KR100567209B1 - 안티-이디오타입 모노클로날 항체, 악성 종양의 능동면역치료법에서의 이들의 용도 및 이들을 함유하는 조성물 - Google Patents
안티-이디오타입 모노클로날 항체, 악성 종양의 능동면역치료법에서의 이들의 용도 및 이들을 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 강글리오시드의 N-글리콜릴 잔기, 특히 암세포에 의해 발현되는 잔기에 대해 특이적인 안티-이디오타입 모노클로날 항체에 관한 것이다. 모노클로날 항체는 암치료용의 면역조절제로서 유용하다. 상세하게는, 본 발명의 안티-Id 모노클로날 항체는 유전적이계 모델에서 우세한 안티-이디오타입 반응을 유도시킬 수 있다. 또한, 안티-이디오타입 모노클로날 항체는 동물의 악성 종양에 대한 방어 효과를 나타낸다.
Description
기술분야
본 발명은 일반적으로 안티-이디오타입 모노클로날 항체 및 면역조절제로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 강글리오시드를 함유하는 N-글리콜릴 및 암세포에서 발현되는 항원과 반응하는 뮤린(murine) 모노클로날 항체에 대해 발생시킨 뮤린 모노클로날 항체; 및 이것의 종양 성장에 대한 억제 효과를 포함한다.
배경
암을 치료하는 방법중의 하나는, 종양에 대한 숙주 면역계의 본래의 잠재력을 활성화시키는 목적을 갖는 치료 양식인 능동 면역치료법을 사용하는 것이다.
1974년에 니엘스 제른(Niels Jerne)이 그의 이디오타입 네트워크 이론을 제시한 이래로[참조: Jerne, N. K. 1974. Ann Immunol 125C, 373-389], 암에 대한 효과적인 치료법의 연구에서의 새로운 가능성이 생겨났다. 제른의 이론은 최초로 면역계를, 가변 영역 또는 이디오타입(Id)을 통해 서로 상호작용하거나 다수의 천연 에피토프와 상호작용할 수 있는 항체의 네트워크로서 제시하였다. 이러한 복잡한 세트의 이디오타입-안티-이디오타입 상호작용은 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 작용을 한다. Ab1으로 일컬어지는 본래의 항원에 반응하여 생성된 항체는, 그 자체로 항원이 되며, 안티-이디오타입(안티-Id) 항체 또는 Ab2로 일컬어지고, 안티-안티-이디오타입 또는 (Ab1' 또는 Ab3)로서 언급되는 다른 항체에 의해 또한 조절될 수 있는 항체의 제 2의 세트의 생성을 유도시킨다.
제른의 원이론이 계속 검토된 결과, Ab1이 함유된 림프구와 Ab2의 상호작용의 결과는 반드시 면역 반응의 억제가 되는 것이 아니라 이러한 반응의 자극일 수 있다고 보고되었다. 더욱이, 제른은 그의 이론을 B 림프구 및 항체에 한정하였으나, T 세포가 T 세포 수용체의 이디오타입을 통해 조절에서 중요한 역할을 한다는 것이 현재 명백하다 [참조: Teitelbaum, D. et al, 1984 J. Immunol 132, 1282-1285; Zanetti, M. et al (1986) J. Immunol 137, 3140-3146; Powell, J. et al (1988) 140, 3266-3272; Baskin, J.G. et al (1990) J Immunol 145, 202-208; Furuyama, A. et al (1992) Anticancer Res 12, 27-32; Raychaudhuri, S. et al. J. Immunol 131, 271-278; Raychaudhuri et al (1987) J. Immunol 139, 3902-3910; Durrant et al (1994) Cancer Res. 54, 4837-4840].
이디오타입은 주어진 이디오타입내의 이디오타입 결정기 또는 이디오토프를 인식하는 1종 이상의 안티-Id와의 반응성에 의해 면역학적으로 규정된다. 따라서, 특정 Ab1이 다수의 이디오토프를 발현시키기 때문에, 이러한 Ab1이 유전적동계 동물에게 투여되는 경우, 안티-Id 항체의 불균일 집단이 수득된다.
안티-Id 항체의 분류는 이디오타입의 항원-결합 부위내 또는 그 밖의 다른 영역에 대한 이들의 결합에 초점이 맞춰진다. Ab2가 Ab1에 결합하는 것이 관련 항원에 의해 억제되고, Ab2가 Ab1과 동일한 특이성을 갖는 항체 반응을 또한 유도시킬 수 있는 경우, 이것은 천연 항원을 의태하고, Ab2β로서 분류되며; 이러한 타입의 Ab2는 내부 이미지(image) 안티-Id 로서 언급되고, 이들은 대용 항원으로서 작용할 수 있다. 항원에 의해 억제되지 않는 안티-Id는 Ab2α로서 표시되며, 이들 Ab2는 항원-결합 부위와 구조적으로 관련이 없는 Ab1 이디오타입과 반응한다. 1984년에 보나(Bona)와 켈러(Kohler)는 입체 장애로 인해 항원에 의해 억제되는 제 3의 타입의 안티-Id 항체(Ab2γ)를 제시하였으며, 이러한 타입의 안티-Id는 항원-결합 부위와 구조적으로 관련있는 이디오타입과 반응하지만, 이들은 Ab1에 의해 인식되는 항원 에피토프를 의태하지 않는다 [참조: Bona and Kohler (1984) Anti-idiotypic antibodies and internal image. In Monoclonal and anti-idiotypic antibodies: Probes for receptor structure and function, Venter JC, Frasser CM, lindstrom J (eds), NY, Alan R. Liss, pp 141-149, 1984].
제른의 이론을 기초로 하여, 종양 관련된 항원을 포함하는 다수의 항원에 대한 백신을 검색하는 두 가지 주요 방법이 개발되었다. 첫 번째 방법은 Ab2β를 사용하여 상이한 분자 환경내에 에피토프를 제시하는 것을 기초로 한다. 이러한 타입의 안티-Id 항체를 함유하는 백신은 바이러스, 박테리아 및 기생충에 대한 방어 반응을 유도시킬 수 있어 왔다 [참조: Kennedy et al (1986) 232, 220-223; McNamara et al (1985) Sceince 226, 1325-1326]. 또한, Ab2β는 종양 관련된 항 원에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용되어 왔고, 포지티브 결과가 동물 모델 및 임상 실험에서 수득되어 왔다 [참조: Raychauhuri et al (1986) J. Immuno137, 1743-1749; Raychauhuri et al (1987) J. Immunol 139, 3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee et al (1987) J. Immunol 139, 1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee et al (1988) J. Immunol 141, 1398-1403; Herlyn, D. et al (1989) Intern. Rev. Immunol 4, 347-357; Chen, Z-J et al. Cell Imm. Immunother. Cancer (1990) 351-359; Herlyn, D. et al (1991) In Vivo 5, 615-624; Furuya et al (1992) Anticancer Res 12, 27-32; Mittelman, A. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 466-470; Durrant, LG. et al (1994) Cancer Res. 54, 4837-4840; Mittelman, A. et al (1994) Cancer Res. 54, 415-421; Schmitt, H. et al (1994) Hybridoma 13, 389-396; Chakrobarty, M. et al (1995) J. Immunother. 18, 95-103; Chakrobarty, M. et al (1995) Cancer Res. 55, 1525-1530; - Foon, K. A. et al (1995) Clin. Cancer Res. 1, 1285-1294; Herlyn, D. et al (1995) Hybridoma 14, 159-166; Sclebusch, H. et al (1995) Hybridoma 14, 167-174; Herlyn, D. et al (1996) Cancer Immunol. Immunother. 43, 65-76]. 그럼에도 불구하고, Ab2의 β 특성이 Ab2를 유도시킬 수 있는 생물학적 효과를 예측하기에 충분하지 않은 것으로 입증되었다 [참조: Raychauhuri et al (1986) J. Immuno 137, 1743-1749; Raychauhuri et al (1987) J. Immunol. 139, 231-278; Maruyama et al (1996) Int. J. Cancer 65, 547-553].
두 번째 방법은 항원 결합과는 관련이 없지만 다른 항체 또는 T 세포와 이디오토프를 공유하는 조절 이디오토프를 통한 네트워크 조작을 기초로 한다. 이들 안티-Id 항체가 면역 반응 및 방어 효과를 또한 생성시킬 수 있다는 증거가 축적되어 왔다 [참조: Paul, W. E. and Bona, C. (1982)immunology Today 3, 230-234; McNamara M. K. et al (1985) Science 226, 1325-1326; Kohler y cols (1992) Proc. 8th Inter. Cong Immunol. Budapest, pp. 619].
강글리오시드는 시알산을 함유하는 글리코스핑고리피드이며, 대다수의 포유동물 세포막에서 발현된다. 이들 항원이 정상 조직에 존재하지만, 이들은 대량으로 발견되며, 악성 세포의 표면상에서 상이한 기구 및 형태로 발현될 수 있다 [참조: Hakomori, S. (1985), Cancer Res. 45, 2405-2415; Miraldi, F. (1989) Seminars in Nuclear Medicine XIX, 282-294; Hamilton et al (1993) Int J Cancer 53, 1-81].
강글리오시드가 면역 반응을 위한 유용한 표적이지만, 이들의 면역원성은, 이들의 탄수화물 특성 및 이들의 자기 항원 상태로 인해 매우 불량하다 [참조: Livingston, P. et al, (1995) Seminars in Cancer Biology 6, 357-366].
시알산의 N-글리콜릴 변이체는 대부분의 포유동물의 정상 조직에서 발현되지만; 이것을 사람으로부터의 정상 조직에서 검출하기는 매우 어렵다 [참조: Watarai, S. et al (1995) J. Biochem 117, 1062-1069]. 다른 한편으로는, 이들 항원의 존재는 다른 것들 중에서 결장암, 흑색종, 망막아세포종 및 유방암에서 보고되어 왔다 [참조: Higachi, H et al (1984) Jpn J Cancer Res (Gann) 75, 1025-1029; Higachi, H et al (1985) Cancer Res. 45, 3796-3802; Hirabayashi, I. Et al (1987) Jpn J Cancer Res (Gann) 78, 1614-1620; Higachi, H. et al (1988) Jpn J Cancer Res (Gann) 79, 952-966; Miyake, M. et al (1990) Cancer 65,499-505; Devine,P.L. et al (1991) Cancer Res. 51,5826-5386; Vazquez, A.M. et al (1995) Hybridoma 14,551-556; Marquina, G. et al (1996) Cancer Res.56, 5165-5171].
강글리오시드를 함유하는 백신에 의한 면역은 항-강글리오시드 항체를 발생시킨 흑색종 환자의 수명을 연장시켰다 [참조: Livingston, P. et al (1987) Proc NatI Acad Sci USA 84, 2911-2915; Livingston, P. et al (1989) Cancer Res 49, 7045-7050; Livingston, P. (1995) Immunological Reviews 145, 147-166]. 그럼에도 불구하고, 이들의 불량한 면역원성과 함께 항원의 문제는 안티-Id 항체의 사용을 이러한 항원성 모델에서의 능동 면역치료를 위한 흥미있는 대안이 되도록 하였다. 뮤린 안티-Id mAb (4C10)가 사람 흑색종상의 GM3를 인식하는 사람 IgM mAb (L612)에 대해 생성되었다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 결합된 이러한 안티-Id mAb로 면역시킨 마우스의 혈청은 항원 포지티브 흑색종 세포계 및 정제된 GM3와 강력하게 반응하였으며, 이는 GM3 (Ab2β)의 내부 이미지를 함유하는 이러한 안티-Id mAb가 흑색종에 걸린 환자를 능동 특이적 면역치료하기 위한 효과적인 도구가 될 수 있음을 제시한다 [참조: Yamamoto, S. et al (1990) J. Natl. Cancer. Inst. 82, 1757-1760; Irie, R. F. Patent Number US 5,208,146]. 이러한 안티-Id mAb로부터의 VL 및 VH가 클로닝되고, 시퀀싱되고, 키메라 마우스/사람 IgG1 항체로서 발현되었다 [참조: Hastings, A. et al (1992) Cancer Res 52, 1681-1686].
또한, 알파-타입 안티-이디오타입 mAb가 면역진단 방법에 유용한 사람 mAb 1612에 대해 생성되었다 [참조: Irie, R. F. Patent Number US 5,208,146].
GD3 강글리오시드를 인식하는 마우스 mAb (mAbR24)에 대해 유도시킨 뮤린 안티-Id mAb는 GD3를 의태할 수 있고, 정상 토끼 조직상에서의 GD3의 발현에도 불구하고 이러한 강글리오시드에 대한 항체를 유도시킬 수 있다 [참조: Chapman, P. B. And Houghton, A. N. (1991) 88, 186-192]. 예비 실험 결과, BEC-2 + BCG 보조제는 작은 소세포 폐암에 걸린 환자의 수명을 현저하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [참조: Scrip Magazine (1996) pp 56-59; 33rd American Society of Clinical Oncology annual meeting (1997)].
래트를 GD2에 대해 특이적인 뮤린 mAb (3F8)로 면역시키면, 마우스에서의 면역원으로서의 시험시에 강글리오시드 GD3와 반응하는 항체를 자극시킬 수 있는 안티-Id mAb가 생성되었다. 이들 안티-Id mAb는 백신 제조에 유용할 수 있는 것으로 제시되었다 [참조: Cheng, N-K.V. et al (1993) Int. J. Cancer 54, 499-505].
또한, 사람 안티-Id mAb를 GD2에 대해 특이적인 뮤린 mAb 14G2로 처리한 환자로부터의 말초혈 단핵 세포를 사용하여 생성시켰다. 이러한 사람 안티-Id mAb로 토끼를 면역시키면 안티-GD2 항체와 항원 포지티브 종양 세포에 대한 DTH 반응이 유도되었다. 이러한 항체는 악성 흑색종에 걸린 환자를 위해 사람 안티-Id 백신으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 것으로 제시되었다 [참조: Saleh, M. N. et al (1993) J. Immunol 151, 3390-3398].
문헌 ["Ganglioside vaccine: anti-idiotypic monoclonal antibodies as antigen surrogates (Iglesias, E., et al. Biotechnologia Aplicada, Vol. 14, No. 1, 1997, page 50, XP-002091466)]에는, P3 MAb와는 강력하게 반응하지만 시험된 다른 안티-강글리오시드 IgM Mab와는 반응하지 않는, 7개의 IgG1 안티-이디오타입 모노클로날 항체 (MAb)가 기재되어 있다. 7개의 안티-이디오타입 MAb는 1 내지 10㎍/㎖의 농도 범위에서 NGcGM3에 대한 P3 결합을 블록킹시키는 능력을 가졌다. 이들 안티-이디오타입 중 5개는 NGcGM3에 대한 체액성 반응을 유도시킬 수 있었고, 이들은 Ab2β 및 Ab2α 안티-이디오타입 모노클로날 항체로 분류된다.
다른 한편으로는, 페레즈(Perez) 등의 문헌["What ganglioside show us about idoiotypic networks". Biotechnologia Aplicada, VOL. 14, No. 1, 1997, page 42, XP-002091467]에도 안티-강글리오시드 항체 P3가 Balb/c 마우스에서 강력한 IgG 안티-이디오타입 반응 (Ab2, 역가 1/10,000 내지 1/50,000)을 유도시킨다는 것이 기재되어 있다. 수득된 특이적 Ab2 클론의 대부분은 GM3 (NeuGc)에 대한 P3 MAb의 결합을 블록킹시킬 수 있다. 이들 항체는 상기 언급된 경우에서와 같이, 강글리고시드에 대한 천연 자기항체 반응을 유도시킬 수 있었으며, Ab2β 안티-이디오타입 항체로서 역시 분류된다.
상기 배경으로부터 명백해지는 바와 같이, 현재까지, 감마 타입 안티-이디오타입 모노클로날 항체가, 강글리오시드를 함유하는 N-글리콜릴을 인식하고, 동시에, 동물 모델에서 항종양 효과를 나타낼 수 있는 모노클로날 항체에 대해 생성되지 않았다.
문헌 ["Ganglioside vaccine: anti-idiotypic monoclonal antibodies as antigen surrogates (Iglesias, E., et al. Biotechnologia Aplicada, Vol. 14, No. 1, 1997, page 50, XP-002091466)]에는, P3 MAb와는 강력하게 반응하지만 시험된 다른 안티-강글리오시드 IgM Mab와는 반응하지 않는, 7개의 IgG1 안티-이디오타입 모노클로날 항체 (MAb)가 기재되어 있다. 7개의 안티-이디오타입 MAb는 1 내지 10㎍/㎖의 농도 범위에서 NGcGM3에 대한 P3 결합을 블록킹시키는 능력을 가졌다. 이들 안티-이디오타입 중 5개는 NGcGM3에 대한 체액성 반응을 유도시킬 수 있었고, 이들은 Ab2β 및 Ab2α 안티-이디오타입 모노클로날 항체로 분류된다.
다른 한편으로는, 페레즈(Perez) 등의 문헌["What ganglioside show us about idoiotypic networks". Biotechnologia Aplicada, VOL. 14, No. 1, 1997, page 42, XP-002091467]에도 안티-강글리오시드 항체 P3가 Balb/c 마우스에서 강력한 IgG 안티-이디오타입 반응 (Ab2, 역가 1/10,000 내지 1/50,000)을 유도시킨다는 것이 기재되어 있다. 수득된 특이적 Ab2 클론의 대부분은 GM3 (NeuGc)에 대한 P3 MAb의 결합을 블록킹시킬 수 있다. 이들 항체는 상기 언급된 경우에서와 같이, 강글리고시드에 대한 천연 자기항체 반응을 유도시킬 수 있었으며, Ab2β 안티-이디오타입 항체로서 역시 분류된다.
상기 배경으로부터 명백해지는 바와 같이, 현재까지, 감마 타입 안티-이디오타입 모노클로날 항체가, 강글리오시드를 함유하는 N-글리콜릴을 인식하고, 동시에, 동물 모델에서 항종양 효과를 나타낼 수 있는 모노클로날 항체에 대해 생성되지 않았다.
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발명의 요약
본 발명은 일반적으로 안티-이디오타입(안티-Id) 모노클로날 항체(mAb) 및 암치료용 면역조절제로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 강글리오시드를 함유하는 N-글리콜릴과 암세포에서 발현되는 항원과 반응하는 뮤린 감마 타입 mAb에 대해 발생된 뮤린 안티-Id mAb를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 목적은 유전적이계 모델에서 우세한 안티-이디오타입 반응을 유도시키거나, 악성 종양을 함유하는 마우스 또는 그 밖의 동물종에서 방어 효과를 나타낼 수 있는 신규한 안티-Id mAb를 제공하는데 있다.
발명의 상세한 설명
안티-강글리오시드 mAb에 대한 안티-이디오타입(Ab2) 항체 반응을 수득하기 위한 면역 과정
마우스 및 그 밖의 포유동물종을 보조제의 존재 및 부재하에, 임의로 수송 단백질에 결합된, 정제된 안티-강글리오시드 mAb 25 내지 200㎍ 용량으로 면역시킨다.
동물에게 안티-강글리오시드 mAb를 14일 내지 30일의 간격을 두고 2회 내지 6회 투여하였다. 가능한 면역 경로로는 복강내, 피하, 정맥내 또는 이들의 조합이 있다.
면역 기간 전 및 도중에, 혈청 샘플을 취하고, Ab2 항체 수준 반응을 임의의 공지된 면역검정법으로 측정한다. 동물 혈청 희석액을 면역원으로서 사용된 안티-강글리오시드 mAb 또는 면역 프로토콜에서 사용되지 않은 다른 안티-강글리오시드 mAb와 인큐베이팅시킨다.
또한, 실험을 수행하여, 면역된 동물의 혈청이 면역원으로서 사용된 안티-강글리오시드 mAb가 이것의 항원에 결합하는 것을 블록킹하는 능력을 갖는 지를 규정한다.
안티-강글리오시드 mAb에 대한 안티-이디오타입 mAb 생성.
Ab2 항체 역가가 높은 마우스를, 항체 생성 세포를 수득하기 3일전에 면역원으로서 사용된 mAb로 재면역시킨다. 비장 세포가 우선적으로 사용되어야 하지만; 그 밖의 항체 생성 세포가 선택될 수 있다.
이들 세포는, 하이브리드 세포 또는 하이브리도마에게 생체외 및 생체내 복제 특성을 부여하는 골수종 세포와 융합된다. 세포 융합은 공지된 방법중 어느하나에 의해 수행될 수 있다.
하이브리도마에 의해 생성된 항체는 면역검정법, 바람직하게는 면역효소적 검정에 의해 시험되며, 여기서, 하이브리도마 상층액은 면역원으로서 사용된 mAb 및 면역에 사용되지 않은 다른 안티-강글리오시드 mAb와 인큐베이팅된다.
면역원으로서 사용된 안티-강글리오시드 mAb가 이것의 항원에 결합하는 것을 블록킹하는 하이브리도마 상층액의 능력은, 상층액을 안티-강글리오시드 mAb의 적당한 희석액과 인큐베이팅시킨 후 상기 항체를 이것의 항원과 인큐베이팅시킴으로써 결정된다.
선택된 하이브리도마는 2회 이상 클로닝되며, 생성된 mAb는 상기 기술된 바와 같이 생체외 및 생체내에서 생성된다.
수득된 안티-이디오타입 mAb는 안티-강글리오시드 mAb를 인식하며, 안티-강글리오시드 mAb가 이것의 항원에 결합하는 것을 블록킹하는 능력을 가질 수 있다.
유전적이계 모델에서 Ab2 mAb에 대한 안티-안티-이디오타입 (Ab3) 항체를 수득하기 위한 면역 과정.
원숭이 또는 다른 유전적이계 종을 안티-이디오타입 mAb로 면역시킨다. 이들 mAb는 면역원으로서 사용되기 전에, 보조제의 존재 또는 부재하에, 임의로 수송 단백질에 결합된 형태로 투여될 수 있다.
각각의 동물에게, 7일 내지 30일의 간격으로 안티-이디오타입 mAb 250㎍ 내지 2㎎을 2회 내지 8회 투여하였다.
면역 경로는 피내, 피하, 정맥내, 복강내 또는 이들의 조합일 수 있다.
동물 혈액 샘플을 면역 프로토콜 전 및 도중에 취하여, Ab3 항체 반응의 존재를 공지된 면역검정법중의 어느 하나에 의해 모니터한다
안티-강글리오시드 mAb에 의한 면역에 의해 생성된 안티-이디오타입 mAb를 동물에게 투여하면, 항원 특이적 항체 반응의 유도없이 면역원으로서 사용된 안티- 이디오타입 mAb의 이디오타입에 대한 우세한 항체 반응을 유도시킬 수 있다.
안티-이디오타입 mAb 처리에 의한 항종양 효과
안티-이디오타입 mAb를 사용하기 전에, 보조제의 존재 또는 부재하에, 임의로 수송 단백질에 결합된 형태로 유효량으로 투여한다. 유효량이란 용어는 항종양 효과를 얻는데 필요한 안티-이디오타입 mAb의 양을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 안티-이디오타입 mAb에 의한 처리는 동물 체내의 악성 세포의 실험적 투여 전 또는 투여 후에 수행된다.
동물에게 7 내지 30일의 투여 간격으로 안티-이디오타입 mAb 10 내지 200㎍을 1회 내지 5회 투여한다.
면역 경로는 피내, 복강내, 피하, 정맥내 또는 이들의 조합일 수 있다.
안티-이디오타입 mAb로 처리한 후, 안티-이디오타입 mAb로 처리된 군에서의 종양 발생률 및 생존율은 동일한 방식으로 처리되고 유지된 대조군과 비교될 수 있다.
안티-이디오타입 mAb 처리로 인해 종양을 함유하는 동물의 생존율은 현저히 증가하였고, 폐 전이는 현저히 감소하였다.
실시예 1: 유전적동계 모델에서의 P3 mAb에 대한 안티-이디오타입 항체의 생성.
6 내지 8주된 암컷 Balb/c 마우스를 KLH에 커플링된 정제된 P3 모노클로날 항체(강글리오시드를 함유하는 안티-N-글리콜릴)(ECACC accession number 94113026, European Patent Application EP 657471 A1; Vazuez, AM. et al, Hybridoma (1995) 14,551-556) 50㎍을 14일의 투여 간격으로 2회 면역시켰다.
최종 면역시킨지 3일 후, P3 모노클로날 항체에 대한 높은 혈청 수준의 Ab2 항체를 지닌 마우스의 비장을 떼어서, 스테인레스강 체(sieve)로 조직을 프레스하거나 관류시켜서, 세포 현탁액을 준비했다.
융합은 켈러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)의 문헌[1975, Nature (Lond) 256, 495-497]에 기재된 방법을 약간 변형시켜서 수행하였다.
뮤린 비장세포를 RPMI-1640 배지중에 42% 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 융합 배지 0.5㎖에서 ECACC에서 85011420호로 얻을 수 있는 비분비성 뮤린 흑색종 P3/X63 Ag8 6.5.3. 세포와 10:1의 비로 융합시켰다.
융합 세포를 37℃, 5% CO2의 습한 분위기에서 HAT(히포크산틴-아미노프테린 및 티미딘) 선택 배지에서 배양하였다.
융합한 지 10 내지 15일 후, 하이브리도마 상층액내의 항체의 존재를 ELISA로 평가하였다.
ELISA 플레이트(고결합성 COSTAR)를 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.8) 중에서 P3 mAb와 다른 IgM 안티-강글리오시드 mAb 10㎍/㎖와 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척한 후, 플레이트를 1% BSA가 함유된 동일한 완충액으로 37℃에서 1시간 동안 블록킹시켰다.
세척 단계를 반복하고, 웰(well) 당 상층액 50㎕를 첨가시켰다. 2시간 동안 인큐베이팅시킨 후, 플레이트를 재세척하고, 알칼리 포스파타아제 염소(goat) 안티-뮤린 IgG Fc 영역 컨쥬게이트 항혈청을 첨가시켰다. 세척 후, 웰 당 기질 용액(디에탄올아민 완충액(pH 9.8)으로 희석시킨 P-니트로페닐 포스페이트 1㎎/㎖) 100㎕를 첨가시켰다. 흡광도를 ELISA 판독기로 405nm에서 측정하였다.
또한, NeuGcGM3에 대한 P3 mAb의 결합을 블록킹하는 상층액의 능력은 NeuGcGM3가 고정되어 있는 폴리비닐 클로라이드 활성화된 플레이트 (ICN-FLOW)상에서 수행되는 간접 ELISA에 의해 하기 방법에 따라 결정하였다: 메탄올중의 강글리오시드(4㎍/㎖) 50㎕를 각각의 웰에 첨가시켰다. 메탄올을, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 방치시킴으로써 증발시켰다. 그 후, 웰 당 1% BSA가 함유된 TRIS-HCl 0.05M 완충액(pH 7.8) 150㎕를 첨가시키고, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이팅시킨 후, 웰 당 혼합물 50㎕를 첨가시키고, 플레이트를 37℃에서 90분간 인큐베이팅시켰다.
웰을 PBS 200㎕로 4회 세척하고, 적당하게 희석시킨 알칼리 포스파타아제 안티-마우스 면역글로불린 컨쥬게이트 항혈청 5㎕를 첨가시켰다. PBS로 세척한 후, 웰을 상기 기재된 기질 용액과 인큐베이팅시켰다.
IgG1 서블클래스의 1E10으로 명명되는 안티-이디오타입 mAb를 수득하였다. 이러한 1E10 안티-IdP3 mAb는 면역원으로서 사용된 P3 mAb에 대해 매우 특이적이었다. 이것은 다른 안티-강글리오시드 항체, 예를 들어 E1, A3 및 F6과 반응하지 않는다 (도 1). 이러한 안티-이디오타입 mAb는 NeuGcGM3 (도 2) 및 P3 포지티브 유방 종양 세포계에 대한 P3 mAb의 결합을 억제시킬 수 있었다.
실시예 2: 유전적이계 모델에서의 1E10 안티-Id mAb에 대한 안티-안티-이디오타입 (Ab3) 항체 반응의 생성.
알루미늄 히드록시드 침전된 1E10 안티-IdP3 mAb를 사용하여, 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이를 주사 당 mAb 2㎎ 용량으로 14일 간격으로 피내 면역시켰다. 동물에게 다양한 용량의 mAb를 투여하였다.
혈청 샘플을 면역 전 및 면역 후에 취하였다. 원숭이 혈청에서의 Ab3 항체 반응의 존재를 ELISA에 의해 결정하였다. ELISA 플레이트(고결합성 COSTAR)를 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.8)중에서 1E10 mAb 또는 이것의 F(ab')2 단편 10㎍/㎖와 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다.
세척 단계를 반복하고, 웰 당 다양한 혈청 희석액 50㎕를 첨가시켰다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅시킨 후, 플레이트를 재세척하고, 알칼리 포스파타아제 염소 안티-사람 면역글로불린 안티-IgM 또는 안티-IgG 컨쥬게이트 항혈청을 첨가시켰다. 세척 후, 기질 용액을 전술한 바와 같이 첨가시켰다.
블록킹 실험을 수행하여, 안티-이소타입 및 안티-이디오타입 항체 반응을 구별하였다.
원숭이 혈청을 1E10 mAb와 이소타입은 동일하지만 특이성이 다른 mAb 500㎍/㎖와 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 그 후, 1E10 mAb에 대한 잔여 혈청 반응성을 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다.
원숭이 혈청을, ELISA 플레이트상에 코팅된 1E10 mAb F(ab')2 단편에 대한 비오티닐화된 P3 mAb의 결합을 억제시키는 이들의 능력에 대해, 코팅된 플레이트를 혈청 희석액과 인큐베이팅시킨 후 웰 당 비오티닐화된 P3 mAb 50㎕를 첨가시키는 것을 제외하고는, 전술된 ELISA 방법을 사용하여 조사하였다.
37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨 후, 플레이트를 세척하고, 웰 당 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체 50㎕를 37℃에서 1시간 동안 첨가시켰다. 세척 후, 기질 용액(포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5.0) 12㎖ 중의 O-페닐렌디아민 8㎎)을 첨가시켰다. 흡광도를 ELISA 판독기로 492nm에서 측정하였다.
1E10 안티-IdP3 mAb로 면역시킨 원숭이로부터의 혈청은 1E10 F(ab')2 단편과 강력하게 반응하였다 (도 3). 면역된 원숭이로부터의 혈청은 비관련된 mAb(ior C5)과의 반응성 보다는 적지만 면역된 1E10 mAb에 특이적으로 결합하였다. 1E10 이디오타입에 대한 항체의 존재는, 흡착된 혈청과 1E10 안티-IdP3 mAb와의 강력한 반응성으로 인해 동물 혈청을 비관련된 mAb와 인큐베이팅시킨 후에 확인되었으며; 의외로, 유도된 안티-이디오타입 항체 반응은 생성된 안티-이소타입 항체 반응과 비교하여 우수하였다 (도 4). 또한, 원숭이 Ab3 혈청은 1E10 안티-Id mAb에 대한 비오티닐화된 P3 mAb의 결합을 억제시켰으며, 이는 원숭이 Ab3 혈청이 P3 mAb와 이디오타입을 공유한다는 것을 나타낸다 (도 5). 우세한 IgG 항체 반응은 1E10 안티-IdP3 mAb에 대해 생성되었다 (도 6). 원숭이로부터의 혈청은 동물이 최종 면역된 지 4개월 후에도 1E10 F(ab')2와 반응하였고 (도 7), 이 때, 1E10에 대한 P3 mAb 결합을 억제시키는 능력을 갖는 Ab3 항체가 또한 검출되었다. NeuGcGM3에 대한 항체는 동물 혈청에서 검출되지 않았다.
1E10 안티-이디오타입 mAb는 이것이 P3 mAb가 이것의 항원과 결합하는 것을 억제시킬 있지만, 동물에게서 P3 유사 항체의 생성을 유도시킬 수 없기 때문에 감마 타입인 것으로 입증된다.
실시예 3; 1E10 안티-Id mAb에 의한 마우스의 처리.
C57BL/6 마우스를, 알루미늄 히드록시드 침전된 1E10 안티-IdP3 mAb 50㎍으로 5회 면역시켰다. 1주가 지났을 때, 마우스를 5x103개의 B16 흑색종 세포로 피하 주사하였다. 동일한 방식으로 처리되지만 mAb를 투여하지 않은 동물을 대조표준으로서 사용하였다. 카플란-메이어(Kaplan-Meyer) 생존 곡선이 도 8에 도시되어 있으며; 생존은 대조군 보다 1E10 안티-IdP3 mAb로 면역된 군에서 현저히 좋아졌다.
C57BL/6을 50x103개의 루이스(Lewis) 폐암세포로 정맥내 접종하였다. 14일 후, 1E10 10㎍을 정맥내 투여하였고, 6일 후, 마우스를 치사시켜서, 폐 전이의 수를 계수하였다. 비관련된 IgG mAb로 처리하거나 PBS만을 투여시킨 동물을 대조표준으로서 사용하였다. 1E10 안티-P3 mAb로 처리한 동물 10마리중 7마리는 폐 전이를 전개시키지 않았고, 나머지 3마리 동물의 경우, 전이의 최대 총수는 3개였다. 대조적으로, 비관련된 IgG1로 처리한 모든 동물 또는 PBS만을 투여시킨 모든 동물은 폐 전이를 전개시켰다. 이들 결과는 이러한 감마 타입 안티-Id mAb에 의한 처리가 종양에 대한 방어 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 1: P3, E1, A3 및 F6 안티-강글리오시드 mAb에 대한 1E10 안티-IdP3 mAb 의 반응성을 도시한다.
도 2: P3 mAb를 안티-IdP3 mAb와 인큐베이팅시킨 후, NeuGcGM3에 대한 P3 mAb의 반응성을 ELISA에 의해 측정하는, 억제 검정의 결과를 도시한다.
도 3: 동물에게 다양한 용량의 알루미늄 히드록시드 침전된 1E10 안티-Id mAb를 투여한 후 ELISA에 의해 측정한 원숭이 혈청 항체와 1E10 F(ab')2 단편의 반응성을 도시한다.
도 4: 원숭이 사전 흡착되지 않은(non-pre-adsorbed) 혈청과, 1E10 mAb(-■-) 및 이소타입이 매치(match)되는 비관련된 ior C5 mAb(-●-)와의 반응성 모두를 측정할 뿐만 아니라 1E10 mAb(-□-) 및 비관련된 ior C5 mAb(-○-)에 대한 혈청 항체의 결합을 측정하는, 억제 검정의 결과를 도시한다. 화살표는 면역 시기를 나타내고, 연속선은 채혈 시기를 나타낸다.
도 5: ELISA에 의해 측정된, 1E10 mAb로 면역된 원숭이의 혈청에 의한 1E10 안티-Id mAb에 대한 P3 mAb 결합의 억제를 도시한다. 화살표는 면역 시기를 나타내고, 연속선은 채혈 시기를 나타낸다.
도 6: ELISA에 의해 측정된, 안티-이디오타입 mAb로 면역된 원숭이의 혈청에서의 1E10 mAb에 대한 IgM 및 IgG 항체 반응의 동력학을 도시한다. 화살표는 면역 시기를 나타내고, 연속선은 채혈 시기를 나타낸다.
도 7: 원숭이 면역된 혈청; 원숭이에게 알루미늄 히드록시드 침전된 1E10 안티-이디오타입 mAb의 최종 용량을 투여한 후에 수득된 혈청(화살표로 표시됨), 및 동물을 최종 면역시킨 지 4개월 후에 수득된 혈청에 의한 1E10 F(ab')2의 인식을 도시한다.
도 8: 1E10 안티-IdP3 mAb로 처리하고, B16 흑색종 세포를 접종시킨 마우스에서의 생존에 대한 카플란-메이어 곡선을 도시한다.
Claims (8)
- 기탁 번호 ECACC 94113026 로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 뮤린(murine) 안티-N-글리콜릴 강글리오시드 항체에 대해 유도시킨 감마 타입 안티-이디오타입 모노클로날 항체에 있어서,상기 안티-이디오타입 모노클로날 항체는 부다페스트 조약에 따라 ECACC에, 기탁 번호 97112901로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 감마 타입 안티-이디오타입 모노클로날 항체.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 유전적이계 동물에서 우세한 안티-이디오타입 반응을 유도시킬 수 있으며, 종양에 대한 방어 효과를 나타냄을 특징으로 하는 감마 타입 안티-이디오타입 모노클로날 항체.
- 부다페스트 조약에 따라, 1997년 11월 29일자로, 영국에 소재한 유럽 세포 배양균 콜렉션(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에, 기탁 번호 97112901로 기탁된 제1항 또는 제3항에 따른 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 라인(hybridoma cell line).
- 유효량의 제1항 또는 제3항에 따른 안티-이디오타입 모노클로날 항체를, 희석제, 보조제 또는 수송 분자와 함께 함유하는, 폐암을 포함하는 종양 치료용 약제 조성물.
- 악성 종양형성 치료를 위한, 제1항 또는 제3항에 따른 모노클로날 항체에 의해 제조되는 의약.
- 삭제
- 삭제
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