CN101748149B - 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组表达质粒，其含有真核表达载体pEGFP、丙型肝炎病毒的全基因组、以及核酶序列；本发明还公开了一种含有该重组表达质粒的哺乳动物细胞；以及包括该细胞在内的丙肝病毒治疗药物的筛选系统和方法；本系统和方法的优点是稳定性好、操作简单。

Description

含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法

技术领域

本发明涉及一种重组质粒、重组哺乳动物细胞以及药物筛选系统和方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体。全球HCV的感染率约为3％，约1.7亿人感染HCV，我国约为5000万人，并且年发病率呈高速上升趋势。2008年发病人数比2007年上升了16.79％，达到108446人。HCV感染易慢性化，其慢性化率可高达85％，部分慢性丙型肝炎患者最终可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。目前主要采用干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎，但并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效，成功率仅有45％左右，而且复发率也非常高。因此，预防和治疗丙型肝炎，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。然而有效的HCV体外培养细胞模型的缺乏严重阻碍了我们对HCV致病机制的研究和保护性疫苗及抗病毒药物的开发。

丙型肝炎病毒是单股正链RNA(ssRNA)，属黄病毒(Flaviviridae)科嗜肝病毒属。HCV分为6个基因型(核酸序列30-35％差别)，每个基因型又分为多个亚型。HCV基因组全长9.6kb，由5’与3’非编码区(non-coding region，NCR)及一个编码3011个氨基酸的开放阅读框(open reading frame，ORF)组成。5’NCR在不同病毒株中高度保守，分为I-IV四个功能区，而且包含一个内部核糖体进入位点(internalribosome-entry site，IRES)，IRES可以独立结合核糖体的40S亚单位，不依赖帽子结构启动ORF的翻译。3’NCR位于ORF下游，由3个部分构成，即可变区、多聚嘧啶区及98nt高度保守末端，是HCV基因组体内外复制不可或缺的成分。基因组的ORF编码一个多聚蛋白前体，通过宿主和病毒蛋白酶的裂解作用产生10个蛋白。

自从在1989年鉴定出HCV以来，人们就一直努力建立HCV体内外模型，以方便HCV的相关研究。有人曾用含HCV的血清感染人的淋巴细胞系，人的胆上表皮细胞，肝原代细胞建立细胞模型。尽管原代干细胞能被HCV血清成功感染，但HCV复制水平低，只能凭借RT-PCR技术检测病毒。后来，人们逐步建立了多种复制子模型，方便了研究。但是这些模型普遍存在着病毒滴度低、感染性差的问题。2005年6月，HCV体外细胞培养体系取得了突破性进展。日本东京都神经科学研究所微生物学系Wakita教授从一例暴发型丙型肝炎患者(JFH1)的血清中得到HCV全长RNA(GenBank ID：AB047639.1)，通过反转录的方法得到HCV cDNA，并把其构建在T7启动子后。在随后的实验中，他采用体外转录的方法获得JFH1 HCV全序列RNA经电转染至Huh7细胞，证明在Huh7细胞系中JFH1具有较高的复制率。该方法可以在体外得到较高滴度的HCV颗粒，但是由于该模型每次都需要进行体外转录，然后进行电转，无法得到稳定地分泌HCV的细胞系，限制了它的广泛应用，并且由于每次操作的不同，也降低了它的稳定性。

因此该技术领域需要一种简便、稳定的HCV治疗药物的筛选系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、稳定的HCV治疗药物的筛选系统。

本发明的第二个目的是提供一种丙肝病毒治疗药物的筛选方法。

本发明拟通过在HCV cDNA两端引进转录后具有自剪切作用的核酶序列(如图1所示)，构建重组质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme，脂质体转染质粒入Huh7细胞和HepG2细胞，随后进行筛选，得到稳定分泌HCV颗粒的细胞克隆，以该细胞克隆为基础形成HCV治疗药物的评价系统，该系统可用于HCV治疗药物的筛选和评价。

为完成上述发明目的，本发明提供了第一种重组表达质粒，其含有以下成分：真核表达载体pEGFP-N1，丙型肝炎病毒的全基因组，以及核酶序列。

在本发明的一个优选技术方案中，所述丙肝病毒株为JFH1，其全基因组序列为GenBank ID：AB047639.1所表示(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/13122261)。

本发明还提供了第二种重组表达质粒，其特征在于：与上述第一种重组质粒相比，将所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A，从而使其编码产物失去RNA聚合酶活性。

本发明还提供了分别含有上述两种重组质粒的哺乳动物细胞，在本发明的一个优选技术方案中，所述细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。

本发明还提供了一种丙肝病毒治疗药物的筛选系统，该系统包括：含有第一种重组表达质粒的哺乳动物细胞，含有第二种重组表达质粒的哺乳动物细胞，以及丙型肝炎病毒的检测试剂盒。

在本发明的一个优选技术方案中，所述哺乳动物细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。

在本发明的一个优选技术方案中，丙型肝炎病毒的检测试剂盒为丙型肝炎病毒RNA的PCR荧光定量检测试剂盒。

本发明还提供了一种丙肝病毒治疗药物的筛选的方法，所述方法包括：

(1)培养含有第一种重组表达质粒的哺乳动物细胞，培养含有第二种重组表达质粒的哺乳动物细胞；

(2)在上述两种哺乳动物细胞的培养物中加入待筛选的药物，并保持1-3天的作用时间；

(3)检测上述两种哺乳动物细胞的培养物上清中丙型肝炎病毒RNA的量；

(4)对照(3)中两种哺乳动物检测数值的差异，从而得出所述药物的筛选结果。

在本发明的一个优选技术方案中，步骤(1)所述哺乳动物细胞为Huh7细胞或HepG2细胞，步骤(3)中所述的丙型肝炎病毒RNA的检测为PCR荧光定量检测。

综上所述，本发明通过在HCV cDNA两端引进转录后具有自剪切作用的核酶序列(如图1)，构建重组质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme，脂质体转染质粒入哺乳动物细胞，使所述重组质粒能够在细胞内转录后进行自剪切，可以提供正确剪切的HCV全基因组的mRNA序列，随后对转染细胞进行筛选，得到稳定分泌HCV颗粒的细胞克隆，以该细胞克隆为基础形成HCV治疗药物的筛选系统，并辅以不具有正确剪切功能的细胞克隆作为对照，该系统可用于HCV治疗药物的筛选。通过本发明提供的丙肝病毒治疗药物的筛选的方法显示，本发明的HCV治疗药物的评价系统可灵敏进行体外HCV药物筛选。由于该模型基础为筛选到的在细胞内完成转录的稳定细胞系，因此具有保存方便的优点。同时，在药物筛选阶段，无需进行体外转录、电转等诸多步骤，只需复苏细胞，直接完成HCV治疗药物的筛选和评价，极大地提高了系统的稳定性，同时也易于操作和重复。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1：核酶序列示意图；

图2：含HCV gRNA的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme示意图；

图3：对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND示意图；

图4：前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme测序结果图；

图5：前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme测序结果图；

图6：中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)鉴定图；

图7：原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图8：目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图9：HCV核心抗原免疫荧光检测图；

图10：HCV核心抗原免疫印迹检测图；

图11：HCV颗粒电镜观察图；

图12：IFN-α治疗结果曲线图。

具体实施方式

目前，临床上治疗丙型肝炎，通常采用干扰素联合利巴韦林的方法，以下以α-干扰素(IFN-α)为例，进一步阐述本发明的技术方案和效果。

各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、克隆载体质粒pUC18/pUC19及碱性磷酸酶CIAP均购自Takara公司，真核表达载体pEGFP-N1购自Clontech公司，细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，细胞培养基DMEM购自GIBCO公司，优等胎牛血清购自德国BIO-CHROM公司，质粒提取试剂盒分别购自北京全式金公司和Qiagen公司，HCV PCR荧光定量检测试剂盒(国药准字S20040078)购自深圳匹基生物工程有限公司，抗HCV核心单抗购自Thermo公司，封闭用山羊血清、HRP标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山金桥公司，HepG2细胞和Huh7细胞均购自中国科学院上海生命科学院细胞库。

含有HCV JFH1基因组全长cDNA的质粒pJFH1由本室根据GenBank ID：AB047639.1公布序列合成。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme的构建

由于质粒pJFH1较大，直接进行突变PCR引入核酶序列有一定难度，故设计如下：首先，通过酶切的方法切除pJFH1中的一部分序列，然后引入核酶序列，得到前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme(步骤1)；然后通过两次连接把切除的HCV序列重新插入，得到原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme(步骤2、3)；最后，酶切上步得到的原核表达载体，回收目的片段，连入真核表达载体pEGFP-N1，从而得到目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme(步骤4)。

具体操作如下：

1、前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme的构建

以NheI单酶切原有质粒pJFH1，回收3001bp片段，经T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5a，经过筛选得到pUC19-HCV#4-dNheI；在pUC19-HCV#4-dNheI的基础上，通过突变PCR的方法(参考《利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变》)，先后加入Ribozyme序列(见图1)，测序结果(见图4、5)显示得到目的质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme。

2、中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)的构建

NheI和HindIII双酶切质粒pJFH1，回收1401bp片段；HindIII和KpnI双酶切质粒pJFH1，回收5271bp片段；NheI和KpnI双酶切前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme，回收载体；前面回收到的3条片段经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，用不同的酶进行酶切鉴定(见图6)，得知筛选的两个质粒均为中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)，取第1泳道质粒进行以后的工作。

3、原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme的构建

EcoRI和NheI双酶切前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme，回收300bp片段；NheI和KpnI双酶切pJFH1，回收2688bp片段；EcoRI和KpnI双酶切中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)，回收载体。以上回收的三条片段经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，通过EcoRI和HindIII酶切鉴定(见图7)，得知第2、4、5、8、9、10泳道均为阳性质粒，取第2泳道质粒为pUC19-JFH1-Ribozyme。

4、目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme的构建

EcoRI和BamHI双酶切pEGFP-N1，回收载体；EcoRI和BglII双酶切pUC19-JFH1-Ribozyme，回收大片段。以上两条片段经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，以EcoRI和EcoRV双酶切筛选目的质粒(见图8)，得知第1、2泳道为目的质粒，取第1泳道质粒测序，得到最终目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme(图2为该质粒的示意图)。

实施例2、对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND的构建

在pEGFP-JFH1-Ribozyme的基础上，将所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A，从而使其编码氨基酸从D(GAT)突变为N(AAT)，该突变使其编码产物失去RNA聚合酶活性。通过测序筛选得到对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND(如图3)。具体操作方法参见《(利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变》，中国生物工程杂志，2008，28(11)：77-81。

实施例3、转染

实施例1制得的具有自剪切功能的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme和实施例2制得的对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND分别转染HepG2细胞和/或Huh7细胞，按照Lipofectamine2000(Invitrogen公司)说明书进行。转染24小时候，加入G418溶液(含有新霉素的筛选溶液，购自Sigma公司)至终浓度为0.7g/L(为预实验确定的最佳筛选浓度)。由于以上质粒具有新霉素筛选标记，只有整合有该质粒的细胞才能在含有G418的培养基中存活，从而得到单克隆细胞，通过RT-PCR、免疫组化、免疫荧光等方法，筛选出目的单克隆细胞系HepG2/GDD和HepG2/GND。

实施例4、稳定细胞系中HCV抗原的检测

1、免疫荧光：将整合了实施例1制得的具有自剪切功能的质粒的HepG2细胞HepG2/GDD和没有被转化的阴性对照(HepG2)细胞均匀地铺于载玻片上，用37℃预温的1×PBS洗3次，每次10分钟，然后用4％的多聚甲醛(PBS稀释)室温固定30分钟，洗涤(洗涤方式同上)。再用0.2％Triton X-100(PBS稀释)浸泡5分钟以增强细胞膜的通透性，洗涤。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30分钟，PBS清洗后，加入1∶400稀释的抗HCV核心蛋白单抗，37℃孵育1小时，洗涤，加入1∶1000稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1小时，洗涤后加入含有DAPI(4′，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)的封片剂，荧光倒置显微镜下观察(见图9)，分图1和2为空白对照，分图3和4为HepG2/GDD。可见在HepG2/GDD细胞胞浆区域有较强荧光出现，而空白对照则无此现象，由此表明，HepG2/GDD细胞中有HCV蛋白表达。

2、免疫印迹：收集整合了实施例1制得的具有自剪切功能的质粒的HepG2细胞HepG2/GDD，裂解缓冲液裂解后离心取上清，按照4∶1的体积比加入5倍上样缓冲液，沸水浴15分钟。最大量上样，进行SDS-PAGE电泳，之后转入PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上，5％脱脂牛奶37℃封闭2小时，抗HCV核心蛋白单抗(购自Thermo公司)4℃孵育过夜，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1小时，ECL(购自Santacruz公司)显色，暗室内曝光于胶片上(见图10)。图中第一泳道为阴性对照，无条带产生，第二泳道为HepG2/GDD样品，与第三泳道的阳性对照均有条带显现，且大小相似(稍大于20kDa)。

实施例5、HCV病毒颗粒的观察

用细滴管吸取一滴制备好的HepG2/GDD培养上清，滴于铜网上，进行负染操作。完成负染后(具体操作见：Williams，B.D，Carter CB：Transmission Electron MicroscopyA Textbook for Materials Science：Springer US；2009.)，置于电子显微镜下，80kv观察(见图11)，箭头所指即为HCV病毒颗粒，直径约为55nm。

实施例6、抗HCV的药物筛选

将实施例3筛选到的HepG2/GDD和HepG2/GND的细胞系经胰酶消化后，加入新鲜培养基。转接入6孔板中，密度约1×10⁶个细胞/孔。同时加入医院用IFN-α，使各孔中终浓度分别为0、50U/ml、500U/ml、5000U/ml。两天后，收集各孔上清，按照HCV PCR荧光定量检测试剂盒操作方法检测上清中HCV-RNA。

结果发现，HepG2/GDD的HCV-RNA浓度随干扰素浓度升高而呈降低趋势。到达5000U/ml时，HepG2/GDD的HCV-RNA浓度仅为不加药的1％，并且多次实验结果相似，具有极高的稳定性(图12，实验一、二、三)。而HepG2/GND则无此现象，其HCV-RNA浓度始终保持较低水平(图12，阴性对照)。

该模型具有两大优势：

一、稳定性高。由于Wakita报道的细胞模型每次实验均需进行体外转录出HCVRNA，不仅步骤繁琐，更重要的是RNA易于被环境中的RNase所降解，再加上电转会导致大量细胞死亡，从而极大地降低了模型稳定性。而本模型无需进行体外转录、电转等诸多步骤，HCV RNA的产生在细胞内完成，这最大限度地降低了人为操作引起的误差，从而提高了稳定性。

二、操作简便。正如上文所述，该模型在药物筛选阶段，无需进行体外转录、电转等诸多步骤，只需复苏细胞，直接便可完成HCV治疗药物的筛选和评价，无疑极大地提高了系统的简便性。

上述结果说明，本发明的HCV药物筛选细胞模型具有稳定性高、操作简便的特点，可灵敏地进行体外HCV药物筛选。

Claims (5)

1.一种重组表达质粒，其含有以下成分：真核表达载体pEGFP-N1，如GenBankID：AB047639.1所表示的丙型肝炎病毒的全基因组，以及位于所述全基因组两端的核酶序列，其中位于所述全基因组5’端的核酶序列为：

GGCAGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCACCTGCCCCTAA，

位于所述全基因组3’端的核酶序列为：

TGCAGATCATGTGACGGATCTAGATCCGTCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAACATGATC。

2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，把所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A，使其编码产物失去RNA聚合酶活性。

3.一种含有权利要求1或2所述的重组表达质粒的哺乳动物细胞，其特征在于，所述细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。

4.一种丙肝病毒治疗药物的筛选方法，所述方法包括：

(1)培养含有权利要求1所述重组表达质粒的哺乳动物细胞，培养含有权利要求2所述的重组表达质粒的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞均为Huh7细胞或HepG2细胞；

(2)在上述两种哺乳动物细胞的培养物中加入待筛选的药物，并保持1-3天的作用时间；

(3)检测上述两种哺乳动物细胞的培养物上清中丙型肝炎病毒RNA的量；

(4)对照(3)中两种哺乳动物检测数值的差异，从而得出所述药物的筛选结果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的丙型肝炎病毒RNA的检测为PCR荧光定量检测。

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