado como inmunógeno. Éste
no reaccionó con otros anticuerpos
anti-gangliósido, tales como E1, A3 y F6 (figura 1).
Este anticuerpo monoclonal anti-idiotípico fue
capaz de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal P3 a NeuGcGM3
(figura 2) y a una línea celular de tumor de mama P3 positiva.
Ejemplo
II
Fue usado el anticuerpo monoclonal
anti-IdP3 1E10 precipitado por hidróxido de aluminio
para inmunizar intradermalmente monos Cynomologus con una
dosis de 2 mg de anticuerpo monoclonal por inyección en intervalos
de 14 días. Los animales recibieron varias dosis del anticuerpo
monoclonal.
Las muestras de suero fueron tomadas antes y
después de las inmunizaciones. La presencia de respuesta de
anticuerpo Ab3 en el suero de mono fue determinada por ELISA. Las
placas ELISA (de alta unión Costar) fueron incubadas de la noche a
la mañana a 4ºC con 10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal 1E10 o
sus fragmentos F(ab')2 en tampón de
carbonato-bicarbonato, pH 9,8.
Después del lavado, las placas, con PBS que
contenía TWEEN 20 del 0,05%, fueron bloqueadas con el mismo tampón,
que contenía BSA del 1%, durante una hora a 37ºC.
La etapa de lavado fue repetida y fueron
añadidos 50 \mul/pocillo de diferentes diluciones de suero.
Después de la incubación durante 2 horas a 37ºC, las placas fueron
lavadas de nuevo y fueron añadidos inmunoglobulina
anti-humano de cabra de fosfatasa alcalina,
anti-IgM o antisuero de conjugado de
Anti-IgG. Después del lavado, la solución del
sustrato fue añadida como se describe antes.
Fueron realizados experimentos de bloqueo para
distinguir entre las respuestas del anticuerpo
anti-isotípicas y
anti-idiotípicas.
El suero de mono fue incubado de la noche a la
mañana a 4ºC con 500 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal con el
mismo isotipo que el anticuerpo monoclonal 1E10, pero con una
especificidad diferente. La reactividad del suero remanente contra
el anticuerpo monoclonal 1E10 entonces fue medida por ELISA, como se
describe anteriormente.
Los sueros de mono fueron comprobados respecto a
su capacidad de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal P3
biotinilado frente a los fragmentos F(ab')2 del anticuerpo
monoclonal 1E10 sobre placas ELISA revestidas usando el método
ELISA descrito anteriormente, aunque de la incubación de las placas
revestidas con las diluciones de suero, fueron añadidos a cada
pocillo 50 \mul del anticuerpo monoclonal P3 biotinilado. Después
de una incubación durante una hora a 37ºC, las placas fueron
lavadas y fueron añadidos a cada pocillo 50 \mul de complejo
avidin-biotin-peroxidasa y fueron
incubados durante una hora a 37ºC. Después del lavado, fue añadido
el tampón del sustrato (8 mg de o-fenilendiamina en
12 ml de tampón de fosfato-citrato, pH 5,0). La
absorbancia fue medida a 492 nm en un lector de placas ELISA.
Sueros de monos inmunizados con anticuerpo
monoclonal anti-IdP3 1E10 reaccionaron fuertemente
con los fragmentos F(ab')2 1E10 (figura 3). Sueros de monos
inmunizados se unieron específicamente al anticuerpo monoclonal 1E10
inmunizado, con menos reactividad con anticuerpos monoclonales no
relacionados (ior C5). La presencia de anticuerpos frente al
idiotipo 1E10 fue confirmada después de que los sueros del animal
fueran incubados con el anticuerpo monoclonal no pertinente, debido
a una fuerte reactividad de los sueros adsorbidos con el anticuerpo
monoclonal antiideotipo P3 1E10. Sorprendentemente, la respuesta
del anticuerpo anti-idiotípico inducida fue superior
en comparación a la respuesta del anticuerpo
anti-isotípica generada (figura 4). Los sueros de
Ab3 de mono también inhibieron la unión de anticuerpo monoclonal P3
biotinilado frente al anticuerpo monoclonal anti-Id
1E10, indicando que los sueros Ab3 de mono compartían idiotopos con
el anticuerpo monoclonal P3 (figura 5). Una respuesta de anticuerpo
IgG predominante fue generada contra el anticuerpo monoclonal
anti-IdP3 1E10 (figura 6). Sueros de monos
reaccionaron con los fragmentos de F(ab')2 1E10 hasta 4 meses
después de que los animales recibieran la última inmunización
(figura 7). Los anticuerpos Ab3 con capacidad inhibitoria de unión
del mAb P3 a 1E10 también fueron detectados en aquel tiempo. Ningún
anticuerpo contra NeuGcGM3 fue detectado en los sueros de
animales.
animales.
Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico 1E10 es del tipo gamma, ya que el
anticuerpo monoclonal anti-idiotípico 1E10 es capaz
de inhibir la unión del anticuerpo monoclonal P3 con su antígeno y
no es capaz de inducir la producción de anticuerpos del tipo P3 en
los animales.
Ejemplo
III
Fueron inmunizados ratones C57BL/6 con cinco
dosis de 50 \mug de anticuerpo monoclonal
anti-IdP3 1E10 precipitado por hidróxido de
aluminio en intervalos de 14 días. Una semana más tarde, a los
ratones les fue inyectado subcutáneamente 5 x 10^{3} células de
melanoma B16. Los animales que fueron tratados de la misma manera,
pero que no recibieron el anticuerpo monoclonal, fueron usados como
controles. Se muestran las curvas de supervivencia de
Kaplan-Meyer en la figura 8, la supervivencia fue
considerablemente mejor en el grupo que fue inmunizado con
anticuerpo monoclonal anti-IdP3 1E10 que en el grupo
de control.
Se les inoculó intravenosamente a ratones
C57BL/6 con 50 x 10^{3} células Lewis de cáncer de pulmón. Catorce
días más tarde, 10 mg de 1E10 fueron administrados
intravenosamente. Después de 6 días, los ratones fueron
sacrificados y el número de metástasis pulmonar fue contado. Los
animales tratados con un anticuerpo monoclonal IgG no relacionado o
que recibieron sólo PBS fueron usados como controles. Siete de los
10 animales tratados con anticuerpo monoclonal
anti-P3 1E10 no desarrollaron metástasis pulmonar.
En otros 3 animales, el número máximo total de metástasis fue 3. A
la inversa, todos los animales que fueron tratados con IgG1 no
relacionado o que recibieron sólo PBS desarrollaron metástasis
pulmonar. Estos resultados indican que el tratamiento con este
anticuerpo monoclonal anti-Id tipo gama tenía un
efecto protector contra tumores.
La figura 1 muestra la reactividad del
anticuerpo monoclonal anti-IdP3 1E10 contra
anticuerpos monoclonales anti-gangliósido P3, E1,
A3 y F6.
La figura 2 muestra los resultados de un ensayo
de inhibición en el que el anticuerpo monoclonal P3 fue incubado
con el anticuerpo monoclonal anti-IdP3 1E10, y más
tarde la reactividad del anticuerpo monoclonal P3 frente a NeuGcGM3
fue medida por ELISA.
La figura 3 muestra la reactividad de
anticuerpos de suero de mono con los fragmentos F(ab')2 de
1E10 medidos por ELISA después de que el animal recibiera
diferentes dosis del anticuerpo monoclonal de
anti-Id 1E10 precipitado por hidróxido
aluminio.
La figura 4 muestra los resultados de un ensayo
de inhibición, en el que ambas reactividades fueron medidas por
ELISA, la de un suero no-preadsorbido de mono con
anticuerpo monoclonal 1E10 (-\blacksquare-) y la de un suero
no-preadsorbido de mono con anticuerpo monoclonal
ior C5 de isotipo acoplado no relacionado (-\bullet-), así como
la unión de anticuerpos de suero frente a anticuerpos monoclonales
1E10 (-\Box-) y anticuerpo monoclonal ior C5 no relacionado
(-\circ-). Las flechas indican el tiempo de inmunización y las
líneas contínuas el tiempo de toma de las muestras de sangre.
La figura 5 muestra la inhibición de la unión
del anticuerpo monoclonal P3 a el anticuerpo monoclonal
anti-Id 1E10 por el suero de un mono que fue
inmunizado con el anticuerpo monoclonal 1E10, medido por ELISA. Las
flechas indican el tiempo de inmunización y las líneas contínuas el
tiempo de toma de las muestras de sangre.
La figura 6 muestra la cinética de la respuesta
del anticuerpo de IgM e IgG contra el anticuerpo monoclonal 1E10 en
el suero de un mono que fue inmunizado con el anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico, medido por ELISA. Las flechas
indican el tiempo de inmunización y las líneas contínuas el tiempo
de toma de las muestras de sangre.
La figura 7 muestra el reconocimiento de los
fragmentos F(ab')2 1E10 por suero preinmune de mono; por el
suero obtenido después de que el mono recibiera la última dosis de
anticuerpo monoclonal anti-Id 1E10 precipitado por
hidróxido de aluminio (indicado con la flecha), y por el suero
obtenido 4 meses después de que el animal recibiera la última
inmunización.
La figura 8 muestra las curvas de
Kaplan-Meyer para la supervivencia en ratones
tratados con anticuerpo monoclonal anti-IdP3 1E10 e
inoculados con células de melanoma B16.
Claims (4)
1. Un anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico tipo gamma (Ab2\gamma) generado
contra un anticuerpo murino contra gangliósidos que contienen
N-glicolilo producidos por el hibridoma depositado
con el número de entrada ECACC 94113026, siendo el Ab2\gamma
obtenido a partir de la línea celular de hibridoma depositada con el
número de entrada ECACC 97112901.
2. Un hibridoma que produce el anticuerpo
monoclonal de la reivindicación 1, depositado con el número de
entrada ECACC 97112901.
3. Una composición farmacéutica que contiene una
cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico de la reivindicación 1, junto con
un diluyente, un adyuvante o una molécula transportadora.
4. El uso del anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar
neoplasias malignas.
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