PT1930416E

PT1930416E - Nova partícula tipo vírus da hepatite c humano recombinante e método para a produção da mesma

Info

Publication number: PT1930416E
Application number: PT06810937T
Authority: PT
Inventors: Saburo Sone; Jun-Ichi Tanabe; Takaji Wakita; Koji Ishii; Ryosuke Suzuki; Tetsuro Suzuki; Tatsuo Mura
Original assignee: Japan As Represented By The Director General Of Nat Inst Of Infectious Diseases; Tokyo Metropolitan Inst Medical Science; Toray Industries
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2012-02-02
Also published as: CN101278042B; CA2624130A1; AU2006295716A1; AU2006295716B2; US8183044B2; JPWO2007037429A1; US20090221028A1; WO2007037429A1; PL1930416T3; EP1930416A1; EP1930416A4; JP5035985B2; CN101278042A; KR101416143B1; CA2624130C; KR20080056194A; EP1930416B1; ES2376354T3

Description

ΡΕ1930416 1

DESCRIÇÃO "NOVA PARTÍCULA TIPO VÍRUS DA HEPATITE C HUMANO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DA MESMA"

Campo técnico 0 presente invento está relacionado com uma partícula tipo vírus da hepatite C recombinante humano e um método para a produção da mesma.

Fundamento do invento

Os métodos para a introdução de um gene numa célula animal são essencialmente classificados em métodos físicoquímicos e métodos biológicos. Exemplos de métodos fisicoquímicos incluem métodos tais como coprecipitação com fosfato de cálcio, DEAE dextrano, lipofecção, microinjecção e electroporação. Exemplos de métodos biológicos incluem métodos que usam vectores virais.

Um método com vector virai é um método em que um gene é introduzido usando o mecanismo de invasão celular do vírus, ou seja a capacidade infecciosa.

Na superfície de uma partícula virai recombinante, preparada através da utilização de um vector virai, 2 ΡΕ1930416 existem proteínas estruturais derivadas do vírus (nucleo-cápside, proteína do invólucro, etc.), o qual possui um mecanismo para a introdução eficiente de um gene de forma que o vírus pode infectar uma célula através de um receptor na superfície celular. Assim, uma partícula virai recombi-nante preparada usando tal vector virai pode ser usada não só para introduzir um gene numa célula animal para gerar uma célula que expressa o gene de interesse, como também para efectuar terapia génica, construir um animal trans-génico, etc.

Os vectores virais são agrupados em vectores de retrovírus, vectores de vírus de DNA e vectores de vírus de RNA e caracterizados pelo comprimento do gene que se pode introduzir, se o gene é incorporado no genoma cromossómico numa célula, se o gene pode apenas ser introduzido numa célula em divisão ou se também pode ser introduzido numa célula que não está em divisão, tipos de células que podem ser infectadas, citotoxicidade, eficiência de introdução do gene, etc, os quais dependem do tipo do vírus original.

Os retrovírus possuem um RNA de polaridade positiva como genoma. Este RNA tem propriedades características de mRNA das células eucarióticas, especificamente, uma estrutura "cap" metilada no extremo 5' e uma cauda poliA de aproximadamente 200 nucleótidos no extremo 3'. Numa célula infectada, este RNA é convertido em DNA pela transcriptase reversa do vírus. Ainda, o DNA é incorporado no DNA genó-mico do hospedeiro pela acção de enzimas codificadas pelos 3 ΡΕ1930416 genes virais. 0 DNA incorporado é designado provirus. Uma sequência repetida (repetição terminal longa: LTR) ocorre em ambos os extremos do provirus e o RNA virai é sintetizado por um promotor que existe nesta sequência. As proteínas virais são traduzidas a partir do RNA sintetizado e um RNA do tamanho do genoma é incorporado na partícula virai, a qual é libertada da célula como uma partícula filha. A estrutura de RNA necessária para a produção de uma partícula virai inclui LTR em ambos os extremos, um local de ligação de uma sequência iniciadora entre elas, um sinal de encapsidação e um sinal de polipurina. Estes são factores cis essenciais. Por outro lado, os genes codificadores de proteínas virais não são essenciais como factores cis e a replicação e a produção de uma partícula normalmente ocorre quando as proteínas virais são proporcionadas dentro da célula infectada.

Assim, para produzir um retrovírus recombinante, prepara-se um vector do qual tenham sido removidos os genes codificados pelo retrovírus, tais como gag, pol e env, e no qual tenha sido inserido um gene de interesse a ser expresso (referido como vector retroviral) e este vector é introduzido numa célula na qual as proteínas virais são fornecidas (geralmente referida como célula de encapsidação) para preparar uma partícula de retrovírus possuindo um gene estranho (Documento 1 não patente).

Exemplos de retrovírus incluem o vírus da 4 ΡΕ1930416 leucemia murina, o vírus da leucemia felina, oncovirus tipo C dos babuínos, vírus da imunodeficiência humana, vírus da leucemia das células T do adulto, etc. Ainda, exemplos descritos como vectores de retrovírus recombinantes incluem os baseados em vírus da leucemia murina (Documento 1 não patente), os baseados em vírus da imunodeficiência humana (Documento 2 não patente), etc.

Um sistema para a produção de um retrovírus recombinante consiste em duas unidades componentes, especi-ficamente um vector de retrovírus portador de informação genética (um gene estranho de interesse) a ser introduzido e todos os factores necessários para encapsidação e incorporação do genoma virai em eis (DNA de retrovírus recombinante) e uma célula de encapsidação de retrovírus que fornece proteínas virais codificadas pelos genes gag, pol e env. A partícula de retrovírus recombinante não pode ser libertada por uma célula de encapsidação por si só em que um vector recombinante expressando os genes gag, pol e env foi introduzido.

Para produzir uma partícula de retrovírus recombinante, as proteínas Gag, Pol e Env necessitam de estar posicionadas em trans. Assim, através da introdução de um vector de retrovírus numa célula de encapsidação, na qual o vector recombinante expressando os genes gag, pol e env foi introduzido, pode ser produzido um retrovírus recombinante portador de informação genética contida no vector atrás referido. Subsequentemente, quando uma célula é infectada 5 ΡΕ1930416 com estes vírus, o vector retrovírus será incorporado no genoma cromossómico da célula de acordo com o ciclo replicativo natural dos retrovírus.

Assim, o método com vector retrovírus é um sistema construído com o objectivo de incorporação eficiente de um DNA específico no genoma cromossómico do hospedeiro. No entanto, uma vez que a localização do gene de interesse a ser inserido não pode ser prevista, não se pode excluir a possibilidade de um gene normal poder ser danificado pela inserção, de genes na vizinhança do local de inserção poderem ser activados e do gene estranho de interesse poder ser expresso em excesso ou sub-expresso. Para ultrapassar estes problemas, foi promovido o desenvolvimento de um sistema de expressão transitória usando um vector de vírus de DNA que pode ser utilizado como um gene extracromos-sómico.

Um vector de vírus de DNA é um vector derivado de um vírus de DNA. Os vírus de DNA transportam o DNA na sua partícula virai como informação genética. Este DNA é replicado por repetição de um processo de produção de uma cadeia complementar, usando o seu próprio DNA como matriz, pelas enzimas de replicação de DNA dependentes de DNA derivadas do hospedeiro, pelo menos como parte dos catalisadores. Exemplos de vectores de vírus de DNA que podem ser utilizados como um gene extracromossómico incluem os vectores de adenovírus. 6 ΡΕ1930416

Os adenovirus humanos possuem como genoma um DNA linear de cadeia dupla de 36 kb e as regiões incluídas neste genoma são genericamente divididas em genes precoces El, E2, E3 e E4 e genes tardios Ll, L2, L3, L4 e L5. Os genes precoces estão principalmente envolvidos na replicação virai e os genes tardios estão envolvidos na síntese de proteínas estruturais virais tais como as da cápside. Um vector de adenovirus usado para a introdução de um gene é preparado através da substituição da região El (dividida em EIA e E1B e todos os promotores de adenovirus são activados por EIA) , um gene precoce, com um gene estranho pretendido (gene de interesse) e replicado usando células 293, uma linha celular que pode fornecer EIA em trans (as células 293 expressam EIA). Um vector de adenovirus deficiente na região EIA não se pode replicar numa célula normal, a qual não expressa EIA. Uma vez que a região E3 não é essencial para a propagação do vírus, é muitas vezes removida para aumentar o tamanho da inserção do gene estranho. Uma vez que o adenovirus pode encapsidar um genoma até 105% do tamanho do genoma selvagem na sua cápside, um gene estranho até 8,1 kb pode ser inserido através da deleção das regiões El e E3 (Documento 3 não patente).

Um vector de adenovirus pode introduzir um gene numa célula que não esteja em crescimento ou numa célula em crescimento (Documento 4 não patente). Assim, este método é adequado para métodos in vivo de introdução de genes. Uma das desvantagens deste vector é o período geralmente curto 7 ΡΕ1930416 de expressão do gene (em unidades de semana) . Isto deve-se ao facto do genoma dos adenovírus existir apenas como região extracromossómica (epissoma) e não ser replicado ou amplificado. Uma segunda desvantagem é que os adenovírus normalmente usados actualmente provocam reacções inflamatórias não específicas e intensificam uma resposta imune celular contra o próprio vector. Assim, é difícil efectuar a administração contínua em terapia génica (Documento 5 não patente).

Encontram-se em desenvolvimento os vectores virais baseados em vírus de RNA. Os vírus de RNA replicam-se repetindo o processo de geração de uma cadeia complementar, usando o seu próprio RNA como matriz, pelas suas próprias enzimas de replicação de RNA dependente de RNA como catalisadores.

Os vírus de RNA são classificados em vírus de RNA de polaridade negativa e vírus de RNA de polaridade positiva. 0 genoma do vírus da gripe consiste em oito segmentos de RNA de polaridade negativa. Quando o vírus da gripe infecta uma célula, a transcrição dos genes é iniciada pelas proteínas existentes na partícula do vírus da gripe. Em primeiro lugar, a polimerase de RNA virai corta o mRNA da célula hospedeira em cerca de uma dúzia de nucleótidos a partir da estrutura cap 5' e utiliza os fragmentos como sequências iniciadoras para prolongar a cadeia de RNA (cadeia positiva). As proteínas virais são traduzidas a partir deste RNA de polaridade positiva. No processo de ΡΕ1930416 replicação, é sintetizado RNA completamente complementar do RNA virai e o RNA virai filho é amplificado usando esta sequência como matriz. Em seguida, o RNA virai é enca-psidado juntamente com proteínas virais para formar uma partícula virai

Assim, para produzir o vírus da gripe num sistema de cultura celular, as proteínas codificadas pelo vírus da gripe são expressas pelos promotores da RNA-polimerase II tais como, por exemplo, os promotores de CMV ou de CAG, o RNA virai é expresso pelos promotores da RNA-polimerase I, promotores sem uma estrutura cap e poliA, como seja, por exemplo, os promotores dos genes de rRNA, e o RNA virai é encapsidado juntamente com proteínas virais na célula para formar uma partícula virai (Documento 6 não patente). No entanto, a quantidade de vírus a ser produzida não é especificada e esta técnica não foi estabelecida como uma técnica que possa ser utilizada tendo como objectivo a produção num nível satisfatório.

Exemplos de vírus classificados como vírus de RNA de polaridade positiva incluem o vírus Sindbis e o vírus da hepatite C. 0 RNA genómico de um vírus de RNA de polaridade positiva também funciona como RNA mensageiro (daqui em diante referido como "mRNA") ao mesmo tempo e pode produzir proteínas necessárias a replicação e formação da partícula dependendo da função de tradução da célula hospedeira. Por outras palavras, o RNA genómico dos vírus de RNA de 9 ΡΕ1930416 polaridade positiva tem por si só capacidade de transmissão .

Os vectores virais derivados do vírus Sindbis possuem a estrutura básica do RNA genómico da qual a região dos genes estruturais envolvidos na estrutura do vírus foi eliminada e em que um grupo de genes para as proteínas necessárias para a transcrição e replicação virai é mantido e RNA em que um gene estranho pretendido é ligado a jusante do promotor da transcrição. Quando tal RNA ou cDNA transcrito para este RNA é introduzido numa célula, ocorre replicação autónoma do vector de RNA, incluindo o gene estranho, e transcrição do gene estranho situado a jusante do promotor da transcrição e um produto do gene estranho de interesse é expresso na célula. Ainda, pode ser preparado um complexo que tem capacidade infecciosa mas não possui capacidade de transmissão ao permitir-se que uma unidade de cDNA expressando genes estruturais (auxiliar) e uma unidade de cDNA expressando o vector de RNA atrás mencionado coexistam numa célula de encapsidação (Documento 7 não patente).

Uma vez que o vírus Sindbis utiliza como receptor o receptor da laminina de 67 kDa de elevada afinidade (LAMR) e infecta células nervosas com elevada eficiência, o vector do vírus Sindbis chamou a atenção como um sistema para introdução de um gene especificamente em células nervosas (Documento 8 não patente). No entanto, uma vez que se demonstrou que a infecção pelo vírus Sindbis induz 10 ΡΕ1930416 apoptose na célula hospedeira (Documento 9 não patente) existe a preocupação da toxicidade. 0 genoma do virus da hepatite C (HCV) é um RNA de cadeia simples e polaridade positiva com cerca de 9600 nucleótidos. Este RNA genómico compreende a região 5' não traduzida (também expressa como 5'NTR ou 5'UTR), a região traduzida incluindo uma região estrutural e uma região não estrutural e a região não traduzida 3' (também designada como 3'NTR ou 3'UTR) . As proteínas estruturais de HCV são codificadas na região estrutural e múltiplas proteínas não estruturais são codificadas na região não estrutural.

Tais proteínas estruturais (Nucleóide ou "Core", El, E2 e p7) e as proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) do HCV são traduzidas como uma poliproteína contínua da região traduzida, sujeitas a digestão limitada por proteases, libertadas e produzidas. De entre estas proteínas estruturais e não estruturais (i.e., proteínas virais do HCV), o Core é a proteína do nucleóide, El e E2 são as proteínas do invólucro. As proteínas não estruturais são proteínas virais envolvidas na replicação do próprio vírus. NS2 é conhecida por ter actividade de metaloprotease e NS3 é conhecida por ter uma actividade de protease serínica (1/3 no lado do extremo N) e actividade de helicase (2/3 do lado do extremo C). Ainda, também está descrito que NS4A é um cofactor da actividade de protease de NS3 e que NS5B tem actividade de RNA-polimerase dependente de RNA. ΡΕ1930416

Foi descrito que HCV é classificado em muitos tipos dependendo do genótipo ou do serotipo. De acordo com o método de análise filogenética de Simmonds et al., usando sequências de nucleótidos de estirpes de HCV, o qual é presentemente o método de classificação dos genótipos de HCV aceite, o HCV é classificado em seis tipos incluindo os genótipos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b e estes são ainda subdivididos em vários subtipos. Ainda, foram determinadas as sequências de nucleótidos dos genomas de tamanho completo de alguns genótipos do HCV (Documentos 10 a 13 não patente).

Uma partícula de HCV é capturada por polissacári-dos sulfatados na superfície celular, liga-se a um receptor de elevada afinidade através das proteínas do invólucro e é incorporada no endossoma por endocitose. Em seguida, a membrana do vírus e a membrana do endossoma fundem-se e a nucleocápside invade o citoplasma. A tradução do genoma virai nu é iniciada pelo local interno de entrada do ribossoma (IRES). A tradução e a clivagem da proteína ocorre na membrana do retículo endoplasmático. A proteína do Core, as proteínas EI e E2 e o RNA virai replicado no retículo endoplasmático são montados para formarem uma partícula virai. Em seguida a partícula virai gémula para o lúmen do retículo endoplasmático. Pensa-se que a partícula que sofreu gemulação seja libertada para fora da célula através do aparelho de Golgi. 12 ΡΕ1930416

Recentemente, a preparação de um replicão de RNA subgenómico do HCV como RNA derivado de HCV tendo uma capacidade de replicação autónoma (Documentos 1 e 2 de patentes e Documentos 14 a 16 não patentes) permitiu a análise do mecanismo de replicação do HCV usando células em cultura. Este replicão de RNA subgenómico do HCV foi obtido através da substituição das proteínas estruturais existentes a jusante do IRES de HCV na região 5' não traduzida do RNA genómico do HCV com o gene de resistência à neomicina e EMCV-IRES ligada a jusante. Demonstrou-se que, quando introduzido nas células de cancro hepático humano Huh7 e cultivado na presença de neomicina, este replicão de RNA replica-se autonomamente nas células Huh7. Ainda, foi demonstrado que alguns replicões de RNA subgenómico de HCV se replicam autonomamente, não só em Huh7 como também em células tais como células Hela de cancro cervical humano ou em células de cancro hepático humano HepG2 (Documento 3 de patente). Ainda, o Documento 2 de patente propõe a produção de partículas de vírus HCV usando o genoma integral de HCV quando um HCV recombinante é usado como vector para a terapia génica.

[Documento 1 de patente] Publicação de patente JP (Kokai) N° 2002-171978 A

[Documento 2 de patente] Publicação de patente JP (Kokai) N° 2001-17187 A [Documento 3 de patente] Pedido de Patente Internacional (W02004/1041198 13 ΡΕ1930416 [Documento 1 não patente] Mann, R. et al., Cell, 33 (1983) p 153-59 [Documento 2 não patente] Simada, T et al., J Clin Invest. 88 (1991) pl043-47 [Documento 3 não patente] Betta, A et al., Proc. Nati.

Acad. Sei. USA 91 (1994) p8802-06 [Documento 4 não patente] Burden, S & Yarden, Y., Neuron, 18 (1997) p847-55 [Documento 5 não patente] Crystal, R.G Science, 270, (1995) p404-10 [Documento 6 não patente] Neumann, G. & Kawaoka, Y., Viro- logy 287 (2001) p243-50 [Documento 7 não patente] Berglund, P et al., Biote-chnology, 11 (1993) p916-920 [Documento 8 não patente] Wang, K' et ai., J. Virol. 66 (1992) p4992-5001 [Documento 9 não patente] Levine, B. et al., Nature, 361 (1993) p739-42 [Documento 10 não patente] Simmonds, P. et ai., Hepatology, 10 (1994) pl321-24 [Documento 11 não patente] Choo, Q.L et al . Science, 244 (1989) p359 -362 [Documento 12 não patente] Okamoto, H et al., J. Gen. Virol., 73 (1992) p673-79 [Documento 13 não patente] Mori, S. et ai., Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334-42 [Documento 14 não patente] Blight et ai., Science, 290 (2000) pl972-74 14 ΡΕ1930416 [Documento 15 não patente] Friebe et al., J. Virol., 75 (2001) pl2047-57 [Documento 16 não patente] Kato, T. et al., Gastroen-terology, 125 (2003) pl808-17 WO 2004/024904 descreve métodos para a produção de pseudoparticulas virais contendo proteínas funcionais de e.g. vírus da hepatite C. O método permite a expressão de proteínas estruturais para formar partículas tipo vírus. As partículas tipo vírus resultantes são infecciosas mas defectivas para a replicação, uma vez que as proteínas não estruturais para o controlo da replicação do vírus não existem e não são expressas. W02005/080575 descreve um método para a replicação eficiente de um RNA contendo a sequência genómica de HCV de tamanho completo para a produção de partículas de vírus HCV contendo RNA replicão de HCV de tamanho completo ou RNA genómico de HCV de tamanho completo usando um sistema de cultura de células. Especificamente, um RNA replicão tendo capacidade de replicação autónoma e capacidade de produzir partículas virais foi construído usando RNA genómico de HCV. A célula que replicava o RNA replicão de HCV de tamanho completo conseguiu produzir partículas virais e as partículas virais produzidas continham o RNA do replicão de HCV de tamanho completo numa cápside constituída por proteínas do vírus HCV. J.R. Dubensky et ai. descrevem no J. Virol., Vol. 70, 1996, pp. 508-519 um sistema vector de expressão baseado no genoma integral do vírus Sindbis envolvendo a conversão de um replicão de RNA num sistema de expressão baseado em DNA. 15 ΡΕ1930416

Os autores descrevem que é possível produzir partículas de vírus Sindbis em células cotransfectadas com o replicão vector e DNAs do plasmídeo DH. T. Pietschmann et al. descrevem no J. Virology, Vol. 76, 2002, pp. 4008-4021 a preparação de replicões subgenómicos do vírus da hepatite C para a expressão eficiente de proteínas estruturais do HCV. O replicão de RNA derivou de um consenso de isolado do genótipo lb estirpe conl. Os autores de D7 encontraram que apesar da libertação de RNA de HCV resistente às nucleases para o sobrenadante de cultura celular, não se encontrou evidência de montagem de partículas virais.

Descrição do invento O HCV não foi de facto desenvolvido como vector virai como os retrovírus, adenovírus, vírus da gripe e vírus Sindbis. Se tal vector de HCV tivesse sido desenvolvido, podiam ser introduzidos genes especificamente nas células de tecidos hepáticos ou similares. Neste caso, para assegurar um maior grau de segurança, é desejável que o vector HCV infecte células mas que não possua uma propriedade transmissora.

Um objectivo do presente invento é desenvolver uma partícula recombinante tipo vírus da hepatite C (HCV) utilizável como vector como atrás descrito. Ainda, um outro objectivo do presente invento é proporcionar um método para a produção eficiente desta partícula tipo HCV. 16 ΡΕ1930416

Os inventores do presente invento tentaram que células em cultura produzissem partículas recombinantes tipo HCV que parecessem ser industrialmente úteis em termos de segurança, conveniente e aplicabilidade. Em primeiro lugar, o genoma do HCV foi dividido por um vector que expressa as proteínas estruturais do HCV e por um vector que inclui os genes envolvidos na replicação. Um gene estranho pretendido e/ou IRES (local interno de entrada do ribossoma) podem ser incluídos neste último vector.

Os inventores do presente invento construíram um vector, obtido por clonagem de DNA incluindo um gene estranho, a sequência IRES e os genes envolvidos na replicação de HCV a jusante do promotor de T7 e sintetizaram in vitro um replicão de HCV subgenómico incluindo a sequência do gene estranho usando polimerase de T7. Este replicão foi introduzido numa célula animal em cultura para se obter uma estirpe celular em que o replicão de RNA subgenómico do HCV foi replicado.

Subsequentemente, encontraram um sistema que pode introduzir um vector que expressa níveis muito elevados de proteínas estruturais do HCV na estirpe celular com elevada eficiência e introduziram-no nas células portadoras de replicões de RNA subgenómico do HCV de vários genótipos. Como resultado, ao expressarem as proteínas estruturais do HCV nas células, encontraram com êxito combinações com as quais o RNA subgenómico do HCV pode ser encapsidado numa partícula virai. 17 ΡΕ1930416

Ainda, os inventores do presente invento confirmaram que uma partícula recombinante tipo HCV produzida pelo método do presente invento infecta células e que uma célula infectada pelo HCV recombinante não possui a característica de transmissão não produzindo partículas virais filhas. Devido a tais características, a partícula de HCV recombinante do presente invento pode ser usada para a introdução de um gene estranho ou para a terapia génica.

Especificamente, o presente invento é carac-terizado pelas características que se seguem resumidamente.

De acordo com o presente invento é proporcionado um método para a produção de uma partícula de vírus da hepatite C compreendendo os passos de introdução: (i) numa célula portadora do um replicão de RNA subgenómico não incluindo genes codificadores das proteínas estruturais do vírus da hepatite C e compreendendo uma sequência nucleotídica compreendendo a região 5' não traduzida, a sequência nucleotídica codificadora das proteínas não estruturais NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B e a região 3' não traduzida do RNA genómico derivado de um estirpe do vírus da hepatite C do genótipo lb que é uma estirpe conl ou uma estirpe derivada desta, (ii) um vector de vírus da vacina ou um vector portador de um promotor EF-Ια expressando as proteínas do Core, El, E2 e p7 derivadas de uma estirpe do vírus da 18 ΡΕ1930416 hepatite C seleccionada entre os genótipos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b que é diferente da estirpe do vírus da hepatite C de (i) , cultura da célula e recuperação da partícula do vírus da hepatite C recombinante produzida.

Como atrás especificado, a estirpe de vírus da hepatite C de (i) atrás é uma estirpe de vírus do genótipo lb.

Numa outra realização, a estirpe do vírus da hepatite C de (ii) é uma estirpe de vírus do genótipo 2a.

Numa realização preferida, a estirpe de vírus atrás referida do genótipo 2a é a estirpe JFHI ou uma estirpe derivada da mesma.

Ainda numa outra realização, o replicão de RNA atrás mencionado pode ainda incluir pelo menos uma sequência IRES.

Ainda numa outra realização, o replicão de RNA atrás mencionado pode ainda incluir pelo menos um gene estranho.

Numa realização preferida, a IRES e o gene estranho atrás mencionados podem ser colocados entre a região não traduzida 5' e a NS3 atrás referidas. 19 ΡΕ1930416

Ainda numa outra realização, a células atrás referida é uma célula animal.

Numa realização preferida, a célula animal atrás mencionada é uma célula de mamífero.

Exemplos da célula de mamífero atrás incluem Huh7, HepG2 e linhas celulares estabelecidas derivadas destas células.

Ainda noutra realização, o vector de expressão atrás mencionado é um vector virai.

Numa realização preferida, o vector virai atrás mencionado é um vector de vírus da vacina.

As partículas virais podem ser replicadas permitindo que seja produzida a partícula de vírus da hepatite C recombinante e recuperada pelo método atrás descrito do presente invento para infectar células susceptíveis ao HCV tais como células hepáticas ou células linfóides. Tais processos estão incluídos no âmbito do presente invento.

De acordo com um segundo aspecto, o presente invento também proporciona uma partícula de vírus da hepatite C recombinante produzida pelo método atrás descrito do presente invento e caracterizada por possuir capacidade infecciosa mas não capacidade de transmissão. 20 ΡΕ1930416

Numa sua realização, um gene estranho é introduzido na partícula de vírus da hepatite C recombinante atrás referida numa forma expressável.

Numa outra realização, a partícula de vírus da hepatite C recombinante atrás mencionada é um vector.

No presente invento, um dos métodos preferidos para a produção de uma partícula de vírus da hepatite C recombinante é um método de produção de uma partícula de vírus da hepatite C recombinante em que o referido método compreende os passos de introdução (i) numa célula na qual um replicão de RNA subgenómico, como definido na reivindicação 1, com a região não traduzida 5', a sequência nucleotídica codificadora das proteínas não estruturais NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B e a região 3' não traduzida do RNA genómico derivado da estirpe conl do vírus da hepatite C ou um replicão de RNA contendo ainda pelo menos um gene estranho e/ou pelo menos uma sequência IRES para além da sequência nucleotídica, se replica autonomamente; (ii) um vector de vírus da vacina expressando as proteínas do Core, El, E2 e p7 derivadas da estirpe JFH1 do vírus da hepatite C, cultura da célula e recuperação da partícula do virus da hepatite C recombinante produzida.

Ainda, no presente invento, uma partícula do vírus da hepatite C recombinante preferida é produzida pelo método preferido atrás descrito. 21 ΡΕ1930416 0 método do invento em que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo lb como definido na atrás mencionada (i) é a estirpe conl.

Ainda, é também preferido neste método que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo la como definido em (ii) atrás mencionado seja a estirpe H77c, 1, H ou HC-Jl. É igualmente preferido neste método que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo lb como definido na atrás mencionada (ii) seja a estirpe Jl, conl, TH, J, JT e BK. É igualmente preferido neste método que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo 2a como definido na atrás mencionada (ii) seja a estirpe JFH1, HC-J6, JCH1 ou J6CF. É igualmente preferido neste método que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo 3a como definido na atrás mencionada (ii) seja a estirpe NZL1, K3a/650, 452 ou E-bl. É igualmente preferido neste método que a estirpe do vírus da hepatite C do genótipo 3b como definido na atrás mencionada (ii) seja a estirpe Tr. 22 ΡΕ1930416

Ainda, no método do invento o vector da atrás mencionada (ii) é um vector de virus da vacina ou um vector portador do promotor de EF-la.

Ainda, é preferível neste método que o replicão atrás mencionado ainda compreenda pelo menos uma sequência de local interno de entrada do ribossoma (IRES) e/ou pelo menos um gene estranho. É preferido que a sequência IRES e/ou o gene estranho esteja posicionado entre a região não traduzida 5' atrás mencionada e a sequência codificadora da proteína NS3 atrás referida.

Neste método, a célula atrás mencionada é, de preferência, uma célula animal. Exemplos preferidos da célula animal incluem a célula Huh7, a célula HepG2 e as linhas celulares derivadas destas células.

Uma partícula tipo vírus da hepatite C recombinante produzida pelo método atrás descrito possui uma propriedade infecciosa mas não a capacidade de transmissão.

Uma partícula tipo HCV recombinante infecciosa em que um RNA subgenómico de HCV incluindo um gene estranho pretendido é encapsidado e que não possui uma propriedade transmissora e um método de produção da mesma podem ser proporcionados pelo presente invento. Uma vez que tal 23 ΡΕ1930416 partícula tipo HCV recombinante infecciosa possui a vantagem de não ter uma propriedade transmissora, pode ser usada para a introdução de genes (e.g., terapia génica), em particular nas células ou tecidos hepáticos ou linfóides ou pode ser usada como vector virai para a produção de um animal transgénico ou de uma vacina atenuada.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 é uma representação esquemática de uma realização do presente invento, o qual mostra processos de produção de uma partícula tipo HCV recombinante. a): Repli-cões de RNA subgenómico de HCV são replicados na célula Huh7 em que é introduzido o replicão de RNA subgenómico de HCV. Não é produzida uma partícula virai, b): Na célula de a) na qual é introduzido um vector expressando proteínas estruturais de HCV, partículas tipo vírus em que o replicão de RNA subgenómico de HCV é encapsidado são produzidas usando as proteínas estruturais de HCV expressas, c): Numa célula infectada pela partícula tipo vírus produzida em b), os replicões de RNA subgenómico de HCV são replicados, mas não são produzidas partículas virais filhas.

Figura 2 mostra desenhos estruturais de RNA genómico de HCV e cDNA do RNA sugenómico de HCV. 0 diagrama superior e o diagrama do meio mostram, respectivamente, pJFHl e pSGR-JFHl, preparados a partir de HCV do genótipo 2a. 0 diagrama inferior mostra I389/NS3-3'/wt preparado a partir do genótipo lb do HCV. Os símbolos na figura - 24 - ΡΕ1930416 significam o seguinte: T7, promotor do RNA de T7; 5'UTR, região não traduzida 5'; Core, proteína do nucleóide; EI e E2, proteínas do invólucro; p7, proteína p7; NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B, proteínas não estruturais; 3'UTR, região 3' não traduzida; Agel, Pmel e Xbal, locais de clivagem das enzimas de restrição Agel, Pmel e Xbal; EMCV IRES, local interno de entrada do ribossoma do vírus da encefalomiocardite.

Figura 3 mostra mapas de vectores para a expressão de proteínas estruturais de HCV do presente invento. Especificamente, o diagrama superior mostra pGAGC-p7JFHl, um clone de plasmídeo preparado pela inserção dos genes da região estrutural de JFH a jusante do promotor CAG. 0 diagrama inferior mostra a estrutura de pEF4C-p7JFHl, um clone de plasmídeo preparado pela inserção dos genes da região estrutural de JFH a jusante da sequência do promotor do factor de elongação la. Os símbolos na figura têm o seguinte significado: CAG, promotor CAG; pA, sequência poliA adicional; EcoRI, local de clivagem pela enzima de restrição EcoRI; EF-Ια, promotor do factor de elongação la, BGH pA, sequência poliA adicional do factor de crescimento bovino.

Figura 4 mostra mapas dos genes estruturais do HCV inseridos nos vectores pDIsHJFHst, pDIsH77st, pDIsJlst, pDIsJ1(c)/JFH(El-p7)st e pDIsJFH(c)/J1(El-p7)st. As diferenças nas estirpes de vírus a partir das quais derivam os vectores estão representadas pelas áreas sombreadas na grelha. 25 ΡΕ1930416

Figura 5 mostra gráficos mostrando a quantidade de RNA do replicão de HCV (A) e a quantidade da proteína do Core do HCV (B) em cada fracção, obtidos pela introdução de pEF4C-p7JFHl numa estirpe celular IH4.1 portadora do replicão e fraccionamento do sobrenadante da cultura celular (sup) num gradiente de densidade de sucrose. □ , Experiência 1; ♦ , Experiência 2.

Figura 6 mostra os gráficos apresentando a quantidade da proteína do Core do HCV (eixo vertical) em cada fracção (eixo horizontal) obtidos através da infecção de uma estirpe celular 5-15 portador de replicão com DIsJFHst, um vector de vírus da vacina e fraccionamento do sobrenadante da cultura celular (sup) num gradiente de densidade de sucrose. 0 círculo fechado representa a proteína do Core do HCV e o quadrado fechado representa os resultados usando um sobrenadante de cultura tratado com NP40. A experiência I mostra os resultados da cultura não tratada (Figura 6A) e a Experiência 2 mostra os resultados de sobrenadantes de cultura não tratados e tratados com NP40 (Figura 6B).

Melhor forma de executar o invento 1. Definição

Os termos usados na presente especificação possuem os significados que se seguem. 26 ΡΕ1930416 0 termo "replicão de RNA" refere-se a RNA que é preparado através da modificação do genoma virai do HCV e possui uma capacidade de replicação autónoma. 0 termo "capacidade de replicação autónoma" significa uma capacidade de reproduzir autonomamente cópias de um ácido nucleico (i.e., replicação) numa célula como o DNA de plasmideo. 0 termo "capacidade infecciosa" ou "propriedade infecciosa" refere-se à capacidade de introduzir um ácido nucleico e similares dentro de um vírus numa célula devido a capacidades de ligação à célula, fusão com uma membrana celular e similares. 0 termo "vírus da hepatite C recombinante" significa um vírus obtido através da alteração das propriedades do vírus HCV original qualitativamente/quantitati-vamente usando técnicas de engenharia genética. Exemplos incluem um vírus capaz de expressar um gene estranho para além dos genes expressos pelo vírus original, um vírus deficiente numa propriedade de transmissão ou numa capacidade de replicação relativamente ao genoma virai do vírus original, etc. Em sentido lato, são incluídos os vírus obtidos por recombinação de genes entre diferentes tipos ou subtipos do mesmo vírus. 0 termo "propriedade de transmissão" ou "capa- 27 ΡΕ1930416 cidade de transmissão" significa a capacidade de formar uma partícula infecciosa ou um complexo semelhante e de a transmitir a uma outra célula, após introdução de um ácido nucleico numa célula através de infecção ou de uma técnica artificial, e replicação do ácido nucleico existente na célula. "Core" é uma proteína estrutural do nucleóide do HCV. " E1" e "E2" são ambas proteínas estruturais do invólucro. "NS" refere-se a uma proteína não estrutural do HCV, a qual está envolvida na replicação do próprio vírus. "NS2" possui actividade de metaloprotease. "NS3" possui uma actividade de protease serínica (1/3 no lado do extremo N) e uma actividade de helicase (2/3 no lado do extremo C) . "NS4A" é um cofactor para a actividade de protease de NS3. A função de "NS4B" não é clara. "NS5A" pensa-se que possua uma actividade de regulação da transferência de informação da célula hospedeira. "NS5B" possui uma actividade de polimerase de RNA dependente de RNA. 0 termo "sequência IRES" significa um local interno de entrada do ribossoma, ao qual se pode ligar o ribossoma dentro do RNA para iniciar a tradução. A expressão "numa forma expressável" significa um 28 ΡΕ1930416 estado em que um gene de interesse pode ser transcrito e traduzido por sequências reguladoras tais como um promotor e um estimulador. 2. Célula portadora do replicão de RNA subgenó-

mico do HCV

0 genoma do HCV selvagem consiste num RNA com cerca de 9, 6 kb codificador de uma proteína precursora de aproximadamente 3000 aminoácidos. O genoma do HCV é constituído pela região 5' não traduzida (5'UTR), Core, El, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B e a região 3' não traduzida (3'UTR) nesta ordem. O replicão de RNA subgenómico do HCV usado no método do presente invento inclui RNA modificado constituído pela região 5' não traduzida, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B e região 3' não traduzida nesta ordem. Este replicão de RNA foi introduzido numa célula específica, numa forma expressável, de forma a poder ser replicado pela acção de factores reguladores tais como um promotor. O replicão de RNA pode ainda compreender um gene estranho e/ou uma sequência IRES. O gene estranho e a sequência IRES podem ser preferencialmente posicionados entre a região não traduzida 5' e a sequência codificadora de NS3 na ordem de gene estranho e sequência IRES.

Exemplos preferidos da sequência IRES incluem, mas não estão limitados a IRES de EMCV (local interno de 29 ΡΕ1930416 entrada dos ribossomas do vírus da encefalomiocardite) . IRES de EMDV, IRES de HCV, etc. IRES de EMCV e IRES de HCV são os mais preferidos e a IRES de EMCV é a mais preferida.

Exemplos do gene estranho usado incluem genes que apresentam resistência a drogas (ou seja, estes genes permitem a selecção das células; as células possuidoras deste gene terão resistência à droga) como seja, por exemplo, um gene codificador de neomicina, higromicina, puromicina, zeocina, blasticidina, cinase de timidina, canamicina ou similares; genes repórter (ou seja estes genes são genes marcadores que codificam um produto usado como indicador da expressão do gene) tais como, por exemplo, genes codificadores de uma enzima que catalisa uma reacção luminescente ou uma reacção corada de um gene repórter como seja, por exemplo, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP) , β-galactosidase e similares; ainda, genes alvo de terapia génica e ácidos nucleicos terapêuticos tais como, por exemplo, genes codificadores de várias proteínas úteis no tratamento de doenças que requerem tratamento em mamíferos incluindo seres humanos tais como, por exemplo, enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticorpos, ácidos nucleicos terapêuticos tais como RNA e siRNA anti-sentido, etc.

Exemplos específicos de replicão de RNA subgenómico de HCV incluem pSGR-JFHl (diagrama do meio na Figura 2), I389/NS3-3'/wt (diagrama inferior na Figura 2) etc. Tais replicões de RNA subgenómico do HCV podem ser 30 ΡΕ1930416 preparados pelos métodos descritos, por exemplo, em Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808-1817, uma publicação dos inventores do presente invento, Publicação de Patente Internacional W02004/104198 (Documento 3 de Patente), etc.

No método de análise filogenética usando sequências nucleotidicas de uma estirpe de HCV, o HCV é classificado em seis tipos: genótipos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b. Cada um destes tipos é ainda classificado em vários subtipos. As sequências nucleotidicas integrais dos genomas de HCV de alguns genótipos foram determinadas (Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) pl321-1324; Choo, Q.L et al.,

Science, 244 (1989) p359-362; Okamoto, H. et al., J. Gen. Virol., 73 ( ; 1992) p673-679; Mori, S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun .. 183 (1992) p334-342; e Publicação de

Patente Internacional W02004/104198).

Exemplos específicos das estirpes de HCV do genótipo la incluem a estirpe H77c (sequência de consenso da estirpe H77: número de acesso GenBank AF011751, a estirpe 1 (número de acesso GenBank M62321), estirpe H (número de acesso GenBank M67463), a estirpe HC-J1 (número de acesso GenBank D10749), etc. Exemplos específicos das estirpes de HCV do genótipo lb incluem a estirpe J1 (número de acesso GenBank D89815), a estirpe conl (número de acesso GenBank AJ238799, pode ser referida como estirpe con-1), a estirpe TH (Wakita, T. et al., et al., J. Biol. Chem., 269 (1994) pl4205-14210), a estirpe J (número de acesso GenBank 31 ΡΕ1930416 D90208), a estirpe JT (número de acesso GenBank D01171), a estirpe BK (número de acesso GenBank M58335), etc. Exemplos específicos das estirpes de HCV do genótipo 2a incluem a estirpe JFH1 (número de acesso GenBank AB047639, pode ser referida como a estirpe JFH-1), a estirpe HC-J6 (número de acesso GenBank D00944), a estirpe JCH1 (número de acesso GenBank AB047640), a estirpe J6CF (número de acesso GenBank AF177036), etc. Exemplos específicos das estirpes de HCV do genótipo 2b incluem a estirpe HC-J8 (número de acesso GenBank D01221), etc. Exemplos específicos de estirpes de HCV do genótipo 3a incluem a estirpe NZL1 (número de acesso GenBank D17763), a estirpe K3a/650 (número de acesso GenBank D28917), a estirpe 452 (número de acesso GenBank DQ437509), a estirpe E-bl (Chan, S. et al., J. Gen. Virol., 73 (1992) pll31-1141), etc. Exemplos específicos das estirpes de HCV do genótipo 3b incluem a estirpe Tr (Chayama, K. et al., J. Gen. Virol., 75 (1994) p3623-3629), etc. Ainda, uma lista de números de acesso do GenBank para outras estirpes foi já descrita (Tokita, T. et al., J. Gen. Virol. 79 (1998) pl847-1857; Cristina J. & Colina R. Virology Journal, 3 (2006) pl-8).

Os elementos constituintes do replicão de RNA subgenómico do HCV usados no presente invento (especifica-mente, a região não traduzida 5', NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B e a região não traduzida 3') derivam de uma estirpe conl do genótipo lb ou seus subtipos, de forma que o replicão de RNA subgenómico do HCV pode ser construído de forma a poder ser replicado numa célula. Deve-se notar que 32 ΡΕ1930416 o presente invento é um método para a produção de uma partícula tipo vírus da hepatite C recombinante que possui uma propriedade infecciosa mas não uma propriedade de transmissão e o replicão de RNA do presente invento não inclui genes codificadores das proteínas estruturais do HCV (Core, El, E2 e p7) para eliminar a propriedade de transmissão da partícula tipo vírus produzida.

Os elementos atrás referidos podem derivar da mesma estirpe de HCV ou podem ser uma forma combinada ou seja quimera) derivada de duas ou mais estirpes diferentes do HCV. As estirpes de HCV preferidas para (ii) atrás incluem pelo menos uma estirpe seleccionada do grupo consistindo em estirpes de HCV dos genótipos lb e 2a e a estirpe conl, uma estirpe de HCV do genótipo lb e a estirpe JFHI, uma estirpe de HCV do genótipo 2a, são as mais preferidas. A estirpe de HCV no presente invento pode ser uma estirpe isolada resultante de mutação natural ou artificial da estirpe conl ou da estirpe JFHI como estirpe parental cujo genótipo é alterado relativamente ao da estirpe parental (derivado) . Nesta situação, a caracterís-tica fenotípica pode ser a mesma ou diferente da estirpe parental, mas é preferida uma estirpe tendo a mesma característica.

Exemplos do replicão de RNA subgenómico do HCV incluem um replicão de RNA subgenómico do HCV tendo a região não traduzida 5', a sequência codificadora de NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B e a região não traduzida 3' da 33 ΡΕ1930416

estirpe conl do HCV (genótipo lb, número de acesso GenBank AJ238799, Lohmann, V. et al. , Science 285 (1999) pllO-113). Ainda, um gene estranho pretendido e uma sequência IRES podem ser incluídos entre a região não traduzida 5' e a sequência codificadora da proteína NS3 destes replicões de RNA subgenómico do HCV. A região não traduzida 5'. A sequência das proteínas estruturais (Core, El, E2 e p7), proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B), região não traduzida 3' e outros locais no RNA genómico do HCV podem ser definidos usando a sequência de cDNA genómico intacto, por exemplo, correspondendo ao RNA genómico da estirpe JFH1, uma estirpe de HCV do genótipo 2a (Publicação de Patente JP (Kokai) N° 2002-171978 A) (número de acesso do GenBank AB047639, Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808-1817, SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos codificada está também apresentada em SEQ ID NO:11) como referência.

Por exemplo, o cDNA genómico integral derivado da estirpe JFH1, a região não traduzida 5' que pode ser usada como um elemento do replicão de RNA subgenómico do HCV do presente invento está representada pelas posições de nucleótidos 1 a 340 da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:10, a região codificadora da proteína do Core até à proteína p7 (Core, El, E2 e p7) está representada pelas posições nucleotídicas 341 a 2779 e a região codificadora desde a proteína NS3 até à região não traduzida 3' (NS3, 34 ΡΕ1930416 NS4A, NS4B, NS5A, NS5B e 3'UTR) está representada pelos números de nucleótidos 3431 a 9678. As regiões dentro do cDNA genómico derivadas de outras estirpes de HCV podem ser identificadas por comparação com as sequências destas regiões derivadas da estirpe JFH1.

Um replicão de RNA subgenómico do HCV pode ser sintetizado com uma RNA-polimerase dependente de DNA usando um vector em que DNA complementar do RNA subgenómico do HCV é clonado a jusante de um promotor da transcrição de RNA a partir da sequência de DNA. Exemplos do promotor da transcrição de RNA a partir de uma sequência de DNA incluem T7, T3, SP6, etc e o promotor T7 é preferido. Um RNA subgenómico do HCV pode ser sintetizado pela polimerase de T7. Uma célula em que um replicão de RNA subgenómico do HCV se replica autonomamente pode ser preparada através da introdução do RNA subgenómico de HCV assim sintetizado numa célula que permite a propagação do HCV.

Exemplos preferidos da célula incluem células animais tais como, por exemplo, células de vertebrado incluindo células de peixe, répteis, anfíbios, aves e mamíferos, e as células de mamífero são as mais preferidas. Outros exemplos da célula incluem células normais derivadas do fígado, cérvice uterino e rins fetais, células tumorais, linhas celulares estabelecidas das mesmas, etc. Exemplos incluem células tais como Huh7, HepG2, IMY-N9, HeLa e HEK293 (Date, T. et al., J. Biol. Chem., 279 (2004) p22371-22376, Ito, T. et al., Hepatology 34 (2001) p566-572), e 35 ΡΕ1930416

Huh7, HepG2, e os clones derivados destas células são preferidos.

Exemplos de outros métodos de replicação do RNA subgenómico do HCV em células em cultura incluem sistemas que utilizam cDNA de HCV sem utilização de um replicão de RNA. Quando o cDNA de HCV é expresso usando um promotor do tipo RNA-polimerase II, a estrutura cap é adicionada ao extremo 5' do RNA transcrito e a cadeia poliA é adicionada ao extremo 3'. Assim, o RNA transcrito é usado como matriz para a síntese proteica no ribossoma e a replicação do RNA genómico do HCV não ocorre. Para resolver este problema, Heller et al., prepararam um vector de DNA através da ligação de uma sequência de ribozima aos extremos 5' e 3' do genoma do HCV e permitindo que a ribozima corte o DNA transcrito pela RNA-polimerase II numa célula, de forma que o RNA de HCV, a que cap ou poliA não são adicionados, possa ser sintetizado na célula (Heller T et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 102 (2005) p2579-2583). Uma célula em que um replicão de RNA subgenómico do HCV se replica pode ser obtida através da introdução deste vector numa célula.

De acordo com um outro método, uma célula em que um replicão de RNA subgenómico do HCV se replica pode ser obtida através da clonagem de DNA complementar do RNA subgenómico do HCV num vector tendo um sistema promotor/ terminador da RNA-polimerase I e introdução do vector numa célula que permite a propagação do HCV. Mais especi-ficamente, pode ser usado pHH21 (Neumann G. et al., Proc. 36 ΡΕ1930416

Natl. Acad. Sei. USA, 96 (1999) p9345-9350) . pHH21 é um vector compreendendo o promotor da RNA-polimerase I humana como promotor e o terminador da RNA-polimerase I de murganho como terminador. Quando a sequência de reconhecimento da enzima de restrição BsmBI é adicionada aos extremos 5' e 3' do cDNA complementar de um replicão de RNA subgenómico do HCV por PCR, o cDNA é digerido com BsmBI, o genoma do HCV é inserido no local BsmBI de pHH21 e o genoma do HCV pode ser ligado sem sequências nucleotidicas extra entre o promotor/terminador e o genoma do HCV.

Um replicão de RNA subgenómico do HCV ou um vector como seja um vector expressando o replicão de RNA subgenómico do HCV pode ser introduzido numa célula usando quaisquer técnicas conhecidas dos familiarizados com a área. Exemplos de tais técnicas de introdução incluem electroporação, pistolas de partículas, lipofecção, método do fosfato de cálcio, microinjecção, método do DEAE-dextrano, etc.

No presente invento, uma célula em que o replicão subgenómico do HCV do presente invento se replica pode ser preparada de acordo com as descrições atrás. Uma vez que tal replicão de RNA se replica autonomamente e de forma contínua na célula, uma determinada quantidade do mesmo é mantida mesmo numa célula em que haja degradação do RNA. Assim, o replicão de RNA pode ser mantido numa célula em que o replicão de RNA subgenómico do HCV do presente invento, um vector que expressa o replicão do RNA 37 ΡΕ1930416 subgenómico do HCV é introduzido como atrás descrito. No presente invento, "célula portadora de um replicão de RNA" significa que o replicão de RNA existe na célula não transitoriamente mas continuamente numa quantidade significativa devido à sua capacidade de replicação autónoma.

De acordo com o método do presente invento, uma partícula tipo vírus na qual um replicão de RNA subgenómico do HCV é encapsidado pode ser produzida através da introdução de um vector que expressa as proteínas estruturais do HCV descritas abaixo numa célula portadora do replicão de RNA subgenómico do HCV do presente invento.

3. Construção do vector de expressão das proteínas estruturais do HCV

No método do presente invento, é preferido expressar os genes das proteínas estruturais do HCV numa célula portadora de um replicão de RNA subgenómico do HCV para proporcionar a proteína estrutural do HCV.

As proteínas estruturais do HCV consistem em Core, El, E2 e p7. Os genes codificadores destas proteínas para fornecer a proteína estrutural do HCV não estão limitados pelos genótipos do HCV e cada um dos genes pode derivar da mesma estirpe do HCV ou pode existir numa forma combinada (quimera) derivada de duas ou mais estirpes diferentes do HCV. É suficiente que os genes das proteínas estruturais do HCV estejam definidos de acordo com a 38 ΡΕ1930416 reivindicação 1. As estirpes de HCV preferidas para (ii) atrás são pelo menos uma estirpe virai seleccionada do grupo consistindo em la, 2a, 3a e 3b e as estirpes mais preferidas de HCV são pelo menos uma estirpe virai seleccionada do grupo consistindo nas estirpes de HCV do genótipo lb e 2a. As estirpes virais mais preferidas incluem as de pelo menos um tipo seleccionado do grupo consistindo nas estirpes do genótipo la tais como H77c, 1, H e HC-J1, estirpes do genótipo lb como seja Jl, conl, TH, J, JT e BK e estirpes do genótipo 2a tais como JFH1, HC-J6, JCH1 e J6CF. A estirpe H77 do genótipo la, a estirpe Jl do genótipo lb e a estirpe JFH1 do genótipo 2a são mais preferidas (número de acesso GenBank AB047639, Kato, T. et al, Gastroenterology, 125 (2003) pl808-1817). O método para a expressão destas proteínas pode ser qualquer método desde que seja um método pelo qual possam ser expressas numa célula, de preferência uma célula animal, mais de preferência uma célula de mamífero. É preferido um método que usa um vector de expressão no qual os genes atrás referidos são inseridos.

No método preferido do presente invento, um vector que expressa as proteínas estruturais do HCV (de preferência, um vector de expressão incluindo os genes das proteínas estruturais do HCV numa forma expressável sob o controlo de um promotor) foi introduzido numa célula portadora do replicão do RNA subgenómico do HCV descrito na 39 ΡΕ1930416 secção 2 atrás e expresso para proporcionar as proteínas estruturais do HCV.

Exemplos do vector de expressão incluem CDM8, pEFl/Myc-Hisl,2,3, pEF4/Myc-Hisl,2,3, pcDNA3.1, pREP4, pCEP (todos da Invitrogen Corporation) , pCl-neo (Promega Corporation), etc. pcDNA5/T0 (Invitrogen Corporation) que inclui um promotor cuja expressão pode ser regulada por tetraciclina, pode igualmente ser usado. 0 promotor não está limitado desde que possa expressar os genes numa célula animal e exemplos dos mesmos incluem o promotor precoce imediato (IE) de citomegalovírus, o promotor precoce ou tardio de SV40, o promotor de metalotioneina, o promotor de retrovírus, o promotor de choque térmico, o promotor SRa, o promotor do factor de elongação Ια, o promotor da albumina, etc.

Ainda, os exemplos dos vectores disponíveis incluem vectores virais. Os vectores virais não estão limitados desde que possam infectar uma célula animal e expressem um gene estranho pretendido e exemplos preferidos dos mesmos incluem vectores de retrovírus, vectores de adenovírus, vectores do vírus Sindbis e vectores de vírus da vacina. Em particular, são preferidos os vectores do vírus da vacina uma vez que os vectores de vírus da vacina podem expressar uma grande quantidade do produto do gene (Elroy-Stein, 0., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86 (1989) p6126-6130). 40 ΡΕ1930416 É preferível que o vector que expressa a proteína estrutural do HCV usado no método do presente invento inclua o gene da proteína Core, o gene da proteína El, o gene da proteína E2 e o gene da proteína p7 como os genes das proteínas estruturais do HCV numa forma em que possam ser expressos na célula hospedeira. Exemplos de tal vector que expressa a proteína estrutural do HCV do presente invento incluem o gene da proteína Core, o gene da proteína El, o gene da proteína E2 e o gene da proteína p7 sob o controlo de um promotor que pode expressar os genes inseridos. No presente invento, o vector portador do promotor do factor de elongação la, no qual o gene da proteína do Core, o gene da proteína El, o gene da proteína E2 e o gene da proteína p7 foram inseridos sob o controlo do promotor do factor de elongação la (EF-la), pode ser usado como um vector que expressa a proteína estrutural do HCV. Aqui, o "vector de expressão portador do promotor do factor de elongação la" significa um vector que inclui a sequência do promotor do gene do factor de elongação la (promotor EF-la: Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18 (1990) p5322) colocado de forma que os genes sob o seu controlo possam ser expressos na célula hospedeira. Exemplos dos mesmos incluem pEFI/Myc-Hisl,2,3 and pEF4/Myc-Hisl,2,3 (ambos da Invitrogen Corporation).

Um outro exemplo preferido de vector de expressão das proteínas estruturais do HCV do presente invento é um vector de vírus da vacina compreendendo o gene da proteína do Core, o gene da proteína El, o gene da proteína E2 e o 41 ΡΕ1930416 gene da proteína p7 numa forma expressável (vector do vírus da vacina recombinante). Estirpes de vírus da vacina tais como, por exemplo, as estirpes DIs, WR e IBTd (Meis, RJ & Condit, RC. Virol. 182 (1992) p442-454) podem ser preferencialmente usadas na preparação de um vector de vírus da vacina recombinante. 0 método para a preparação de um vector de vírus da vacina recombinante está igualmente descrito detalhadamente nos exemplos atrás descritos. Resumidamente, um vector de vírus da vacina recombinante pode ser produzido através da clonagem dos genes das proteínas estruturais do HCV atrás referidas sob o controlo de um promotor do vírus da vacina, como seja p7.5, num vector de transferência do vírus da vacina, ainda a introdução do vector de transferência numa célula infectada pelo vírus da vacina por electroporação ou similares, cultura da célula para produzir partículas virais e ainda, preferencialmente, selecção do vírus e sua purificação. Tal vector de vírus da vacina pode ser preparado na forma de uma partícula tipo vírus recombinante.

Uma vez que as proteínas estruturais do HCV {Core, El, E2, p7) e as proteínas não estruturais (NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) são traduzidas a partir da região traduzida como uma poliproteína, sujeita a digestão limitada com protease, libertadas e produzidas, prefere-se expressar estas proteínas estruturais do HCV como uma poliproteína de Core, El, E2 e p7 num segmento contínuo, mas estas proteínas podem ser expressas por vectores de expressão separados. 42 ΡΕ1930416

Se as proteínas estruturais forem expressas numa célula na qual foi introduzido um vector que expressa as proteínas estruturais, estas podem ser detectadas por reacção de uma solução da cultura celular ou proteínas extraídas das células com anticorpos contra as proteínas estruturais (W02004/104198).

Especificamente, por exemplo, uma amostra de proteína extraída de células é fraccionada por electrofo-rese em gel de SDS-poliacrilamida, transferida para uma membrana de nitrocelulose e reagida com um anticorpo anti-proteínas de HCV (e.g., anticorpo específico anti-Core ou anti-soro colhido de um doente com hepatite C) e o anticorpo pode ser detectado (por transferência western).

Como alternativa, as células que expressam as proteínas de HCV são imunocoradas usando um anticorpo semelhante e a expressão e localização intracelular destas proteínas pode ser confirmada. 4. Encapsidação do replicão de RNA subgenómico do HCV numa partícula

No método do presente invento, uma partícula tipo vírus, em que um replicão subgenómico do HCV é encapsidado pelas proteínas estruturais, é produzida numa célula fornecendo: um vector expressando as proteínas estruturais 43 ΡΕ1930416 do HCV numa célula portadora do replicão de RNA subgenómico do HCV.

Para encapsidar numa partícula virai um replicão de RNA subgenómico de HCV numa célula em que o replicão do RNA subgenómico do HCV se replica, um vector que expressa as proteínas estruturais (Core, El, E2 e p7) pode ser introduzido na célula e expresso. Como alternativa, o RNA subgenómico do HCV pode ser introduzido numa célula em que as proteínas estruturais (Core, El, E2 e p7) são estavelmente expressas.

Exemplos de tal método de introdução incluem métodos conhecidos tais como electroporação, pistola de partículas, lipofecção, método do fosfato de cálcio, microinjecção e método de DEAE-dextrano. 5. Produção de partículas tipo vírus de HCV recombinante A célula portadora de um replicão de RNA subgenómico do HCV preparado como descrito atrás no qual foram introduzidos os genes das proteínas estruturais (Core, El, E2 e p7) do HCV e expressos (célula produtora de partículas tipo HCV recombinantes) pode produzir uma partícula tipo vírus recombinante. A partícula tipo HCV recombinante produzida possui capacidade infecciosa e a capacidade de replicar o RNA subgenómico do HCV. No entanto, não possui propriedade transmissora (capacidade de 44 ΡΕ1930416 transmissão) , uma vez que a célula infectada não pode produzir uma partícula virai filha.

Assim, uma partícula tipo HCV recombinante pode ser preparada num sistema de cultura celular através da cultura da célula produtora da partícula de HCV recombinante do presente invento. A partícula tipo HCV pode ser obtida de preferência através da cultura das células produtoras das partículas tipo HCV recombinante e recuperação da partícula tipo vírus produzida na cultura (de preferência uma solução da cultura). Uma partícula tipo vírus pode ser recuperada a partir da solução de cultura atrás mencionada por técnicas tais como, por exemplo, centrifugação em gradientes de densidade de sucrose. A capacidade produtora de partículas virais da célula produtora de partículas tipo HCV recombinantes do presente invento pode ser confirmada por quaisquer métodos de detecção de vírus conhecidos dos familiarizados com a área. Por exemplo, a capacidade produtora de partículas virais pode ser determinada através do fraccionamento de uma solução de cultura de células que parecem produzir um partícula tipo vírus num gradiente de densidade de sucrose e medição da densidade de cada fracção e da concentração da proteína do Core de HCV ou do RNA replicão do HCV na fracção para ver se a gravidade específica condiz com a gravidade específica conhecida do HCV. Ainda, quando a densidade de uma fracção em que o pico da proteína do Core é detectada for inferior à densidade da fracção obtida pelo 45 ΡΕ1930416 fraccionamento da solução de cultura após tratamento com 0,25% de NP40 (polioxietileno (9) de éter octilfenilico) , pode-se determinar se a célula tem uma capacidade produtora de partículas tipo vírus.

Ainda, se uma partícula tipo vírus numa célula produtora de partículas tipo HCV recombinante possui capacidade infecciosa pode ser determinado através da detecção do fenótipo de um gene estranho que existe num RNA subgenómico de HCV encapsidado na partícula virai. Por exemplo, se o gene estranho for um gene de resistência a drogas, ele pode ser avaliado através da inoculação da partícula virai numa célula permissiva ao HCV, cultura geralmente durante 2 a 3 semanas na presença desta droga e contagem dos clones resistentes à droga.

Ainda, pode ser confirmado que uma partícula tipo vírus, numa célula produtora de partículas tipo HCV recombinante, não produz uma partícula virai filha numa célula infectada, por transferência Western descrita atrás ou se existem as proteínas estruturais do HCV num extracto da célula infectada, de preferência uma amostra de sobrenadante da cultura de célula infectada.

Uma partícula virai tipo HCV recombinante produzida pelo método do presente invento tem capacidade de infectar uma célula (de preferência uma célula permissiva). É igualmente proporcionado um método para a produção de uma célula infectada pelo vírus da hepatite C recombinante 46 ΡΕ1930416 compreendendo os passos de cultura de uma célula produtora de partículas tipo HCV recombinante e permitindo que uma partícula tipo vírus na cultura obtida (de preferência caldo de cultura) infecte uma outra célula (de preferência célula permissiva para o HCV) . Aqui, a célula permissiva para o HCV é uma célula possuidora da capacidade de replicação do RNA genómico do HCV e/ou de ser infectada pelo HCV e não está limitada a estes exemplos. Exemplos específicos de células linfóides incluem a célula HPB-Ma, célula Daudi, etc. No entanto, as células hepáticas e linfóides não estão limitadas a estes exemplos.

Para facilitar a compreensão, os processos de produção das partículas tipo HCV recombinantes explicadas nas secções 2 a 5 atrás estão mostrados esquematicamente na Figura 1. 6. Vector para a introdução de genes A partícula tipo HCV recombinante do presente invento produzida pelo método do presente invento caracteriza-se por possuir no genoma de RNA uma sequência nucleotídica compreendendo a região não traduzida 5', a sequência nucleotídica codificadora das proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B e a região não traduzida 3', derivada das estirpes de HCV atrás mencionada (pelo menos uma estirpe virai seleccionada entre os genótipos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b, de preferência lb e 2a, tais como por exemplo, a estirpe conl do genótipo lb e a estirpe JFH1 do genótipo 2a). 47 ΡΕ1930416

Ainda, a partícula tipo HCV recombinante do presente invento possui uma característica interessante que, quando a partícula tipo HCV produzida numa célula produtora de partículas tipo HCV recombinante pelo método do presente invento infecta uma célula (e.g., uma célula permissiva para o HCV descrita atrás), o RNA subgenómico do HCV atrás mencionado é replicado na célula infectada, mas não é formada uma partícula virai filha. A partícula tipo HCV recombinante do presente invento pode ser usada como vector para a introdução /expressão de genes através da inserção de um gene estranho pretendido num replicão de RNA subgenómico do HCV nela encapsidado. Tal partícula virai tipo HCV recombinante do presente invento compreendendo um gene estranho pode ser preparada através da preparação de um replicão de HCV subgenómico recombinante, em que o gene estranho é inserido entre a região não traduzida 5' e a sequência IRES, e sua encapsidação pelo método atrás referido do presente invento. Uma vez que a partícula de HCV produzida na célula produtora da partícula de HCV recombinante não possui uma capacidade de transmissão, pode também ser usada como vector para a introdução de genes em células ou tecidos hepáticos ou linfóides.

Uma vez que o RNA subgenómico do HCV encapsidado numa partícula virai pelo método de produção de partículas virais do presente invento não é incorporado no genoma 48 ΡΕ1930416 cromossómico numa célula permissiva para o HCV infectada pela partícula tipo vírus do presente invento, possui a vantagem que os genes normais não estão danificados ou genes na vizinhança do local de inserção não são activados pela inserção de genes.

Devido às características atrás referidas, o vector do presente invento pode ser usado, por exemplo, para a terapia génica ou construção de animais transgénicos através da introdução de um gene estranho.

Exemplos de genes estranhos (ou ácido nucleico estranho) a serem introduzidos num replicão de RNA subgenómico do HCV e encapsidados numa partícula virai incluem, mas não estão limitados a genes codificadores de proteínas derivadas de mamíferos incluindo seres humanos, por exemplo, várias proteínas envolvidas em doenças tais como proteínas, polipéptidos ou péptidos incluindo, por exemplo, enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticorpos, moléculas imuno-reguladoras, proteínas supressoras de tumores, factores de crescimento, proteínas de membrana e proteínas vasoactivas; ácidos nucleicos terapêuticos tais como RNA anti-sentido e siRNA que inibem ou suprimem a tradução de proteínas, etc.

As células ou tecidos alvo susceptíveis ao HCV são células ou tecidos de mamífero, de preferência células ou tecidos humanos como seja, por exemplo, células ou tecidos hepáticos e linfóides humanos. 0 vector do presente 49 ΡΕ1930416 invento actua nas células ou tecidos alvo em condições in vivo, in vitro ou ex vivo. De preferência, o vector do presente invento pode ser usado no tratamento de seres humanos, por exemplo, terapia génica, tratamento de cancro (e.g., cancro hepático, linfoma, etc.) e similares.

Os teores da especificação e/ou dos desenhos do Pedido de Patente JP N° 2005-287825, sobre os quais o presente pedido reivindica a prioridade, estão incluídos na presente especificação.

Exemplos O presente invento será explicado mais especifi-camente com referência aos exemplos que se seguem. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e o âmbito do presente invento não está limitado a estes exemplos.

Exemplo 1

Preparação de células portadoras do replicão O DNA do plasmídeo pSGR-JFHl (diagrama do meio da Figura 2) foi construído através da substituição de parte das regiões estruturais e das regiões não estruturais com o gene de resistência à neomicina (neo: igualmente referido como gene da fosfotransferase de neomicina) e EMCV-IRES (local interno de entrada dos ribossomas do vírus da 50 ΡΕ1930416 encefalomiocardite) em pJFHl que foi preparado através da inserção de DNA contendo o cDNA do genoma completo da estirpe JFH-1 (genótipo 2a), uma estirpe do virus da hepatite C isolada de um doente com hepatite fulminante (clone JFH-1: GenBank número de acesso AB047639) no promotor de T7 a jusante no plasmideo pUC19. Este procedimento de construção foi realizado de acordo com uma descrição anterior (Lohmann et al., Science, 285 (1999) pllO-113).

Especificamente, o plasmideo pJFHl foi digerido com as enzimas de restrição Agel e Ciai e uma sequência 5'NTR até à região do Core derivada de pJFHl e o gene de resistência à neomicina derivado de pRSV5NEO foram ligados aos locais de clivagem por amplificação por PCR, um fragmento digerido com as enzimas de restrição Agel e Pmel e uma sequência de IRES de EMCV até à região NS3 foram ligados por amplificação de PCR e um fragmento digerido com as enzimas de restrição Pmel e Ciai foi inserido e ligado.

Subsequentemente, pSGR-JFHl foi digerido com a enzima de restrição Xbal. Em seguido, 10 a 20 pg destes fragmentos digeridos com Xbal foram ainda tratados por incubação usando 20 unidades de nuclease de feijoeiro (volume total de mistura de reacção, 50 μΐ) a 30°C durante 30 minutos. A nuclease de feijoeiro é uma enzima que catalisa uma reacção de degradação selectiva de uma porção de cadeia simples num DNA de cadeia dupla. Geralmente, quando o RNA é sintetizado usando o fragmento digerido com Xbal atrás referido como matriz, é sintetizado um replicão 51 ΡΕ1930416 com quatro nucleótidos extra CTGA, o qual é uma parte da sequência de reconhecimento de Xbal, adicionado ao extremo 3'. Assim, neste exemplo, através do tratamento dos fragmentos digeridos com Xbal com nuclease de feijoeiro, os quatro nucleótidos CTGA do fragmento digerido com Xbal são removidos. Subsequentemente, para obter um DNA matriz, uma solução contendo o fragmento digerido com Xbal tratado com nuclease de feijoeiro foi sujeito a tratamento para remoção de proteína de acordo com um método convencional para purificar o fragmento digerido com Xbal do qual foram removidos os quatro nucleótidos CTGA.

Subsequentemente, o RNA foi sintetizado in vitro pela RNA-polimerase de T7 usando este DNA como matriz. Para esta síntese de RNA, foi usado o MEGAscript da Ambion. 20 μΐ da mistura de reacção contendo 0,5 a 1,0 pg de DNA matriz reagiu de acordo com as instruções do fabricante.

Após completada a síntese do RNA, adicionou-se DNase (2 unidades) à solução de reacção, reagiu a 37°C durante 15 minutos e depois a extracção de RNA foi ainda realizada com fenol acídico para remover o DNA matriz. 0,01 ng a 10 pg deste RNA (RNA replicão) foi misturado com RNA celular total extraído de células Huh7 e ajustado de forma a que a quantidade total de RNA fosse 10 pg. Em seguida, o RNA misto foi introduzido na célula Huh7 por electroporação. As células Huh7 electroporadas foram semeadas numa placa de cultura e cultivadas durante 16 a 24 52 ΡΕ1930416 horas e depois adicionado G418 (neomicina) à placa de cultura em várias concentrações. Em seguida, a cultura prosseguiu com substituição do meio de cultura duas vezes por semana. Colónias de células viáveis foram clonadas a partir de uma placa de cultura após 21 dias da cultura atrás referida e a cultura prosseguiu. Algumas estirpes de clones celulares foram estabelecidas através da clonagem de tais colónias. Uma estirpe celular portadora do replicão de RNA subgenómico do HCV foi designada 1H4.1.

Ainda, a célula 5-15, uma estirpe celular portadora de um replicão de RNA subgenómico de HCV (GenBank número de acesso AJ242654; I389/NS3-3'/wt na coluna inferior da Figura 2) preparado a partir de cDNA do genoma de tamanho completo derivado da estirpe con-1 do genótipo de HCV lb como descrito atrás, que foi preparada através da introdução deste replicão de RNA na estirpe celular Huh7 (Lohmann et ai., Science, 285 (1999) pllO-113), foi igualmente usada nas experiências.

Exemplo 2

Preparação do vector de expressão das proteínas estruturais 1) Vector plasmídico de expressão das proteínas estruturais

Uma região incluindo os genes da região 53 ΡΕ1930416 estrutural (posições de nucleótidos: 249 a 2781) da estirpe JFHl isolada de um doente com hepatite fulminante (GenBank número de acesso AB047639) (Kato T. et al., J. Med. Viol. 64 (2001)p334-339) foi amplificada por PCR. Este fragmento de DNA foi digerido com Nhel e EcoRI e assim o fragmento obtido contendo os genes estruturais foi purificado por electroforese em gel de agarose e dotado de extremos cerses pela DNA-polimerase. Este cDNA com extremos cerses foi inserido a jusante da sequência do promotor CAG (CAG) num vector plasmidico. De forma semelhante, o cDNA atrás referido contendo os genes da região estrutural obtido por digestão com Nhel e EcoRI foi inserido entre os locais de reconhecimento Spel e EcoRI em pEF4Myc-His (Invitrogen Corporation), um vector portador da sequência do promotor do gene do factor de elongação la) promotor EF-la: Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18 (1990) p5322) . Os plasmideos obtidos resultantes foram designados pCAGC-p7JFHl e pEF4C-p7JFHl, respectivamente (Figura 3). 2) Vector de virus da vacina recombinante expressando as proteínas estruturais

Para preparar um vector que possui os genes estruturais da estirpe JFHl e pode expressar as proteínas codificadas por estes genes, primeiro, pEF4C-p7JFHl mostrado no diagrama superior da Figura 3 foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e a região codificadora das proteínas do Core, El, E2 e p7 foi fraccionada por electroforese em gel de agarose. Subsequentemente, este 54 ΡΕ1930416 fragmento foi ligado a um vector de transferência para o virus da vacina pDIsgptmH5 que foi projectado de forma a inserir o gene a fosforribosil transferase de xantina-guanina (XGPRT) devendo ser inserido juntamente com um gene de interesse (Ohnishi, K. et ai., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94; Ishii, K. et ai., Virology 302 (2002) p433- 444). Este pDIsgptmH5 é um vector de transferência no qual o gene XGPRT de Escherichia coli está inserido sob o controlo do promotor p7.5 do vírus da vacina inserido num local de clonagem do vector pUc/DIS (Ishii, K. et ai., Virology 302 (2002) p433-444) . O vector obtido foi designado pDIsJFHst.

Um vector que compreende os genes estruturais da estirpe H77c e que pode expressar as proteínas codificadas por estes genes foi preparado pelo método que se segue. Primeiro, a um vector no qual o cDNA genómico de HCV da estirpe H77c (GenBank número de acesso AF011751) foi clonado como matriz, foram adicionados 5 μΐ de tampão 10X do kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 μΐ de mistura de dNTPs 2,5 mM e 1 μΐ da sequência iniciadora directa H77/J1 (AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEQ ID NO: 1) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa H77 (AAGAGCTCTCATAACCCGACA-AGAACAACGCCGCC: SEQ ID NO: 2) 10 μΜ cada e água desionizada para perfazer 49 μΐ de volume total. Em seguida, foi adicionado 1 μΐ de Taq LA Takara (Takara Bio Inc.) e efectuada a reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada nas seguintes condições: 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos e 68 °C durante 5 minutos (por ciclo) . Quando uma 55 ΡΕ1930416 parte dos produtos de PCR foi sujeita a electroforese num gel de agarose, foi confirmado um produto de amplificação de aproximadamente 2,5 kb.

Assim, foi realizada uma reacção de ligação usando 2 μΐ dos produtos de PCR para ligar um produto de amplificação num vector plasmidico. Escherichia coli foi transformada com este produto de ligação de acordo com um método convencional e preparou-se DNA plasmidico usando o transformante obtido. Este DNA de plasmideo foi digerido com enzimas de restrição que podem remover o fragmento de DNA inserido no DNA plasmidico e sujeito a electroforese em gel de agarose para confirmar que o fragmento de DNA de cerca de 2,5 kb foi inserido no DNA plasmidico. A sequência nucleotidica do fragmento de DNA inserido foi determinada por um método convencional. Como resultado, encontrou-se que a sequência nucleotidica determinada corresponde à sequência de posições de nucleótidos 271 a 2819 na sequência nucleotidica com o número de acesso GenBank AF011751. Subsequentemente, este DNA de plasmideo foi digerido com Bgll e Saci e sujeito a electroforese em gel de agarose para isolar um fragmento de DNA contendo a região do gene estrutural da estirpe H77c, o qual foi ligado ao vector de transferência do vírus da vacina pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect Dis. 58 (2005) p88-94; Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444). O vector obtido como resultado foi designado pDIsH77st.

Um vector que compreende os genes estruturais da 56 ΡΕ1930416 estirpe J1 e que pode expressar as proteínas codificadas por estes genes foi preparado pelo método que se segue. Primeiro, a um vector no qual o cDNA genómico do HCV da estirpe J1 (GenBank número de acesso D89815) foi clonado como matriz, foram adicionados 5 μΐ de tampão lOx do kit de LA-PCR (Takara Bio Inc.) 5 μΐ de mistura de dNTPs 2,5 mM e 1 μΐ de sequência iniciadora directa H77/J1 (AAAGATCTGC- GAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEQ ID NO: 1) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa J1 (AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC: SEQ ID NO: 3) 10 μΜ cada e, finalmente, água desionizada para perfazer 49 μΐ de volume total. Em seguida, adicionou-se 1 μΐ de LA Taq Takara (Takara Bio Inc.) e realizou-se a reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada nas seguintes condições: 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos e 68°C durante 5 minutos (por ciclo). Quando uma parte dos produtos de PCR foi sujeita a electroforese em gel de agarose, foi confirmado o produto de amplificação de cerca de 2,5 kb. Assim, realizou-se uma reacção de ligação usando 2 μΐ dos produtos de PCR para ligar um produto de amplificação ao vector plasmídico. Escherichia coli foi transformada com este produto de ligação de acordo com um método convencional, e DNA de plasmídeo foi preparado usando o transformante obtido. Este DNA de plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição que podem remover o fragmento de DNA inserido no DNA plasmídico e sujeito a electroforese em gel de agarose para confirmar que o fragmento de DNA de aproximadamente 2,5 kb foi inserido no DNA plasmídico. A sequência nucleotídica do fragmento de DNA inserido foi determinada por um método convencional. 57 ΡΕ1930416

Como resultado, a sequência nucleotidica determinada correspondia à sequência entre as posições de nucleótidos 271 e 2819 na sequência nucleotidica com o número de acesso GenBank D98915. Subsequentemente, este DNA de plasmideo foi digerido com BglII e Saci e sujeito a electroforese em gel de agarose para isolar um fragmento de DNA contendo a região do gene estrutural da estirpe Jl, a qual foi ligada ao vector de transferência do vírus da vacina pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94; Ishii, K. et ai., Virology 302 (2002) p433-444).0 vector obtido resultante foi designado pDIsJlst.

Um vector que compreende uma sequência do gene estrutural quimérico do gene do Core derivado da estirpe Jl e os genes El, E2 e p7 derivados da estirpe JFH1 e que pode expressar as proteínas codificadas por estes genes foi preparada pelo método que se segue. Primeiro, para amplificar o gene do Core da estirpe Jl, a um vector em que o cDNA genómico do HCV da estirpe Jl (GenBank número de acesso D89815) foi clonado como matriz, foram adicionados 5 μΐ de tampão lOx acompanhado do kit LA-PCR (Takara Bio Inc.), 5 μΐ da mistura de dNTPs 2,5 mM e 1 μΐ da sequência iniciadora directa H77/J1 (SEQ ID NO:l) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa J1/JFH1(GTAGCTGCTACTGGTATTCTTCACCTGGGCA-GCGGAAGCTGGGATGGTCAAACAG GACAG: SEQ ID NO: 4) 10 μΜ cada e, finalmente, água desionizada para perfazer 49 μΐ de volume total. Em seguida, adicionou-se 1 μΐ de LA Taq Takara (Takara Bio Inc.) e realizou-se a reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada na seguinte condições: 25 ciclos de 58 ΡΕ1930416 98°C durante 20 segundos e 68°C durante 5 minutos (por ciclo) . Para amplificar os genes El, E2 e p7 da estirpe JFH1, a um vector no qual o cDNA genómico do HCV da estirpe JFH1 (GenBank número de acesso AB047639) foi clonado como matriz, foram adicionados 5 μΐ de tampão lOx do kit LA-PCR (Takara Bio Inc.) , 5 μΐ da mistura de dNTPs 2,5 mM e 1 μΐ da sequência iniciadora directa J1/JFH1 (CTGTCCTGTTTGACC-ATCCCAGCTTCCGCTGCCCAGGTGAAGAATACCAGTAGCA GCTAC: SEQ ID NO: 5) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa JFH1 (AAGAGCTCT-CAATCAATATCAACAAACCCACGCCT: SEQ ID NO: 6) 10 μΜ cada e, finalmente, água desionizada para perfazer um volume total de 49 μΐ. Em seguida, adicionou-se 1 μΐ de LA Taq Takara (Takara Bio Inc.) e realizou-se uma reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada nas seguintes condições que se seguem: 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos e 68°C durante 5 minutos (por ciclo). Os fragmentos amplificados obtidos foram purificados e dissolvidos em 50 μΐ de H2O. 1 μΐ de cada solução foi diluída 100 vezes e 1 μΐ de cada solução foi combinado com a mistura. Usando esta mistura como matriz, foram realizados 5 ciclos de LA-PCR nas condições atrás referidas sem adição de sequências iniciadoras. Em seguida, a sequência iniciadora directa H77/J1 (SEQ ID NO:1) e a sequência iniciadora reversa JFH1 (SEQ ID NO:6) foram adicionadas, foram realizados mais 10 ciclos de LA-PCR e o fragmento de DNA quimérico amplificado foi purificado. Este fragmento foi clonado no vector plasmídico e determinada a sequência nucleotídica do fragmento de DNA. Como resultado, foi confirmado que o fragmento de DNA tinha uma sequência de genes estruturais 59 ΡΕ1930416 quimérica do gene do Core derivado da estirpe J1 e os genes El, E2 e p7 derivados da estirpe JFH1. Subsequentemente, um fragmento obtido pela digestão deste plasmideo com BglII e Saci foi ligado ao vector de transferência do vírus da vacina pDIsgptmH5 (pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et ai., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94; Ishii, K. et ai., Virology 302 (2002) p433-444). O vector obtido resultante foi designado pDIsJl©/JFHl(El-p7)st.

Um vector que compreende uma sequência de genes estruturais quimérica do gene do Core derivado da estirpe JFHl e os genes El, E2 e p7 derivados da estirpe Jl e que pode expressar as proteínas codificadas por estes genes foi preparado pelo método que se segue. Primeiro, para amplificar o gene do Core da estirpe JFHl, a um vector no qual o cDNA genómico de HCV estirpe JFHl (GenBank número de acesso AB047639) foi clonado como matriz, foram adicionados 5 μΐ de tampão lOx do kit LA-PCR (Takara Bio Inc., 5 μΐ da mistura de dNTPs 2,5 mM e 1 μΐ da sequência iniciadora directa JFHl(AAAGATCTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGC: SEQ ID NO: 7) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa JFHl/Jl(GGTATAT-CCCGGACACGTTGCGCACTTCATAAGCAGAGACCGGAACGGTGATGC AGGAC: SEQ ID NO: 8) 10 μΜ cada, e realizada a reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada nas seguintes condições: 25 ciclos de 98°C durante 20 segundos e 68°C durante 5 minutos (por ciclo) . Para amplificar os genes El, E2 e p7 da estirpe Jl, a um vector no qual o cDNA genómico de HCV da estirpe Jl (GenBank número de acesso D89815) foi clonado como matriz, foram adicionado 5 μΐ de tampão 10X do kit LA- 60 ΡΕ1930416 PCR (Takara Bio Inc.), 5 μΐ de mistura de dNTPs, 2,5 mM e 1 μΐ da sequência iniciadora directa (GTCCTGCATCACCGTTCCGGT-CTCTGCTTATGAAGTGCGCAACGTGTCCGGGATA TACC: SEQ ID NO: 9) e 1 μΐ da sequência iniciadora reversa J1 (AAGAGCTCTCATAGACCTA-CAAAAACCCCGCCTCC: SEQ ID NO: 3) 10 μΜ cada e, finalmente, áqua desionizada para perfazer 49 μΐ de volume total. Em sequida, adicionou-se 1 μΐ de LA Taq Takara (Takara Bio Inc.) e realizou-se a reacção de PCR. A reacção de PCR foi realizada nas sequintes condições: 25 ciclos de 98°C durante 20 sequndos e 68°C durante 5 minutos (por ciclo). Os fragmentos amplificados obtidos foram purificados e dissolvidos em 50 μΐ de H2O. 1 μΐ de cada solução foi diluida 100 vezes e 1 μΐ de cada solução foi combinado numa mistura. Usando esta mistura como matriz, foram realizados 5 ciclos de LA-PCR nas condições atrás referidas sem adição de sequências iniciadoras. Em seguida, foram adicionadas as sequências iniciadora directa JH1 (SEQ ID NO:7) e a sequência reversa J1 (SEQ ID NO:3), foram ainda realizados 10 ciclos de LA-PCR e o fragmento de DNA quimérico amplificado foi purificado. Este fragmento foi clonado no vector plasmidico e a sequência nucleotidica do fragmento de DNA foi determinada. Como resultado, foi confirmado que o fragmento de DNA tinha uma sequência do gene estrutural quimérico do gene do Core derivado da estirpe JFH1 e os genes El, E2 e p7 derivados da estirpe J1. Subsequentemente, um fragmento obtido por digestão deste plasmideo com Bgll e Saci foi ligado ao vector de transferência para o vírus da vacina pDIsgtmH5 (Ohnishi, K. et al., Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94; Ishii, K. et al., Virology 61 ΡΕ1930416 302 (2002) ρ433-444). Ο vector obtido resultante foi designado pDIsJFH(C)/J1(El-p7)st.

Os mapas das sequências de genes estruturais do HCV (sequência dos genes estruturais quiméricos) inseridos nos vectores preparados como descrito atrás, pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJlst, pDIsJ1(c)/JFH(El-p7 ) st, e pDIsJFH(c)/ Jl(El-p7)st, estão apresentados na Figura 4.

Vectores de virus da vacina recombinante estirpe DIs portadores de cada um dos vectores atrás mencionados foram preparados e seleccionados por exemplo como segue. 500 μΐ de solução de virus contendo cerca de 106 unidades formadoras de placas (pfu) do virus da vacina estirpe DIs foram inoculados numa placa de 80 mm em que tinham sido semeados cerca de 107 fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e o virus foi deixado a infectar as células através de agitação cada 15 minutos 8 vezes. Em seguida, adicionou-se Meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DMEM) com 1 ml de 10% de soro fetal de vitela (FCS) e a mistura foi cultivada a 37°C em 5% de CO2 durante 2 horas. O meio foi removido, as células foram lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) e adicionou-se 0,5 ml de solução de tripsina a 0,05% para descolar as células. Em seguida, a suspensão de células foi centrifugada a 2000 rpm durante 3 minutos para recuperar as células, e as células foram suspensas em 400 μΐ de PBS. 10 pg do vector de transferência atrás referido foi dissolvido nesta ΡΕ1930416 suspensão celular e a electroporação foi realizada numa cuvete de 0,4 cm usando Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc.), com uma voltagem aplicada uma vez a 250 V e 500 pFD. As células foram suspensas em 2 ml de DMEM contendo 10% FCS, semeadas numa placa de 35 mm e cultivadas a 37°C em 5% CO2 durante 7 dias. As células infectadas foram recuperadas com o meio, liofilizadas 3 vezes, ultra-sonicadas durante 2 minutos e depois diluidas 10, 100 ou 1000 vezes com o mesmo meio. 106 células foram semeadas numa placa de 35 mm, seguido da adição de 25 pg/ml de MPA, 250 pg/ml de xantina e 15 pg/ml de hipoxantina ao meio (DMEM contendo 10% FCS) e cultivadas durante a noite. Em seguida, as soluções de células atrás diluidas foram inoculadas. O vírus foi deixado a infectar células através de agitação cada 15 minutos 8 vezes, a solução de células diluída foi removida, em seguida foi adicionado 2 ml de 1% de agar de baixo ponto de fusão (DMEM com 10% FCS; o qual contém MPA, xantina e hipoxantina) e a mistura foi solidificada e mantida a 37°C em 5% CO2 durante 7 dias. As regiões das placas formadas foram picadas com uma pipeta de Pasteur, suspensas em 200 μΐ de DMEM contendo 10% FCS e ultrassonicado durante 2 minutos para libertar o vírus do agar. Esta solução de cultura foi diluída 10, 100 e 1000 vezes com o mesmo meio, repetido duas vezes o mesmo procedimento do ensaio de placas para purificar o vírus recombinante e os processos foram amplificados através da infecção das células CEF.

Os vectores virais (partículas tipo vírus 63 ΡΕ1930416 recombinantes) preparados como descrito atrás a partir de pDIsJFHst, pDIsH77st, pDIsJlst, pDIsJ1(c)/JFH(El-p7)st, e pDIsJFH(c)/J1(El-p7)st foram designados como DIsJFHst, DIsH77st, DlsJlst, DIsJl (c)/JFH(El-p7)st, e DIsJFH(c)/ Jl(El-p7)st, respectivamente.

Exemplo 3

Introdução do vector de expressão das proteínas estruturais em células portadoras de replicão e produção da proteína estrutural

Para expressar as proteínas estruturais do HCV numa célula portadora de um replicão, o vector expressando as proteínas estruturais do HCV pCAGC-p7JFHl ou pEF4C-p7JFHl preparado no Exemplo 2 foi introduzido numa célula portadora de replicão através de lipofecção e similares. Ainda, os vectores virais expressando as proteínas estruturais do HCV preparados no Exemplo 2, DIsJHst, DIsH77st, DlsJlst, DIsJ1(c)/JFH(El-p7)st, e DIsJFH(c)/ Jl(El-p7)st, foram deixados a infectar células portadoras de replicão. 1) Introdução do vector plasmídico expressando as proteínas estruturais pCAGC-p7JFHl foi introduzido na célula portadora de replicão 5-15 por lipofecção, em seguida as células foram cultivadas continuamente em 8 ml de solução de 64 ΡΕ1930416 cultura e o sobrenadante de cultura foi recuperado aos 4 dias para quantificar a proteína do Core do HCV. No entanto, a quantidade ficou abaixo do limite de detecção.

Entretanto, pEF4C-p7JFHl foi introduzido na célula portadora de replicão IH4.1 por lipofecção. Como resultado, a proteína do Core de HCV pode ser detectada no sobrenadante de cultura através de transferência Western. Assim, as células portadoras do replicão IH4.1 na qual pEF4C-p7JHFl foi introduzida foram cultivadas durante 4 dias e depois o meio de cultura foi colhido (8 ml) e centrifuqado a 8000 q e 4°C durante 60 minutos para colher o sobrenadante de cultura. Subsequentemente, este sobrenadante foi centrifugado usando o rotor SW20 (Beckman) a 25000 rpm e 4°C durante 4 horas e os sedimentos foram suspensos em 1 ml de tampão. A amostra foi aplicada sobre gradientes de densidade de 10 a 60% de sucrose preparados num tubo do Rotor SW41E (Beckman) e centrifugadas a 35000 rpm e 4°C durante 16 horas. Os gradientes de densidade de 10 a 60% de sucrose foram preparados colocando uma camada de 2 ml de solução de sucrose a 60% (peso/peso) (dissolvida em Tris 50 mM, pH 7,5/NaCl 1M/EDTA 1 mM) , 1 ml de solução de sucrose a 50%, 1 ml de solução de sucrose a 40%, 1 ml de solução de sucrose a 30%, 1 ml de solução de sucrose a 20% e 1 ml de solução de sucrose a 10% num tubo de centrífuga.

Após finalizada a centrifugação, fracções de 0,5 ml cada foram colhidas do fundo do tubo. A densidade, a concentração de proteína do Core de HCV e a concentração de 65 ΡΕ1930416 RNA foram determinadas para cada fracção. A proteína do Core do HCV foi quantificada pelo teste IRMA Ortho para antigénios do HCV (Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) pl802-1808) . 0 RNA replicão do HCV foi quantificado de acordo com o método de Takeuchi et al., Gastroente-rology, 116 (1999) p636-642). Como se mostra na Figura 5, os picos do RNA replicão e da proteína do Core são concordantes e estavam ambos na fracção 8 nas duas experiências. A densidade desta fracção era concordante com a densidade descrita para a partícula do HCV, com cerca de 1,17 g/ml. Isto sugere que foram produzidas partículas virais.

2)Introdução do vector vírus da vacina recombi-nante expressando a proteína estrutural de HCV 2 x 106 células da célula portadora de replicão estirpe 5-15 foram semeadas numa placa de 10 cm e 0,5 pfu/célula de DIsJFHst foi deixado a infectar a célula portadora do replicão até ao dia seguinte. A cultura continuou em 8 ml de meio de cultura. Após 4 dias de

cultura, a solução de cultura foi recuperada e centrifugada a 8000 xg e 4°C durante 60 minutos e o sobrenadante de cultura foi colhido. Em seguida, este sobrenadante foi centrifugado usando o Rotor SW20 (Beckman) a 25000 rpm e 4°C durante 4 horas, sedimentos equivalentes a 8 ml da solução de cultura celular foram suspensos em 1 ml de tampão com ou sem 0,2% NP40. A amostra foi incubada a 4°C durante 20 minutos, colocada sobre gradientes de densidade de 10 a 60% de sucrose num tubo para o Rotor SW41E 66 ΡΕ1930416 (Beckman) e centrifugado a 35000 rpm e 4°C durante 16 horas. O gradiente de densidade de 10 a 60% de sucrose foi preparado colocando 2 ml de solução de sucrose a 60% (peso/peso) (dissolvida em Tris 50 mM, pH 7,5/NaCl 0, 1M/EDTA 1 mM) , 1 ml de solução de sucrose a 50%, 1 ml de solução de sucrose a 40%, 1 ml de solução de sucrose a 30%, 1 ml de solução de sucrose a 20% e 1 ml de solução de sucrose a 10% num tubo de centrífuga.

Após finalizada a centrifugação, fracções de 0,5 ml cada foram colhidas do fundo do tubo. A densidade, a concentração de proteína do Core de HCV e a concentração de RNA foram determinadas para cada fracção. A proteína do Core do HCV foi quantificada pelo teste IRMA Ortho para antigénios do HCV (Aoyagi et ai., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) pl802-1808).

Os resultados de duas experiências independentes estão apresentados na Figura 6. No grupo não tratado com NP40 (tratado com PBS), a densidade da partícula contendo a proteína do Core foi de 1,16 g/ml (fracção 7) . No grupo tratado com NP40, a densidade da partícula contendo a proteína do Core foi 1,21 g/ml (fracção 9) . Isto sugeriu que uma membrana na superfície, que tinha uma gravidade específica baixa devido aos lípidos contidos, foi removida da partícula virai por NP40, formando uma partícula de nucleóide tendo o ácido nucleico e a proteína do Core sozinha sem uma estrutura tipo vírus, e assim aumentou a 67 ΡΕ1930416 gravidade especifica. Isto sugeriu que uma partícula virai completa foi produzida neste sistema experimental.

Na mesma forma como descrito atrás, os vectores virais DlsJlst, DIsJ1 (c)JFH(El-p7)st, and DIsJFH(c)/J1(El-p7)st foram ainda deixados infectar a célula portadora de replicão estirpe 5-15. 8 ml de sobrenadante obtido pela cultura das células durante 4 dias após a infecção foi concentrado com uma membrana de ultrafiltração e fraccionado por centrifugação no gradiente de densidade de sucrose atrás referido. A densidade e a concentração da proteína do Core do HCV foram determinados para cada uma das fracções. 0 padrão de distribuição de densidade da proteína do Core do HCV mostrou que a partícula tipo vírus produzida estava contida no sobrenadante de cultura das células infectadas por DlsJlst, DIsJ1(c)/JFH(El-p7)st, ou DIsJFH(c)/J1(El-p7)st.

Exemplo 4

Confirmação da capacidade infecciosa da partícula tipo HCV recombinante

Como se mostra na Figura 1, a partícula de HCV recombinante preparada nos exemplos atrás descritos possui o gene neo como marcador de resistência a drogas. Assim, para confirmar que a partícula obtida no Exemplo 3 possui uma capacidade infecciosa, é suficiente para permitir que esta partícula infecte a célula Huh7 e avaliar se podem ser obtidas colónias resistentes a G418 (neomicina). 68 ΡΕ1930416 DIsJFHst foi deixado infectar a célula portadora de replicão 5-15, o sobrenadante de cultura obtido através da cultura das células durante 4 dias foi concentrado 30 vezes por membrana de ultrafiltração (limite de exclusão 1 x 103 Da) para infectar as células Huh7. Após infecção, adicionou-se 1 mg/ml de G418 à placa de cultura. Em seguida, a cultura foi continuada substituindo o meio de cultura duas vezes por semana. Após cultura durante 21 dias a pós sementeira, as células viáveis foram coradas com violeta de cristal. Como resultado, foi confirmada a formação de colónias.

Se as proteínas estruturais do HCV não forem detectadas numa célula infectada, significa que as partículas filhas não são produzidas na célula infectada. Assim, as colónias formadas nesta experiência foram propagadas e preparados os seus extractos celulares. Em seguida, estes extractos foram analisados por SDS-PAGE e transferência Western. Nas análises, as células Huh7 foram transitoriamente transfectadas pelo DNA do plasmídeo de expressão incluindo o gene do Core e o extracto celular obtido foi usado como controlo positivo. Ainda, um extracto celular obtido a partir das células Huh7 que não foi transfectado foi usado como controlo negativo. Uma amostra extraída de cada clone celular foi sujeita a SDS-PAGE e depois transferida para uma membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore) e a proteína do Core traduzida na célula foi analisada por ECL (Amersham Pharmacia Biotech) usando um 69 ΡΕ1930416 anticorpo anti-Core especifico (anticorpo do clone 2H9) e um anticorpo secundário marcado com HRP que reconhece o anticorpo. Como resultado, a proteína do Core não foi detectada nas células infectadas. Isto significa que, após a partícula tipo HCV recombinante produzida pelo método do presente invento infectar uma outra célula não foi reproduzida como partícula, não tendo pois capacidade de disseminar a infecção a outras células (capacidade transmissão).

Aplicabilidade industrial

Uma partícula tipo HCV recombinante, tendo uma propriedade infecciosa nas não uma propriedade transmissora, em que um RNA subgenómico de HCV contendo um gene pretendido é encapsidado e um método para a produção do mesmo podem ser proporcionados pelo presente invento. Uma vez que tal partícula tipo HCV recombinante possuindo uma propriedade infecciosa possui a vantagem de não ter uma propriedade transmissora, pode ser usada em terapia génica através da introdução in vivo ou ex vivo em células hepáticas ou linfóides ou tecidos de mamíferos, em particular humanos, ou pode ser usado como vector virai para a construção de um animal transgénico ou de uma vacina atenuada.

Texto Livre de Listagem de Sequências

As sequências de SEQ ID NOS: 1 a 9 representam sequências iniciadoras. 70 ΡΕ1930416

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Director General of National Institute of Infectious Diseases Tokyo Metropolitan Organization for Medicai Research Toray Industries, Inc.

<120> Nova partícula tipo vírus da hepatite C humano recombinante e método para a produção da mesma <130> PH-2921-PCT <140> PCT/JP2006/319573 <141> 2006-09-29 <150> JP 2005-287825 <151> 2005-09-30 <160> 14

<170>PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <220> <223> Inventor: Tanabe, Jun-ichi: Sone, Saburo: Wakita, Takaji

Inventor: Ishii, Takashi; Suzuki, Ryosuke: Suzuki, Tetsurou Inventor: Miyamura Tatsuo <4 00> 1 aaagatctgc gaaaggcctt gtggtactgc 30

<210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 2 aagagctctc ataacccgac aagaacaacg ccgcc 35

<210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 3 aagagctctc atagacctac aaaaaccccg cctcc 35

<210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 4

gtagctgcta ctggtattct tcacctgggc agcggaagct gggatggtca aacaggacag 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA 71 ΡΕ1930416 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 5

ctgtcctgtt tgaccatccc agcttccgct gcccaggtga agaataccag tagcagctac 60 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 6 aagagctctc aatcaatatc aacaaaccca cgcct 35

<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 7

aaagatctgc gaaaggcctt gtggtactgc 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 8

ggtatatccc ggacacgttg cgcacttcat aagcagagac cggaacggtg atgcaggac 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora <400> 9 gtcctgcatc accgttccgg tctctgctta tgaagtgcgc aacgtgtccg ggatatacc 29

<210> 10 <211> 9678 <212> DNA

<213> Virus da hepatite C <22 0>

<221> CDS <222> (341).. (9442) <400> 10 acetgcccct aataggggeg aeactccgee atfasteaet eeeetgtgag gaactactgt §0 etteacgoag aaagcgccta gccatggcgt tagutgagt gtcgtacage cteca&gecc 320 ceccctcccf sgssagccat agtggtstgc ggaa&e-ggtg tgiaesccgf aattgeeggi 380 72 ΡΕ1930416 »*8«e*W«t c*tfcteit** atàaacccac tetttt*ec«g geeatttgff «gigoecce* 246 «Biimtict a*ccg*gtag eg«g*stt* «aMMfifict tgtggtsKJtg edgggagft 300 çgcsfctgçgag fcgcnee*ggg* ggtctcgtag ae*8fci©a<ssç. efcg age ae* aat ect m tíet Ser Thr As» Pr© l 5 &«s £*t caa aga see «*» are atfc sae egt ege ee* *» gm m Ly* Pr© Gin Arg Lf® Ur Ar* Asm Ihr As» Arg Ar* Pr© Slu ásp 10 ΙΦ m «tt «a* ttc. ccg *«© ggc ca* ate *Êt *ie W* *ta tm ttg ttg mt Vai ifi PS*« Fíô dy Sly Sly Gia 11« m Sly Gly Vai Tw leu Leu 2S m n CCS «te agg Kgc CCS *tt ttg g£t sts C:g« acg a ca ass saa ast W* ft» Ari Are «1» fir» Alt Uu Cif vai Arg Ihr mt Ars Ln Tftr Ser 40 4S m *«t tôé é*f oes» egt gss •f» ©g« eeg eee «te eee »«s get 6g£ m mu Arg Ser Gin fm Arg «ly Arg Arg Sis fr© lie .Pjo Lys A:gp Arg 1« 60 «6 «*» te© aet m mg gee *8* gg* asa «ca fflt cg« «ee tg* «ee et» «?P Arg Ser Ihr «Ϊ iys AU Itp Sly tys Pr» Sly Arg Pr© Try Pr© Lee TO n 80 m tat **· aat e*« eie w& &£§ «« IIA *6®. et« et* fcee «ee &*# m 73 ΡΕ1930416 fft €ljf Asei 01« Gíy Leu Giy Trp Ala tt* ttp tas le» Sér Pre te®: m m 100 gga tsi C®6 eet tas tgg SSé cee aet eaa «** «e* **f te® «®e mt CtT Ser te* P're Ser fíp eh Pr® líar A*p Pr* te* iié te® Ser te® SOS HO m SKK 8¼ Sit B.aa ate gae ace ata aeg tg* ®s ttt ®ee ®ae «te m ta Vai «* Lr* Jla Asp Thr leu Har Oy* rnr flw Ata tep Leu ISO 12£ 130 efc® SM tas ata ecç «te «ta Mc «ee ««* ett e®i ®:ge ®*e »<?«? *·* m Met Oly fyr 11« Pr© Vai v*i m* Aia P*« Le« Ser Oly Ata Ale Ar® m 140 MS «** f<W cae 8®« «S» gté «*S **S S*« MS ftt aat tat gea 835 Ala %1 Λ la Ui 3 CMy Vai te® v«i La» Ci*i Asa 01 y Vai Aétl Tyr Ala ISO 185 160 m asa sss eas <St» «SÊ «ft tte esc tt* tal eta ti* ti® etg «a* m ft* Qlf ÃSfi Lett Pr* Oly Pte Pr* í%e Ser íle Pke lau. Leu Ala 1««. 170 HS ISO tt* tee tgè »le ase st* áa® «ta tai ®S* géS *0« m ea® aat éc* mi Lee Ser €γ& ru Utr V«1 Pra Ser Ate Ale 01a Vai lya Asa fhr m m tos »ii ®fps age tâô »** «*» »«e «wst g«e i#e fec* a&* »«c ata ac-t Ser S«r Ser r:yr Ifat Vai tte Asa Aap €ys Ser âaa As** $«.r lie 1¼ 200 205 11.0 74 ΡΕ1930416 m cai etc gag mt tet gtt etc CttS gtc tee ggl tgc gtc ccf tgc 102T Tm 013 Leu Gíu Ala Ala mi LâU Hí s Vai Pro Sly Cys ¥a;l ISpp Cys 215 22& 22S e$s& **s sts aat «*i tes e$e tgt gtg cea gte· te* e*ã sec im eu Arg Hl Óly Asn m Ser Ar* Cys Txp M Pm S*r Pt* Aati m m m 245 st* stg ess çag cec mt scc etc acg ca* «st ctg cgs ®CK cac 1133 lift âia Tal Art m® Fr$ m Ala tm Thr SI* Oíy Leu Arg Ihr Sk m 2S5 2&) ate gat 3t.g gtt gtg aís tscc scc acc iíe fcge tet set etc iac stg im ILí Âsp IiSt Vai. ¥àl Ser Ala Thx Phe Cys Sef Ala L*b Tyr m 2SS mè 2fS gf8 gae etc tgt g*e «te atg ete gcg $ee ©a* Mm U* ate i*« 121§ Siy Asp Leu Gy* Cif «U VéI M«t L*« AU ák Cl» sai PA* 11* ¥*l m m$ :8§0 us es* *»* ta* «ac Ut g*« e*a *«* fcg« eet t*e te* ate tac im Ser IVe ©lo Trr HlS frjs Phs %X 61» 0Ϊ» Cys ás» Cys Ser 11* Tyr 295 30& m$ cct gge MG it€ act g£S CSC cgç atf gea fSS e» •te ati atg aac U1S Pt» aijr mc Ile fhr Oly His Arg Èfet Al* trp Asp fctet Asit 31Ô 33S 330 3I§ tm teg eee mg gee â££ âtg ate et* fc* t*e ®*í *'*! &gt gte cce 13€3 75 ΡΕ1930416

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Lisboa, 19 de Janeiro de 2012

Claims

ΡΕ1930416 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção de uma partícula tipo vírus da hepatite C recombinante compreendendo a introdução numa (i) célula portadora de um replicão de RNA subge-nómico, que não inclui genes codificadores das proteínas estruturais do vírus da hepatite C, e compreendendo uma sequência nucleotídica compreendendo a região 5' não traduzida, a sequência nucleotídica codificadora das proteínas não estruturais e a região não traduzida 3' de um genoma de RNA derivado de uma estirpe do vírus da hepatite C do genótipo lb que é uma estirpe conl ou uma estirpe derivada da mesma em que as proteínas não estruturais são as proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B (ii) um vector de vírus da vacina ou um vector portador de um promotor EF-Ια expressando as proteínas derivadas do Core, El, E2 e p7 derivadas de pelo menos uma estirpe virai seleccionada do grupo consistindo nas estirpes do vírus da hepatite C dos genótipos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b que é diferente da estirpe do vírus da hepatite C como definido em (i) cultura da célula e recuperação da partícula tipo vírus produzida. 2 . 0 método de acordo com a reivindicação 1, em 2 ΡΕ1930416 que a estirpe do virus da hepatite C como definida em (ii) é do genótipo la e é a estirpe H77c, 1, H ou HC-J1. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe do virus da hepatite C como definida em (ii) é do genótipo lb e é a estirpe Jl, conl, TH, J, JT ou BK. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe do virus da hepatite C como definida em (ii) é do genótipo 2a e é a estirpe JFH1, HC-J6, JCH1 ou J6CF. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe do virus da hepatite C como definida em (ii) é do genótipo 3a e é a estirpe NZL1, K3a/650, 452 ou E-bl. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe do virus da hepatite C como definida em (ii) é do genótipo 3b e é a estirpe Tr. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o replicão de RNA ainda compreende pelo menos uma sequência de entrada interna do ribossoma (IRES) e/ou pelo menos um gene estranho. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência IRES e/ou o gene estranho está posicionado entre a região 5' não traduzida e a sequência codificadora da proteína NS3. 3 ΡΕ1930416 9. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula animal.
10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que a célula animal é a célula Huh7, a célula HepG2 ou uma linha celular estabelecida derivada destas células.
11. Uma partícula tipo vírus da hepatite C recombinante produzida pelo método de acordo coma reivindicação 1, que tem uma propriedade infecciosa mas não uma propriedade transmissora. Lisboa, 19 de Janeiro de 2012