WO2014051111A1 - C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びc型肝炎ウイルス粒子の産生方法 - Google Patents

C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びc型肝炎ウイルス粒子の産生方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014051111A1
WO2014051111A1 PCT/JP2013/076414 JP2013076414W WO2014051111A1 WO 2014051111 A1 WO2014051111 A1 WO 2014051111A1 JP 2013076414 W JP2013076414 W JP 2013076414W WO 2014051111 A1 WO2014051111 A1 WO 2014051111A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hcv
hepatitis
virus
cells
particle formation
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/076414
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博 堀田
千恵 青木
脇田　隆字
スダルモノ プラティビ
シトンプル ラトナ
ハキム ルクマン
カルドノ レオナルダス
Original Assignee
国立大学法人 神戸大学
東レ株式会社
公益財団法人東京都医学総合研究所
インドネシア大学
インドネシアン インスティテュート オブ サイエンシーズ（エルアイピーアイ）
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 神戸大学, 東レ株式会社, 公益財団法人東京都医学総合研究所, インドネシア大学, インドネシアン インスティテュート オブ サイエンシーズ（エルアイピーアイ） filed Critical 国立大学法人 神戸大学
Priority to CA 2886336 priority Critical patent/CA2886336A1/en
Priority to EP13841603.7A priority patent/EP2902485A4/en
Priority to CN201380062187.1A priority patent/CN105164251A/zh
Priority to US14/432,076 priority patent/US20150258189A1/en
Priority to JP2014538656A priority patent/JP6283315B2/ja
Publication of WO2014051111A1 publication Critical patent/WO2014051111A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/10—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28061—Methods of inactivation or attenuation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G01N2333/186—Hepatitis C; Hepatitis NANB
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to an agent for promoting formation of HCV particles and a method for enhancing production of HCV particles in cultured cells infected with hepatitis C virus (HCV).
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV is a causative virus that causes serious diseases.
  • treatment methods using interferon (IFN) and ribavirin, an antiviral drug are frequently used for many patients with hepatitis C.
  • IFN interferon
  • ribavirin an antiviral drug
  • RNA replicons In these HCV subgenomic RNA replicons, the region encoding the structural protein present downstream of HCV IRES in the 5 'untranslated region of HCV genomic RNA is replaced by the neomycin resistance gene and EMCV-IRES linked downstream thereof. It is. By introducing this RNA replicon into human hepatoma cell Huh7 and culturing it in the presence of neomycin, it was proved that the RNA replicon replicates autonomously in Huh7 cells.
  • Non-Patent Documents 5 to 7 In order to develop vaccines and the like more effectively, a system that can more effectively form HCV particles in infected cells and release them outside the cell is desired.
  • An object of the present invention is to provide an HCV particle formation promoter that can promote the formation of HCV particles in cultured cells, and further to provide a method for enhancing production of HCV particles. It is another object of the present invention to provide a method for evaluating an anti-HCV drug candidate substance and a method for producing an HCV vaccine.
  • statins or pharmaceutically acceptable salts thereof effectively promote the formation of HCV particles, and the HCV particles of the present invention
  • the invention relating to the formation accelerator was completed.
  • anti-HCV drug candidate substances can be evaluated by culturing HCV-infected cells in the presence of the HCV particle formation promoter and the anti-HCV drug candidate substance, and relate to a method for evaluating anti-HCV drug candidate substances.
  • the present invention has also been completed.
  • HCV vaccine could be produced by using the HCV particle produced by the HCV particle production enhancing method, and completed the present invention relating to the method for producing HCV vaccine.
  • this invention consists of the following. 1. An HCV particle formation promoter containing a statin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 2. 2. The HCV particle formation promoter according to item 1, wherein the statin is one or more statins selected from the group consisting of lovastatin, fluvastatin, simvastatin, atorvastatin, and pravastatin. 3. 3. The HCV particle formation promoter according to item 1 or 2, which contains a culture extract of a microorganism capable of producing a statin or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 4). 4. The HCV particle formation promoter according to item 3 above, wherein the microorganism is an Aspergillus filamentous fungus. 5. 5. 5.
  • a method for enhancing production of HCV particles comprising culturing HCV-infected cells in the presence of the HCV particle formation promoter according to any one of items 1 to 4. 6). 6. The method for enhancing production of HCV particles according to item 5, wherein the HCV particle formation promoter according to any one of items 1 to 4 is added and cultured after the HCV protein is formed in the HCV-infected cells. 7). 7. A method for producing an HCV vaccine, which is produced by inactivating HCV produced by the method for enhancing production of HCV particles according to item 5 or 6. 8). An HCV vaccine produced by the production method according to item 7 above. 9.
  • Anti-HCV wherein HCV-infected cells are cultured with an anti-HCV agent candidate substance in the presence of the HCV particle formation promoter according to any one of items 1 to 4 above, and the strength of inhibiting HCV particle formation is evaluated.
  • Evaluation method for drug candidate substances 10.
  • the method for evaluating an anti-HCV agent candidate substance according to item 9 including the following steps: 1) A step of adding the HCV particle formation promoter and anti-HCV agent candidate substance according to any one of items 1 to 4 to HCV-infected cells; 2) a culture process for culturing HCV-infected cells; 3) An evaluation step for measuring the amount of cultured HCV particles and evaluating the strength to inhibit the formation of HCV particles.
  • HCV particle formation accelerator of the present invention By culturing HCV-infected cells using the HCV particle formation accelerator of the present invention, it was possible to promote the formation of HCV particles and improve the production efficiency of HCV particles. According to the method of the present invention, production of HCV particles can be increased in cultured cells infected with HCV, and anti-HCV drug candidate substances can be evaluated. Furthermore, HCV vaccine can be efficiently produced using the HCV particles obtained by the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a purification flowchart from a cell extract of Aspergillus terreus as an example of producing the HCV particle formation promoter of the present invention.
  • the growth inhibitory concentration (IC 50 ) and cytotoxicity (CC 50 ) for each solution in each purification step are shown.
  • Example 1 It is a figure which shows the measurement result of a virus titer when the HCV particle formation promoter of this invention is added to a cultured cell.
  • Example 2 It is a figure which shows the examination result of the HCV particle formation promoter addition time to the cultured cell after HCV infection.
  • Example 3 It is a figure which shows the examination result of the HCV particle formation promoter addition time to the cultured cell after HCV infection.
  • Example 4 It is a figure which shows the measurement result of the virus particle formed inside and outside a cell when the HCV particle formation promoter of this invention is added to a cultured cell.
  • Example 5 It is a figure which shows the measurement result of RNA copy number in a cell when the HCV particle formation promoter of this invention is added to a cultured cell.
  • Example 6 It is a figure which shows the result of having confirmed the protein formation ability in a cell by the immuno-staining when the HCV particle formation promoter of this invention was added to the cultured cell. (Example 6)
  • the present invention relates to an HCV particle formation promoter containing a statin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • statins refer to cholesterol in the liver by inhibiting the action of HMG-CoA reductase (3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase), which is the rate-limiting enzyme of the mevalonate pathway, one of the biosynthetic pathways of cholesterol.
  • HMG-CoA reductase 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase
  • Lovastatin here is CAS number 75330-75-5, (1S, 3R, 7S, 8S, 8aR) -8- [2-((2R, 4R) -4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran -2-yl) ethyl] -3,7-dimethyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydro-1-naphthyl and simvastatin are CAS numbers 79902-63-9, (1S, 3R, 7S, 8S, 8aR) -8- [2-[(2R, 4R) -4-hydroxy-6-oxotetrahydropyran-2-yl] ethyl] -3,7-dimethyl-1,2,3,7, 8,8a-Hexahydro-1-naphthyl and fluvastatin sodium are CAS numbers 93957-55-2, (3R, 5S, 6E) -7- [3- (4-fluorophenyl) -1-
  • statin of the present invention one or more selected from the above can be selected and used.
  • Preferred examples include lovastatin, fluvastatin, simvastatin, atorvastatin, and pravastatin, and more preferred examples include lovastatin, fluvastatin, simvastatin, and atorvastatin.
  • the active ingredient contained in the HCV particle formation promoter of the present invention may be the above-mentioned statin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • Acupuncture statin, pharmaceutically acceptable salts thereof, and hydrates thereof may be produced synthetically or produced by microorganisms.
  • the HCV particle formation promoter of the present invention may be a composition containing a synthetically produced statin, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or a hydrate thereof as an active ingredient, a statin, It may be a cultivated extract of microorganisms capable of producing pharmaceutically acceptable salts and / or hydrates thereof.
  • the microorganism culture extract can be used as it is as the HCV particle formation promoter of the present invention.
  • the active ingredient contained in the HCV particle formation promoter of the present invention is a statin, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or a hydrate thereof.
  • the statin, the pharmaceutically By using a culture extract of a microorganism capable of producing a statin, a pharmaceutically acceptable salt, and / or a hydrate thereof as it is as an HCV particle formation promoter of the present invention, the statin, the pharmaceutically
  • the production of the HCV particle formation accelerator can be facilitated and the cost can be reduced compared to the synthesis and purification of acceptable salts and / or hydrates thereof.
  • Statins as active ingredients, pharmaceutically acceptable salts thereof, and hydrates thereof can be prepared synthetically or can be obtained from a culture extract of a biosynthesizable microorganism. Methods for synthesizing statins, pharmaceutically acceptable salts thereof, and hydrates thereof are not particularly limited, and methods known per se or any synthetic method developed in the future can be applied. Microorganisms that can produce statins, pharmaceutically acceptable salts thereof, and / or hydrates thereof are not particularly limited. For example, lovastatin includes Aspergillus filamentous fungi, and particularly preferably Aspergillus terreus. (See FIG. 1).
  • the pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited, and may be any salt known to those skilled in the art, for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt and the like.
  • the HCV particle formation promoter of the present invention may contain other compounds in addition to the above-mentioned statin, its pharmaceutically acceptable salt, and / or hydrate thereof as an active ingredient.
  • the dosage form of the HCV particle formation promoter of the present invention is not particularly limited as long as the statin as an active ingredient, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or a hydrate thereof can be cultured with HCV-infected cells. Good.
  • the HCV particle formation promoter of the present invention includes pharmaceutically acceptable carriers, excipients, binders, lubricants and colorants known to those skilled in the art in addition to the active ingredient of the present invention. Etc. can be included as appropriate.
  • the HCV particle formation promoter of the present invention can be easily prepared by any formulation preparation method known to those skilled in the art.
  • suitable carriers include lactose, starch, sucrose, glucose, methylcellulose, magnesium stearate, mannitol, sorbitol and croscarmellose sodium.
  • suitable binders include starch, gelatin, or natural sugars such as glucose, anhydrous lactose, free flowing lactose, beta-lactose and corn sweeteners, and gum arabic, guar gum, tragacanth or sodium alginate. Natural and synthetic gums such as carboxymethylcellulose, polyethylene glycol, and waxes.
  • Lubricants used in these dosage forms include sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate and sodium chloride.
  • the present invention also extends to a method for enhancing production of HCV particles by culturing HCV-infected cells together with the HCV particle formation promoter.
  • the cells that can be used for production of the HCV particles of the present invention may be HCV-permissive cells.
  • the HCV-permissive cell means a cell capable of infecting HCV genomic RNA and / or HCV.
  • HCV-permissive cells are cells derived from liver cells or lymphoid cells, but are not limited thereto. Specific examples of liver cells include primary liver cells, Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, and 293 cells.
  • HCV-permissive cells include Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells and cell lines derived from these cells. Particularly preferred are cells derived from Huh7 cells. Examples of such cells include Huh7.5 cells, Huh7.5.1 cells, and Huh7-it cells. Particularly, cells that can be subcultured are suitable. Further, eukaryotic cells are preferable, and human cells are more preferable. These cells may be commercially available or may be obtained from a cell depository. A cell in which an arbitrary cell (for example, a cancer cell or a stem cell) is established may be used.
  • Huh7.5 cells Blight KJ et al., J. Virol., 76: 13001-13014, 2002
  • Huh7.5.1 cells Zhong J et al., Proc. Natl. Acad) .Sci. USA, 929102: 9294-9299, 2005
  • Huh7-it cells Yu L et al., J. Virol. Methods, 169: 380-384, 2010
  • HCV particle formation promoter of the present invention to HCV-permissive cells infected with HCV selected from the above can promote the formation of HCV particles and enhance the production of HCV particles.
  • the HCV particle formation promoter is added to the culture solution at 10 to 200 ⁇ g / ml, preferably 20 to 50 ⁇ g / ml, and cultivated for 24 to 72 hours, preferably 36 to 72 hours, more preferably about 48 hours to promote HCV particle formation. Production can be enhanced.
  • HCV-infected cells can be confirmed using any known virus detection method.
  • the culture supernatant of HCV-permissive cells can be fractionated by a sucrose density gradient, and virus particles can be detected.
  • Cells in which HCV is infected and HCV genomic RNA is replicated express HCV protein. Therefore, if HCV-infected cells can be cultured and HCV protein can be detected, it can be presumed that the cells are replicating HCV genomic RNA.
  • HCV protein can be detected according to any known protein detection method. Specifically, it can be detected by the method of Kaito M et al., J. Gen. Virol., 75: l755-1760, 1994.
  • the ability to produce virus particles can be performed by confirming the number of infectious virus particles in the culture supernatant.
  • a culture supernatant containing infectious virus particles is inoculated into non-infected cells, and after 18 to 48 hours, preferably about 24 hours, the cells are fixed, immunostained with a specific antibody against HCV protein, and stained positive cells The number of infectious virus particles in the culture supernatant can be confirmed. More specifically, the culture supernatant containing infectious virus particles can be detected by reacting and detecting an anti-HCV Core protein antibody by the enzyme-linked Immunosorbent ⁇ ⁇ Assay (ELISA) method.
  • ELISA enzyme-linked Immunosorbent ⁇ ⁇ Assay
  • Analysis of HCV RNA that is replicated in HCV-infected cells can be analyzed by ordinary molecular biological methods.
  • the method for extracting RNA from the cells can be a method known per se. Specifically, the amount or sequence of the replicated RNA can be analyzed using Northern blotting, ribonuclease protection assay, RT-PCR, or the like. When RNA is quantified, Northern blotting or quantitative RT-PCR can be used, and when RNA sequence is analyzed, sequence analysis can be used.
  • HCV particles produced by the method of the present invention have the ability to infect HCV-permissive cells.
  • the HCV-permissive cell means a cell capable of infecting HCV genomic RNA and / or HCV.
  • HCV-permissive cells are cells derived from liver cells or lymphoid cells, but are not limited thereto. Specific examples of liver cells include primary liver cells, Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, and 293 cells. Examples include, but are not limited to, cells, HPB-Ma cells, and Daudi cells.
  • HCV-permissive cells include Huh7 cells, RCYM1RC cells, 5-15RC cells, HepG2 cells and cell lines derived from these cells. Particularly preferred are cells derived from Huh7 cells. Examples of such cells include Huh7.5 cells, Huh7.5.1 cells, and Huh7-it cells.
  • the method of purifying HCV particles from the virus solution containing HCV particles obtained above, such as a culture supernatant containing infectious virus particles, is not particularly limited, and a method known per se or a method developed in the future should be applied. Can do. For example, centrifugation and / or a filter can be used to remove cells and cell debris, and ultrafiltration concentration, chromatography and density gradient centrifugation can be combined in any order or purified alone.
  • the present invention further extends to a method for producing an HCV vaccine using HCV particles produced by the method of the present invention as an antigen. Furthermore, it extends to the HCV vaccine produced by this method.
  • HCV particles inactivated infectivity For the production of the HCV vaccine of the present invention, it is preferable to use HCV particles inactivated infectivity.
  • the infectious inactivation method is not particularly limited as long as it is a clinically usable method, and a method known per se or a method developed in the future can be employed.
  • it can be achieved by adding an inactivating agent such as formalin, ⁇ -propiolactone, glutardialdehyde and the like to the HCV particle suspension prepared according to the present invention and reacting with the HCV particles (Appaiahgari). MB et al., Vaccine, 22: 3669-3675, 2004).
  • the infectivity can be lost and the HCV particles can be inactivated quickly.
  • inactivation can be performed with little influence on proteins constituting HCV particles.
  • the ultraviolet ray source for inactivation can be performed using a commercially available germicidal lamp, particularly a 15 W germicidal lamp, but is not limited thereto.
  • the adjuvant is not particularly limited as long as it can be used as an adjuvant for vaccines and can be clinically used, but an adjuvant known per se or an adjuvant developed in the future can be applied.
  • aluminum hydroxide Alum
  • any substance that can be used clinically such as CpG oligonucleotides and double-stranded RNA.
  • PolyI C, polyICLC or polyIpolyC12U.
  • the HCV particle formation accelerator of the present invention can be further used in a method for evaluating anti-HCV agent candidate substances.
  • the anti-HCV agent include a substance having an inhibitory action on HCV particle production in cells and an inhibitory action on HCV particle release from cells.
  • the anti-HCV candidate substance is not particularly limited as long as it is a substance expected to have such an action, and examples thereof include proteins, peptides, and low molecular compounds.
  • HCV-infected cells are cultured for 36 to 72 hours with the HCV particle formation promoter of the present invention and the anti-HCV drug candidate substance or with only the anti-HCV drug candidate substance, and cultured HCV-infected cells. This is achieved by comparing the HCV particle formation ability. Specifically, a method including the following steps 1) to 3) can be employed.
  • Examples of the cells that can be used here include the above-described HCV-permissive cells.
  • Example 1 HCV particle formation promoter
  • a solution using Aspergillus terreus culture extract (B13) as a raw material was used as the HCV particle formation promoter of the present invention.
  • the HCV particle formation accelerator of this example was produced by the method shown in FIG.
  • the crude lovastatin solution “B15” or the purified lovastatin solution “B15.4.1” shown in FIG. 1 was used as an HCV particle formation accelerator.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • LC / MS liquid chromatography / mass spectrometry
  • Example 2 HCV infectivity when cultured cells were treated
  • the effect on the HCV infectivity when an HCV particle formation promoter was added to Huh7-it cells was confirmed.
  • HCV particle formation accelerator the purified lovastatin solution “B15.4.1” (FIG. 1) of Example 1 was used as an “HCV particle formation accelerator”.
  • a culture solution was added to the HCV particle formation promoter to adjust the lovastatin concentration at the time of virus inoculation and culture to 1.25 to 20 ⁇ g / ml.
  • Huh7 cell-derived HCV hypersensitive strain Huh7-it cells were used as cultured cells.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, non-essential amino acids, penicillin, and streptomycin was used and cultured in a 48-well culture plate.
  • HCV stock solution used for promoting the HCV particle formation of the present invention was prepared by the following method.
  • the HCV strain the JFH1 strain (genome sequence: GenBank accession number AB047639) was used.
  • RNA with the same sequence as the full genome of HCV JFH1 strain was introduced (transfected) into Huh7-it cells by electroporation (van den Hoff MJ et al., Nucleic Acids Res., 20: 2902, 1992). The culture supernatant after 72 hours was collected.
  • the infectious titer was calculated by the above and adjusted to 5.4 ⁇ 10 4 infectious units / ml was used as the HCV stock solution.
  • the infectious titer for preparing the HCV stock solution was determined by immunostaining.
  • An anti-HCV-Core (clone CP14) monoclonal antibody was used as the primary antibody, and an HRP-labeled goat anti-mouse antibody was used as the labeled antibody.
  • Konica Immunostain HRP-1000 Konica Minolta was added, and the number of viral antigen-positive cell populations (immune focus; also called focus) stained in blue was measured under a microscope to calculate the infectious titer.
  • HCV infection method After inoculating cultured cells with a mixture of the HCV stock solution (5.4 ⁇ 10 4 infection units / ml) prepared in 3) above and an HCV particle formation promoter, and adsorbing them at 37 ° C. for 2 hours After removing the virus solution and washing with the culture solution three times, HCV particle formation promoter was added in the same manner and cultured for 48 hours (lovastatin concentration: 1.25 to 20 ⁇ g / ml). The virus was inoculated into the cultured cells so that the multiplicity of infection (moi) was 0.1.
  • the infected cell culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes, and the centrifuged supernatant was used as a sample solution.
  • the above sample solution is inoculated into HCV-uninfected Huh7-it cells, and after 24 hours, the cells are fixed, patient serum that has been confirmed in advance to react strongly with HCV protein as a primary antibody, and Alexa488-labeled goat as a secondary antibody. Immunostaining was performed using an anti-human IgG antibody (Molecular Probe), the number of staining positive cells was counted, and the HCV infectivity titer was measured.
  • Example 3 Examination of timing of addition of HCV particle formation promoter to cultured cells (1) In this example, the effect on the HCV infectivity titer when HCV particle formation promoter was added to Huh7-it cells for 2 hours during HCV adsorption and / or 48 hours after infection was confirmed.
  • Virus infectivity titer measurement result As a result of the above, when HCV particle formation promoter is added after HCV adsorption and cultured, HCV particle formation promoter is present, regardless of whether HCV particle formation promoter is present during HCV adsorption. In the presence of 20 ⁇ g / ml lovastatin, a high virus infectivity value was observed for each sample solution in a concentration-dependent manner (FIG. 3).
  • Example 4 Examination of timing of addition of HCV particle formation promoter to cultured cells (2) In this example, the effect of lovastatin as an HCV particle formation promoter on HCV infectivity when added to Huh7-it cells for 2 hours during HCV adsorption or 48 hours after infection was confirmed.
  • Example 5 Confirmation of HCV particle formation inside and outside cultured cells
  • cultured cells were prepared by the same method as in Example 2, and an HCV particle formation promoter was added for 48 hours after infection from during HCV adsorption. The effect on the HCV infectivity inside and outside the cell when added to it cells was confirmed.
  • the purified lovastatin solution “B15.4.1” (FIG. 1) of Example 1 was used as an HCV particle formation accelerator.
  • a culture solution was added to the HCV particle formation promoter to adjust the lovastatin concentration at the time of virus inoculation and culture to 20 ⁇ g / ml.
  • a system containing dimethyl sulfoxide (DMSO) instead of the HCV particle formation accelerator was used as a control.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the sample for measuring the extracellular HCV infection titer was the same as in Example 2.
  • Samples for measuring intracellular HCV infectivity were prepared by the freeze-thaw method. First, the infected cells were washed with PBS, suspended by trypsin / EDTA treatment, and centrifuged to collect the cell pellet. It was washed once with PBS, suspended in 0.5 ml of culture medium, freeze-thawed three times at -80 ° C., and then centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant as a measurement sample. The virus titer measurement for each sample was performed in the same manner as in Example 2.
  • HCV particle production in cells was almost the same as that of the control, but the cells treated with HCV particle formation promoters were found to have significantly higher HCV particle production ability of 20 to 30 times extracellularly. (FIG. 5).
  • Example 6 Confirmation of the number of HCV RNA copies in cultured cells
  • cultured cells were prepared by the same method as in Example 2, and HCV particle formation promoters were added for 48 hours after infection from during HCV adsorption.
  • the effect of adding to Huh7-it cells on the number of HCV RNA copies in cultured cells on days 1, 2, 3, and 4 after HCV infection was confirmed.
  • the purified lovastatin solution “B15.4.1” (FIG. 1) of Example 1 was used as an HCV particle formation accelerator.
  • a culture solution was added to the HCV particle formation promoter to adjust the lovastatin concentration at the time of virus inoculation and culture to 20 ⁇ g / ml.
  • a system containing DMSO instead of the HCV particle formation accelerator was used as a control.
  • a sample for measuring intracellular HCV RNA copy was prepared in the same manner as in Example 5. From infected cells using Trizol (R) / Trizol (R ) -LS (Invitrogen Co.) to extract total RNA. From total RNA, using the ReverTra Ace (R) qPCR-Kit (Toyobo), 37 °C 15 min reverse transcription reaction, the enzyme deactivation reaction at 98 ° C. 5 minutes to synthesize cDNA. Measurements of the number of HCV RNA copies was carried out by LightCycler (R) quantitative RT-PCR method using the 480 real-time PCR system.
  • PCR conditions were as follows: heat denaturation at 95 ° C. for 10 seconds, followed by 40 cycles of 95 ° C. for 10 seconds and 60 ° C. for 20 seconds.
  • SEQ ID NO: 1 5'-CTTTGACTCCGTGATCGACT-3 '
  • SEQ ID NO: 2 5'-CCCTGTCTTCCTCTACCTG-3 '
  • Example 7 HCV particle production promoting effect of various statins
  • HCV particle production promoting effect was observed for various commercially available statins.
  • HCV particle formation accelerator a commercially available statin preparation was used as an HCV particle formation accelerator.
  • Lovastatin (mevinolin: Sigma-Aldrich; CAS No. 75330-75-5), fluvastatin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; CAS No. 93957-55-2), simvastatin (Sigma-Aldrich; CAS No. 79902- 63-9), atorvastatin calcium trihydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; CAS No. 134523-03-8) and pravastatin sodium salt hydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; CAS No. 81131-70-6) ) was used.
  • Each statin was adjusted by diluting with a culture solution so that the concentration at the time of culture became the concentration shown in Table 1.
  • DMSO 1 ⁇ g / ml
  • HCV particle formation accelerator 2 ⁇ g / ml
  • Huh7-it cells were cultured and used in the same manner as in Example 2.
  • Example 2 Method for measuring virus infectivity titer A sample for confirming virus-producing ability was prepared in the same manner as in Example 2, and the virus infectivity titer was measured in the same manner as in Example 2. 5) Virus infectivity titer measurement results The results are shown in Table 1. As a result, HCV particle formation promoter effect was recognized for each statin.
  • the production efficiency of HCV particles in the cell culture medium can be improved 10 times or more by culturing HCV-infected cells by adding the HCV particle formation promoter of the present invention.
  • an HCV vaccine can be produced efficiently and efficiently.
  • the anti-HCV agent Evaluation can be made.
  • an HCV vaccine can be efficiently produced using the HCV particles obtained according to the present invention.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

培養細胞においてHCV粒子の形成を促進しうるHCV粒子形成促進剤を提供し、更にはHCV粒子の産生増強方法を提供する。また、抗HCV剤候補物質の評価方法、並びにHCVワクチンの製造方法を提供する。スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分とするHCV粒子形成促進剤による。スタチン又はその薬学的に許容しうる塩をHCV感染培養細胞に加えることで、感染性HCV粒子が形成促進され、産生増強が認められる。また、当該HCV粒子形成促進剤と抗HCV剤候補物質の存在下にHCV感染細胞を培養することにより抗HCV剤候補物質を評価する。更に、HCV粒子の産生増強方法により産生されたHCV粒子を用いてHCVワクチンを作製する。

Description

C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びC型肝炎ウイルス粒子の産生方法
　本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV：Hepatitis C Virus）感染培養細胞におけるHCV粒子の形成促進剤及びHCV粒子の産生増強方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１２－２１５４７４号優先権を請求する。
　1989年にHCV遺伝子がクローニングされてから、C型肝炎患者血清中のHCVを培養細胞に感染させウイルス増殖細胞系を作製する方法の確立はHCV研究の最大のテーマであった。
　全世界で2億人、日本国内でも約200万人ものHCVキャリヤーが存在している。HCVの感染者は非常に高い確率で慢性肝炎を発症し、一部の患者においては慢性肝炎が更に肝硬変、肝癌へと進行する。つまりHCVは重篤な疾患を引き起こす原因ウイルスである。現在、多くのC型肝炎患者に対してインターフェロン(IFN)、及び抗ウイルス薬であるリバビリンを併用した治療方法が多用されている。しかしながら、IFNが効きにくいタイプのHCV感染者も多く、上記治療方法では治療効果が低いという問題点がある。またIFNは、患者に対して強い副作用を示すことも明らかになっている。そのため、HCVの感染拡大の防止及びHCVの撲滅に向けた、新規治療薬及び新規ワクチンの開発が急務となっている。
　一方、HCVの感染性クローンは、動物実験レベルではチンパンジーやヒト肝細胞を移植されたキメラマウスでのみ増殖が可能だが、患者検体から培養細胞に容易に感染できるウイルスは得られておらず、倫理的な問題やコストの面からチンパンジーの利用は進まず、研究面での貢献は厳しかった。HCVのサブゲノムを培養細胞中にて複製増殖させることが可能なHCVサブゲノムRNAレプリコンシステムが作製されたことが報告された（非特許文献１～４、特許文献１、２）。これにより、培養細胞を用いてHCVの複製機構を解析することが可能となった。これらのHCVサブゲノムRNAレプリコンは、HCVゲノムRNAの5'非翻訳領域中のHCV IRESの下流に存在する構造タンパク質をコードする領域を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したEMCV-IRESによって置換したものである。このRNAレプリコンを、ヒト肝癌細胞Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Huh7細胞内でRNAレプリコンが自律複製することが証明された。
　この後、HCVの全ゲノムRNAが自律複製するHCVフルゲノムRNAレプリコンが作製され、さらにHCVの生活環（ウイルス吸着・侵入からウイルス粒子の形成と細胞外への放出まで）を反映する感染増殖系が作製され、報告されている（非特許文献５～７）。ワクチン等をより効果的に開発するためには、さらに効果的に、感染細胞内でのHCV粒子の形成と細胞外への放出が行われる系が望まれる。
Science, 285:110-113, 1999 Science, 290:l972-74, 2000 J. Virol., 75:l2047-57, 2001 Gastroenterology, 125:l808-17, 2003 Nat. Med., 11:791-796, 2005 Science, 309:623-626, 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:9294-9299, 2005
特開 2001-17187号公報 国際公開パンフレットWO2004/104198A1
　本発明は、培養細胞においてHCV粒子の形成を促進しうるHCV粒子形成促進剤を提供することを課題とし、更にはHCV粒子の産生増強方法を提供することを課題とする。また、抗HCV剤候補物質の評価方法、並びにHCVワクチンの作製方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、スタチン又はその薬学的に許容しうる塩が効果的にHCV粒子の形成を促進することを見出し、本発明のHCV粒子形成促進剤に係る発明を完成した。また、当該当該HCV粒子形成促進剤と抗HCV剤候補物質の存在下にHCV感染細胞を培養することで抗HCV剤候補物質を評価しうることを見出し、抗HCV剤候補物質の評価方法に係る本発明も完成した。更にHCV粒子産生増強方法により産生されたHCV粒子を用いることでHCVワクチンを作製しうることを見出し、HCVワクチンの作製方法に係る本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、HCV粒子形成促進剤。
２．前記スタチンが、ロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン及びプラバスタチンからなる群から選択される１又は複数のスタチンである、前項１に記載のHCV粒子形成促進剤。
３．スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を産生しうる微生物の培養抽出物を含有する、前項１又は２に記載のHCV粒子形成促進剤。
４．前記微生物がAspergillus属糸状菌である、前項３に記載のHCV粒子形成促進剤。
５．前項１～４のいずれか１項に記載のHCV粒子形成促進剤の存在下でHCV感染細胞を培養する、HCV粒子の産生増強方法。
６．前項１～４のいずれか１項に記載のHCV粒子形成促進剤を、前記HCV感染細胞内にHCVタンパク質が形成された後に添加して培養する、前項５に記載のHCV粒子の産生増強方法。
７．前項５又は６に記載のHCV粒子の産生増強方法により産生されたHCVを不活化して作製する、HCVワクチンの作製方法。
８．前項７に記載の作製方法により作製された、HCVワクチン。
９．前項１～４のいずれか１項に記載のHCV粒子形成促進剤の存在下で、抗HCV剤候補物質と共にHCV感染細胞を培養し、HCV粒子の形成を阻害する強さを評価する、抗HCV剤候補物質の評価方法。
１０．以下の工程を含む、前項９に記載の抗HCV剤候補物質の評価方法：
１）前項１～４のいずれか１項に記載のHCV粒子形成促進剤及び抗HCV剤候補物質を、HCV感染細胞に添加する工程；
２）HCV感染細胞を培養する培養工程；
３）培養されたHCV粒子の量を測定し、HCV粒子の形成を阻害する強さを評価する評価工程。
　本発明のHCV粒子形成促進剤を用いてHCV感染細胞を培養することにより、HCV粒子を形成促進させ、HCV粒子の産生効率を向上させることができた。本発明の方法より、HCV感染培養細胞でHCV粒子の産生を増加させることができると共に、抗HCV剤候補物質の評価を行うことができる。更に、本発明により得られたHCV粒子を用いてHCVワクチンを効率よく生産することができる。
本発明のHCV粒子形成促進剤を作製する一例として、Aspergillus terreusの菌体抽出物から精製フローチャートを示す図である。ここでは、各精製工程における各溶液についての増殖阻害濃度(IC50)及び細胞毒性(CC50)が示されている。（実施例１） 本発明のHCV粒子形成促進剤を培養細胞に加えたときの、ウイルス力価の測定結果を示す図である。（実施例２） HCV感染後の培養細胞へのHCV粒子形成促進剤添加時期の検討結果を示す図である。（実施例３） HCV感染後の培養細胞へのHCV粒子形成促進剤添加時期の検討結果を示す図である。（実施例４） 本発明のHCV粒子形成促進剤を培養細胞に加えたときの、細胞内外で形成されたウイルス粒子の測定結果を示す図である。（実施例５） 本発明のHCV粒子形成促進剤を培養細胞に加えたときの、細胞内でのRNAコピー数の測定結果を示す図である。（実施例６） 本発明のHCV粒子形成促進剤を培養細胞に加えたときの、細胞内でのタンパク形成能を免疫染色により確認した結果を示す図である。（実施例６）
　本発明は、スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分とする、HCV粒子形成促進剤に関する。
　本明細書においてスタチンとは、コレステロールの生合成経路の一つメバロン酸経路の律速酵素であるHMG-CoA 還元酵素(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase) の働きを阻害し肝臓でのコレステロールの生合成を抑制することにより高コレステロール血症の治療薬として使用されている薬物であり、ロバスタチン（Lovastatin）、シンバスタチン（Simvastatin）、フルバスタチンナトリウム（Fluvastatin sodium）、プラバスタチン（Pravastatin）、アトルバスタチンカルシウム（Atorvastatin Calcium）、ピタバスタチンカルシウム（Pitavastatin calcium）、ロスバスタチンカルシウム（Rosuvastatin calcium）等をいう。
　ここにおいてロバスタチンとは、CAS番号75330-75-5、(1S,3R,7S,8S,8aR)-8-[2-((2R,4R)-4-ヒドロキシ-6-オキソテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)エチル]-3,7-ジメチル-1,2,3,7,8,8a-ヘキサヒドロ-1-ナフチルを、シンバスタチンとは、CAS番号79902-63-9、(1S,3R,7S,8S,8aR)-8-[2-[(2R,4R)-4-ヒドロキシ-6-オキソテトラヒドロピラン-2-イル]エチル]-3,7-ジメチル-1,2,3,7,8,8a-ヘキサヒドロ-1-ナフチルを、フルバスタチンナトリウムとは、CAS番号93957-55-2、(3R,5S,6E)-7-[3-(4-フルオロフェニル)-1-(1-メチルエチル)-1H-インドール-2-イル]-3,5-ジヒドロキシ-6-ヘプテン酸 ナトリウム、プラバスタチンとは、CAS番号81093-70-6、(1S,βR,δR,8aβ)-1,2,6,7,8,8a-ヘキサヒドロ-β,δ,6β-トリヒドロキシ-2β-メチル-8α-[(S)-2-メチル-1-オキソブトキシ]-1β-ナフタレンヘプタン酸を、アトルバスタチンカルシウムとは、CAS番号134523-03-8、(3R,5R)-7-[2-(4-フルオロフェニル)-5-イソプロピル-3-フェニル-4-[(フェニルアミノ)カルボニル]-1H-ピロール-1-イル]-3,5-ジヒドロキシヘプタン酸カルシウムを、ピタバスタチンカルシウムとは、CAS番号147511-69-1、(3R,5S,6E)-7-(2-シクロプロピル-4-(4-フルオルフェニル)キノリニ-3-イル)-3,5-ジヒドロキシヘプテ-6-ン酸を、ロスバスタチンカルシウムとは、CAS番号147098-20-2、ビス[(E)-7-[4-(4-フルオロフェニル)-6-イソプロピル-2-[メチル(メチルスルホニル) アミノ] ピリミジン-5-イル](3R,5S)-3,5-ジヒドロキシヘプテ-6-ン酸] カルシウムをいう。
　本発明のスタチンとして、上記より選択される１種又は複数種を選択して使用することができる。好ましくは、ロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、及びプラバスタチンが挙げられ、より好ましくは、ロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、及びアトルバスタチンが挙げられる。本発明のHCV粒子形成促進剤に含まれる有効成分は、上述のスタチン又はその薬学的に許容しうる塩であってもよいし、それらの水和物であってもよい。 スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及びそれらの水和物は、合成により作製してもよいし、微生物により産生させたものであってもよい。
　本発明のHCV粒子形成促進剤は、合成により作製されたスタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を有効成分として含む組成物であってもよいし、スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を産生しうる微生物の培養抽出物であってもよい。前記微生物の培養抽出物は、そのまま本発明のHCV粒子形成促進剤として用いることもできる。いずれの場合も、本発明のHCV粒子形成促進剤に含まれる有効成分は、スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物である。スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を産生しうる微生物の培養抽出物を、そのまま本発明のHCV粒子形成促進剤として用いることで、スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を合成し、精製するよりもHCV粒子形成促進剤の製造を容易に行うことができ、費用も軽減化することができる。
　有効成分としてのスタチン、その薬学的に許容しうる塩、及びそれらの水和物は、合成によって作製することもできるし、生合成可能な微生物の培養抽出物から取得することもできる。スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及びそれらの水和物を合成する方法は特に限定されず、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる合成方法を適用することができる。スタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を産生しうる微生物としては、特に限定されないが、例えばロバスタチンについてはAspergillus属糸状菌が挙げられ、特に好適にはAspergillus terreusが挙げられる（図１参照）。
　本発明において薬学的に許容される塩とは、特に制限なく、当業者に公知の任意の塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを挙げることが出来る。本発明のHCV粒子形成促進剤は、有効成分として上述のスタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物を含む他、他の化合物を含んでいてもよい。
　本発明のHCV粒子形成促進剤の剤型は特に限定されず、有効成分としてのスタチン、その薬学的に許容しうる塩、及び／又はそれらの水和物をHCV感染細胞と共に培養可能であればよい。本発明のHCV粒子形成促進剤には、上記を考慮して、本発明の有効成分以外に当業者に公知の薬学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤及び着色剤などを適宜含ませることができる。本発明のHCV粒子形成促進剤は、当業者に公知の任意の製剤調製方法で容易に調製することができる。 例えば、適当な担体の例としては、ラクトース、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール及びクロスカルメローズナトリウムなどを挙げることができる。或いは、適当な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、又は、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、ベータ-ラクトース及びトウモロコシ甘味料のような天然の糖、並びに、アラビアガム、グアーガム、トラガントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然及び合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びロウなどがある。又、これらの剤形に使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムなどがある。 
　本発明は、上記HCV粒子形成促進剤と共にHCV感染細胞を培養することによる、HCV粒子の産生増強方法にも及ぶ。本発明のHCV粒子の産生に使用可能な細胞は、HCV許容性細胞であればよい。ここでHCV許容性細胞とは、HCVゲノムRNAの複製能及び／又はHCVが感染しうる細胞を意味する。HCV許容性細胞は、肝臓細胞又はリンパ球系細胞由来の細胞であるが、これらに限定されるものではない。肝臓細胞としては、具体的には初代肝臓細胞や、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。好ましいHCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞及びそれらの細胞から派生した株化細胞などが挙げられる。特に好ましくはHuh7細胞から派生した細胞であり、このような細胞としては、例えばHuh7.5細胞やHuh7.5.1細胞、Huh7-it細胞などが挙げられる。特に継代培養可能な細胞であれば好適である。さらに真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよい。任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）を株化した細胞を使用してもよい。Huh7細胞から派生した細胞株として、Huh7.5細胞（Blight KJ et al., J. Virol., 76:13001-13014, 2002）及びHuh7.5.1細胞（Zhong J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:9294-9299, 2005）及びHuh7-it細胞（Yu L et al., J. Virol. Methods, 169:380-384, 2010）などが挙げられる。
　本発明のHCV粒子形成促進剤を、上記より選択されるHCVが感染しているHCV許容性細胞に添加することによりHCV粒子を形成促進させ、HCV粒子を産生増強させることができる。具体的には、上記より選択されるいずれかの培養したHCV許容性細胞にHCVを接種し、HCVを細胞内に吸着させた後に、培養液に上記HCV粒子形成促進剤を、10～200μg/ml、好ましくは20～50μg/mlの濃度になるように添加し、24～72時間、好ましくは36～72時間、より好ましくは約48時間培養することでHCV粒子を形成促進させ、HCV粒子を産生増強させることができる。
　HCV感染細胞のHCV粒子産生能は、公知の任意のウイルス検出法を用いて確認することができる。例えば、HCV許容性細胞の培養上清を、ショ糖密度勾配により分画し、ウイルス粒子を検出することができる。HCVが感染し、HCVゲノムRNAが複製された細胞は、HCVタンパク質を発現する。従って、HCV感染細胞を培養し、HCVタンパク質を検出することができれば、その細胞はHCVゲノムRNAを複製しているものと推定することができる。さらに、HCVタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に従って行うことができる。具体的には、Kaito M et al., J. Gen. Virol., 75:l755-1760, 1994の方法により、検出することができる。ウイルス粒子産生能は、培養上清中の感染性ウイルス粒子の数を確認することで行うことができる。感染性ウイルス粒子を含む培養上清を非感染細胞に接種し、18～48時間後、好ましくは約24時間後に細胞を固定して、HCVタンパク質に対する特異抗体を用いて免疫染色し、染色陽性細胞の数を計測することで、培養上清中の感染性ウイルス粒子の数を確認することができる。より具体的には、感染性ウイルス粒子を含む培養上清をEnzyme-linked Immunosorbent Assay（ELISA）法により抗HCV Coreタンパク質抗体を反応させ、検出することによって行うことができる。
　HCV感染細胞において複製されるHCV RNAの解析は、通常の分子生物学的方法で解析することができる。細胞からRNAを抽出する方法は、自体公知の方法によることができる。具体的には、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法やRT-PCR法などを用いて、複製されたRNAの量又は配列を解析することができる。RNAの定量を行う場合はノーザンブロット法や定量RT-PCRで、RNAの配列を解析する場合はシークエンス解析法を用いることができる。
　本発明の方法で産生されるHCV粒子は、HCV許容性細胞への感染能を有する。ここでHCV許容性細胞とは、HCVゲノムRNAの複製能及び／又はHCVが感染しうる細胞を意味する。HCV許容性細胞は、肝臓細胞又はリンパ球系細胞由来の細胞であるが、これらに限定されるものではない。肝臓細胞としては、具体的には初代肝臓細胞や、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。好ましいHCV許容性細胞としては、Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞及びそれらの細胞から派生した株化細胞などが挙げられる。特に好ましくはHuh7細胞から派生した細胞であり、このような細胞としては、例えばHuh7.5細胞やHuh7.5.1細胞、Huh7-it細胞などが挙げられる。
　感染性ウイルス粒子を含む培養上清など、上記で得られたHCV粒子を含むウイルス液から、HCV粒子を精製する方法は特に限定されず、自体公知の方法又は今後開発される方法を適用することができる。例えば、遠心及び／又はフィルターなどを用いて細胞及び細胞の残渣を除去し、限外濾過濃縮、クロマトグラフィー及び密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせて、あるいは単独で精製することができる。
　本発明は、さらに本発明の方法で産生されるHCV粒子を抗原とするHCVワクチンの作製方法にも及ぶ。更に当該方法により作製されたHCVワクチンにも及ぶ。
　本発明のHCVワクチンの作製に関しては、感染性が不活化されたHCV粒子を使用することが好ましい。感染性の不活化方法は臨床に使用可能な方法であればよく特に限定されず、自体公知の方法、今後開発される方法を採用することができる。例えばホルマリン、β－プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、本発明により作製されたHCV粒子浮遊液に添加混合し、HCV粒子と反応させることにより達成することができる（Appaiahgari MB et al., Vaccine, 22:3669-3675, 2004）。また、HCV粒子を紫外線で照射することで、感染性を失わせ、迅速に不活化することもできる。紫外線照射によれば、HCV粒子を構成するタンパク質などへの影響が少なく、不活化を行うことができる。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に15W殺菌灯を用いて行うことができるが、それらに限るものではない。
　アジュバントは、ワクチン用アジュバントとして使用でき臨床に使用可能であればよく特に限定されないが、自体公知のアジュバント又は今後開発されるアジュバントを適用することができる。例えば、既にワクチン用アジュバントとして使用が認可されている水酸化アルミニウム（Alum）等が望ましいが、臨床に使用できるものならば良く、CpGオリゴヌクレオチド、２本鎖RNAが挙げられ、２本鎖RNA として、polyI:C、polyICLC又はpolyIpolyC12Uを挙げることができる。
　本発明のHCV粒子形成促進剤は、さらに抗HCV剤候補物質の評価方法に利用することができる。ここにおいて、抗HCV剤は、細胞でのHCV粒子産生抑制作用や、細胞からのHCV粒子放出抑制作用を有する物質が挙げられる。抗HCV剤候補物質は、そのような作用が期待される物質であればよく、特に限定されないが、例えばタンパク質、ペプチドの他、低分子化合物などが挙げられる。
　抗HCV剤候補物質の評価方法としては、HCV感染細胞を本発明のHCV粒子形成促進剤と抗HCV剤候補物質と共に、あるいは抗HCV剤候補物質のみで36～72時間培養し、培養HCV感染細胞からHCV粒子形成能を比較することで達成される。具体的には、以下の１）～３）の工程を含む方法によることができる。
１）HCV感染細胞に、本発明のHCV粒子形成促進剤及び抗HCV剤候補物質を加える工程；
２）C型肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養工程；
３）培養されたC型肝炎ウイルス粒子の量を測定し、C型肝炎ウイルス粒子の形成を阻害する強さを評価する評価工程。
　ここで使用可能な細胞は、上述したHCV許容性細胞が挙げられる。
　本発明の理解を深めるために、本発明の内容を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）HCV粒子形成促進剤
　本実施例では、本発明のHCV粒子形成促進剤として、Aspergillus terreus培養抽出物（B13）を原料とする溶液を使用した。本実施例のHCV粒子形成促進剤は、図１に示す方法で作製した。以下の実施例では、図１に示す粗製ロバスタチン溶液「B15」又は精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」をHCV粒子形成促進剤として使用した。B15.4.1の組成を核磁気共鳴（NMR）法及び液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー（LC/MS）により調べた結果、ロバスタチンがほぼ純品で得られたことが確認された。ロバスタチン量は、乾燥させた精製標品（B15.4.1）を精密化学天秤にて秤量し、計測した。
（実施例２）培養細胞を処理したときのHCV感染価について
　本実施例では、HCV粒子形成促進剤をHuh7-it細胞に添加したときのHCV感染価に及ぼす影響を確認した。
１）HCV粒子形成促進剤
　実施例では、実施例１の精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」（図１）を「HCV粒子形成促進剤」として使用した。以下ではHCV粒子形成促進剤に培養液を加えて、ウイルス接種時及び培養時のロバスタチン濃度が1.25～20μg/mlとなるように調整し、使用した。
２）培養細胞
　本実施例では、培養細胞として、Huh7細胞由来のHCV高感受性株Huh7-it細胞を用いた。培地は、10%牛胎児血清・非必須アミノ酸・ペニシリン・ストレプトマイシン添加Dulbecco's modified Eagle's培地を使用し、48ウェル培養プレートを用いて培養した。
３）HCVストック液
　本発明のHCV粒子形成促進のために使用するHCVストック液は、以下の方法で調製した。HCV株はJFH1株（ゲノム配列：GenBank accession number AB047639）を使用した。HCV JFH1株フルゲノムと同一配列のRNAを、Huh7-it細胞にエレクトロポレーション法（van den Hoff MJ et al., Nucleic Acids Res., 20:2902, 1992）にて導入（トランスフェクション）し、導入72時間後の培養上清を回収した。回収した培養上清は、0.45μmのフィルター（Millipore社）に通して夾雑物を除いた後、別のHuh7-it細胞に添加し、72時間後のHCV感染細胞数をフォーカス法により計測することにより感染力価を算出し、5.4×104 感染単位/mlに調整したものをHCVストック液とした。HCVストック液調製のための感染力価は、免疫染色法により行った。１次抗体として抗HCV-Core（クローンCP14）モノクローナル抗体を用い、標識抗体としてHRP標識ヤギ抗マウス抗体を用いた。コニカイムノステインHRP-1000（コニカミノルタ社）を加え、青色に染色したウイルス抗原陽性細胞集団（免疫フォーカス；フォーカスとも呼ぶ）の数を顕微鏡下で測定し、感染力価を算出した。
４）HCV感染方法
　上記３）で調製したHCVストック液（5.4×104 感染単位/ml）とHCV粒子形成促進剤を混合したものを培養細胞に接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、同様にHCV粒子形成促進剤を加えて48時間培養した（ロバスタチン濃度：1.25～20μg/ml）。ウイルスは、多重感染価（multiplicity of infection; moi）が0.1となるように培養細胞に接種した。
５）ウイルス感染価測定方法
　ウイルス産生能を確認するために、上記感染細胞培養液を10,000 rpmで3分間遠心し、その遠心上清を試料液とした。上記試料液をHCV非感染Huh7-it細胞に接種し、24時間後に細胞を固定して、一次抗体としてHCVタンパク質に強く反応することが予め確認された患者血清、及び二次抗体としてAlexa488標識ヤギ抗ヒトIgG抗体（Molecular Probe社）を用いて免疫染色し、染色陽性細胞の数を計測し、HCV感染価を測定した。
６）ウイルス感染価測定結果
　上記の結果、5～20μg/mlのロバスタチンが含まれるように調整された精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」存在下で培養した場合に、ロバスタチン濃度依存的に各試料液について高いHCV感染価が認められた（図２）。
（実施例３）培養細胞へのHCV粒子形成促進剤の添加時期の検討（１）
　本実施例では、HCV粒子形成促進剤をHCV吸着中2時間及び／又は感染後48時間にHuh7-it細胞に添加したときのHCV感染価に及ぼす影響を確認した。
１）HCV粒子形成促進剤
　本実施例では、実施例１の粗製ロバスタチン溶液「B15」（図１）を「HCV粒子形成促進剤」として使用した。以下では、HCV粒子形成促進剤に培養液を加えて、ウイルス接種時及び培養時のロバスタチン濃度が1～50μg/mlとなるように調整し、使用した。
２）培養細胞
　本実施例では、実施例２と同手法でHuh7-it細胞を培養し、使用した。
３）HCV粒子形成促進剤の添加時期
　本実施例ではHCVを実施例２と同様にmoi=0.1となるように培養細胞に接種し、HCV粒子形成促進剤は以下のi)～iii)の時期に添加した。
i)吸着中＋吸着後
　培養細胞に、HCVとHCV粒子形成促進剤を混合したものを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、ロバスタチンを含むHCV粒子形成促進剤を加えて46時間培養した。
ii)吸着後のみ
　培養細胞にHCVを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤添加培養液を加えて46時間培養した。
iii))吸着中のみ
　培養細胞にHCVとHCV粒子形成促進剤を混合したものを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤を含まない培養液を加えて46時間培養した。
４）ウイルス感染価測定方法
　ウイルス産生能を確認するための試料は実施例２と同手法にて調製し、実施例２と同手法でウイルス感染価を測定した。
５）ウイルス感染価測定結果
　上記の結果、HCV吸着中にHCV粒子形成促進剤が存在するか否かに関わらず、HCV吸着以降にHCV粒子形成促進剤を添加して培養した場合に、5～20μg/mlのロバスタチン存在下で濃度依存的に各試料液について高いウイルス感染価が認められた（図３）。
（実施例４）培養細胞へのHCV粒子形成促進剤の添加時期の検討（２）
　本実施例では、HCV粒子形成促進剤としてロバスタチンを、HCV吸着中2時間又は感染後48時間にHuh7-it細胞に添加したときのHCV感染価に及ぼす影響を確認した。
１）HCV粒子形成促進剤
　本実施例では、実施例１の精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」（図１）を「HCV粒子形成促進剤」として使用した。以下では、HCV粒子形成促進剤に培養液を加えて、ウイルス接種時及び培養時のロバスタチン濃度が20μg/mlとなるように調整し、使用した。
２）培養細胞
　本実施例では、実施例２と同手法でHuh7-it細胞を培養し、使用した。
３）HCV粒子形成促進剤の添加時期
　本実施例ではHCVを実施例２と同様にmoi=0.1となるように培養細胞に接種し、HCV粒子形成促進剤は以下のi)～iii)の時期に添加した。
i)吸着中＋吸着後
　培養細胞にHCVとHCV粒子形成促進剤を混合したものを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤を添加した培養液を加えて46時間培養した。
ii)吸着中のみ
　培養細胞にHCVとHCV粒子形成促進剤を混合したものを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤を含まない培地を加えて46時間培養した。
iii)吸着後のみ
　培養細胞にHCVを接種して37℃で2時間吸着させた後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤を添加した培養液を加えて46時間培養した。
４）ウイルス感染価測定方法
　ウイルス産生能を確認するための試料は実施例２と同手法にて調製し、実施例２と同手法でウイルス感染価を測定した。
５）ウイルス感染価測定結果
　上記の結果、HCV吸着中にHCV粒子形成促進剤が存在するか否かに関わらず、HCV吸着以降にHCV粒子形成促進剤を添加して培養した場合に、高いウイルス感染価が認められた（図４）。
（実施例５）培養細胞内外でのHCV粒子形成確認
　本実施例では、培養細胞は実施例２と同手法により準備し、HCV吸着中から感染後48時間にわたってHCV粒子形成促進剤を、Huh7-it細胞に添加したときの、細胞内外でのHCV感染価に及ぼす影響を確認した。本実施例では、HCV粒子形成促進剤として、実施例１の精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」（図１）を使用した。以下では、HCV粒子形成促進剤に培養液を加えて、ウイルス接種時及び培養時のロバスタチン濃度が20μg/mlとなるように調整し、使用した。HCV粒子形成促進剤のかわりにジメチルスルホキシド (DMSO)を含む系をコントロールとした。
　細胞外のHCV感染価を測定するための試料は、実施例２と同手法によった。細胞内のHCV感染価を測定するための試料は、凍結融解法で調製した。まず、感染細胞をPBSで洗浄後、トリプシン/EDTA処理により浮遊させ、遠心して細胞ペレットを回収した。それをPBSで1回洗浄し、0.5 mlの培養液に懸濁して-80℃で3回凍結融解を繰り返した後、12,000rpmで5分間遠心して得られた上清を測定用試料とした。各試料についてのウイルス力価測定は、実施例２と同手法により行った。
　上記の結果、細胞内ではHCV粒子産生はコントロールとほとんど差を認めなかったが、細胞外ではHCV粒子形成促進剤で処理した系のほうが20倍～30倍と有意に高いHCV粒子産生能が確認された（図５）。
（実施例６）培養細胞内でのHCV RNAコピー数の確認
　本実施例では、培養細胞は実施例２と同手法により準備し、HCV吸着中から感染後48時間にわたってHCV粒子形成促進剤を、Huh7-it細胞に添加したときの、HCV感染後1、2、3、4日目での、培養細胞内でのHCV RNAコピー数に及ぼす影響を確認した。本実施例では、HCV粒子形成促進剤として、実施例１の精製ロバスタチン溶液「B15.4.1」（図１）を使用した。以下では、HCV粒子形成促進剤に培養液を加えて、ウイルス接種時及び培養時のロバスタチン濃度が20μg/mlとなるように調整し、使用した。HCV粒子形成促進剤のかわりにDMSOを含む系をコントロールとした。
　細胞内のHCV RNAコピーを計測するための試料は、実施例５と同手法で調製した。感染細胞からTrizol(R)/Trizol(R)-LS(Invitrogen社)を用いて全RNAを抽出した。全RNAから、ReverTra Ace(R) qPCR-Kit (Toyobo)を用いて、37℃15分間逆転写反応、98℃5分間で酵素失活反応を行い、cDNAを合成した。HCV RNAコピー数の測定は、LightCycler(R) 480 リアルタイムPCRシステムを用いた定量RT-PCR法により行った。HCV特異的プライマーとして配列番号１及び２に示す塩基配列からなる、NS3部位へのプライマーを用い、PCR反応溶液は10μl 2×SYBR(R) Premix ExTaq(Takara)、0.4μl 各プライマー(10 pmol/μl)、2μl cDNAテンプレート、7.2μl 滅菌蒸留水を用いた。PCR条件は95℃、10秒の熱変性後、95℃10秒、60℃20秒のサイクルを40回繰り返した。
（配列番号１）5'-CTTTGACTCCGTGATCGACT-3'
（配列番号２）5'-CCCTGTCTTCCTCTACCTG-3 '
　上記の実験結果より、細胞内HCV RNA複製量はHCV粒子形成促進剤の有無によって影響を受けないことがわかった（図６）。また、免疫染色により、細胞内HCVタンパク質（抗原）合成量もロバスタチンの有無によって影響を受けないことがわかった（図７）。これらの実験結果より、ロバスタチンのHCV産生亢進作用は、HCV RNA複製やHCVタンパク質合成までの段階ではなく、それ以降のHCV粒子形成あるいは放出の段階で作用しているものと推測された。
（実施例７）各種スタチンのHCV粒子産生促進効果
　本実施例では、市販されている各種スタチンについて、HCV粒子産生促進効果を観察した。
１）HCV粒子形成促進剤
　本実施例では、HCV粒子形成促進剤として市販のスタチン製剤を使用した。ロバスタチン（メビノリン：シグマアルドリッチ社製；CAS番号75330-75-5）、フルバスタチンナトリウム（和光純薬工業株式会社製；CAS番号93957-55-2）、シンバスタチン（シグマアルドリッチ社製；CAS番号79902-63-9）、アトルバスタチンカルシウム三水和物（和光純薬工業株式会社製；CAS番号134523-03-8）及びプラバスタチンナトリウム塩水和物（和光純薬工業株式会社製；CAS番号81131-70-6）を用いた。各スタチンは、培養時の濃度が表１に示す濃度になるように培養液で希釈して調整した。コントロールとしてHCV粒子形成促進剤のかわりにDMSO（1μg/ml）を用いた。
２）培養細胞
　本実施例では、実施例２と同手法でHuh7-it細胞を培養し、使用した。
３）HCV粒子形成促進剤の添加時期
　本実施例ではHCVをmoi=0.1となるように培養細胞に接種して37℃で2時間吸着後、ウイルス液を除き、培養液で3回洗浄後、HCV粒子形成促進剤を添加した培養液を加えて46時間培養した。
４）ウイルス感染価測定方法
　ウイルス産生能を確認するための試料は実施例２と同手法にて調製し、実施例２と同手法でウイルス感染価を測定した。
５）ウイルス感染価測定結果
　上記の結果を表１に示した。その結果、各スタチンについてHCV粒子形成促進剤効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上詳述したように、本発明のHCV粒子形成促進剤を添加してHCV感染細胞を培養することにより、細胞培養液にHCV粒子の産生効率を10倍以上向上させることが期待できる。これにより効果的にHCVワクチンを効率よく生産することができる。さらに、HCV感染細胞を本発明のHCV粒子形成促進剤及び抗HCV剤候補物質と共に培養し、細胞培養液中のウイルス力価及び／又はHCV RNAコピー数の計測を行うことで、抗HCV剤の評価を行うことができる。また、更に、本発明により得られたHCV粒子を用いてHCVワクチンを効率よく生産することができる。

Claims (10)

  1. スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤。
  2. 前記スタチンが、ロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン及びプラバスタチンからなる群から選択される１又は複数のスタチンである、請求項１に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤。
  3. スタチン又はその薬学的に許容しうる塩を産生しうる微生物の培養抽出物を含有する、請求項１又は２に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤。
  4. 前記微生物がAspergillus属糸状菌である、請求項３に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤の存在下でC型肝炎ウイルス感染細胞を培養する、C型肝炎ウイルス粒子の産生増強方法。
  6. 請求項１～４のいずれか１項に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤を、前記C型肝炎ウイルス感染細胞内にC型肝炎ウイルスタンパク質が形成された後に添加して培養する、請求項５に記載のC型肝炎ウイルス粒子の産生増強方法。
  7. 請求項５又は６に記載のC型肝炎ウイルス粒子の産生増強方法により産生されたC型肝炎ウイルスを不活化して作製する、C型肝炎ウイルスワクチンの作製方法。
  8. 請求項７に記載の作製方法により作製された、C型肝炎ウイルスワクチン。
  9. 請求項１～４のいずれか１項に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤の存在下で、抗C型肝炎ウイルス剤候補物質と共にC型肝炎ウイルス感染細胞を培養し、C型肝炎ウイルス粒子の形成を阻害する強さを評価する、抗C型肝炎ウイルス剤候補物質の評価方法。
  10. 以下の工程を含む、請求項９に記載の抗C型肝炎ウイルス剤候補物質の評価方法：
    １）請求項１～４のいずれか１項に記載のC型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及び抗C型肝炎ウイルス剤候補物質を、C型肝炎ウイルス感染細胞に添加する工程；
    ２）C型肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養工程；
    ３）培養されたC型肝炎ウイルス粒子の量を測定し、C型肝炎ウイルス粒子の形成を阻害する強さを評価する評価工程。
PCT/JP2013/076414 2012-09-28 2013-09-27 C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びc型肝炎ウイルス粒子の産生方法 WO2014051111A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA 2886336 CA2886336A1 (en) 2012-09-28 2013-09-27 Hepatitis c virus particles formation promoter, and method for producing hepatitis c virus particles
EP13841603.7A EP2902485A4 (en) 2012-09-28 2013-09-27 PROMOTER OF FORMATION OF HEPATITIS C VIRUS PARTICLES, AND METHOD FOR PRODUCING HEPATITIS C VIRUS PARTICLES
CN201380062187.1A CN105164251A (zh) 2012-09-28 2013-09-27 C型肝炎病毒颗粒形成促进剂和c型肝炎病毒颗粒的产生方法
US14/432,076 US20150258189A1 (en) 2012-09-28 2013-09-27 Hepatitis c virus particles formation promoter, and method of producing hepatitis c virus particles
JP2014538656A JP6283315B2 (ja) 2012-09-28 2013-09-27 Ｃ型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びｃ型肝炎ウイルス粒子の産生方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012215474 2012-09-28
JP2012-215474 2012-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014051111A1 true WO2014051111A1 (ja) 2014-04-03

Family

ID=50388501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/076414 WO2014051111A1 (ja) 2012-09-28 2013-09-27 C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びc型肝炎ウイルス粒子の産生方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20150258189A1 (ja)
EP (1) EP2902485A4 (ja)
JP (1) JP6283315B2 (ja)
CN (1) CN105164251A (ja)
CA (1) CA2886336A1 (ja)
WO (1) WO2014051111A1 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001017187A (ja) 1999-04-03 2001-01-23 Ralf Bartenschlager Ｃ型肝炎ウイルス細胞培養系、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物、細胞培養系または構築物の使用、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得する方法、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノム、ｃ型肝炎ウイルス−部分ゲノム、または任意のｃ型肝炎ウイルス−構築物の突然変異体の製法、細胞培養に適合したｃ型肝炎ウイルス−構築物、その突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノムの突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子、およびこれで感染した細胞
WO2004104198A1 (ja) 2003-05-26 2004-12-02 Toray Industries, Inc. 遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス（HCV）ゲノム由来の核酸を含む核酸構築物、及び該核酸構築物を導入した細胞
WO2009011413A1 (ja) * 2007-07-13 2009-01-22 Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Infectious Diseases エピトープタグ化ｃ型肝炎ウイルス粒子の作製と利用
WO2011024875A1 (ja) * 2009-08-28 2011-03-03 財団法人 東京都医学研究機構 Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来のポリヌクレオチド及びその利用
WO2011118743A1 (ja) * 2010-03-25 2011-09-29 国立大学法人東京大学 感染性ｃ型肝炎ウイルス高生産hcv変異体及びその利用
JP2012501664A (ja) * 2008-09-12 2012-01-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 細胞培養液中における感染性ｃ型肝炎ウイルス粒子の産生
JP2012215474A (ja) 2011-03-31 2012-11-08 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 冷却材配管構造

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2851807C (en) * 2004-02-20 2016-06-28 Toray Industries, Inc. Nucleic acid construct containing full length genome of human hepatitis c virus, recombinant full length virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis c virus particle
US20120251572A1 (en) * 2009-09-30 2012-10-04 Takaji Wakita Hepatitis c virus vaccine composition
CN102086183B (zh) * 2009-12-04 2014-04-16 北大方正集团有限公司 一种提取分离他汀类物质的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001017187A (ja) 1999-04-03 2001-01-23 Ralf Bartenschlager Ｃ型肝炎ウイルス細胞培養系、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物、細胞培養系または構築物の使用、ｃ型肝炎ウイルス−ｒｎａ−構築物の細胞培養に適合した突然変異体を獲得する方法、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノム、ｃ型肝炎ウイルス−部分ゲノム、または任意のｃ型肝炎ウイルス−構築物の突然変異体の製法、細胞培養に適合したｃ型肝炎ウイルス−構築物、その突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス−全長ゲノムの突然変異体、ｃ型肝炎ウイルス粒子またはウイルス様粒子、およびこれで感染した細胞
WO2004104198A1 (ja) 2003-05-26 2004-12-02 Toray Industries, Inc. 遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス（HCV）ゲノム由来の核酸を含む核酸構築物、及び該核酸構築物を導入した細胞
WO2009011413A1 (ja) * 2007-07-13 2009-01-22 Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Infectious Diseases エピトープタグ化ｃ型肝炎ウイルス粒子の作製と利用
JP2012501664A (ja) * 2008-09-12 2012-01-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 細胞培養液中における感染性ｃ型肝炎ウイルス粒子の産生
WO2011024875A1 (ja) * 2009-08-28 2011-03-03 財団法人 東京都医学研究機構 Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来のポリヌクレオチド及びその利用
WO2011118743A1 (ja) * 2010-03-25 2011-09-29 国立大学法人東京大学 感染性ｃ型肝炎ウイルス高生産hcv変異体及びその利用
JP2012215474A (ja) 2011-03-31 2012-11-08 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 冷却材配管構造

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPAIAHGARI MB ET AL., VACCINE, vol. 22, 2004, pages 3669 - 3675
BADER T. ET AL.: "ROSUVASTATIN COMPARED TO FLUVASTATIN, SIMVASTATIN, AND RIBAVIRIN FOR ANTI-HCV ACTIVITY IN VITRO", JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 52, no. SUPPL., 2010, pages S289, XP026998641 *
BLANCHET MATTHIEU ET AL.: "SKI-1/S1P inhibition: A promising surrogate to statins to block Hepatitis C virus replication", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 95, May 2012 (2012-05-01), pages 159 - 166, XP028426118 *
BLIGHT KJ ET AL., J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 13001 - 13014
DELANG LEEN ET AL.: "Statins potentiate the in vitro anti-hepatitis C virus activity of selective hepatitis C virus inhibitors and delay or prevent resistance development", HEPATOLOGY, vol. 50, 2009, pages 6 - 16, XP002731240 *
GASTROENTEROLOGY, vol. 125, 2003, pages 1808 - 17
J. VIROL., vol. 75, 2001, pages 12047 - 57
KAITO M ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 75, 1994, pages 1755 - 1760
MASANORI IKEDA ET AL.: "The antiviral activity of antihyperlipidemics", MODERN MEDICAL LABORATORY, vol. 34, no. 5, 2006, pages 491 - 494, XP008178544 *
NAT. MED., vol. 11, 2005, pages 791 - 796
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 102, 2005, pages 9294 - 9299
SCIENCE, vol. 285, 1999, pages 110 - 113
SCIENCE, vol. 290, 2000, pages 1972 - 74
SCIENCE, vol. 309, 2005, pages 623 - 626
See also references of EP2902485A4
VAN DEN HOFF MJ ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 20, 1992, pages 2902
YU L ET AL., J. VIROL. METHODS, vol. 169, 2010, pages 380 - 384
ZHONG J ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 102, 2005, pages 9294 - 9299

Also Published As

Publication number Publication date
EP2902485A1 (en) 2015-08-05
JPWO2014051111A1 (ja) 2016-08-25
CA2886336A1 (en) 2014-04-03
US20150258189A1 (en) 2015-09-17
JP6283315B2 (ja) 2018-02-21
EP2902485A4 (en) 2016-03-16
CN105164251A (zh) 2015-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lorenzo et al. Hepatitis C virus evasion mechanisms from neutralizing antibodies
Tashiro et al. Immunotherapy against cancer-related viruses
Lambotin et al. A look behind closed doors: interaction of persistent viruses with dendritic cells
Silvestri et al. Hepatitis C virus infection among cryoglobulinemic and non-cryoglobulinemic B-cell non-Hodgkin's lymphomas
Elsebai et al. Pan-genotypic hepatitis C virus inhibition by natural products derived from the wild Egyptian artichoke
US8663653B2 (en) Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 2B
Kao et al. The core of hepatitis C virus pathogenesis
Ng et al. Persistent dengue infection in an immunosuppressed patient reveals the roles of humoral and cellular immune responses in virus clearance
Kumar et al. Immune responses against hepatitis C virus genotype 3a virus-like particles in mice: A novel VLP prime-adenovirus boost strategy
Ren et al. N-glycosylation-mutated HCV envelope glycoprotein complex enhances antigen-presenting activity and cellular and neutralizing antibody responses
CA2794359A1 (en) Infectious hepatitis c virus-high producing hcv variants and use thereof
JP4009732B2 (ja) レポーター遺伝子産物を発現するｈｃｖ全長ゲノム複製細胞、並びに、当該細胞を用いたスクリーニング方法およびスクリーニングキット
JP6283315B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びｃ型肝炎ウイルス粒子の産生方法
Chowdhary et al. Recent updates on viral Oncogenesis: Available preventive and therapeutic entities
Qin et al. Fetal bovine serum inhibits hepatitis C virus attachment to host cells
El‐Farrash et al. In vitro infection of immortalized primary hepatocytes by HCV genotype 4a and inhibition of virus replication by cyclosporin
JP5535073B2 (ja) 新規ｈｃｖレプリコン複製細胞および全長ｈｃｖｒｎａ複製細胞、ならびにこれらの利用
Ye et al. Centrifugal enhancement of hepatitis C virus infection of human hepatocytes
Zhou et al. Development of a dendritic cell vaccine encoding multiple cytotoxic T lymphocyte epitopes targeting hepatitis C virus
JP2007063284A (ja) Ｃ型肝炎治療用組成物、ｃ型肝炎治療剤およびｃ型肝炎治療用キット
Weilandt et al. Mutational modifications of hepatitis A virus proteins 2B and 2C described for cell culture-adapted and attenuated virus are present in wild-type virus populations
Chang et al. HMG CoA reductase inhibitors inhibit HCV RNA replication of HCV genotype 1b but not 2a
JP6147157B2 (ja) 抗ｃ型肝炎ウイルス剤
WO2008147735A1 (en) Identification of adaptive mutations that increase infectivity of hepatitis c virus jfh1 strain in cell culture
Saw et al. Systemic Onco-Spheres: Viruses in Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201380062187.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13841603

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014538656

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2886336

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14432076

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013841603

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013841603

Country of ref document: EP