KR19990018301A - 한국에서 분리된 일본뇌염 바이러스의 염기서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내에서 분리된 일본뇌염 바이러스 5주의 PrM과 E유전자 염기서열과 재조합 백신 제조에 유용한 K94P05주의 전체게놈 염기서열 및 아미노산서열을 제공한다.
국내에서 분리된 일본뇌염 바이러스 분리주는 K96P10, K94P05, K91P55, K87P39 및 K82P01이며 영국 NCBI Genbank data library에 기탁되었다. K94P05바이러스주는 7개의 특이한 아미노산 변이부위가 있음이 확인되었다.

Description

한국에서 분리된 일본뇌염 바이러스의 염기서열
본 발명은 국내에서 분리된 일본뇌염 바이러스의 염기서열에 관한 것이다. 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus; JEV)는 Flaviviridae에 속하는 positive RNA바이러스로서 모기에 의하여 매개되며 아시아 지역에서는 매년 35,000명 정도의 일본 뇌염 환자가 발생된다. 국내에서는 1946년이래 매년 발병되고 있으나 1983년 이후 Nakayama-NIH주로 제조된 사백신을 사용하면서 환자 발생율이 급격히 감소하여 왔다. 그러나, 이 불활화 백신의 제조주인 Nakayama-NIH주로 제조된 백신이 모든 일본뇌염 바이러스주들에 대하여 효과가 있는지 의구심이 있다. 더욱이 현재 사용중인 상기 백신은 사백신으로서 마우스 뇌내 유래라는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명은 국내에서 분리된 일본 뇌염 바이러스 5주, 즉 K96P10, K94P05, K91P55, K87P39 및 K82P01에 대한 유전학적 및 혈청학적 특징을 Nakayama-NIH주 또는 기타 아시아지역에서 분리된 일본 뇌염 바이러스주와 비교분석하여 이를 근거로 우리나라사람에게 적합한 백신 바이러스주를 선정하고 이를 이용하여 재조합백신을 제조하는데 그 목적이 있다. 본 발명의 다른 목적은 항원발현과 동물면역에 따른 항체생성과 방어효과의 확인 실험에 상기 재조합백신을 이용하게 하는데 있다.
도 1은 한국에서 뇌염 바이러스(JEV)분리주의 전기영동사진.
도 2는 한국에서 분리된 일본뇌염 바리어스(JEV)분리주 K94PO5의 전체게놈의 전기영동사진.
본 발명은 Cross-hemagglutination inhibition실험을 통하여 한국에서 분리된 균주와 여타균주의 혈정학적 차이를 확인하는 공정; 한국에서 분리된 균주들간의 Envelope gene의 염기서열을 확인하는 공정으로 구성되어 있다.
본 발명자들은 5가지의 다클론항체를 사용하여 수행한 Cross-hem agglutination inhibition test 결과 국내 분리주와 Nakayama-NIH주 JaGa0l주 Beijing-I주 간의 HI titer차이는 크지 않았으나 국내분리주인 K94P05에 의하여 기니픽에서 만들어진 다클론항체는 Nakayama-NIH주에 의하여 생산된 다클론항체보다 한국분리주에 대하여 더 높은 중화능이 있음을 확인하였다. 이와같은 사실은 한국 분리주가 현재 국내에서 일본 뇌염백신제조에 사용중인 Nakayama-NIH주와 혈청적으로 차이가 있음을 시시한다.
본 발명자들이 조사한바 Nakayama-NIH주와 국내 분리주 K94P05주의 E단백질의 neucleotide서열 평균 유사도는 92.8%였으며 아미노산서열 평균유사도는 98.0%였음을 확인하였다. 또 1980년대 국내의 분리주의 nucleotide유사도는 92.8%였고 1990년때 분리주의 그것은 99.3%였으며 또 E유전자 염기서열을 기초로한 phylogenetic tree는 최소한 두 개의 sub-lineages로 분류되었는바 이같은 사실로 미루어 보아 국내의 일본 뇌염 바이러스는 최소한 2종류의 유전적 type가 있음을 시사하고 있다. 따라서 현재 국내에서 백신제조에 사용하고 있는 Nakayama-NIH유래 불활화 백신의 중화 epitope를 피할 수 있는 새로운 종류의 일본뇌염 virus돌연변이주가 발생될 수 있으므로 우리나라에 적합한 신종 백신주를 선정할 필요가 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명한다.
JE virus준비
일본뇌염 바이러스(JE virus)는 각각 1982, 1987, 1991, 1994 및 1996년도에 국내에서 분리된 것을 사용하였다. 이들 바이러스는 전남 완도에서 채집된 일본 뇌염 바이러스를 매개하는 모기(Culex tritaeniorhynchus)에서 분리하였다. 생후 2-3일된 영아 마우스의 뇌내에 0.02㎖씩 접종하고 3-4일후에 뇌염감염증상이 나타난 뇌를 무균적으로 채취하여 0.01M의 인산완층 식염수(PBS, pH7.4)를 10%(W/V)되도록 하였다. 뇌조직을 homogenizing하여 4℃에서 12,000rpm 30분간 원심분리하여 뇌조직을 제거한 후 상층액을 영아 마우스 뇌접종에서 증식시켜 사용하였다. 본 발명에서 사용한 바이러스주는 표 1과 같다.
국내에서 분리된 JE virus주
Strain 년도 장소 Source(기탁번호)
K96P10K94P05K91P55K87P39k82P01 19961994199119871982 전남 완도 C.tritaeniorhynchusC.tritaeniorhynchus(U34929)C.tritaeniorhynchus(U34928)C.tritaeniorhynchus(U34927)C.tritaeniorhynchus(U34926)
국내 분리주에 대한 다클론항체의 제조
국내 분리주 K82P01, K87P39, K91P55, K94P05에 대한 다클론항체(polyclonal antibody)를 제조하기 위하여 기니픽(G.P)를 사용하였다.
각 분리주를 초회면역시에는 Complete adjuant와 1:1로 혼합하여 0.5㎖씩 각각 5마리의 G.P에 복강내로 면역하고 10일후 2차 면역시 Incomplete adjuant를 역시 동일 분량 혼합하여 면역하였다. 10일후 바이러스만을 G.P에 면역하고 10일후 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 20℃에 저장하고 분석재료로 사용하였다. 제조된 다클론항체를 사용하여 Cross-HI test를 실시한 결과는 표 2와 같다. 또 제조된 다클론항체중 Nakayama-NIH와 K94P05로 만든 다클론항체를 이용한 cross-neutralization결과는 표 3과 같다. 실험결과, 한국분리주가 현재 국내에서 일본 뇌염 백신제조에 사용중인 Nakayama-NIH주와 혈청적으로 차이가 있어 국내분리주인 K94P05에 의해 기니픽에서 만들어 진 다클론항체가 한국분리주에 대하여 중화능이 더 높은 것으로 나타났다.
Cross-Ham agglutination Inhibition test결과
VirusAntibody Nakayama Jagor Beijing K82P01 K87P39 K94P05 K95P20 K96P10
K82P01K87P39K91P05K94P05Nakayama 160160160160160 160160320160160 640320320320320 320320320160160 160160320320160 160320320320160 160160320160160 160160320160160
anti-K94P05와 anti Nakayama-NIH 다클론항체를 이용한 교차 중화능.
주: Serum dilution yielding 80% reduction in plaque number.
JE Virus의 RNA분리
일본뇌염 바이러스의 RNA를 분리하기 위하여 다음 세가지 방법을 사용하였다.
첫째는 SDS-Proteinase K-phenol방법이고, 두번째는 RNA Tack TM resin kit(Biotecxi USA)를 사용하는 방법이며, 셋번째는 Guanidine Thiocyanate kit(Promega)방법이었다.
각각 제조회사의 추천된 방법으로 분리하였고 분리된 RNA는 -70℃에서 보관하고 실험에 제공되었다.
cDNA제조 및 RT-PCR
분리된 RNA를 포함한 용액 8㎖ RT buffer(5x)4㎕, 2.5mM dNTP 4㎖, Ramdom Heaxamer(50 A260 Units, Boehringer spelling)2㎕, DTT(0.1M)2㎕를 혼합하여 70℃에서 5분간 반응시킨후 얼음에 급속히 넣었다. 이 반응물에 Reverse Transcriptase(SuperScript TM Ⅱ, 200units)1㎖를 첨가한 후 42℃에서 30분간 반응후 95℃에서 5분간 불활성화시켜 -20℃에 저장하여 실험에 사용하였다.
제조된 cDNA 2㎕, mixed dNTP(2.5mM)16㎕, 20mM Sense and amtisense primer 5㎕, 10x pCR 완충용액 10㎕, Tag polymerase 2.5units(Boehringer Mannheim)에 pfu enzyme 0.25units을 첨가하고 전체 반응액이 100㎕되도록 증류수로 적정하였다.
이 PCR 반응용액을 Perkin-Elmer-Cetus thermal cycler(Model 9600)로 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 3분, 30 Cycles로 증폭한 다음 마지막 Cycle에서 충분한 polymerization time을 주기 위하여 72℃에서 10분간 1 Cycle을 반응하였다. 증폭이 끝난 PCR products는 etidum bromide를 포함한 1% agarose gel에서 running하여 확인하였다.
K94P05는 전체 Coding 염기서열을 증폭하고 (도2)나머지 바이러스주는 PrM에서 envelope gene만을 증폭하였다(도 1). 사용된 primer는 표 4와 같다.
TA 클로닝
증폭후 PCR산물을 TA클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 Cloning하였으며 2개 이상의 독립된 Colony를 배양하여 염기서열 분석에 제공하였다.
DNA서열분석
클로닝된 일본뇌염 Virus의 유전자를 분석하기 위하여 ABI PRISM 377 DNA Sequencer를 사용하였다. Dye-terminator labeling방식으로 반응하기 위하여 클로닝된 plasmid lμg, oligo 3.2 pmol 1㎕, 반응혼합물(perkin Elmer)9.5㎕를 증류수로 20㎕로 적정하여 90℃에서 20초간 1 Cycle, 96℃에서 10초, 55℃에서 30초, 60℃에서 4분간 25 Cycle을 반응하였다. 반응중 Centri-Sep컬럼을 미리 reconstitute시킨후 이를 이용하여 반응된 산물을 정제하고 염기서열을 분석하였다.
국내에서 분리된 JEV의 PrM과 E유전자의 전체 핵산 서열분석은 표 5와 같다. 상기 바이러스주의 E유전자의 염기서열을 NCBI Genbank data library에 등록하였으며 기탁번호는 K82P01, K87P39, K91P55, K94P05에 대하여 각각 U34926, U34927, U34928 및 U34929로 기탁되었다.
주: Nucleotide위치를 PrM과 E단백질의 Coding region에 따라 번호를 부여하고 점들은 동일한 nucleotide를 가르킨다.
Nucleotide 염기서열 상동성 분석
염기서열이 결정된 data를 DNASIS와 PROSIS를 사용하여 비교분석한 결과는 표 6과 같다. 각 분리주의 nucleotide 상동성보다는 아미노산의 상동성이 높으며 이는 유전자의 변이 위치가 woble position에 주로 발생했기 때문이다.
또, 국내분리주는 Nakayama주와 nucleotide에서 87.4%- 95.6%까지 상동성이 있으며 아미노산서열은 98.2%-97.2%까지 상동성을 보였다.
K94P05 strain의 전체게놈 아미노산 서열분석
cloning된 JEV K94P05의 게놈을 분석하기 위하여 ABI PRISM 377 DNA Sequencer를 사용하였다. Dye-terminator labeling 방식으로 반응하기 위하여 Cloning 된 plasmid 1㎖, oligo 3.2pmol 1㎖, reaction mixture(perkin Elmer)9.5㎖를 증류수로 20㎖로 적정하여 90℃에서 20초간 1cycle, 96℃에서 10초, 55℃에서 30초, 60℃에서 4분간 25cycle을 반응하였다. 반응중 Centri-Sep컬럼을 미리 reconstitute시킨후 이를 이용하여 반응된 산물을 정제하고 아미노산서열을 분석하였다. 분석된 JEV K94P05주의 전체게놈 아미노산 서열은 표 7과 같다.
E유전자 단백질 아미노산 서열에 의하면 국내 분리주 K94P05주는 특이한 아미노산 변이부위가 존재함을 알수 있는바, E89, E129, E221, E2441, E366, E459, E477이 존재함이 확인되었다.
JEV E단백질의 1486개의 nucleotide와 496개의 아미노산서열의 상동성
주: values above dashes(identity trace)are % identical amino acids and those below dashes % identical nucleotides.
JEV K94P05의 전체게놈의 아미노산 서열
주 : Amino acid residues are numbered from the first methionine of polyprotein. One-letter amino acid notation is used. N-terminal of the three strucural proteins and putative N-termainal of nonstructural proteins are indicated by arrows. Stars indicated identical amino acid in compared with JEV strains. 11 shadded bars represented that unique amino acid regions were found in K94P05.
이상 설명한 바와같이 본 발명은 국내에서 분리된 일본뇌염 바이러스 5주를 사용하여 현재 국내 일본뇌염 바이러스 불활화 사백신의 제조에 사용되는 Nakayama주와 염기서열 PrM/M 및 E유전자 시퀸스를 비교 분석한 결과 국내분리주는 Nakayama주와 다른 Subgroup에 속할 뿐 아니라 최소한 2종 이상의 유전적 차이가 있는 분리주가 존재하고 있음을 확인하는 효과가 있다.
따라서 본 발명은 현재 사용중인 불활화 사백신 제조주인 Nakayama-NIH주를 대신할 새로운 변이주를 선정하여야할 필요성을 제공하는 효과가 있어 혈청 의학 및 면역학상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 국내에서 분리한 일본 뇌염 바이러스(JEV)5개주 K96P10, K94P05, K91P55, K87P39, K82P01의 PrM과 E유전자의 염기서열.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 K94P05주의 전체 게놈 RNA의 아미노산서열.
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