CN117736276A - 肠道病毒71型vp1蛋白高保守位点突变致流产株感染性克隆及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及肠道病毒71型VP1蛋白高保守位点突变致流产株感染性克隆及其构建方法和应用。本发明提供的肠道病毒71型VP1蛋白突变体及其对应的编码核酸分子、生物材料和感染性克隆能够使得肠道病毒71型的增殖能力和毒力丧失，为抗EV71新靶点药物设计和疫苗株的筛选提供了基础，对于肠道病毒71型感染的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及肠道病毒71型VP1蛋白高保守位点突变致流产株感染性克隆及其构建方法和应用。
背景技术
肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)是引起手足口病(Hand,Foot and MouthDisease，HFMD)的主要病原之一，其临床症状表现为手、足、口部的粘膜疱疹及溃疡，严重时可导致中枢神经系统感染甚至死亡，目前还没有治疗EV71感染的特效药物。
EV71属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。基因组为约7.4kb长的单股正链RNA，包括编码结构蛋白的P1区和编码非结构蛋白的P2、P3区及5’非编码区和含有polyA尾的3’非编码区。P1、P2和P3区共同编码一条含2193个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白随后被剪切加工为成熟的病毒蛋白，包括4个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中，P1区的VP1蛋白暴露在病毒衣壳的表面，含有主要的细胞受体结合域。根据VP1的基因序列可将EV71分为A、B、C三个基因型。
EV71首先通过VP1蛋白与宿主细胞膜上的受体结合启动感染过程。当EV71与受体结合进入细胞后，在内体中进行胞质转运。晚期内体中的酸性环境可以诱导VP1蛋白的N末端发生变构暴露于病毒衣壳表面，同时VP4蛋白从衣壳中脱离。此时颗粒的二重轴处出现一个直径大约为10A°的可供基因组RNA释放的通道。
Zhang YX等人(Zhang Y-X,Huang Y-M,Li Q-J,Li X-Y,Zhou Y-D,Guo F,et al.(2017)A highly conserved amino acid in VP1 regulates maturation ofenterovirus 71.PLoS Pathog 13(9):e1006625)发现VP1107单一位点的丙氨酸到苏氨酸突变即可影响病毒在细胞中的增殖表型，其机制是通过影响子代病毒颗粒VP0前体蛋白的成熟化剪切从而影响了病毒的脱衣壳过程。开发更多的、从不同机制影响病毒增殖或毒力的VP1蛋白突变病毒株对于EV71病毒疫苗等药物的开发、筛选和质量控制以及EV71感染的预防和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明提供肠道病毒71型VP1蛋白高保守位点突变致流产株感染性克隆及其构建方法和应用。
本发明在对肠道病毒71型VP1蛋白的定点突变筛选中发现，在拯救病毒的过程中有11个位点的突变株无法拯救出具有感染性的子代病毒颗粒，即这些位点的突变会导致病毒流产(丧失增殖能力和感染性)，这些突变位点包括：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。经分析，这些位点均具有高保守性。这些致病毒流产突变位点及其对应蛋白突变体、感染性克隆的开发为抗EV71新靶点药物设计和疫苗株的筛选提供了基础。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供肠道病毒71型VP1蛋白突变体，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
优选地，所述肠道病毒71型VP1蛋白突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的任意一种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-11任一所示。
上述VP1蛋白突变体能够使得EV71的增殖力和毒力丧失，导致病毒流产。
本发明提供编码以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体的核酸分子。
根据上述提供的VP1蛋白突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码上述VP1蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，该核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述VP1蛋白突变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12-22任一所示。
本发明提供一种cDNA，所述cDNA包含肠道病毒71型的全长核酸序列，所述全长核酸序列发生突变以使得其编码的VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
优选地，所述cDNA与肠道病毒71型野生型病毒株的全长基因组cDNA相比的突变为使得其编码的VP1蛋白发生以下突变中的任意一种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
在本发明的一些实施方式中，所述野生型病毒株为HP株(Zhang YX,Huang YM,LiQJ,et al.A highly conserved amino acid in VP1 regulates maturation ofenterovirus 71[J].PLoS Pathogens,2017,13(9):e1006625.DOI:10.1371/journal.ppat.1006625.)。
本发明提供包含上述cDNA的肠道病毒71型感染性克隆。
优选地，所述感染性克隆还包含与所述cDNA可操作性连接的质粒载体。
本发明提供包含所述核酸分子或所述cDNA的生物材料，或者，表达所述肠道病毒71型VP1蛋白突变体的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒可为将所述核酸分子或cDNA与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。
所述宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞，所述微生物包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酵母)或病毒(例如肠道病毒71型)。所述动物细胞可为常用于培养病毒的动物细胞(例如Vero细胞等)。
本发明提供肠道病毒71型突变致流产株感染性克隆的构建方法，所述方法包括：将肠道病毒71型的感染性克隆进行突变以使得其编码的VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
在本发明的一些实施方式中，将肠道病毒71型野生型病毒株HP的感染性克隆进行突变以使得其编码的VP1蛋白与野生型病毒株的VP1蛋白相比包含以下突变中的一种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述cDNA或所述生物材料在构建肠道病毒71型感染性克隆中的应用。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述cDNA或所述生物材料在降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力中的应用。
优选地，所述降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力为使得肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力丧失。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述cDNA或所述生物材料在降低肠道病毒71型的细胞吸附能力中的应用。
优选地，所述细胞吸附能力中的细胞优选为Vero细胞。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述cDNA或所述生物材料的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物中的应用；
(2)在作为用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选靶点中的应用；
(3)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选中的应用；
(4)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的质量控制中的应用。
优选地，所述药物包括治疗性药物(例如抗体、抗病毒化合物、组合物等药物)、疫苗等。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述cDNA或所述生物材料在制备用于检测肠道病毒71型在样品中是否存在或其存在水平的产品中的应用。
本发明提供一种使肠道病毒71型丧失增殖能力和/或毒力的方法，所述方法包括：将肠道病毒71型的基因组进行突变，以使得其编码VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的肠道病毒71型VP1蛋白突变体及其对应的编码核酸分子和生物材料能够使得肠道病毒71型的增殖能力和毒力丧失，为抗EV71新靶点药物设计和疫苗株的筛选提供了基础，对于肠道病毒71型感染的防治具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1和图2为本发明实施例1中测序鉴定HP各突变株VP1蛋白编码序列。
图3为本发明实施例3中HP各突变株在Vero细胞上的增殖表型，其中Ctrl代表对照，EV71-HP代表野生株HP。
图4为本发明实施例4中HP各突变株病毒蛋白的表达，其中Ctrl代表对照，EV71-HP代表野生株HP。
图5为本发明实施例5中HP各突变株病毒正负链基因组RNA的复制水平。
图6为本发明实施例6中检测HP各突变株释放到上清中的病毒颗粒。
图7为本发明实施例7中检测HP各突变株病毒的吸附能力和内化效率，其中，A为吸附能力检测结果，B为内化效率检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，对于VP1蛋白突变位点的描述中，T32A代表第32位氨基酸由T突变为A，A46T代表第46位氨基酸由A突变为T，以此类推。
实施例1肠道病毒71型HP株致流产VP1各突变株cDNA感染性克隆的构建
以肠道病毒71型野生株病毒(EV71-HP株)的感染性克隆质粒为模板，通过定点突变的方法将VP1蛋白相应位点进行突变，分别将VP1蛋白的第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
首先分别用带有突变碱基的引物(表1)扩增出带有相应突变位点的质粒。PCR反应结束后，加入限制性内切酶DpnI消化甲基化质粒模板。将处理好的PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，携带缺刻的突变质粒在DH5α中得到修复和扩增。最后通过测序验证突变位点被成功引入(图1和图2)，得到HP-T32A、HP-A46T、HP-M63A、HP-E65A、HP-T66A、HP-L70A、HP-N71A、HP-G105A、HP-Q118A、HP-T141A及HP-A160T的cDNA感染性克隆。
表1构建突变株感染性克隆的点突变引物名称及序列
实施例2通过感染性克隆拯救EV71-HP各突变株病毒
体外转录：使用限制性内切酶HindIII对各突变株cDNA感染性克隆的3’端酶切，得到线性化的DNA模板。利用胶回收纯化试剂盒(货号：CW2301M，购自CWBIO公司)提纯后用T7RNA聚合酶体外转录试剂盒MEGAscript High Yield Transcription Kit(货号：#ON-040，购自HONGENE BIOTECH公司)在体外转录出全长的病毒基因组RNA，然后用氯化锂对RNA进行纯化。
细胞转染：Vero细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基中，接种六孔板24h后，更换为不含血清的DMEM培养基，用RNAiMAX转染试剂(货号：13778150，购自ThermoFisherScientific)进行转染，每孔转染2μg RNA。转染后每天观察细胞的病变效应(cytopathiceffect，CPE)，待细胞圆缩、脱落达75％以上或转染后7d，收获病毒感染的细胞及培养上清进行鉴定与传代。
实施例3EV71-HP各突变株在Vero细胞上的增殖表型
将Vero细胞铺于六孔板中，待第二天细胞融合度达到90％左右时，每孔转染2μg病毒基因组RNA，每天观察细胞的CPE进展，待细胞90％-100％发生病变时或转染后7d收取上清，拯救得到相应的病毒。在显微镜下拍照记录细胞的CPE进展情况，结果显示，HP株及其突变株基因组RNA转染细胞1d后均使细胞产生零星的细胞病变。转染7d后，HP株产生的CPE可达80％以上，而其他突变株基因组转染的细胞在后续观察的7天中未出现明显的CPE(图3)。收取上清，在新的细胞中盲传3代，仍不能使感染细胞产生CPE，说明VP1蛋白第32、46、63、65、66、70、71、105、118、141、160位氨基酸位点的单一突变均能阻断病毒的增殖，使其发生流产，不能产生有感染性的子代病毒颗粒。
实施例4免疫印迹(Western blotting)检测HP各突变株病毒蛋白的表达
Vero细胞接种六孔板24h后，每孔转染2μg病毒基因组RNA。转染24h后用1mL预冷的PBS收集细胞，800rpm离心10min，弃掉PBS，加入1×SDS loading buffer，金属浴100℃30分钟，样品即可进行PAGE电泳。利用特异性抗体通过Western Blotting分别检测病毒结构蛋白VP1、VP2和VP0的表达。一抗分别为抗EV71VP1鼠单克隆抗体(货号：MAB1255-M08，购自Abnova公司)、抗EV71 VP0/2鼠单克隆抗体(货号：MAB979，购自Millipore公司)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗(货号：ZB-2305，购自中杉金桥公司)。免疫印迹结果显示，HP株各突变株(HP-T32A、HP-A46T、HP-M63A、HP-E65A、HP-T66A、HP-L70A、HP-N71A、HP-G105A、HP-Q118A、HP-T141A及HP-A160T)基因组RNA转染的细胞中均能检测到特异病毒蛋白的表达(图4)，说明病毒的蛋白合成未被阻断，但病毒蛋白的表达量均显著低于野生株。
实施例5RT-qPCR检测HP各突变株正负链基因组RNA的复制
Vero细胞接种六孔板24h后，每孔转染2μg病毒基因组RNA。转染24小时后用1×PBS洗3次，然后用细胞刮板轻轻将细胞刮下置于1.5mL EP管中3000rpm离心10min后弃上清。再加入1mL Trizol Reagent试剂(货号：R401-01-AA，购自Vazyme公司)于冰上裂解30min，加入200μL氯仿涡旋震荡，12000rpm离心15min取水相于新的EP管中，1:1体积加入异丙醇溶液后上下颠倒混匀，静置10min后12000rpm离心10min，弃掉上清。加入75％乙醇8000rpm离心5min，弃掉上清，晾干沉淀至透明，加入适量无RNA酶的水溶解沉淀即为病毒感染细胞的总RNA样品。
取上述2μg RNA样品和2μL引物EV71-qPCR-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAAA-3’)或EV71-qPCR-R(5’-GAGTGGCAAGATGTC GGTTG-3’)，于1.5mL EP管中混匀，同时加入1μL RNase Inhibitor(25U/μL)，5μL dNTPs(2.5mM)，5μL 5×Reversetranscriptase buffer，1μL M-MLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，用DEPC水补齐体系至25μL进行逆转录，分别以病毒基因组负链或正链RNA为模板合成cDNA。
通过RT-qPCR对合成的cDNA样品进行定量分析。反应体系为10μL Power SYBRgreen PCR Master Mix；0.4μL EV71-qPCR-F；0.4μL EV71-qPCR-R；1μL cDNA样品；最后用ddH2O补齐至20μL。每个样品做3个复孔，以GAPDH为内参，按照2-ΔΔCt法计算病毒基因组负链或正链RNA的拷贝数。结果显示，HP及其各突变株病毒(HP-T32A、HP-A46T、HP-M63A、HP-E65A、HP-T66A、HP-L70A、HP-N71A、HP-G105A、HP-Q118A、HP-T141A及HP-A160T)基因组RNA转染的细胞中均能检测到相应的负链基因组RNA，说明这些位点突变后，病毒基因组的复制也没有被阻断(图5)。
实施例6检测HP各突变株基因组RNA转染的细胞上清中释放的病毒颗粒
为检测上述突变位点是否会阻断子代病毒颗粒的释放，将各株病毒基因组RNA转染细胞24h后的上清经15％的蔗糖垫在4℃ 37000rpm离心2.5h(Beckman SW41Ti)进行浓缩纯化，然后通过Western blotting检测病毒的VP1蛋白。Western blotting结果显示，HP株及VP1蛋白第32、46、63、65、66、70、71位点突变株基因组RNA转染细胞的上清中均能检测到VP1蛋白(图6)，说明这7个氨基酸位点的突变并不会阻断EV71子代病毒颗粒的释放。而VP1蛋白第105、118、141、160位点突变株基因组RNA转染细胞的上清中未能检测到病毒的VP1蛋白，表明上述4个位点的单一突变能阻断子代病毒颗粒的释放，导致病毒的流产。
实施例7检测HP各突变株病毒的吸附能力和内化效率
Vero细胞六孔板每孔转染2μg病毒基因组RNA(HP-T32A、HP-A46T、HP-M63A、HP-E65A、HP-T66A、HP-L70A、HP-N71A)，转染24h后收取上清，即拯救得到病毒。将收集到的病毒经15％的蔗糖垫超离浓缩(37000rpm离心2.5h)。每份样品的一半用Trizol LS提取RNA后使用引物EV71-qPCR-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACTT CACTATGAAA-3’)和EV71-qPCR-R(5’-GAGTGGCAAGATGTC GGTTG-3’)通过RT-qPCR定量病毒基因组RNA的拷贝数。
吸附实验：将含有相同基因组RNA拷贝数的病毒加入Vero细胞六孔板，4℃同步化吸附1h后用PBS清洗细胞3次，去掉未吸附的病毒粒子。收取细胞，用Trizol提取总RNA，通过RT-qPCR定量吸附到细胞表面的病毒基因组RNA。结果显示，上述7株子代病毒的释放未被阻断的突变株，其对Vero细胞的吸附能力并未完全丧失，只有EV71-N71A株的吸附能力与野生株HP和其他突变株相比明显降低(图7的A)。
内化实验：将含有相同基因组RNA拷贝数的病毒加入Vero细胞六孔板，4℃吸附1h，用PBS洗3次，再置于37℃孵育30min完成病毒的内化。然后用胰酶消化5分钟清除吸附在细胞表面未内化的病毒颗粒。收取细胞，用Trizol提取总RNA，通过RT-qPCR定量进入到细胞内的病毒基因组RNA。结果显示，虽然各突变株内化的效率不一，但均能检测到已内化的病毒颗粒(图7的B)。综合吸附实验和内化实验的结果，推测导致上述7株突变株病毒流产的原因可能发生在内化后病毒感染的早期阶段。这7个突变位点均位于VP1蛋白的N末端，很可能是在病毒脱衣壳过程中阻抑了A-particle的变构，从而导致病毒的基因组RNA无法顺利地释放到胞质中。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-11任一所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
4.cDNA，其特征在于，所述cDNA包含肠道病毒71型的全长核酸序列，所述全长核酸序列发生突变以使得其编码的VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的cDNA，或者，所述生物材料表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.肠道病毒71型突变致流产株感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将肠道病毒71型的感染性克隆进行突变以使得其编码的VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
7.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的cDNA或权利要求5所述的生物材料在构建肠道病毒71型感染性克隆中的应用。
8.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的cDNA或权利要求5所述的生物材料在降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力中的应用；
优选地，所述降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力为使得肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力丧失。
9.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的cDNA或权利要求5所述的生物材料的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物中的应用；
(2)在作为用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选靶点中的应用；
(3)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选中的应用；
(4)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的质量控制中的应用。
10.一种使肠道病毒71型丧失增殖能力和/或毒力的方法，其特征在于，所述方法包括：将肠道病毒71型的基因组进行突变，以使得其编码VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第32位由T突变为A、第46位由A突变为T、第63位由M突变为A、第65位由E突变为A、第66位由T突变为A、第70位由L突变为A、第71位由N突变为A、第105位由G突变为A、第118位由Q突变为A、第141位由T突变为A、第160位由A突变为T。
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