CN102936278A

CN102936278A - 登革病毒2型ns3蛋白的表位多肽及其应用

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Publication number: CN102936278A
Application number: CN2012104940163A
Authority: CN
Inventors: 田衍平; 陈宗涛; 徐小峰
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-02-20

Abstract

本发明公开了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，该表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具有特异性高，免疫原性好的优点，该表位多肽可以直接与载体蛋白偶联形成交联体，制成表位多肽的衍生物，制得的衍生物能够制备预防登革病毒2型感染的疫苗，安全、可靠，无毒副作用，对预防和治疗登革病毒2型感染奠定了基础。

Description

登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，还涉及该表位多肽的衍生物和应用。

背景技术

登革病毒（dengue virus，DV）是引起人类登革热（classical dengue fever，DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）的病原体。近年来，随着人口流动的增加及全球气侯变暖，每年热带和亚热带地区约有 1亿人受到该病毒的感染，其中DHF/DSS 患者约为50万人，病死率高达5%，如未得到及时治疗，病死率可上升至50%。近年来，在流行地区，DHF/DSS的发病率呈明显增加趋势，已成为严重的公共卫生问题。但迄今为止，DF、DHF和DSS的发病机制仍不十分清楚，也缺乏安全有效的预防疫苗和治疗药物。因此，DF、DHF和DSS已成为当今世界严重的公共卫生问题，对其病原体、发病机理及防治策略的相关研究具有重要意义。

DV是黄病毒属的单链正股RNA病毒，基因组约为10kb、含有一个ORF，编码3个结构蛋白（C, prM 和E）和7个非结构蛋白（NS1-NS2a/2b-NS3-NS4a/4b-NS5）。DV有四个血清型（DV1-DV4），以蚊虫为传播媒介，其中主要流行的是DV2。目前，DV致病机理和人体免疫防御机制不明，缺乏有效的治疗手段，临床上仍以治疗为主。由于人体抵抗不同型DV感染的能力弱，发病地区的人群反复感染DV是比较常见的，因而潜在的DHF/DSS发生的可能性很大，导致DV的危害性呈上升趋势。DV致病机理和人体免疫防御机制不明使得DV的疫苗研究仍处在实验阶段。DV疫苗研究的重点集中在研制四价疫苗，希望获得能同时针对四型DV的疫苗，从而在根本上防治DV感染和DHF/DSS的出现。减毒四价活疫苗曾一度被认为是最具前景的候选疫苗。但由于是减毒或灭活病原体，存在一定的毒副作用。基因工程疫苗研究虽然取得了较大进步，获得了各种重组的DV蛋白。但无论是大肠杆菌还是真核体系的酵母菌、杆状病毒、哺乳动物细胞等表达方式均有不足，且重组蛋白纯化复杂，避免蛋白结构和功能改变困难。迄今为止，仍然没有获得既安全又有效的疫苗。20 世纪80 年代初，Lerner等提出发展合成多肽疫苗，并预测合成多肽疫苗将是人类预防疾病的终极武器。合成肽疫苗 (synthetic peptide vaccine) 就是用化学合成抗原表位氨基酸序列法制备而成的具有保护性作用的类似天然抗原决定簇的多肽疫苗。多肽具有免疫背景明确、稳定、纯度高、易于获得、批间差异极小、无毒副作用等优点，还有一个极大的优势就在于可对任意氨基酸顺序组合进行合成，可以极方便地将多种病原的表位、同类病原不同亚型的表位组合在一起，从而获得针对多种疾病的超级疫苗。这种疫苗不含核酸，是最为理想的安全新型疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一。

对于合成肽疫苗的设计，最重要的一步是找到特异的抗原表位。登革病毒的非结构蛋白3(NS3)是一个多功能蛋白，具有多种酶活性，涉及到病毒多聚蛋白的加工和RNA的复制及5’加帽。该蛋白具有很好的免疫原性，并存在特异的CD4⁺和CD8⁺ T 细胞识别表位。可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。

因此，急需一种登革病毒2型NS3蛋白的表位肽，特异性高、免疫原性好。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一个登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽；本发明的目的之二在于提供一个含登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽的衍生物，本发明的目的之三在于提供衍生物在制备预防或治疗登革病毒2型感染的药物中的应用。本发明的目的之四在于提供衍生物在制备诊断或检测登革病毒2型感染的试剂中的应用。

为实现上述发明目的，技术方案为：

1.登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含权利要求1所述表位多肽的衍生物，所述衍生物为所述表位多肽与载体蛋白偶联的交联体。

优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

3.所述的衍生物在制备预防或治疗登革病毒2型感染的疫苗中的应用。

4.所述的衍生物在制备诊断或检测登革病毒2型感染的试剂中的应用。

本发明有益效果在于：本发明公开了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，是以抗登革病毒NS3蛋白单克隆4F5抗体为基础，以噬菌体肽库初步确定单克隆4F5抗体所对应的抗原表位所在区域，然后合成表位多肽，通过拮抗试验，检测到表位多肽能够抑制单克隆4F5抗体结合登革病毒2型抗原的活性。

为了增强表位多肽的免疫原性，将表位多肽与载体蛋白偶联形成交联体，免疫BALB/c小鼠后能产生特异的免疫反应，因此可以利用表位多肽研制登革病毒2型的疫苗和诊断试剂。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1 筛选的噬菌体与抗体4F5的结合能力鉴定结果图（4F5为单克隆抗体，NMS为正常鼠血清）。

图2 筛选噬菌体肽库的氨基酸序列及登革病毒2型(Tr1751株)所对应的序列。

图3 4F5与表位多肽反应的ELISA结果图。

图4表位多肽的拮抗试验ELISA结果图。

图5表位多肽与BSA偶联的交联体免疫动物后抗血清效价测定图。

图6 抗交联体血清与DV2的免疫荧光分析结果图（a: DV2 感染的细胞与表位多肽免疫的抗血清孵育；b: 正常细胞与表位多肽免疫的抗血清孵育；c: DV2 感染的细胞与对照多肽免疫的抗血清孵育；d: 正常细胞与对照多肽免疫的抗血清孵育）。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1、材料的准备

登革病毒2型（DV2，Tr1751株）：由本实验室保存。

实验动物：BALB/c小鼠，6-8周龄，SPF级，雌性，体重18-22g，购自第三军医大学实验动物中心。

合成多肽：由上海生工生物工程公司合成，用二甲亚砜（DMSO）溶解成5mg/mL的浓度，-70℃保存，临用时用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成1mg/mL。

弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司；噬菌体肽库展示试剂盒（Ph.D.-7 ^TM Phage Display Peptide Library Kit），购自美国NEB公司。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加蒸馏水至1000mL，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

LB固体培养基：1.5g琼脂粉加入100mL LB培养液中，高压蒸气灭菌后倾倒平板。

DNA电泳缓冲液(50×TAE) ：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，加水至1000mL即可，应用浓度为1×TAE。

EB溶液：EB贮存液(10mg/ml)，0.2g EB溶解于20mL H₂O中，混匀后于4℃避光保存。

EB染色液：10μL EB贮存液，100mL 1×TAE缓冲液。

PBS缓冲液(pH7.2)：Na₂HPO₄14mmol，NaH₂PO₄6mmol，NaCl₂9g，加蒸馏水到1L。

顶层琼脂：每升含：10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，1g MgCl₂·6H₂O，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50mL等份。固体培养基室温贮存，用微波炉融化。

四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。

封阻缓冲液：0.1M NaHCO₃ (pH 8.6)，5 mg/ml BSA, 0.02% NaN₃。过滤除菌，4℃贮存。

PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000，2.5M NaCl。高压灭菌，室温贮存。

碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl (pH 8.0)，1mM EDTA，4M NaI，室温避光贮存。

考马斯亮兰R-250快速染色系统(参考《精编分子生物学实验指南》)。染色液：0.29g考马斯亮兰R-250溶于250mL下述脱色液中。脱色液：250mL 95%乙醇和80mL冰乙酸，加双蒸水至1000mL。

TE buffer(pH 8.0)：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA。

ELISA试剂的配制

1）包被液：0.05mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）：Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃2.9g，NaN₃0.2g，加蒸馏水至1000mL；

2）抗体稀释液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05%Tween-20；0.5%BSA；

3）封闭液：10mmol/L PBS(pH7.3)；2.0% BSA；

4）洗涤液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05% Tween-20；

5）底物液：0.1mmol/L Na₂HPO₄ 5.12ml；0.05mmol/L柠檬酸4.86 ml；OPD 4mg；30% H₂O₂ 5μl；加水至100 ml。

Western blot试剂的配制

1）TBS缓冲液：100mmol/L Tris.cl, pH7.5, 0.9%NaCl；

2）TTBS：0.1%（V/V）Tween20溶于TBS缓冲液中，于4℃保存备用；

3）电转液：在500mL去离子水中加入3.03gTris碱和14.41g甘氨酸，再加入200mL甲醇，并补水至1L，溶液pH值约为8.3-8.4；如果用PVDF膜，甲醇浓度应降至15%，如果用尼龙膜，可不加甲醇。

实施例2、抗体纯化

（1）缓冲液的准备：

平衡缓冲液：50mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5；

洗脱缓冲液：0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.0；

再生缓冲液：0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH3.0；

中和缓冲液：1M Tris-Cl，pH9.0；

以上缓冲液使用前均需0.45μm滤膜过滤。

（2）样品的准备

取用登革病毒2型（Tr1751株）免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，制备的阳性杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔得到腹水（具体见Zongtao Chen et al. Production of a Monoclonal Antibody Against Non-Structural Protein 3 of Dengue-2 Virus by Intrasplenic Injection）。所得的腹水用平衡缓冲液稀释10倍，以保证样品液的成分及pH与平衡缓冲液接近，然后孔径为0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

（3）操作步骤

a) 填料蛋白A琼脂糖(Agarose protein A)装柱后，用纯水流洗5个柱床体积洗掉乙醇，用平衡缓冲液流洗10个柱床体积平衡柱子。通过蛋白A可以特异性的与抗体的Fc段结合，但是不同pH值的结合程度不同，因此可以通过调节pH值结合抗体并洗脱抗体。

b) 将步骤（2）制备的样品上柱，上样流速 60cm/h。

c) 然后用平衡缓冲液再洗10个柱床体积，把UV洗至基线。

d) 用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱后立即用中和缓冲液中和到中性。

e) 然后用再生缓冲液流洗5个柱床体积，再依次用纯水、20%乙醇分别流洗5个柱床体积，柱子再生后置于4℃保存。

纯化结果：经过亲和层析得到纯化的4F5抗体（单抗），纯化的4F5抗体进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，检测其灰度值分析，结果表明纯化的蛋白纯度达到85%以上。

实施例3、利用噬菌体肽库筛选抗原表位

一、噬菌体筛选

第一天：纯化的4F5抗体包被96孔微量板

1. 将实施例2制备的4F5抗体溶于0.1M pH8.6的NaHCO₃中，制备成浓度为100μg/mL的4F5抗体溶液。

2. 在96孔微量板上每孔加入150μL步骤1制备的4F5抗体溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。

3. 然后将96孔微量板放入增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中，4℃轻微震荡，孵育过夜。

第二天

4. 挑宿主菌ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于20mL LB液体培养基中，37℃剧烈震荡培养。

5. 倒掉96孔微量板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每孔加满封阻液，4℃作用至少1小时。

6. 将步骤5封阻液除去后，再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均匀旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。

7. 用100μL的TBST缓冲液稀释成浓度为2×10¹¹的噬菌体（即10μL的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动60min。

8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。

9. 按步骤6的用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。

10. 用非特异性缓冲液 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2)，1mg/mL BSA来分离已结合的分子：温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用15μL（1M Tris-HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。

11. 参照试剂盒说明书测定洗脱物的滴度（测定量约为1μL）（试剂盒 Ph.D.-7 ^TM Phage Display Peptide Library Kit 购自美国NEB公司）。

12. 剩余洗脱物扩增：将洗脱物加入到20mL ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37℃剧烈摇动培养4.5小时。

13. 将培养物转入一离心管中，然后，在4℃、10000rpm条件下，离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。

14. 将上清的80%转入一新鲜管中，加入相当于上清液体积1/6的PEG/NaCl。4℃沉淀过夜，使噬菌体充分沉淀。

第三天

15.将步骤14所得的沉淀在4℃、10000 rpm条件下离心15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

16. 将步骤15的沉淀物重悬于1mL TBS溶液中，悬液转入微量离心管中，在4℃、10000rpm条件下，离心5min，使残余细胞沉淀。

17. 上清液转入另一新鲜微量离心管，加入相当于上清液体积1/6的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4℃、10000rpm条件下，离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

18. 沉淀物重悬于200μL TBS溶液中，质量分数为0.02% 的NaN3溶液中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中，即为扩增后的洗脱物。

19.将步骤18得到的扩增后洗脱物用常规M13方法，用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4℃贮存。

20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用。

第四和第五天

21. 计数板上蓝斑数确定滴度，用这个值来计算相应于洗脱物中2×10¹¹ pfu的加入量。

22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹ pfu的噬菌体量重复4-18步骤，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。

23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。

24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用。

第六天

25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹ pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。

26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用。

27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。

28．噬菌斑的扩增：将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 mL到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。

29. 用灭菌牙签挑一蓝色噬菌斑到上述1 mL培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。37℃摇床培养4.5-5 小时（不要过长）。

30. 培养物转入微量离心管中，离心30 秒。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液。

二、结合克隆的特征鉴定

用ELISA检测所选噬菌体对靶分子4F5抗体（单抗）的结合

1.将上述扩增噬菌体，于4℃保存。

2.对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管ER2738于20mL LB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。

3.每管ER2738培养液中加入5 μL扩增噬菌体，37℃通气培养4.5小时。

4.将步骤3的培养物转入离心管中，在4℃、10000 rpm条件下，离心10 min。收集上清，将上清移入新鲜离心管，再离心。

5.将步骤4的离心产物取80%上清于新鲜离心管中，加入相当于上清液体积1/6的PEG/NaCl，4℃沉淀至少1小时。

6.将步骤5的样品在4℃、10000 rpm条件下，离心15 min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。

7.将步骤6的沉淀重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管，4℃、10000 rpm条件下，离心5min除去沉淀中的残留细胞。

8.将上清液转入新鲜微量离心管，加入相当于上清液体积1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上作用15-60min，然后在4℃、10000rpm条件下，离心10min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。

9. 将沉淀重悬于50μL TBS中，常规M13方法测定噬菌体滴度，4℃贮存。

10. 用100-200μL 浓度为100μg/mL的纯化抗体(溶于0.1M pH 8.6 NaHCO₃中)包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆包被一排孔，在密封的湿盒中4℃包被过夜。

11. 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，每孔加满封阻液。

12. 甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度为0.5% (v/v)。

13. 在单独的封阻板中每孔预先加入200μL TBS/Tween，由每孔加入10¹¹个病毒子。

14. 用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温震荡作用1-2小时。

15. 然后用1×TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。

16. 在封阻液以1:5000的比例加入HRP标记的抗-M13抗体（体积比），每孔加入200μL稀释抗体，室温震荡作用1小时。

17. 用1×TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。

18. 按下述方法准备HRP底物溶液，每孔加200μL底物溶液，室温作用10-60min。

19. 用酶标仪读出OD490 nm处的吸光值。

结果，所选噬菌体对抗体的结合如图1所示，我们随机选取16个噬斑扩增后检测与4F5抗体和对照抗体的结合。结果13个噬菌体与4F5抗体有高的亲和力，而与正常血清没有特异反应。

实施例4 筛选噬菌体插入氨基酸序列的测定

1. 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500μL含噬菌体上清转入一新鲜离心管。

2. 加入200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。

3. 4℃，12000rpm 离心10 min，弃上清液。

4. 短暂离心，小心吸去残余上清。

5. 沉淀物重悬于100μL碘化物缓冲液中，加入250μL乙醇，室温温育10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

6. 4℃，12000rpm离心10min，弃上清，然后用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。

7. 沉淀重悬于30μL TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA]中。

8. 上述沉淀物送大连宝生物公司测序。测序引物为M13(-96)，序列为 5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。

9. 所读序列相应于模板的反义链，然后将互补链写出，根据试剂盒说明书所列的遗传密码表由此链翻译得到氨基酸序列（使用的试剂盒为 Ph.D.-7 ^TM Phage Display Peptide Library Kit，购自美国NEB公司。

结果：经过测序分析得到结果如图2所示。经过氨基酸序列比对对应DV2（登革病毒2型）NS3蛋白上的一段序列为：Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn（SEQ ID NO.1）（缩写为RVGRNPKNEN，DV2（登革病毒2型，Tr1751株）NS3蛋白的460-469位氨基酸）。

实施例5 合成表位多肽

1）表位肽的合成

针对实施例4中所确定的4F5抗体识别表位合成表位多肽和对照多肽（送上海生工生物工程有限公司合成），合成表位多肽序列为Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn（SEQ ID NO.1），对照多肽序列：Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu（SEQ ID NO.2）（缩写为：TKEGERKKL，DV2 NS3蛋白的583-591位氨基酸），纯度为85％以上，合成量为10mg。

2) 酶联免疫吸附试验（ELISA）方法验证表位多肽与4F5抗体的反应性

将合成的表位多肽和对照肽以及对照蛋白BSA包被ELISA板，以确定4F5抗体所针对的表位。具体操作步骤如下：

（1）用包被液将合成的表位多肽与对照多肽分别稀释至0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL和32μg/mL。

（2）包被：酶标板每孔分别加100μL步骤（1）的稀释液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，风干。

（3）封闭：加封闭液200μL /孔，4℃过夜，洗涤5遍，风干，密封4℃保存备用。

（4）抗体稀释：将实施例2纯化的4F5抗体按1:1000倍稀释（浓度）。

（6）取包被好的酶标板，加入依次稀释抗体100μL/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，风干。

（7）加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1:2000稀释)100μL /孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，风干。

（8）加底物显色液100μL /孔，室温避光反应5-10分钟。

（9）加终止液2M/L H₂SO₄50μL/孔，立即在酶标仪上以490nm波长测定OD值。

结果如图3所示，随着浓度的增加，4F5抗体与表位多肽的结合反应增加，而与对照多肽和BSA的反应没有变化，说明，表位多肽与4F5抗体有特异性反应。

实施例6 抗体拮抗试验

（1）用包被液将DV2抗原（登革病毒2型，Tr1751株）稀释到100 μg/mL。

（2）包被：酶标板加100μL/孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，拍干。

（3）封闭：加封闭液200μL /孔，4℃过夜，洗涤5遍，拍干，密封4℃保存备用。

（4）抗体稀释：将实施例2纯化的4F5抗体按1:1000倍稀释。稀释后的抗体与不同浓度的表位多肽和对照多肽混合，抗原肽和对照多肽浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL和15μg/mL。

（5）取包被好的酶标板，依次加入步骤（4）制备的抗原抗体混合物，每孔加入100μL，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，拍干。

（7）加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶2000稀释)100μL /孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，拍干。

（8）加底物显色液100μL /孔，室温避光反应5-10分钟。

结果如图4所示，随着表位肽浓度的增加，显色反应逐步降低，而对照多肽的反应没有变化，进一步说明合成的抗原多肽是该抗体的抗原表位。

实施例7 表位多肽与BSA的偶联及免疫小鼠

1、由于单个表位多肽分子量较小，属于半抗原，免疫原性较差，所以欲将其与载体蛋白BSA偶联，从而增强其免疫原性，可以引发特异性抗原抗体反应。本实验采用戊二醛将合成肽表位通过化学偶联法偶联到牛血清白蛋白(BSA)上形成交联体（简称为表位多肽的衍生物），即抗原，具体由上海生工生物工程公司完成。

2、动物免疫

2.1 分组：分为三组，如表1所示：

表1.动物分组

2.2 免疫动物：雌性Balb/c小鼠，8周龄。

2.3免疫程序

首次采用抗原加完全福氏佐剂（CFA）免疫，然后于第2、4周采用相同抗原加不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫，于免疫3次后第七天取小鼠的血液上清检测特异性抗体效价的改变。

3、酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测抗体的产生：

采用DV2抗原(登革病毒2型，Tr1751株)包被ELISA板检测表位疫苗免疫的血清中的抗体。步骤如下：

1) 用包被液将表1中的抗原分别稀释到100μg/mL。

2) 包被：酶标板加100μL/孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，拍干。

3) 封闭：加封闭液200μL /孔，4℃过夜，洗涤5遍，拍干，密封4℃保存备用。

4) 采血及稀释：小鼠眼眶取血，离心取上清用抗体稀释液按1:100，1:400，1:800，1:1600， 1:3200，1:6400，1:12800，1:25600梯度进行被比稀释。

5) 取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μL /孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，拍干。

6) 加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶2000稀释)100μL/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，拍干。

7) 然后加入底物显色液100μL /孔，室温避光反应5-10分钟。

8) 加终止液50μL/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值。

结果如图5所示，表位多肽与BSA偶联免疫组的血清能够与DV2抗原（登革病毒2型，Tr1751株）反应，而对照组基本不与DV2（登革病毒2型，Tr1751株）反应（结果判断：OD值大于或等于阴性对照（小鼠免疫前血清1∶100倍稀释）的2.1倍时视为抗体阳性）。说明本发明构建的嵌合表位疫苗诱导小鼠产生特异性抗体，因此抗原多肽的衍生物能够用于防治登革病毒2型感染的疫苗。

本实施例中，载体蛋白可以用免疫学领域常用的载体蛋白替代，如血蓝蛋白（KLH）、鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等均可实现发明目的。

实施例8 表位肽抗血清与DV2的免疫荧光分析

（1）将盖玻片（8×8 mm²）置于6孔板中。

（2）将Vero细胞制成细胞悬液，以2×10⁵/孔，接种于6孔培养板中，在温度为37 ℃，5％CO₂ 孵育18-24 h。感染前吸出培养上清，用无血清MEM培养液润洗一次，再加入登革病毒2型病毒液1mL/孔，37 ℃吸附1h。最后弃去病毒液，加入MEM培养液（含2％小牛血清）2mL/孔，置于37 ℃，5％CO₂孵箱中培养。

（3）感染后36 h，取出盖玻片，用4％多聚甲醛（pH7.2-7.6）固定20 min(室温)。润洗后，加0.2％Triton X-100/PBS，室温条件下孵育5 min。润洗后，加1％BSA/PBS，对细胞膜上的非特异性结合位点进行封闭30min（室温）。

（4）弃去封闭液，以抗表位多肽血清为一抗，以小鼠抗DV2（登革病毒2型，Tr1751株）血清（1:100）为阳性对照和正常小鼠血清为阴性对照。4℃孵育过夜。洗涤3次后，加羊抗小鼠IgG-FITC（1:400），室温1h。洗涤3次、自然干燥后甘油封片，荧光显微镜观察。

结果如图6所示：阳性对照和表位多肽抗血清组细胞内均有特异性的荧光，而对照组没有特异性的荧光，说明该抗原表位能产生针对DV2的NS3蛋白的抗体。因此可以将表位多肽免疫小鼠后制备成抗表位多肽血清，用于诊断登革病毒2型感染的诊断试剂。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。

<110> 中国人民解放军第三军医大学

<120> 登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B细胞表位肽

<400> 1

Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照肽

<400> 2

Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu

1 5 9

Claims

1.登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，其特征在于：所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含权利要求1所述表位多肽的衍生物，其特征在于：所述衍生物为所述表位多肽与载体蛋白偶联形成的交联体。

3.根据权利要求2所述表位多肽的衍生物，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

4.权利要求2所述的衍生物在制备预防或治疗登革病毒2型感染的疫苗中的应用。

5.权利要求2所述的衍生物在制备诊断或检测登革病毒2型感染的试剂中的应用。