CN117736277A - 肠道病毒71型vp1蛋白高保守氨基酸位点突变病毒株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及肠道病毒71型VP1蛋白高保守氨基酸位点突变病毒株及其构建方法和应用。本发明提供的肠道病毒71型VP1蛋白突变体及其对应的编码核酸分子和生物材料能够使得肠道病毒71型的增殖能力显著下降，且毒力明显降低，可用于构建肠道病毒71型突变病毒株，降低肠道病毒71型的增殖能力和毒力。本发明提供的突变病毒株可用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染的药物的开发、筛选和质量控制，对于肠道病毒71型感染的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及肠道病毒71型VP1蛋白高保守氨基酸位点突变病毒株及其构建方法和应用。
背景技术
肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)是引起手足口病(Hand,Foot and MouthDisease，HFMD)的主要病原之一，其临床症状表现为手、足、口部的粘膜疱疹及溃疡，与柯萨奇病毒A16引起的HFMD类似。HFMD通常是一种自限性疾病，严重时可导致中枢神经系统感染甚至死亡。
EV71是一种正链RNA病毒，编码一条含有2193个氨基酸的多聚蛋白，可被加工成结构蛋白和非结构蛋白，包括结构蛋白P1区(VP4、VP2、VP3、VP1)以及非结构蛋白P2区(2A、2B、2C)和P3区(3A、3B、3C、3D)。结构蛋白组装成病毒颗粒的衣壳，其中VP1蛋白暴露在病毒衣壳的表面，是主要的受体结合蛋白，该蛋白的某些位点突变已被证明可影响病毒与受体的吸附进而影响EV71的感染性和毒力。目前已经确定出5种EV71的膜受体，其中最重要的两个分别为清道夫受体B2(SCARB2，广泛分布于各种组织细胞)和P选择素糖蛋白配体1(PSGL-1，主要在白细胞中表达)。
Zhang YX等人(Zhang Y-X,Huang Y-M,Li Q-J,Li X-Y,Zhou Y-D,Guo F,et al.(2017)A highly conserved amino acid in VP1 regulates maturation ofenterovirus 71.PLoS Pathog 13(9):e1006625.)发现VP1107单一位点的丙氨酸到苏氨酸突变可以影响病毒在细胞中的增殖表型，其机制是通过影响子代病毒颗粒的成熟化剪切从而影响了病毒的脱衣壳过程。开发更多的、从不同机制影响病毒增殖或毒力的VP1蛋白突变病毒株对于EV71病毒疫苗等药物的开发、筛选和质量控制以及EV71感染的预防和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明提供肠道病毒71型VP1蛋白高保守氨基酸位点突变体、其突变病毒株及其构建方法和应用。
本发明在对肠道病毒71型VP1蛋白的定点突变筛选中发现，将VP1蛋白的以下位点进行突变：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A能够显著降低病毒与受体的结合能力，显著降低病毒的增殖力和毒力，是肠道病毒71型的毒力位点。经比对，上述位点在不同基因型病毒株中高度保守，为“跨型别高保守位点(cross genotype highlyconserved sites,CGHCS)”。这些突变位点及其对应蛋白突变体、突变病毒株的开发为研发新的抗EV71药物以及获得新的EV71疫苗候选株奠定了重要基础，为阐明病毒的致病机制、定位病毒的毒力决定位点提供了依据。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供肠道病毒71型VP1蛋白突变体，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
优选地，所述肠道病毒71型VP1蛋白突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的任一种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
优选地，所述野生型病毒株为野生型病毒株HP，其VP1蛋白的氨基酸序列为将SEQID NO.1所示序列的第78位由A突变为T。
优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-7任一所示。
上述VP1蛋白突变体能够使得EV71的受体结合能力下降、增殖力和毒力也明显下降。
本发明提供编码以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体的核酸分子。
根据上述提供的VP1蛋白突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码上述VP1蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，该核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述VP1蛋白突变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列为在肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白编码基因的基础上，进行以下突变中的任一种：第78位氨基酸的密码子突变以使得其由T突变为A、第88位氨基酸的密码子突变以使得其由G突变为A、第99位氨基酸的密码子突变以使得其由G突变为A、第133位氨基酸的密码子突变以使得其由A突变为T、第139位氨基酸的密码子突变以使得其由A突变为T、第158位氨基酸的密码子突变以使得其由P突变为A、第159位氨基酸的密码子突变以使得其由G突变为A。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-14任一所示。
本发明提供包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒可为将所述核酸分子与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。
所述宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞，所述微生物包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酵母)或病毒(例如肠道病毒71型)。所述动物细胞可为常用于培养病毒的动物细胞(例如Vero细胞等)。
本发明提供肠道病毒71型突变病毒株，所述肠道病毒71型突变病毒株包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
优选地，所述肠道病毒71型突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株的基因组进行突变以使得其VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
在本发明的一些实施方式中，所述突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株HP(Zhang YX,Huang YM,Li QJ,et al.A highly conserved amino acid in VP1regulates maturation of enterovirus 71[J].PLoS Pathogens,2017,13(9):e1006625.DOI:10.1371/journal.ppat.1006625.)的病毒基因组进行突变以使得其VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
以上所述的肠道病毒71型突变病毒株具有降低的受体结合能力、细胞吸附能力、增殖能力和/或毒力。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述生物材料在构建肠道病毒71型突变病毒株中的应用。
优选地，所述肠道病毒71型突变病毒株具有降低的受体结合能力、细胞吸附能力、增殖能力和/或毒力。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述生物材料在降低肠道病毒71型的增殖能力、毒力、受体结合能力和/或细胞吸附能力中的应用。
本发明中，所述受体结合能力中的受体优选为SCARB2受体和/或PSGL-1受体。
本发明中，所述细胞吸附能力中的细胞优选为Vero细胞。
具体地，含有以下突变中的一种或多种的VP1蛋白突变体及表达该VP1蛋白突变体的突变病毒株与PSGL-1受体的结合能力下降：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第139位由A突变为T、第159位由G突变为A。
含有以下突变中的一种或多种的VP1蛋白突变体及表达该VP1蛋白突变体的突变病毒株与SCARB2受体的结合能力下降：第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第159位由G突变为A。
含有以下突变中的一种或多种的VP1蛋白突变体及表达该VP1蛋白突变体的突变病毒株对Vero细胞的吸附能力下降：第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述肠道病毒71型病毒株的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物中的应用；
(2)在作为用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选靶点中的应用；
(3)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选中的应用；
(4)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的质量控制中的应用。
优选地，所述药物包括治疗性药物(例如抗体、抗病毒化合物、组合物等药物)、疫苗等。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述肠道病毒71型病毒株在制备用于检测肠道病毒71型在样品中是否存在或其存在水平的产品中的应用。
本发明提供以上所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述肠道病毒71型病毒株在制备肠道病毒71型感染的动物模型中的应用。
本发明提供一种降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力的方法，所述方法包括：将肠道病毒71型的基因组进行突变，以使得其编码VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的肠道病毒71型VP1蛋白突变体及其对应的编码核酸分子和生物材料能够使得肠道病毒71型的增殖能力显著下降，且毒力明显降低，突变体及其突变病毒株的受体结合能力下降、细胞吸附能力下降，可用于构建肠道病毒71型突变病毒株，降低肠道病毒71型的增殖能力和毒力。
本发明提供的突变病毒株可用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染的疫苗等药物的开发、筛选和质量控制，对于肠道病毒71型感染的防治具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中各突变株病毒基因组的测序鉴定结果。
图2为本发明实施例4中各突变株病毒的蛋白表达检测结果，其中Ctrl代表对照，EV71-HP代表野生株HP。
图3为本发明实施例5中各突变株病毒的细胞增殖表型，其中Ctrl代表对照，EV71-HP代表野生株HP。
图4为本发明实施例5中各突变株病毒的生长动力学曲线，其中，A为以MOI＝10接种Vero细胞，B为以MOI＝0.1接种Vero细胞。
图5为本发明实施例6、7、8中各突变株病毒对细胞受体的吸附能力，其中，A为与SCARB2受体、PSGL-1受体的结合能力，B为对Vero细胞的吸附能力，C为病毒基因组RNA拷贝数。
图6为本发明实施例9中各突变株在BALB/c乳鼠体内的毒力表型，其中，A为小鼠后肢麻痹情况，B为小鼠体重，C为小鼠死亡率，D为病毒在小鼠各脏器中的载量；其中，MOCK代表对照，EV71-HP代表野生株HP。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，对于VP1蛋白突变位点的描述中，T78A代表第78位由T突变为A，G88A代表第88位由G突变为A，以此类推。
实施例1肠道病毒71型HP株VP1蛋白高保守氨基酸位点突变株cDNA感染性克隆的构建
以野生型病毒株(EV71-HP株)的感染性克隆质粒为模板，通过定点突变的方法分别将VP1蛋白的第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。首先分别用带有突变碱基的引物(表1)扩增出带有相应点突变的质粒。PCR反应结束后，加入限制性内切酶DpnI消化甲基化的质粒模板。将处理好的PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，携带缺刻的突变质粒在DH5α中得到修复和扩增。最后通过测序验证各突变位点被成功引入(图1)，得到HP-T78A(即HP株的VP1蛋白第78位由T突变为A)、HP-G88A、HP-G99A、HP-A133T、HP-A139T、HP-P158A和HP-G159A株的感染性克隆。
表1引物名称和序列
实施例2通过感染性克隆拯救EV71突变株病毒
体外转录：使用限制性内切酶HindIII对各突变株cDNA感染性克隆的3’端进行酶切，得到线性化的DNA模板，利用胶回收纯化试剂盒(货号：CW2301M，购自CWBIO公司)提纯后用T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒MEGAscript High Yield Transcription Kit(货号：#ON-040，购自HONGENE BIOTECH公司)在体外转录出全长的病毒基因组RNA，然后用氯化锂纯化RNA。
细胞转染：Vero细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基中，接种六孔板24h后，更换为不含血清的DMEM培养基，用RNAiMAX转染试剂(货号：13778150，购自ThermoFisherScientific)进行转染，每孔转染2μg RNA。转染后每天观察细胞的病变效应(cytopathiceffect，CPE)，待细胞圆缩、脱落达75％以上或转染后7d，收获病毒感染的细胞及培养上清进行鉴定与传代。
实施例3 RT-PCR鉴定拯救出的突变株病毒的VP1序列
用Trizol LS提取突变株病毒的基因组RNA作为模板，利用引物EV71-VP1-PCR-F(5’-GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTG-3’)和EV71-VP1-PCR-R(5’-CAAGAGTgGTGATCGCTGTGC-3’)通过RT-PCR反应扩增病毒基因组第2438位至3329位核苷酸序列(包含VP1蛋白的编码序列)。通过测序分析对拯救出的突变病毒株进行鉴定，结果显示，由相应突变株感染性克隆拯救出的病毒含有预期的氨基酸突变位点，即分别获得VP1蛋白的第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A的7种突变株病毒，分别命名为HP-T78A、HP-G88A、HP-G99A、HP-A133T、HP-A139T、HP-P158A和HP-G159A。
实施例4免疫印迹(Western blotting)检测突变株病毒蛋白的表达
Vero细胞接种六孔板24h后，每孔转染2μg病毒基因组RNA。转染48h后用1mL预冷的PBS收集细胞，800rpm离心10min，弃掉PBS，加入1×SDS loading buffer，金属浴100℃30分钟，样品即可进行电泳。利用特异性抗体通过Western Blotting分别检测病毒结构蛋白VP1、VP2和VP0的表达。一抗分别为抗EV71 VP1鼠单克隆抗体(货号：MAB1255-M08，购自Abnova公司)、抗EV71 VP0/2鼠单克隆抗体(货号：MAB979，购自Millipore公司)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗(货号：ZB-2305，购自中杉金桥公司)。免疫印迹结果显示，HP株与其各突变株病毒基因组RNA转染的细胞中均能检测到特异的病毒蛋白的表达，与HP株相比，各突变株的VP1、VP2和VP0蛋白表达量均显著降低(图2)。
实施例5突变株病毒在Vero细胞中的增殖表型
Vero细胞六孔板每孔转染2μg病毒基因组RNA，每天观察细胞的CPE进展，待细胞90％-100％发生病变时，收取上清，即拯救得到相应的病毒。显微镜下拍照记录细胞的CPE。HP株基因组RNA转染细胞后，病毒的增殖及细胞CPE的进展较各突变株病毒明显更快(图3)。转染1d后，HP株及其突变株基因组转染的细胞均产生零星的细胞病变。而转染3d后，HP株产生的CPE可达80％以上，而各突变株产生的CPE没有明显进展。HP-A139T株转染4d后，HP-G99A、HP-A133T株转染5d后，HP-T78A、HP-G88A、HP-P158A和HP-G159A转染7d后，细胞CPE才可达80％以上，说明VP1蛋白第78、88、99、133、139、158、159位氨基酸位点的突变均能显著影响病毒在细胞中的增殖表型，显著降低了病毒的增殖能力。
用微量滴定法测定病毒的感染性滴度。Vero细胞接种96孔板，每孔接种1×104个细胞。第二天待细胞长成单层后，用DMEM培养基10倍连续梯度稀释待测病毒液，每孔接种100μL稀释的病毒液。每天观察记录各孔细胞的CPE进展，直至接种后第5天终止观察。根据Reed-Muench公式，计算该病毒的TCID50。此外，分别以高感染剂量(MOI＝10)和低感染剂量(MOI＝0.1)接种HP及其各突变株病毒到Vero细胞，置37℃培养。高感染剂量接种后于感染后0h，2h，4h，8h，12h，24h、36h、48h和72h收取样品，低感染剂量接种后分别在病毒接种1d，2d和3d后收取样品。用微量滴定法测定上清中的病毒滴度，绘制EV71的增殖动力学曲线。结果表明，以MOI＝10接种Vero细胞后，随着培养时间的延长，HP突变株的滴度都逐渐增大，但在接种72h内T78A、G99A、A133T和G159A突变株的病毒滴度始终低于野生株病毒，其余突变株与野生株的滴度基本持平(图4的A)。当以MOI＝0.1接种Vero细胞72h后，T78A、G99A、G159A突变株的病毒滴度与野生株相比差距更大，其余突变株与野生株的滴度基本持平(图4的B)。
实施例6 HP-G99A、HP-A133T和HP-G159A突变株病毒与SCARB2受体体外结合能力下降
EV71-SCARB2-Fc结合实验是将Dynabeads蛋白G(Life technologies)和SCARB2嵌合Fc的蛋白在300μL免疫共沉淀缓冲液中置于4℃孵育1小时，然后用PBS洗三次珠子，加入经超离浓缩的病毒液(含0.5μg VP1蛋白)，在免疫共沉淀缓冲液中再孵育1小时，之后再清洗三次珠子，即获得免疫沉淀产物。经Western blotting分析，用抗EV71 VP1抗体(Abnov，MAB1255-MO8)检测与SCARB2受体蛋白结合的病毒颗粒。结果显示，与野生株HP相比，突变株HP-G99A、HP-A133T、HP-G159A与SCARB2受体的结合能力显著降低，其余突变株与SCARB2受体的结合能力基本持平(图5的A)。
实施例7 HP-T78A、HP-G88A、HP-G99A、HP-A139T和HP-G159A突变株病毒与PSGL-1受体体外结合能力下降
EV71-PSGL-1-Fc结合实验是将Dynabeads蛋白G(Life technologies)和PSGL-1嵌合Fc的蛋白在300μL免疫共沉淀缓冲液中置于4℃孵育1小时，然后用PBS洗三次珠子，加入经超离浓缩的病毒液(含0.5μg VP1蛋白)，在免疫共沉淀缓冲液中再孵育1小时，之后再清洗三次珠子，即获得免疫沉淀产物。经Western blotting分析，用抗EV71 VP1抗体(Abnov，MAB1255-MO8)检测与PSGL-1受体蛋白结合的病毒颗粒。实验结果显示，与野生株HP相比，突变株HP-T78A、HP-G88A、HP-G99A、HP-A133T、HP-A139T、HP-G159A与PSGL-1受体的结合能力显著降低(图5的A)。
实施例8 HP-G99A、HP-A133T、HP-P158A和HP-G159A突变株病毒对Vero细胞的吸附能力下降
Cell-ELISA实验：提前1天，将Vero细胞以每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板中。Vero细胞主要表达SCARB2受体。每孔细胞分别加入100μL各突变株病毒液4℃吸附1小时，然后用PBS洗三次去除未与细胞吸附的病毒颗粒。用4％多聚甲醛固定细胞，5％脱脂牛奶封闭。加入EV71 VP1一抗溶液(1：1000)，37℃孵育1小时。用PBST清洗3次后，每孔加入HRP偶联的抗鼠IgG二抗(1：50000)，室温下孵育40分钟后加入TMB过氧化物酶底物避光作用30分钟显色，完成后加入终止液停止显色。在酶标仪OD 450nm处记录每孔的吸光度数值。结果显示，HP-G99A、HP-A133T、HP-P158A、HP-G159A的OD值明显低于野生株(图5的B)，表明这4株突变株病毒对Vero细胞的吸附能力显著低于野生株。
Q-PCR检测病毒的基因组RNA拷贝数：提前1天，将Vero细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中。以MOI＝10接种突变株病毒，4℃下吸附1小时，然后用PBS洗三次去除未吸附的病毒颗粒。然后每孔细胞加入1mL Trizol提取总RNA，用引物EV71-qPCR-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAAA-3’)和EV71-qPCR-R(5’-GAGTGGCAAGATGTCGGTTG-3’)定量各突变株病毒基因组RNA的拷贝数。Q-PCR的结果与Cell-ELISA一致，HP-G99A、HP-A133T、HP-P158A和HP-G159A株病毒的基因组RNA拷贝数明显降低野生株(图5的C)，表明上述4个位点的突变会显著降低病毒颗粒对Vero细胞的吸附能力。值得注意的是，在体外受体结合实验中，P158A位点突变基本没有影响病毒与SCARB2/PSGL-1受体的结合能力，但该位点突变会影响病毒对Vero细胞的吸附能力，推测P158A突变后可能影响了EV71病毒与细胞上其它受体的结合能力。
实施例9突变株病毒在BALB/c乳鼠体内的毒力减弱
2日龄BALB/c乳鼠(5只/组)腹腔接种(100μL/只)107lgTCID50/mL的HP株及其各突变株病毒，连续观察16天，每天记录乳鼠的后肢麻痹程度，体重变化和死亡率。观察结束后解剖小鼠脾脏、胃和肌肉组织，研磨取上清，用qPCR测定病毒在小鼠体内的组织分布。结果显示，EV71-HP株感染的小鼠体重下降的速度比其突变株迅速(图6的B)，且死亡率更高(图6的C)。突变株感染小鼠后不会导致小鼠出现后肢麻痹(图6的A)，并且病毒在各脏器中的载量也显著低于野生株(图6的D)。以上结果均说明VP1蛋白第78、88、99、133、139、158、159位氨基酸位点的突变后可使病毒在小鼠体内的毒力减弱。
综上所述，本发明发现EV71的VP1蛋白的T78A、G88A、G99A、A133T、A139T、P158A、G159A这7个高保守位点的突变会影响病毒在细胞中的增殖能力，这些高保守位点很可能是EV71潜在的毒力位点。经动物实验验证，T78A、G88A、G99A、A133T、A139T、P158A、G159A这7个高保守位点的突变均导致病毒在小鼠体内的毒力减弱。
本发明提供的EV71的毒力位点以及构建的影响EV71毒力的突变病毒株对于新靶点抗病毒药物的开发和疫苗株的筛选具有重要意义。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体相对于肠道病毒71型野生型病毒株的VP1蛋白，含有以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-7任一所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述肠道病毒71型突变病毒株包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体。
6.根据权利要求5所述的肠道病毒71型突变病毒株，其特征在于，所述突变病毒株通过将肠道病毒71型野生型病毒株的基因组进行突变以使得其VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种得到：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
7.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在构建肠道病毒71型突变病毒株中的应用。
8.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料在降低肠道病毒71型的增殖能力、毒力、受体结合能力和/或细胞吸附能力中的应用。
9.权利要求1或2所述的肠道病毒71型VP1蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5或6所述的肠道病毒71型突变病毒株的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物中的应用；
(2)在作为用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选靶点中的应用；
(3)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的筛选中的应用；
(4)在用于预防和/或治疗肠道病毒71型感染或由肠道病毒71型感染导致疾病的药物的质量控制中的应用。
10.一种降低肠道病毒71型的增殖能力和/或毒力的方法，其特征在于，所述方法包括：将肠道病毒71型的基因组进行突变，以使得其编码VP1蛋白发生以下突变中的一种或多种：第78位由T突变为A、第88位由G突变为A、第99位由G突变为A、第133位由A突变为T、第139位由A突变为T、第158位由P突变为A、第159位由G突变为A。
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