JPWO2019013258A1 - 光制御性のウイルスタンパク質、その遺伝子、及びその遺伝子を含むウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
ウイルスベクターの活性の制御を可能とするウイルスベクターの開発を目的とする。ウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、RNAウイルス由来のウイルスタンパク質遺伝子を提供することによる。このウイルスベクターにより、ウイルスタンパク質の酵素活性並びにそれに基づくウイルスベクターの活性を、光の照射により制御できる。
Description
本発明は、ウイルスタンパク質の酵素活性を光の照射で制御する技術に関する。
バイオテクノロジーの進歩により、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入技術が確立されてきており、ＡＤＡ欠損症などの重篤な遺伝病、癌、エイズをはじめとした様々な疾患に対する遺伝子治療の研究が行われている。遺伝子導入技術としては、非ウイルス的な導入法と、ウイルスを用いた導入法に大別される。しかし、非ウイルス的な形質導入技術は、一般に導入効率が低い傾向があり、導入された遺伝子の発現効率も低い。遺伝子治療においては、ウイルスを用いた遺伝子導入技術が使用され、多くのウイルスベクターが開発されている。
ウイルスベクターは、ウイルスが本来持っている感染性を利用して、外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子をプロモーター制御下に配置することで、感染細胞において外来遺伝子の発現を達成することができる。このようなウイルスベクターとして用いるウイルスとして、様々なウイルスが利用可能であり、例えばゲノムへの組み込みを目的としてレトロウイルスや、一過的な遺伝子発現を目的として、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスが汎用されている。
しかしながら、これまでのウイルスベクターを用いた場合、感染後にウイルスベクターの活性を制御する手法は開発されていなかった。ゲノムへの組み込みを目的としたレトロウイルスを用いた場合には、ゲノムへの組み込みが完了した後もウイルスが残存し、副作用を引き起こすことがあった。また、一過的な遺伝子発現を目的としてアデノウイルスやアデノ随伴ウイルスを用いた場合であっても、体内の様々な組織においてウイルスが残存すること、また既にヒトに感染して潜伏しているウイルスとの間で、ベクターレスキューが生じる危険性も指摘されている。
J. General virology (1990), 71, 1153-1162; J. General virology (1997), 78, 571-576
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Nature Chemical Biology, DOI10.1038/nchembio.2205
Nature Biotechnology (2015) vol. 33, 755-760, doi:10.1038/nbt.3245
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Journal of Virology（2014）vol. 88:11187-11198
Science, (2012) vol. 338, 810-814
本発明は、ウイルスベクターの活性の制御を可能とするウイルスベクターの開発を目的とする。
本発明者らは、複数の機能ドメインを含むウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子を挿入することで、ウイルスタンパク質の酵素活性を光の照射により制御できることを見出し、本発明に至った。
そこで本発明は、下記の発明に関する：
[１] 酵素活性を有するウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、ウイルスタンパク質遺伝子であって、前記光スイッチタンパク質が、少なくとも２のサブユニットを含み、各サブユニットをコードする遺伝子がリンカーをコードする遺伝子で連結されているか、又はリンカーを介さず直接連結されている、前記ウイルスタンパク質遺伝子。
[２] 前記リンカーが、１０〜１００アミノ酸残基である、項目１に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[３] 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が、Ｍａｇｎｅｔ遺伝子である、項目１又は２に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[４] 前記ウイルスタンパク質の活性を、４５０〜４９０ｎｍの波長の光を照射することにより調節できる、項目３に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[５] 酵素活性を有するウイルスタンパク質が、ポリメラーゼもしくはプロテアーゼドメインを有するウイルスタンパク質である、項目１〜４のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[６] 前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、項目１〜５のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[７] 前記ウイルスタンパク質が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、項目１〜６のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[８] 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬタンパク質である、項目７に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[９] 前記外来遺伝子導入可能領域が、ＬｎドメインとＬｃドメインの間の領域である、項目７又は８に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[１０] 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子の上流及び/又は下流にさらにリンカーを含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[１１] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸。
[１２] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸を含むベクター。
[１３] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子を含むウイルス又はウイルスベクター。
[１４] 項目１１に記載の核酸、項目１１に記載のベクター、又は項目１２に記載のウイルス若しくはウイルスベクターを含む、キット。
[１５] 項目１１に記載の核酸を含む細胞。
[１６] 前記細胞が、ｉＰＳ細胞又はその子孫細胞である、項目１５に記載の細胞。
[１７] 細胞を一過的にウイルスベクターで感染させる方法であって、
導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、
感染した細胞を光照射下で培養する工程、及び
感染した細胞を光不照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[１８] 導入遺伝子を発現させる方法であって、
導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[１９] ｉＰＳ細胞の製造方法であって、
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、l−Ｍｙｃ（またはｃ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる群から選ばれる少なくとも１の導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを体細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[２０] 感染した細胞を光不照射下で培養する工程をさらに含む、項目１８又は１９に記載の方法。
[１] 酵素活性を有するウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、ウイルスタンパク質遺伝子であって、前記光スイッチタンパク質が、少なくとも２のサブユニットを含み、各サブユニットをコードする遺伝子がリンカーをコードする遺伝子で連結されているか、又はリンカーを介さず直接連結されている、前記ウイルスタンパク質遺伝子。
[２] 前記リンカーが、１０〜１００アミノ酸残基である、項目１に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[３] 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が、Ｍａｇｎｅｔ遺伝子である、項目１又は２に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[４] 前記ウイルスタンパク質の活性を、４５０〜４９０ｎｍの波長の光を照射することにより調節できる、項目３に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[５] 酵素活性を有するウイルスタンパク質が、ポリメラーゼもしくはプロテアーゼドメインを有するウイルスタンパク質である、項目１〜４のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[６] 前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、項目１〜５のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[７] 前記ウイルスタンパク質が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、項目１〜６のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[８] 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬタンパク質である、項目７に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[９] 前記外来遺伝子導入可能領域が、ＬｎドメインとＬｃドメインの間の領域である、項目７又は８に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[１０] 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子の上流及び/又は下流にさらにリンカーを含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
[１１] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸。
[１２] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸を含むベクター。
[１３] 項目１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子を含むウイルス又はウイルスベクター。
[１４] 項目１１に記載の核酸、項目１１に記載のベクター、又は項目１２に記載のウイルス若しくはウイルスベクターを含む、キット。
[１５] 項目１１に記載の核酸を含む細胞。
[１６] 前記細胞が、ｉＰＳ細胞又はその子孫細胞である、項目１５に記載の細胞。
[１７] 細胞を一過的にウイルスベクターで感染させる方法であって、
導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、
感染した細胞を光照射下で培養する工程、及び
感染した細胞を光不照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[１８] 導入遺伝子を発現させる方法であって、
導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[１９] ｉＰＳ細胞の製造方法であって、
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、l−Ｍｙｃ（またはｃ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる群から選ばれる少なくとも１の導入遺伝子を含む項目１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを体細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。
[２０] 感染した細胞を光不照射下で培養する工程をさらに含む、項目１８又は１９に記載の方法。
本発明の光制御性のウイルスタンパク質は、光の照射の有無によりその酵素活性を制御することができる。ウイルスタンパク質の酵素活性は、そのウイルスの増殖や感染などの活性に寄与することから、このような光制御性のウイルスタンパク質遺伝子を有するウイルスベクター又はウイルスの活性を、光の照射の有無により制御することが可能になる。
本発明は、複数の機能ドメインを含むウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、ウイルスタンパク質遺伝子に関する。ここで、光スイッチタンパク質が、少なくとも２のサブユニットを含み、各サブユニットをコードする遺伝子がリンカーで連結されることを特徴とする。
さらに別に態様では、本発明は、複数の機能ドメインを含むウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、ウイルスタンパク質遺伝子に関する。ここで、光スイッチタンパク質が、少なくとも２のサブユニットを含み、各サブユニットをコードする遺伝子がリンカーを介さずに直接連結されることを特徴とする。
各サブユニットは、所望の活性を発揮できる範囲で、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び付加が付されてもよい。特に、リンカーを介して又は介さずに連結される部位においては、サブユニット中においてアミノ酸の欠失がされてもよい。
ウイルスは、ゲノムの種類によりＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスに大別される。さらに、ゲノムが１本鎖から構成されるか、２本鎖から構成されるかにより区別され、１本鎖の場合には、さらに＋鎖か-鎖によっても細分される。本発明においてウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方を指すが、好ましくはＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは、国際ウイルス分類委員会により、第３群〜第６群に分類され、本発明において、ウイルスは第３群〜第６群の任意の群に属するＲＮＡウイルスに関してもよい。特に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ作用を有するＬタンパク質に光スイッチタンパク質を導入する観点から、本発明のウイルスは、一本鎖ＲＮＡマイナス鎖（第５群）に属するウイルスに関することが好ましい。また、ｐ１５０に光スイッチタンパク質を導入する観点から、本発明のウイルスは一本鎖ＲＮＡ＋鎖（第４群）に属するウイルスに関してもよい。
国際ウイルス分類第５群に属する一本鎖ＲＮＡマイナス鎖のゲノムを有するウイルスとしては、モノネガウイルス目のパラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、及び目未帰属のオルソミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科のウイルスが挙げられる。これらのウイルスは、ゲノムの複製にＲＮＡ依存性ＲＮＡタンパク質を必要とし、Ｌタンパク質又はそのファミリーを有する。したがって、これらのウイルスのＬタンパク質又はそのファミリータンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質を導入可能である。特に、ラブドウイルス科に属する水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）、狂犬病ウイルス（Rabies virus）、並びにパラミクソウイルス科に属する麻疹ウイルス（Measles virus）、センダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、イヌジステンパーウイルス（Canine distemper virus)、アザラシジステンパーウイルス（Phocine distemper virus)、牛疫ウイルス（Rinderpest virus)のＬタンパク質はそれぞれ非常に相同性が高いことが知られている（非特許文献１：J. General virology (1990), 71, 1153-1162; J. General virology (1997), 78, 571-576)。
国際ウイルス分類第４群に属する一本鎖ＲＮＡプラス鎖のゲノムを有するウイルスとして、ニドウイルス目のコロナウイルス科、アルテリウイルス科、ピコルナウイルス目のピコルナウイルス科、目未帰属のトガウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、へペウイルス科のウイルスが挙げられる。これらのウイルスのうち、ｐ１５０タンパク質とｐ９０タンパク質を有するトガウイルス科、ルビウイルス属、又は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４を有するトガウイルス科、アルファウイルス属に属するウイルスが好ましく、特に好ましくはルビウイルス属の風疹ウイルスである。また、一本鎖ＲＮＡプラス鎖を有し、かつ逆転写酵素を有することを特徴とする国際ウイルス分類第６群として、目未帰属のレトロウイルス科のウイルスが挙げられる。
ＤＮＡウイルスは、最大で３０万塩基のゲノムサイズを有するウイルスが見出されている。一方で、ＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスよりも比較的小さいサイズのゲノムを有しており、平均で１万塩基、多くとも３万塩基ほどのゲノムサイズを有する。したがって、ＲＮＡウイルスは、自己のウイルスゲノム上にコードされるウイルスタンパク質の数も、比較的少ない。例えば、モノネガウイルス目パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に分類される麻疹ウイルスでは、約１６ｋ塩基のマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有しており、３’端から、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、Ｌと名付けられた６つの遺伝子から構成される。また、トガウイルス科ルビウイルス属に分類される風疹ウイルスでは、約１２ｋ塩基の＋鎖の一本鎖ＲＮＡであり、３’端から、ｐ１５０、ｐ９０、キャプシド、Ｅ２、Ｅ１と名付けられた遺伝子が存在する。
ウイルスタンパク質は、主にウイルス粒子の構成成分となる構造タンパク質と、感染細胞内に発現してウイルスのＲＮＡ合成や抗免疫作用に働くがウイルス粒子中には取り込まれない非構造タンパク質に大別される。本発明における「酵素活性を有するウイルスタンパク質」は、構造タンパク質であってもよいし、非構造タンパク質であってもよい。酵素活性を有するウイルスタンパク質としては、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、キャップメチルトランスフェラーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ノイラメニダーゼなどが挙げられる。酵素活性を有するタンパク質は、通常そのウイルスの感染及び増殖に必須のタンパク質であり、その機能が阻害されると、ウイルスの活性が低下し、場合により不活性化する。酵素活性を有するタンパク質は、１又は複数の機能ドメインを有するものが多い。機能ドメインとしては、ポリメラーゼドメインやプロテアーゼドメインなどの酵素活性に直接影響するドメインや、酵素活性ドメインに補助的に働くドメインが挙げられる。そのようなドメイン間にはヒンジドメインや機能未知（又は機能を発揮しない）ドメインを有することがあり、そのようなドメイン間に外来遺伝子を導入しうる。外来遺伝子を導入してもなお、酵素活性を有するタンパク質の活性を維持できる領域を外来遺伝子導入可能領域という。
外来遺伝子導入可能領域を有する酵素活性を有するタンパク質として、例えば麻疹ウイルスのＬタンパク質や、風疹ウイルスのｐ１５０（非特許文献２：Virology 406 (2010) p. 212-227）、シンドビスウイルスの非構造タンパク質Ｐ３が挙げられる（非特許文献３：J. Virology (2006), vol. 80, No.8, p.4122-4134）が、これらのものに限定されることを意図するものではない。当業者であれば、外来遺伝子導入可能領域を有するウイルスタンパク質遺伝子を任意に選択できる。外来遺伝子導入可能領域に導入可能な遺伝子のサイズは、外来遺伝子導入可能領域を含むウイルスタンパク質の種類に応じて様々である。一般に、外来遺伝子導入可能領域であっても、導入できる遺伝子は、その大きさや翻訳後の立体構造に応じて変化する。導入可能な遺伝子のサイズの上限は、ウイルスタンパク質の活性が維持される範囲で任意に選択することができ、例えば１０００アミノ酸残基以下、好ましくは５００アミノ酸残基以下、より好ましくは４００アミノ酸残基以下である。導入可能な遺伝子のサイズの下限は特に限定される必要はない。
Ｌタンパク質は、モノネガウイルス目に属するウイルスが共通して有するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。モノネガウイルス目には、５つのファミリーが含まれるが、異なるファミリーに属するモノネガウイルスであっても、Ｌタンパク質の構造には多くの共通点が存在しており、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメイン、キャッピングドメイン、コネクタードメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、Ｃ末ドメインを有している。モノネガウイルス目のＬタンパク内でアミノ酸配列の相同性の非常に高い領域をドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩと呼ぶ。モルビリウイルスのＬタンパク同士は、さらにアミノ酸配列の相同性が高く、相同性の高い領域は、Ｄ１〜Ｄ３のドメインと呼ばれている。これらのドメインは、可変ヒンジドメイン（Ｈ１及びＨ２）により連結されている。ここで、Ｈ２ドメインは、外来遺伝子導入可能領域となる。したがって、Ｌタンパク質は、Ｄ１、Ｈ１及びＤ２を含むＮ末端ドメイン（Ｌｎ）と、Ｄ３ドメインを含むＣ末端ドメイン（Ｌｃ）に分けられ、ＬｎとＬｃとの間には、外来遺伝子を導入できる。より具体的に、麻疹ウイルスのＬタンパク質の場合には開始コドンから１７０７残基までをＬｎドメインとし、１７０８残基から２１８１残基までのＬｃドメインとすることができる。この外来遺伝子導入可能領域には、２５０残基程度の外来ポリペプチドをＬタンパク質の活性に影響を与えずに導入できることが知られている（非特許文献４: J. Virology (2002) vol.76, No.14, 7322-7328, 非特許文献５:J. Virology (2007) vol. 81, No. 24, 13649-13658）が、Ｌタンパク質の活性を消失させない限りにおいて、任意の大きさのポリペプチドが導入されうる。理論に限定されることを意図するものではないが、ＬｎドメインとＬｃドメインとが近位に存在することができれば、Ｌタンパクの活性が発揮されることから、８００残基以上のポリペプチドであっても導入しうるが、上限としては８００残基以下が好ましく、より好ましくは６００残基以下であり、さらに好ましくは４００残基以下であり、さらにより好ましくは３００残基以下である。
ｐ１５０タンパク質は、アミノ末端にメチルトランスフェラーゼドメイン、マクロドメイン（Ｘドメイン）、及びプロテアーゼドメインから構成されている。Ｘドメインの上流には、プロリンヒンジ（ＰＨ）ドメイン及び機能未知のＹドメインが存在する。ＰＨドメインを含めたＱドメインは、外来遺伝子導入可能領域を有し、２５０残基程度の外来ポリペプチドをｐ１５０タンパク質の活性に影響を与えずに導入できることが知られている（非特許文献６、Vaccine 28 (2010）, p.1181-1187, 非特許文献７ J Virology, 2009, vol. 83, p.3549-3555)。Ｐ１５０の活性が発揮できる範囲で、８００残基以上のポリペプチドであっても導入しうるが、上限としては８００残基以下が好ましく、より好ましくは６００残基以下であり、さらに好ましくは４００残基以下であり、さらにより好ましくは３００残基以下である。
光スイッチタンパク質とは、光感受性タンパク質のうち、特定波長を有する光の照射により、自身もしくは他のタンパク質の活性をコントロールできるタンパク質をいう。光感受性タンパク質としては、ロドプシンや、光受容タンパク質ＣＲＹ２をはじめ様々なタンパク質が知られているが、その中で特に２つ以上のサブユニットに分かれており、光照射によりサブユニット間の会合と解離を制御することができるタンパク質が好ましい。２つ以上のサブユニットにより構成される光スイッチタンパク質遺伝子としては、例えばＭａｇｎｅｔ遺伝子（ｐＭａｇ（配列番号１）−ｎＭａｇＨｉｇｈ（配列番号２）、Ｄｒｏｎｐａ遺伝子（ＤＰＫ（配列番号３）−ＤＰＮ（配列番号４））（非特許文献１６：X.X. Zhou, K. Chung, A.J. Lam and M.Z. Lin, Science, 338, 810-814 (2012)）、Ｃｒｙ２（配列番号５）−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号６）系、並びにこれらの改変遺伝子を使用することができるが、これらのものに限定されることを意図するものではない。Ｌ遺伝子に組み込む観点からは、Ｍａｇｎｅｔ遺伝子（ｐＭａｇ−ｎＭａｇ）が好ましい。
照射する光の波長は、使用する光スイッチタンパク質の種類に応じて適宜選択することができる。Ｍａｇｎｅｔ遺伝子（ｐＭａｇ−ｎＭａｇ）を用いる場合には、４５０〜４９０ｎｍ、Ｄｒｏｎｐａ遺伝子（ＤＰＫ−ＤＰＮ）を用いる場合には、３９０〜５００ｎｍ、Ｃｒｙ２−ＣＩＢ１Ｎ遺伝子を用いる場合に４５０〜４９０ｎｍの波長を用いることができる。生体内での光スイッチタンパク質のオン−オフを制御する観点からは、生体内での透過性の高い波長が好ましく、例えば４５０〜９００ｎｍの波長が好ましく、更に好ましくは６５０〜９００ｎｍである。光スイッチタンパク質は、感受性の波長領域を変更するために任意に改変することができる。したがって、当業者であれば、本発明の使用態様に応じて好ましい吸収波長となるように、公知の光スイッチタンパク質を改変することができる。
２つ以上のサブユニットにより構成される光スイッチタンパク質は、通常、独立して遊離しているサブユニットが、特定波長の光の照射の元で会合する性質を有する。この性質を利用し、光スイッチタンパク質をＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることで、ＤＮＡ組換え反応を光でコントロールできるシステムが考案されている（非特許文献８：Nature Chemical Biology, DOI10.1038/nchembio.2205）。具体的に、ＤＮＡ組換え酵素であるＣｒｅを二分割し、Ｎ末端側（ＣｒｅＮ）とＣ末端側（ＣｒｅＣ）とにそれぞれ光スイッチタンパク質であるＭａｇｎｅｔ遺伝子のサブユニット（ｐＭａｇ及びｎＭａｇ)が連結されて、独立に発現されるシステムである。ＣｒｅＮ-ｐＭａｇとＣｒｅＣ−ｎＭａｇは、光非照射下では、それぞれ遊離サブユニットとして存在しているが、青色光照射下ではｐＭａｇとｎＭａｇとが会合し、Ｃｒｅの酵素活性が発揮される。同様に、光スイッチタンパク質であるＭａｇｎｅｔ遺伝子をＣｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９システムと組み合わせることでＤＮＡ組換え反応を光でコントロールできるシステムも考案されている（非特許文献９： Nature Biotechnology 33, 755-760(2015) doi:10.1038/nbt.3245)。Ｍａｇｎｅｔ遺伝子として使用されるｐＭａｇサブユニット（配列番号１）とｎＭａｇサブユニット（配列番号７）は、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列、及び配列番号２のアミノ酸配列を有し、遊離のタンパク質として発現し、青色光照射下で会合する。会合速度が異なる改変型の遺伝子が知られており、改変されたＭａｇｎｅｔ遺伝子を使用することもできる。ｐＭａｇサブユニット（配列番号１)の改変型遺伝子として、ｐＭａｇＦａｓｔ１（配列番号７６）、ｐＭａｇＦａｓｔ２（配列番号７７）などが知られている。また、ｎＭａｇサブユニット（配列番号７）の改変型遺伝子として、ｎＭａｇＨｉｇｈ（配列番号２）などが知られている。
本発明では２つ以上のサブユニットにより構成される光スイッチタンパク質は、サブユニット間がリンカーで連結される。サブユニット数がｎである場合、サブユニット間のリンカーはｎ-１個存在することとなる。各リンカーの長さは、光スイッチ遺伝子の機能の発揮し、かつウイルスタンパク質の機能の発揮する観点で任意に選択することができる。光スイッチ遺伝子を、外来遺伝子導入可能領域に組み込んだ場合に、ウイルスレスキューが可能でありさえすれば、リンカー残基数を調節することで、光スイッチの遺伝子の機能を調節しうる。その理由としては、ウイルスレスキューが可能であるということは、光照射下において、光スイッチタンパク質のサブユニットが会合し、会合状態でのウイルスタンパク質の活性が維持できているといえ、リンカーの長さは会合状態に影響を及ぼしにくい一方で、未会合状態（光非照射下）では、リンカーを伸ばしていけば何れかの長さでウイルスタンパク質の活性を低下することができるからである。
リンカー残基数の上限は、外来遺伝子導入可能領域における、導入遺伝子のサイズの上限と、導入する光スイッチタンパク質のサブユニットのサイズに応じて、適宜選択することができ、例えば１００残基以下が好ましく、５０残基以下がより好ましく、３０残基以下がさらにより好ましい。リンカー残基数の下限は、サブユニットの遊離・会合を許容する観点から、１０残基以上が好ましく、１５残基以上がより好ましく、２０残基以上がさらにより好ましい。リンカーの配列は任意の配列であってもよいが、βシートやαヘリックスなどの二次構造をとらないことが好ましい。したがって、リンカー中のグリシンの含量が２５％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらにさらに好ましい。
また、光スイッチタンパク質とウイルスタンパク質との間は、さらにリンカーで連結されてもよいし、直接連結されてもよい。Ｎ末側のサブユニットとウイルスタンパク質との間のリンカーを、Ｎ−リンカー（又は上流リンカー）と呼ぶこととし、Ｃ末側のサブユニットとウイルスタンパク質との間のリンカーをＣ−リンカー（又は下流リンカー）と呼ぶことができる。Ｎ−リンカー及びＣ−リンカー残基の上限及び下限は、導入遺伝子のサイズの上限と、導入する光スイッチタンパク質のサブユニットのサイズに応じて、適宜選択することができる。例えば５０残基以下が好ましく、３０残基以下がより好ましく、１５残基以下がさらにより好ましい。リンカーの代わり、又はリンカーとともに外来遺伝子の導入の可否を検出するためのタグが含まれてもよい。
本発明の１の態様では、本発明にかかる光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸に関する。「遺伝子をコードする核酸」には、元となる核酸配列の他に、縮重により同一の遺伝子をコードする核酸が含まれる。本発明のさらなる態様では、かかる核酸を含むプラスミドベクターやウイルスベクターにも関する。
本発明のウイルスベクターは、ウイルス遺伝子をコードする核酸の他に、任意の外来遺伝子をコードする核酸を含むことができる。本発明のウイルスベクターは、光の照射により局所的にウイルスベクターの活性化を行うことができることから、ウイルスベクターの投与後、光の照射により部位特異的にウイルスベクターを活性化でき、外来遺伝子を発現させることができる。光は体外から照射されてもよいし、内視鏡を用いて体内から照射することもできる。このようなウイルスベクターを、光感受性ウイルスベクターと呼ぶことができる。また本発明の光感受性ウイルスは、当該ウイルスのもつ細胞溶解性、特に腫瘍溶解活性を利用して、癌などの疾患治療に利用しうる。光感受性ウイルス感染後、標的となる細胞、特に癌細胞が含まれる領域に光を照射することで、部位特異的に細胞溶解を引き起こすことができる。
麻疹ウイルスは、一般的に複数本のゲノムを粒子内に取り込むことができる（非特許文献１０:Emboj. 2002 May 15, 21(10):2364-72）。そのため、ゲノムを２本、もしくは３本に分節化しても、増殖することができる（非特許文献１１：J. Virol. 2006; 80:4242-4248）。したがって、本発明のウイルスベクターは、必ずしも１本のゲノムからのみ構成されることをいとしておらず、場合により２本、３本、又はそれ以上の本数のゲノムを含んでいてもよい。
光感受性ウイルスベクターに導入する外来遺伝子は、その目的に応じて適宜選択することができる。例えば、癌に対する遺伝子治療のために使用する場合、癌細胞に直接癌抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、ＲＣＡ１等）を導入することもできるし、リンパ球にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの遺伝子を発現させて、腫瘍抗原特異的な細胞傷害活性を高めることができる。また、遺伝子欠陥にともなう遺伝病患者に対する遺伝子導入治療としては、遺伝子欠陥を補うことが可能な遺伝子を外来遺伝子としてウイルスベクターに導入できる。このような遺伝子として、例えば筋ジストロフィーの治療に用いられるジストロフィン、ラミニンa2、ジストログリカン等が用いられる。治療対象の疾患及び治療のために導入する遺伝子については、当業者が適宜選択することができる。
治療目的以外にも、研究目的などのために本発明のウイルスベクターを利用することができる。本発明のウイルスベクターで細胞を感染後、所定の光を照射することで、外来遺伝子の一過的な発現が可能になり、またその後光照射を停止することで、ウイルスの活性を低下させ、細胞からのウイルスの排除が可能になる。ｉＰＳ細胞の作成には、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４、l−Ｍｙｃ（またはｃ−Ｍｙｃ）といったリプログラミング因子を体細胞に発現させる必要がある。従来のウイルスベクターによる実験では、ウイルスの活性を制御できない。そうすると、従来のウイルスベクターを用いた実験では、ｉＰＳ細胞へと誘導した後に、ウイルスを排除することができない。一方で、導入された因子の一部は癌遺伝子としても知られていることから、ｉＰＳ細胞が癌化するおそれが指摘されている。本発明のウイルスベクターを利用して遺伝子導入を行い、光照射を行うことにより、リプログラミング因子の一つ又は複数を、一過的に細胞で発現することが可能になる。そして光照射を停止することで、ウイルス活性を低下又は不活性化することができる。これにより、ｉＰＳ細胞を誘導後、継代を繰り返すことでウイルスの完全な排除が可能となる。
本発明の更なる態様では、本発明の光感受性ウイルスベクターを用いた、細胞に一過的にウイルスベクターを感染させる方法にも関する。より具体的に、この方法は、本発明の光感受性ウイルスベクターを細胞に感染させる工程、感染した細胞を光存在下で培養する工程、及び感染した細胞を光不存在下で培養する工程を含む。光存在下で培養することで、ウイルスベクターを活性化し、導入遺伝子の遺伝子発現を促進することができる。その後、光不存在下で培養することで、ウイルスを不活性化し、ウイルスを排除することができる。ウイルスを完全に排除するために、暗所下での継代培養が行われうる。数世代の境内培養により、ウイルスを完全に排除することができる。
一過的にウイルスベクターを感染させる方法は、ｉＰＳ細胞の製造方法に応用することができる。この方法ではＯｃｔ３／４、 Ｓｏｘ２、 Ｋｌｆ４、l−Ｍｙｃ（またはｃ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる群から選ばれる少なくとも１の導入遺伝子を含む、本発明の光感受性ウイルスベクターを体細胞に感染させる工程、及び感染した細胞を光存在下で培養する工程を含む。光存在下で培養することで、導入遺伝子が細胞内で発現され、特定の組合せ、例えばＯｃｔ３／４、 Ｓｏｘ２、 Ｋｌｆ４、及びl−Ｍｙｃ、又はＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が発現した場合に、ｉＰＳ細胞へと誘導される。誘導されたｉＰＳ細胞について、さらに光不存在下で培養する工程が行われうる。この工程により、ｉＰＳ細胞に感染していたウイルスベクターは不活性化される。ウイルスベクターを完全に排除するために、暗所下での継代培養が行われうる。数世代の継代培養により、ウイルスベクターを完全に排除することができる。これにより、導入遺伝子を含まないｉＰＳ細胞を作成することができる。導入遺伝子を含まないｉＰＳ細胞とは、ｉＰＳ細胞を誘導するために導入された導入遺伝子及びその導入遺伝子を導入するために用いられたウイルスベクターを実質的に含まないｉＰＳ細胞又はその子孫細胞をいう。「ウイルスベクターを実質的に含まない」とは、例えばＲＴ−ＰＣＲの手法により、ウイルスベクターの存在を確認した際に未検出であることをいう。
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：光スイッチタンパク質を導入したウイルスの作成
組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミドの作成
麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３を元に、組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミドを作成した。麻疹ウイルスのゲノムの先頭にＥＧＦＰ転写ユニットを追加した（図１）(配列番号８)。これにより、ウイルスが感染した細胞をＥＧＦＰの発現により確認が可能になる。Ｌタンパク遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子であるＤＰ（配列番号９）、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ＣＲＹ２−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１１）、及びＣＲＹ２ＰＨＲ−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１２）の遺伝子を導入して、改変Ｌタンパク遺伝子を製造した。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行った。各プラスミドを作製するために用いたＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤＰＫ-ＤＰＮ（配列番号１３）、ｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＣＲＹ２−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１５）、及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ＣＲＹＰＨＲ−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１６）である。
組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミドの作成
麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３を元に、組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミドを作成した。麻疹ウイルスのゲノムの先頭にＥＧＦＰ転写ユニットを追加した（図１）(配列番号８)。これにより、ウイルスが感染した細胞をＥＧＦＰの発現により確認が可能になる。Ｌタンパク遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子であるＤＰ（配列番号９）、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ＣＲＹ２−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１１）、及びＣＲＹ２ＰＨＲ−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１２）の遺伝子を導入して、改変Ｌタンパク遺伝子を製造した。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行った。各プラスミドを作製するために用いたＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤＰＫ-ＤＰＮ（配列番号１３）、ｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＣＲＹ２−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１５）、及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ＣＲＹＰＨＲ−ＣＩＢ１Ｎ（配列番号１６）である。
組換え麻疹ウイルスの合成
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ）（配列番号３３）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ）（配列番号３４）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−９３０１Ｂ−ｗｔＬ）（配列番号３５）と、上述の組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミド（５μｇ）をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。２日の培養後、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞をＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ重層し、ウイルスレスキューの有無を調べた。
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ）（配列番号３３）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ）（配列番号３４）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−９３０１Ｂ−ｗｔＬ）（配列番号３５）と、上述の組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミド（５μｇ）をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。２日の培養後、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞をＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ重層し、ウイルスレスキューの有無を調べた。
光応答性の確認
レスキューされた組換え麻疹ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ麻疹ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群、暗所群、赤色ＬＥＤ（ピーク波長：６５５ｎｍ）照射群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた。光スイッチタンパク質として、ｐＭａｇ−ｎＭａｇhighを導入した場合、青色ＬＥＤ照射群でＥＧＦＰの発現が見られた一方で、暗所群ではＥＧＦＰの発現が少なかった（図２）。この光応答性のウイルスを「Magnet-L光感受性麻疹ウイルス」と呼ぶこととする。
レスキューされた組換え麻疹ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ麻疹ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群、暗所群、赤色ＬＥＤ（ピーク波長：６５５ｎｍ）照射群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた。光スイッチタンパク質として、ｐＭａｇ−ｎＭａｇhighを導入した場合、青色ＬＥＤ照射群でＥＧＦＰの発現が見られた一方で、暗所群ではＥＧＦＰの発現が少なかった（図２）。この光応答性のウイルスを「Magnet-L光感受性麻疹ウイルス」と呼ぶこととする。
実施例２：光感受性麻疹ウイルスの光照射による活性の制御
光感受性麻疹ウイルスの増殖曲線
６穴プレートに生育させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に、実施例１で取得されたＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスをＭＯＩ が０．０１になるように感染させた。青色または赤色ＬＥＤを当てる場合は、ＣＯ2インキュベーター内で、ＩＳＬＭ−１５０Ｘ１５０−ＲＢ（ＣＣＳ）でそれぞれの色のＬＥＤ（ピーク波長：赤６５５ｎｍ、青色４７０ｎｍ）を照射しながら培養した。様々な時間で細胞と培養液を回収し、増殖したウイルスの感染力価（ＰＦＵ）を測定した（図３）。青色ＬＥＤ照射群でのみウイルスの増殖が確認された（図３）。蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を確認することでも、青色ＬＥＤ照射依存的にウイルスが増殖していることを確認した（図２）。同様の実験を実施し、青色ＬＥＤ照射群で、一部、４日目から青色ＬＥＤ照射を止めて、ウイルス増殖の変化を観察した（図４）。青色ＬＥＤの照射を停止すると、ウイルスの増殖が止まり、力価が徐々に減少した（図４）。同様の実験を実施し、Ｍａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスで感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞を暗所で７日間培養し、７日目から青色ＬＥＤ照射を開始した。青色ＬＥＤ照射の開始後、ウイルスの増殖が開始され、１０日目以降、高いウイルス力価が確認された（図５）。
光感受性麻疹ウイルスの増殖曲線
６穴プレートに生育させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に、実施例１で取得されたＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスをＭＯＩ が０．０１になるように感染させた。青色または赤色ＬＥＤを当てる場合は、ＣＯ2インキュベーター内で、ＩＳＬＭ−１５０Ｘ１５０−ＲＢ（ＣＣＳ）でそれぞれの色のＬＥＤ（ピーク波長：赤６５５ｎｍ、青色４７０ｎｍ）を照射しながら培養した。様々な時間で細胞と培養液を回収し、増殖したウイルスの感染力価（ＰＦＵ）を測定した（図３）。青色ＬＥＤ照射群でのみウイルスの増殖が確認された（図３）。蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を確認することでも、青色ＬＥＤ照射依存的にウイルスが増殖していることを確認した（図２）。同様の実験を実施し、青色ＬＥＤ照射群で、一部、４日目から青色ＬＥＤ照射を止めて、ウイルス増殖の変化を観察した（図４）。青色ＬＥＤの照射を停止すると、ウイルスの増殖が止まり、力価が徐々に減少した（図４）。同様の実験を実施し、Ｍａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスで感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞を暗所で７日間培養し、７日目から青色ＬＥＤ照射を開始した。青色ＬＥＤ照射の開始後、ウイルスの増殖が開始され、１０日目以降、高いウイルス力価が確認された（図５）。
実施例３：ミニゲノムアッセイ
麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミドの作成
ｐｃＤＮＡ３（Thermo Fisher Scientific社）のＣＭＶプロモーター領域を、pＥＦ−ＤＥＳＴ５１（Thermo Fisher Scientific社）のＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター配列で置き換え、そのＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター配列の下流に、ハンマーヘッド型リボザイム配列(配列番号４２)、麻疹ウイルスゲノム５’末端配列（配列番号４３）、ｎａｎｏ ｌｕｃ遺伝子配列(Promega社、ｐＮＬ３．３由来)（配列番号４４）、麻疹ウイルスゲノム３’末端配列（配列番号４５）、及びＨＤＶリボザイム配列(配列番号４６)を組み込んだ麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミド（配列番号４７）を作成した（図６）。この麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミドを細胞にトランスフェクトすると、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターの働きにより、５’末端にハンマーヘッド型リボザイム、３’末端にＨＤＶリボザイムを有するＲＮＡが転写される。これらのリボザイムの働きにより転写されたＲＮＡのリボザイム部分は切断され、麻疹ウイルスゲノムを模したｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子を持つ麻疹ウイルスミニゲノムが生成される（図６）。
麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミドの作成
ｐｃＤＮＡ３（Thermo Fisher Scientific社）のＣＭＶプロモーター領域を、pＥＦ−ＤＥＳＴ５１（Thermo Fisher Scientific社）のＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター配列で置き換え、そのＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター配列の下流に、ハンマーヘッド型リボザイム配列(配列番号４２)、麻疹ウイルスゲノム５’末端配列（配列番号４３）、ｎａｎｏ ｌｕｃ遺伝子配列(Promega社、ｐＮＬ３．３由来)（配列番号４４）、麻疹ウイルスゲノム３’末端配列（配列番号４５）、及びＨＤＶリボザイム配列(配列番号４６)を組み込んだ麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミド（配列番号４７）を作成した（図６）。この麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミドを細胞にトランスフェクトすると、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターの働きにより、５’末端にハンマーヘッド型リボザイム、３’末端にＨＤＶリボザイムを有するＲＮＡが転写される。これらのリボザイムの働きにより転写されたＲＮＡのリボザイム部分は切断され、麻疹ウイルスゲノムを模したｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子を持つ麻疹ウイルスミニゲノムが生成される（図６）。
麻疹ウイルスタンパク発現プラスミドの作成 ミニゲノムアッセイ
ｐＣＡ７プラスミド（ｐＣＡＧ−Ｔ７プラスミドと同一）のＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のＮ遺伝子配列を導入し、Ｎタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−ＩＣ−Ｎ：配列番号４８）を得た。同様に、ｐＣＡ７プラスミドのＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のＰ遺伝子配列を導入し、Ｐタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−ＩＣ−ＰΔＣ：配列番号４９）を得た。さらに、ｐＣＡ７プラスミドのＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルス９３０１B株のＬ遺伝子配列を導入し、Ｌタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−９３０１Ｂ−ｗｔＬ：配列番号５０）を得た。これらのプラスミドは、非特許文献１２（Takeda et al. 2005 Virus Res 108:161-165)及び非特許文献１３（Nakatsu et al. 2006 J Virological Methods 137:152-155）の記載に従って取得した。さらにＬ遺伝子配列の代わりに、上述のｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）の改変Lタンパク遺伝子を元にして、上述の方法と同様にして、改変Ｌタンパク質（modified L）発現プラスミド（配列番号５１）を得た。
ｐＣＡ７プラスミド（ｐＣＡＧ−Ｔ７プラスミドと同一）のＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のＮ遺伝子配列を導入し、Ｎタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−ＩＣ−Ｎ：配列番号４８）を得た。同様に、ｐＣＡ７プラスミドのＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルスＩＣ−Ｂ株のＰ遺伝子配列を導入し、Ｐタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−ＩＣ−ＰΔＣ：配列番号４９）を得た。さらに、ｐＣＡ７プラスミドのＣＡＧプロモーターの下流に、麻疹ウイルス９３０１B株のＬ遺伝子配列を導入し、Ｌタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡ７−９３０１Ｂ−ｗｔＬ：配列番号５０）を得た。これらのプラスミドは、非特許文献１２（Takeda et al. 2005 Virus Res 108:161-165)及び非特許文献１３（Nakatsu et al. 2006 J Virological Methods 137:152-155）の記載に従って取得した。さらにＬ遺伝子配列の代わりに、上述のｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）の改変Lタンパク遺伝子を元にして、上述の方法と同様にして、改変Ｌタンパク質（modified L）発現プラスミド（配列番号５１）を得た。
ミニゲノムアッセイ
上述の麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミド（０．０３μｇ）と、Ｎタンパク質発現プラスミド（０．０６μｇ）と、Ｐタンパク質発現プラスミド（０．０１５μｇ）と、Ｌタンパク質発現プラスミド又はＬ改変タンパク質発現プラスミド（０．０６μｇ）とを、TransIT LT1 (Mirus)を使用して９６ウェルに播種された２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞では、麻疹ウイルスミニゲノムの生成とともに、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質（又はＬ改変タンパク質）が発現し、これらのタンパク質が全て揃うと、リボ核タンパク複合体が形成する（図７）。リボ核タンパク複合体は、LタンパクのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性により、nano Luc遺伝子が転写され、細胞内の翻訳系によりnano Lucが発現する（図７）。そこで、トランスフェクトされた細胞において、暗所又は所定の波長（青色ＬＥＤ照射（４７０ｎｍ））の光照射下で２日間培養後、１０μｌの培養上清を回収し、Nano-Glo luciferase Assay kit (Promega)でルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図８に示す。図８では、野生型Ｌタンパク質発現させた場合における、暗所下でのルシフェラーゼ活性を１００％として示した。ｐＭａｇと、ｎＭａｇｈｉｇｈとをリンカー配列で組み込んだＬタンパク質（ｐＭａｇ-ｎＭａｇｈｉｇｈ）を発現させた細胞群では、暗所下（dark）ではルシフェラーゼ活性をの著しい低下が見られた一方で、青色ＬＥＤ照射下（blue）では、ルシフェラーゼ活性を検出することができた（図８）。実施例２に示されるようにｐＭａｇと、ｎＭａｇｈｉｇｈとをリンカー配列で組み込んだ改変Ｌタンパク質（ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ）を有するＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスは、青色光の照射によりその活性の制御が可能であることが示されている。本実験のミニゲノムアッセイにおいても、改変Ｌタンパク質の光制御が可能であることが示されており、かかるミニゲノムアッセイが、実際にウイルスを用いた試験の代替として使用できることが示された。
上述の麻疹ウイルスミニゲノム発現プラスミド（０．０３μｇ）と、Ｎタンパク質発現プラスミド（０．０６μｇ）と、Ｐタンパク質発現プラスミド（０．０１５μｇ）と、Ｌタンパク質発現プラスミド又はＬ改変タンパク質発現プラスミド（０．０６μｇ）とを、TransIT LT1 (Mirus)を使用して９６ウェルに播種された２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞では、麻疹ウイルスミニゲノムの生成とともに、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質（又はＬ改変タンパク質）が発現し、これらのタンパク質が全て揃うと、リボ核タンパク複合体が形成する（図７）。リボ核タンパク複合体は、LタンパクのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性により、nano Luc遺伝子が転写され、細胞内の翻訳系によりnano Lucが発現する（図７）。そこで、トランスフェクトされた細胞において、暗所又は所定の波長（青色ＬＥＤ照射（４７０ｎｍ））の光照射下で２日間培養後、１０μｌの培養上清を回収し、Nano-Glo luciferase Assay kit (Promega)でルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図８に示す。図８では、野生型Ｌタンパク質発現させた場合における、暗所下でのルシフェラーゼ活性を１００％として示した。ｐＭａｇと、ｎＭａｇｈｉｇｈとをリンカー配列で組み込んだＬタンパク質（ｐＭａｇ-ｎＭａｇｈｉｇｈ）を発現させた細胞群では、暗所下（dark）ではルシフェラーゼ活性をの著しい低下が見られた一方で、青色ＬＥＤ照射下（blue）では、ルシフェラーゼ活性を検出することができた（図８）。実施例２に示されるようにｐＭａｇと、ｎＭａｇｈｉｇｈとをリンカー配列で組み込んだ改変Ｌタンパク質（ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ）を有するＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスは、青色光の照射によりその活性の制御が可能であることが示されている。本実験のミニゲノムアッセイにおいても、改変Ｌタンパク質の光制御が可能であることが示されており、かかるミニゲノムアッセイが、実際にウイルスを用いた試験の代替として使用できることが示された。
実施例４：リンカーの検討
二本の麻疹ウイルスゲノムを活用して、リンカーを持たないｐＭａｇ、ｎＭａｇｈｉｇｈで光制御性の麻疹ウイルスが合成できるか試した。具体的に、一方のゲノムのＬ遺伝子では、Ｌ遺伝子のＮ末端側とｐＭａｇとが連結されており、もう一方のゲノムのＬ遺伝子は、ｎＭａｇｈｉｇｈ遺伝子と、Ｌ遺伝子のＣ末端側が連結されているウイルスベクターをそれぞれ作成した（配列番号７４及び７５；図９）。これらのウイルスベクターを細胞に共感染させ、転写翻訳がされた後に、青色光を照射するとｐＭａｇとｎＭａｇｈｉｇｈとが会合するため、活性型のＬタンパク質が生成するものと考えられたが、実際にはウイルスレスキューをすることができなかった。リンカー無しでは、青色光照射によっても活性型Ｌタンパクができなかった一方で、ｐＭａｇとｎＭａｇｈｉｇｈとがリンカーを介して１つのタンパク質上に繋がれることで、青色項照射の有無により、活性を制御することができたと考えられる。
二本の麻疹ウイルスゲノムを活用して、リンカーを持たないｐＭａｇ、ｎＭａｇｈｉｇｈで光制御性の麻疹ウイルスが合成できるか試した。具体的に、一方のゲノムのＬ遺伝子では、Ｌ遺伝子のＮ末端側とｐＭａｇとが連結されており、もう一方のゲノムのＬ遺伝子は、ｎＭａｇｈｉｇｈ遺伝子と、Ｌ遺伝子のＣ末端側が連結されているウイルスベクターをそれぞれ作成した（配列番号７４及び７５；図９）。これらのウイルスベクターを細胞に共感染させ、転写翻訳がされた後に、青色光を照射するとｐＭａｇとｎＭａｇｈｉｇｈとが会合するため、活性型のＬタンパク質が生成するものと考えられたが、実際にはウイルスレスキューをすることができなかった。リンカー無しでは、青色光照射によっても活性型Ｌタンパクができなかった一方で、ｐＭａｇとｎＭａｇｈｉｇｈとがリンカーを介して１つのタンパク質上に繋がれることで、青色項照射の有無により、活性を制御することができたと考えられる。
実施例１においてウイルスレスキューができた一方で、光応答性を示さなかった改変Ｌタンパク質について、リンカーの検討をすることができる。ウイルスレスキューが可能である場合、光照射下において、スイッチタンパク質のサブユニットが会合し、会合状態でのウイルスタンパク質の活性が維持できているといえ、リンカーの長さは会合状態に影響を及ぼしにくい一方で、未会合状態では、リンカーを伸ばしていけば何れかの時点でウイルスタンパク質の活性を低下することができる。したがって、現在使用しているリンカーよりも長いリンカーを用いることにより、光応答性を達成しうる。
実施例５：狂犬病ウイルスをベースとした光制御性ウイルスベクターの作成
組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドの作成
狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐＨＥＰを元に、組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドを作成した。狂犬病ウイルスのゲノムのＧ遺伝子とＬ遺伝子の間にＥＧＦＰ転写ユニットを追加した（図１０）(配列番号５２)。これにより、ウイルスが感染した細胞をＥＧＦＰの発現により確認が可能になる。このプラスミドは、非特許文献１４（Khawplod et al. 2005 Journal of Virological methods 125:35-40）の記載に従って取得した。Ｌ遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子を導入した。導入される光応答性遺伝子はとして、２６残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、リンカーを介さず直接結合されたｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）、ｎＭａｇｈｉｇｈの代わりにｎＭａｇを用いたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を用いて、改変Ｌ遺伝子を製造した。これらの遺伝子導入は、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（Clontech）を用いて行った。プラスミドを作製するために用いるＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号５３）、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ(配列番号８４)、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ(配列番号８５）であった。
組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドの作成
狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐＨＥＰを元に、組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドを作成した。狂犬病ウイルスのゲノムのＧ遺伝子とＬ遺伝子の間にＥＧＦＰ転写ユニットを追加した（図１０）(配列番号５２)。これにより、ウイルスが感染した細胞をＥＧＦＰの発現により確認が可能になる。このプラスミドは、非特許文献１４（Khawplod et al. 2005 Journal of Virological methods 125:35-40）の記載に従って取得した。Ｌ遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子を導入した。導入される光応答性遺伝子はとして、２６残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、リンカーを介さず直接結合されたｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）、ｎＭａｇｈｉｇｈの代わりにｎＭａｇを用いたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を用いて、改変Ｌ遺伝子を製造した。これらの遺伝子導入は、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（Clontech）を用いて行った。プラスミドを作製するために用いるＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号５３）、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ(配列番号８４)、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ(配列番号８５）であった。
組換え狂犬病ウイルスの合成
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｎ）（配列番号６０）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｐ）（配列番号６１）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｌ）（配列番号６２）と、０．５μｇのＧタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｇ）（配列番号６３）上述の組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号５３）、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ(配列番号８４)、及びｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ(配列番号８５)（５μｇ）をそれぞれＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞を継代しながら培養を続けウイルスを得た。
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｎ）（配列番号６０）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｐ）（配列番号６１）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｌ）（配列番号６２）と、０．５μｇのＧタンパク発現プラスミド（ｐＨ−Ｇ）（配列番号６３）上述の組換え狂犬病ウイルス生成用のプラスミドｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号５３）、ｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ(配列番号８４)、及びｐＨＥＰ−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ(配列番号８５)（５μｇ）をそれぞれＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞を継代しながら培養を続けウイルスを得た。
光応答性の確認
レスキューされた組換え狂犬病ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＢＨＫ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ狂犬病ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群と、暗所群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた。青色ＬＥＤ照射した場合、光応答性遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）、及びｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を導入されたウイルスは、いずれも同等に増殖した。一方、暗所群では、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）、及びｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）の順でウイルス増殖活性が抑えられることが示された（図１５）。
レスキューされた組換え狂犬病ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＢＨＫ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ狂犬病ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群と、暗所群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた。青色ＬＥＤ照射した場合、光応答性遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）、及びｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を導入されたウイルスは、いずれも同等に増殖した。一方、暗所群では、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）、及びｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）の順でウイルス増殖活性が抑えられることが示された（図１５）。
実施例６：風疹ウイルスをベースとした光制御性ウイルスベクターの作成
組換え風疹ウイルス生成用のプラスミドの作成
風疹ウイルスＨｉｒｏｓｈｉｍａ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐＨＳを元に、組換え風疹ウイルス生成用のプラスミドを作成した。風疹ウイルスのゲノムのＰ１５０遺伝子内部のアミノ酸番号７１７の外来遺伝子導入可能領域にAzami Green 1 (AG1)(MBL)を挿入する（図１１）(配列番号６４)。このプラスミドは、非特許文献１５（Sakata et al. 2014 Journal of Virology 88:11187-11198）の記載に従って取得した。これにより、ウイルスが感染した細胞をAG1の発現により確認が可能になる。Ｐ１５０遺伝子内に存在するもう一つの外来遺伝子導入可能領域（アミノ酸番号１００５）に、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）の遺伝子を導入して、改変Ｐ１５０遺伝子を製造する。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行う。各プラスミドを作製するために用いるＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐＨＳ−７１７ＡＧ１−１００５ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号６５）とする。ＡＧ１とｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈの場所を入れ替えたｐＨＳ−７１７ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ−１００５ＡＧ１（配列番号６６）も作製する。
組換え風疹ウイルス生成用のプラスミドの作成
風疹ウイルスＨｉｒｏｓｈｉｍａ株のゲノム配列をコードしているプラスミドｐＨＳを元に、組換え風疹ウイルス生成用のプラスミドを作成した。風疹ウイルスのゲノムのＰ１５０遺伝子内部のアミノ酸番号７１７の外来遺伝子導入可能領域にAzami Green 1 (AG1)(MBL)を挿入する（図１１）(配列番号６４)。このプラスミドは、非特許文献１５（Sakata et al. 2014 Journal of Virology 88:11187-11198）の記載に従って取得した。これにより、ウイルスが感染した細胞をAG1の発現により確認が可能になる。Ｐ１５０遺伝子内に存在するもう一つの外来遺伝子導入可能領域（アミノ酸番号１００５）に、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）の遺伝子を導入して、改変Ｐ１５０遺伝子を製造する。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行う。各プラスミドを作製するために用いるＰＣＲプライマーは下記の通りである。これらの遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐＨＳ−７１７ＡＧ１−１００５ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号６５）とする。ＡＧ１とｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈの場所を入れ替えたｐＨＳ−７１７ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈ−１００５ＡＧ１（配列番号６６）も作製する。
組換え風疹ウイルスの合成
上述のプラスミドを鋳型にして、in vitro transcription kit(Life Technologies)を用いてＲＮＡを合成する。６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ細胞に、２．５μｇのＲＮＡをＤＭＲＩＥ−Ｃ (Life Technologies)を用いてトランスフェクトする。ＢＨＫ細胞を継代しながら培養を続けウイルスを得る。
上述のプラスミドを鋳型にして、in vitro transcription kit(Life Technologies)を用いてＲＮＡを合成する。６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ細胞に、２．５μｇのＲＮＡをＤＭＲＩＥ−Ｃ (Life Technologies)を用いてトランスフェクトする。ＢＨＫ細胞を継代しながら培養を続けウイルスを得る。
レプリコンアッセイ
風疹ウイルスレプリコン発現プラスミドの作成
風疹ウイルスＨｉｒｏｓｈｉｍａ株から、構造蛋白質（Ｃ、Ｅ２およびＥ１）をコードしているＯＲＦを欠損させたゲノム（サブゲノムレプリコン）がクローニングされているプラスミドの構造蛋白質を欠損させた領域にｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子を導入した（配列番号７１）（図１１）。このプラスミドは、非特許文献１５：Sakata et al. 2014 Journal of Virology 88:11187-11198）に記載のプラスミドのＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子部分をｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子に変えたものである。さらにＰ１５０配列の２カ所の外来遺伝子導入可能領域（アミノ酸番号７１７とアミノ酸番号１００５）に、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈをそれぞれ導入し、改変Ｐ１５０タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌ）発現レプリコンを得た（配列番号７２及び配列番号７３）を得た。
風疹ウイルスレプリコン発現プラスミドの作成
風疹ウイルスＨｉｒｏｓｈｉｍａ株から、構造蛋白質（Ｃ、Ｅ２およびＥ１）をコードしているＯＲＦを欠損させたゲノム（サブゲノムレプリコン）がクローニングされているプラスミドの構造蛋白質を欠損させた領域にｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子を導入した（配列番号７１）（図１１）。このプラスミドは、非特許文献１５：Sakata et al. 2014 Journal of Virology 88:11187-11198）に記載のプラスミドのＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子部分をｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子に変えたものである。さらにＰ１５０配列の２カ所の外来遺伝子導入可能領域（アミノ酸番号７１７とアミノ酸番号１００５）に、ｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈをそれぞれ導入し、改変Ｐ１５０タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌ）発現レプリコンを得た（配列番号７２及び配列番号７３）を得た。
レプリコンアッセイ
上述のレプリコンプラスミドを鋳型にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Life Technologies）を用いてでＲＮＡを合成する。２４ウェルプレートに生育させたＢＨＫ細胞に、レプリコンＲＮＡ１．５μｇと風疹ウイルスキャプシドＲＮＡ１．５μｇをＤＭＲＩＥ−Ｃ(Life Technologies)を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞では、Ｐ１５０タンパク質とＰ９０タンパク質が発現し、これらのタンパク質のポリメラーゼ活性により、ｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子が転写され、細胞内の翻訳系によりｎａｎｏ Ｌｕｃが発現する。
上述のレプリコンプラスミドを鋳型にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Life Technologies）を用いてでＲＮＡを合成する。２４ウェルプレートに生育させたＢＨＫ細胞に、レプリコンＲＮＡ１．５μｇと風疹ウイルスキャプシドＲＮＡ１．５μｇをＤＭＲＩＥ−Ｃ(Life Technologies)を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞では、Ｐ１５０タンパク質とＰ９０タンパク質が発現し、これらのタンパク質のポリメラーゼ活性により、ｎａｎｏ Ｌｕｃ遺伝子が転写され、細胞内の翻訳系によりｎａｎｏ Ｌｕｃが発現する。
実施例７：ｉＰＳ細胞の作成
実施例１のＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスのゲノムに、転写ユニットとしてリプログラミング因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｌ−Ｍｙｃを組み込み、ウイルスベクターを作成した。具体的に、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ６４８９遺伝子を含む第一ゲノムと、Ｈ遺伝子と改変Ｌ遺伝子とを含む第二ゲノムからなる２本の麻疹ゲノムにリプログラミング遺伝子を導入した。第一ゲノムにおいて、Ｏｃｔ３をＮ遺伝子の上流に、Ｓｏｘ２遺伝子及びｌ−ｍｙｃ遺伝子を配置した（配列番号８６）。第二ゲノムにおいて、Ｈ遺伝子の上流にＥＧＦＰ及びＫｌｆ４遺伝子を配置した（配列番号８７）（図１７A）。繊維芽細胞や、ヒトの末梢血から取得された体細胞を、それぞれの細胞に適した培地で、３７℃、５％ＣＯ2加湿雰囲気下で培養した。培地を捨て、ウイルスベクターをＭＯＩ＝０．１以上で細胞に感染させた。感染後、細胞をＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液で培養した。感染後に青色ＬＥＤ光を照射することで、各リプログラミング因子を体細胞内で発現させた。各リプログラミング因子の発現を調べ、２０日以上培養を続けて、ｉＰＳ細胞へと誘導した（図１７B）。
実施例１のＭａｇｎｅｔ−Ｌ光感受性麻疹ウイルスのゲノムに、転写ユニットとしてリプログラミング因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｌ−Ｍｙｃを組み込み、ウイルスベクターを作成した。具体的に、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ６４８９遺伝子を含む第一ゲノムと、Ｈ遺伝子と改変Ｌ遺伝子とを含む第二ゲノムからなる２本の麻疹ゲノムにリプログラミング遺伝子を導入した。第一ゲノムにおいて、Ｏｃｔ３をＮ遺伝子の上流に、Ｓｏｘ２遺伝子及びｌ−ｍｙｃ遺伝子を配置した（配列番号８６）。第二ゲノムにおいて、Ｈ遺伝子の上流にＥＧＦＰ及びＫｌｆ４遺伝子を配置した（配列番号８７）（図１７A）。繊維芽細胞や、ヒトの末梢血から取得された体細胞を、それぞれの細胞に適した培地で、３７℃、５％ＣＯ2加湿雰囲気下で培養した。培地を捨て、ウイルスベクターをＭＯＩ＝０．１以上で細胞に感染させた。感染後、細胞をＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液で培養した。感染後に青色ＬＥＤ光を照射することで、各リプログラミング因子を体細胞内で発現させた。各リプログラミング因子の発現を調べ、２０日以上培養を続けて、ｉＰＳ細胞へと誘導した（図１７B）。
実施例８：リンカーの長さの検討
実施例１で作成したＥＧＦＰ転写ユニットを追加した組み換え麻疹ウイルス（配列番号８）のＬタンパク遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子であるｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈを導入するにあたり、リンカーの働きを確認すべく、リンカーの長さを変更した。導入される光応答性遺伝子として、２６残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、その約４倍である１１４残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）、リンカーを介さず直接結合されたｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）を作成した。また、ｎＭａｇｈｉｇｈの代わりにｎＭａｇを用いたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を作成した。これらの光応答性遺伝子をＬタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に導入して、改変Ｌタンパク遺伝子を含む麻疹ウイルスゲノム生成用プラスミドを作成した。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行った。これらの光応答性遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）、ｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８１）、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８２）、及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号８３）である。
実施例１で作成したＥＧＦＰ転写ユニットを追加した組み換え麻疹ウイルス（配列番号８）のＬタンパク遺伝子の外来遺伝子導入可能領域に、光応答性遺伝子であるｐＭａｇ−ｎＭａｇｈｉｇｈを導入するにあたり、リンカーの働きを確認すべく、リンカーの長さを変更した。導入される光応答性遺伝子として、２６残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、その約４倍である１１４残基のリンカーを用いて結合されたｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）、リンカーを介さず直接結合されたｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）を作成した。また、ｎＭａｇｈｉｇｈの代わりにｎＭａｇを用いたｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を作成した。これらの光応答性遺伝子をＬタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に導入して、改変Ｌタンパク遺伝子を含む麻疹ウイルスゲノム生成用プラスミドを作成した。これらの遺伝子導入は、In-fusionキット（Clontech）を用いて行った。これらの光応答性遺伝子を導入したプラスミドの配列は、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１４）、ｐ（＋）ＭＶ３２３-ｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８１）、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８２）、及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号８３）である。
組換え麻疹ウイルスの合成
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ）（配列番号３３）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ）（配列番号３４）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−９３０１Ｂ−ｗｔＬ）（配列番号３５）と、上述の組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミド（５μｇ）をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。２日の培養後、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞をＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ重層し、ウイルスをレスキューした。
６ウェルプレートに生育させたＢＨＫ／Ｔ７−９細胞に、０．８μｇのＮタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ）（配列番号３３）、０．６μｇのＰタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ）（配列番号３４）、１．６μｇのＬタンパク発現プラスミド（ｐＣＩＴＥ−９３０１Ｂ−ｗｔＬ）（配列番号３５）と、上述の組換え麻疹ウイルス生成用のプラスミド（５μｇ）をＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（ロシュ）を用いてトランスフェクトした。２日の培養後、ＢＨＫ／Ｔ７−９細胞をＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ重層し、ウイルスをレスキューした。
光応答性の確認
レスキューされた組換え麻疹ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ麻疹ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群と、暗所群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた（図１４）。青色ＬＥＤ照射した場合、光応答性遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）、及びｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）は、いずれも同等に増殖した。一方、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を導入したものについては、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈと比較して、増殖速度が悪かった。暗所群では、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）及びｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）を導入したものについては、２日目以降に弱い増殖を示した。一方で、ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）と、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）とは、ウイルス増殖はほとんど見られなかった。
レスキューされた組換え麻疹ウイルスをＭＯＩが０．０１となるようにＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に感染させた。感染後、光応答性の遺伝子を組み込んだ麻疹ウイルスで感染させた細胞を、青色ＬＥＤ（ピーク波長：青色４７０ｎｍ）を照射群と、暗所群とに分けて培養し、ＥＧＦＰの発現の有無を調べた（図１４）。青色ＬＥＤ照射した場合、光応答性遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）、ｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）、及びｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）は、いずれも同等に増殖した。一方、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）を導入したものについては、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈと比較して、増殖速度が悪かった。暗所群では、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）及びｐＭａｇ−４×ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号８０）を導入したものについては、２日目以降に弱い増殖を示した。一方で、ｐＭａｇ−ｄｉｒｅｃｔ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号７８）と、ｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇ（配列番号７９）とは、ウイルス増殖はほとんど見られなかった。
実施例９：麻疹ウイルスによる治療活性
５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）の懸濁液を、１×１０7細胞／マウスとなるように腹側部皮下に投与した。１日おきに腫瘍径及び体重を測定した。腫瘍長径が２ｍｍ以上に達した時から、１日おきに５回、組み換え麻疹ウイルスを５×１０5ＩＵ／マウスの濃度で腫瘍内に投与した。使用したウイルスは、光応答遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）を導入された麻疹ウイルスを用いた。マウスを青色光照射群（４匹）と、暗所（自然光）群（４匹）とに分け６０日間飼育した。対照としてウイルス非投与の暗所（自然光）群（４匹）を用いた。毎日腫瘍径を観察し、長径が１０ｍｍに達した際に安楽死を行った。結果を図１６Ａ及びＢに示す。青色光照射群において、腫瘍サイズの縮小をもたらした一方で、暗所（自然光）群では、腫瘍の成長の抑制は見られたものの、腫瘍サイズは縮小しなかった。青色光の照射の有無で、麻疹ウイルスの癌細胞への治療活性の調節が可能になった。
５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）の懸濁液を、１×１０7細胞／マウスとなるように腹側部皮下に投与した。１日おきに腫瘍径及び体重を測定した。腫瘍長径が２ｍｍ以上に達した時から、１日おきに５回、組み換え麻疹ウイルスを５×１０5ＩＵ／マウスの濃度で腫瘍内に投与した。使用したウイルスは、光応答遺伝子としてｐＭａｇ−ｌｉｎｋｅｒ−ｎＭａｇｈｉｇｈ（配列番号１０）を導入された麻疹ウイルスを用いた。マウスを青色光照射群（４匹）と、暗所（自然光）群（４匹）とに分け６０日間飼育した。対照としてウイルス非投与の暗所（自然光）群（４匹）を用いた。毎日腫瘍径を観察し、長径が１０ｍｍに達した際に安楽死を行った。結果を図１６Ａ及びＢに示す。青色光照射群において、腫瘍サイズの縮小をもたらした一方で、暗所（自然光）群では、腫瘍の成長の抑制は見られたものの、腫瘍サイズは縮小しなかった。青色光の照射の有無で、麻疹ウイルスの癌細胞への治療活性の調節が可能になった。
Claims (20)
- 酵素活性を有するウイルスタンパク質の外来遺伝子導入可能領域に、光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入された、ウイルスタンパク質遺伝子であって、前記光スイッチタンパク質が、少なくとも２のサブユニットを含み、各サブユニットをコードする遺伝子がリンカーで連結されているか、又はリンカーを介さず直接連結されている、前記ウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記リンカーが、１０〜１００アミノ酸残基である、請求項１に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子が、Ｍａｇｎｅｔ遺伝子である、請求項１又は２に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記ウイルスタンパク質の活性を、４５０〜４９０ｎｍの波長の光を照射することにより調節できる、請求項３に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 酵素活性を有するウイルスタンパク質が、ポリメラーゼもしくはプロテアーゼドメインを有するウイルスタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記ウイルスタンパク質が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬタンパク質である、請求項７に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記外来遺伝子導入可能領域が、ＬｎドメインとＬｃドメインの間の領域である、請求項７又は８に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 前記光スイッチタンパク質をコードする遺伝子の上流及び/又は下流にさらにリンカーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子をコードする核酸を含むベクター。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスタンパク質遺伝子を含むウイルス又はウイルスベクター。
- 請求項１１に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載のウイルス若しくはウイルスベクターを含む、キット。
- 請求項１１に記載の核酸を含む細胞。
- 前記細胞が、ｉＰＳ細胞又はその子孫細胞である、請求項１５に記載の細胞。
- 細胞を一過的にウイルスベクターで感染させる方法であって、
導入遺伝子を含む請求項１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、
感染した細胞を光照射下で培養する工程、及び
感染した細胞を光不照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。 - 導入遺伝子を発現させる方法であって、
導入遺伝子を含む請求項１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。 - ｉＰＳ細胞の製造方法であって、
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、l−Ｍｙｃ（またはｃ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる群から選ばれる少なくとも１の導入遺伝子を含む請求項１３に記載のウイルス又はウイルスベクターを体細胞に感染させる工程、及び
感染した細胞を光照射下で培養する工程、
を含む、前記方法。 - 感染した細胞を光不照射下で培養する工程をさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
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| "CRISPR-CAS9システムを光で制御、より自在なゲノム編集へ", 2015.06.23, RETRIVED ON 2018.09.11, RETRIVE, JPN6018039070, ISSN: 0004964967 * |
| "世界最速で切り替わる小さな光スイッチタンパク質", 2015.05.28, RETRIEVED ON 2018.09.11, RETRIEVED FRO, JPN6018039064, ISSN: 0004964965 * |
| DUPREX W. PAUL, ET AL., "MODULATING THE FUNCTION OF THE MEASLES VIRUS RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE B, JPN6018039071, ISSN: 0004964968 * |
| KAWANO FUUN, ET AL., "ENGINEERED PAIRS OF DISTINCT PHOTOSWITCHES FOR OPTOGENETIC CONTROL OF CELLULAR, JPN6018039063, ISSN: 0004964964 * |
| NIHONGAKI YUTA, ET AL., "PHOTOACTIVATABLE CRISPR-CAS9 FOR OPTOGENETIC GENOME EDITING", NAT. BIOTECHN, JPN6018039067, ISSN: 0004964966 * |
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