CN101748149B - 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 - Google Patents
含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101748149B CN101748149B CN200910260058A CN200910260058A CN101748149B CN 101748149 B CN101748149 B CN 101748149B CN 200910260058 A CN200910260058 A CN 200910260058A CN 200910260058 A CN200910260058 A CN 200910260058A CN 101748149 B CN101748149 B CN 101748149B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- hcv
- plasmid
- ribozyme
- recombinant expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组表达质粒,其含有真核表达载体pEGFP、丙型肝炎病毒的全基因组、以及核酶序列;本发明还公开了一种含有该重组表达质粒的哺乳动物细胞;以及包括该细胞在内的丙肝病毒治疗药物的筛选系统和方法;本系统和方法的优点是稳定性好、操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组质粒、重组哺乳动物细胞以及药物筛选系统和方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体。全球HCV的感染率约为3%,约1.7亿人感染HCV,我国约为5000万人,并且年发病率呈高速上升趋势。2008年发病人数比2007年上升了16.79%,达到108446人。HCV感染易慢性化,其慢性化率可高达85%,部分慢性丙型肝炎患者最终可发展为肝纤维化、肝硬化,甚至肝细胞癌。目前主要采用干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎,但并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效,成功率仅有45%左右,而且复发率也非常高。因此,预防和治疗丙型肝炎,已不仅仅是挽救个人生命的问题,而是关系到民族存亡的大事。然而有效的HCV体外培养细胞模型的缺乏严重阻碍了我们对HCV致病机制的研究和保护性疫苗及抗病毒药物的开发。
丙型肝炎病毒是单股正链RNA(ssRNA),属黄病毒(Flaviviridae)科嗜肝病毒属。HCV分为6个基因型(核酸序列30-35%差别),每个基因型又分为多个亚型。HCV基因组全长9.6kb,由5’与3’非编码区(non-coding region,NCR)及一个编码3011个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。5’NCR在不同病毒株中高度保守,分为I-IV四个功能区,而且包含一个内部核糖体进入位点(internalribosome-entry site,IRES),IRES可以独立结合核糖体的40S亚单位,不依赖帽子结构启动ORF的翻译。3’NCR位于ORF下游,由3个部分构成,即可变区、多聚嘧啶区及98nt高度保守末端,是HCV基因组体内外复制不可或缺的成分。基因组的ORF编码一个多聚蛋白前体,通过宿主和病毒蛋白酶的裂解作用产生10个蛋白。
自从在1989年鉴定出HCV以来,人们就一直努力建立HCV体内外模型,以方便HCV的相关研究。有人曾用含HCV的血清感染人的淋巴细胞系,人的胆上表皮细胞,肝原代细胞建立细胞模型。尽管原代干细胞能被HCV血清成功感染,但HCV复制水平低,只能凭借RT-PCR技术检测病毒。后来,人们逐步建立了多种复制子模型,方便了研究。但是这些模型普遍存在着病毒滴度低、感染性差的问题。2005年6月,HCV体外细胞培养体系取得了突破性进展。日本东京都神经科学研究所微生物学系Wakita教授从一例暴发型丙型肝炎患者(JFH1)的血清中得到HCV全长RNA(GenBank ID:AB047639.1),通过反转录的方法得到HCV cDNA,并把其构建在T7启动子后。在随后的实验中,他采用体外转录的方法获得JFH1 HCV全序列RNA经电转染至Huh7细胞,证明在Huh7细胞系中JFH1具有较高的复制率。该方法可以在体外得到较高滴度的HCV颗粒,但是由于该模型每次都需要进行体外转录,然后进行电转,无法得到稳定地分泌HCV的细胞系,限制了它的广泛应用,并且由于每次操作的不同,也降低了它的稳定性。
因此该技术领域需要一种简便、稳定的HCV治疗药物的筛选系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、稳定的HCV治疗药物的筛选系统。
本发明的第二个目的是提供一种丙肝病毒治疗药物的筛选方法。
本发明拟通过在HCV cDNA两端引进转录后具有自剪切作用的核酶序列(如图1所示),构建重组质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme,脂质体转染质粒入Huh7细胞和HepG2细胞,随后进行筛选,得到稳定分泌HCV颗粒的细胞克隆,以该细胞克隆为基础形成HCV治疗药物的评价系统,该系统可用于HCV治疗药物的筛选和评价。
为完成上述发明目的,本发明提供了第一种重组表达质粒,其含有以下成分:真核表达载体pEGFP-N1,丙型肝炎病毒的全基因组,以及核酶序列。
在本发明的一个优选技术方案中,所述丙肝病毒株为JFH1,其全基因组序列为GenBank ID:AB047639.1所表示(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/13122261)。
本发明还提供了第二种重组表达质粒,其特征在于:与上述第一种重组质粒相比,将所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A,从而使其编码产物失去RNA聚合酶活性。
本发明还提供了分别含有上述两种重组质粒的哺乳动物细胞,在本发明的一个优选技术方案中,所述细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。
本发明还提供了一种丙肝病毒治疗药物的筛选系统,该系统包括:含有第一种重组表达质粒的哺乳动物细胞,含有第二种重组表达质粒的哺乳动物细胞,以及丙型肝炎病毒的检测试剂盒。
在本发明的一个优选技术方案中,所述哺乳动物细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。
在本发明的一个优选技术方案中,丙型肝炎病毒的检测试剂盒为丙型肝炎病毒RNA的PCR荧光定量检测试剂盒。
本发明还提供了一种丙肝病毒治疗药物的筛选的方法,所述方法包括:
(1)培养含有第一种重组表达质粒的哺乳动物细胞,培养含有第二种重组表达质粒的哺乳动物细胞;
(2)在上述两种哺乳动物细胞的培养物中加入待筛选的药物,并保持1-3天的作用时间;
(3)检测上述两种哺乳动物细胞的培养物上清中丙型肝炎病毒RNA的量;
(4)对照(3)中两种哺乳动物检测数值的差异,从而得出所述药物的筛选结果。
在本发明的一个优选技术方案中,步骤(1)所述哺乳动物细胞为Huh7细胞或HepG2细胞,步骤(3)中所述的丙型肝炎病毒RNA的检测为PCR荧光定量检测。
综上所述,本发明通过在HCV cDNA两端引进转录后具有自剪切作用的核酶序列(如图1),构建重组质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme,脂质体转染质粒入哺乳动物细胞,使所述重组质粒能够在细胞内转录后进行自剪切,可以提供正确剪切的HCV全基因组的mRNA序列,随后对转染细胞进行筛选,得到稳定分泌HCV颗粒的细胞克隆,以该细胞克隆为基础形成HCV治疗药物的筛选系统,并辅以不具有正确剪切功能的细胞克隆作为对照,该系统可用于HCV治疗药物的筛选。通过本发明提供的丙肝病毒治疗药物的筛选的方法显示,本发明的HCV治疗药物的评价系统可灵敏进行体外HCV药物筛选。由于该模型基础为筛选到的在细胞内完成转录的稳定细胞系,因此具有保存方便的优点。同时,在药物筛选阶段,无需进行体外转录、电转等诸多步骤,只需复苏细胞,直接完成HCV治疗药物的筛选和评价,极大地提高了系统的稳定性,同时也易于操作和重复。
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
附图说明
图1:核酶序列示意图;
图2:含HCV gRNA的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme示意图;
图3:对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND示意图;
图4:前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme测序结果图;
图5:前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme测序结果图;
图6:中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)鉴定图;
图7:原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme琼脂糖凝胶电泳鉴定图;
图8:目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme琼脂糖凝胶电泳鉴定图;
图9:HCV核心抗原免疫荧光检测图;
图10:HCV核心抗原免疫印迹检测图;
图11:HCV颗粒电镜观察图;
图12:IFN-α治疗结果曲线图。
具体实施方式
目前,临床上治疗丙型肝炎,通常采用干扰素联合利巴韦林的方法,以下以α-干扰素(IFN-α)为例,进一步阐述本发明的技术方案和效果。
各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、克隆载体质粒pUC18/pUC19及碱性磷酸酶CIAP均购自Takara公司,真核表达载体pEGFP-N1购自Clontech公司,细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司,细胞培养基DMEM购自GIBCO公司,优等胎牛血清购自德国BIO-CHROM公司,质粒提取试剂盒分别购自北京全式金公司和Qiagen公司,HCV PCR荧光定量检测试剂盒(国药准字S20040078)购自深圳匹基生物工程有限公司,抗HCV核心单抗购自Thermo公司,封闭用山羊血清、HRP标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山金桥公司,HepG2细胞和Huh7细胞均购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
含有HCV JFH1基因组全长cDNA的质粒pJFH1由本室根据GenBank ID:AB047639.1公布序列合成。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme的构建
由于质粒pJFH1较大,直接进行突变PCR引入核酶序列有一定难度,故设计如下:首先,通过酶切的方法切除pJFH1中的一部分序列,然后引入核酶序列,得到前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme(步骤1);然后通过两次连接把切除的HCV序列重新插入,得到原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme(步骤2、3);最后,酶切上步得到的原核表达载体,回收目的片段,连入真核表达载体pEGFP-N1,从而得到目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme(步骤4)。
具体操作如下:
1、前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme的构建
以NheI单酶切原有质粒pJFH1,回收3001bp片段,经T4DNA连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5a,经过筛选得到pUC19-HCV#4-dNheI;在pUC19-HCV#4-dNheI的基础上,通过突变PCR的方法(参考《利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变》),先后加入Ribozyme序列(见图1),测序结果(见图4、5)显示得到目的质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme。
2、中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI)的构建
NheI和HindIII双酶切质粒pJFH1,回收1401bp片段;HindIII和KpnI双酶切质粒pJFH1,回收5271bp片段;NheI和KpnI双酶切前期质粒pJFH1-dNheI+Ribozyme,回收载体;前面回收到的3条片段经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,用不同的酶进行酶切鉴定(见图6),得知筛选的两个质粒均为中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI),取第1泳道质粒进行以后的工作。
3、原核载体pUC19-JFH1-Ribozyme的构建
EcoRI和NheI双酶切前期质粒pUC19-HCV#4-dNheI+Ribozyme,回收300bp片段;NheI和KpnI双酶切pJFH1,回收2688bp片段;EcoRI和KpnI双酶切中间质粒Ribozyme+HCV(NheI-KpnI),回收载体。以上回收的三条片段经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,通过EcoRI和HindIII酶切鉴定(见图7),得知第2、4、5、8、9、10泳道均为阳性质粒,取第2泳道质粒为pUC19-JFH1-Ribozyme。
4、目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme的构建
EcoRI和BamHI双酶切pEGFP-N1,回收载体;EcoRI和BglII双酶切pUC19-JFH1-Ribozyme,回收大片段。以上两条片段经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,以EcoRI和EcoRV双酶切筛选目的质粒(见图8),得知第1、2泳道为目的质粒,取第1泳道质粒测序,得到最终目的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme(图2为该质粒的示意图)。
实施例2、对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND的构建
在pEGFP-JFH1-Ribozyme的基础上,将所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A,从而使其编码氨基酸从D(GAT)突变为N(AAT),该突变使其编码产物失去RNA聚合酶活性。通过测序筛选得到对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND(如图3)。具体操作方法参见《(利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变》,中国生物工程杂志,2008,28(11):77-81。
实施例3、转染
实施例1制得的具有自剪切功能的质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme和实施例2制得的对照质粒pEGFP-JFH1-Ribozyme/GND分别转染HepG2细胞和/或Huh7细胞,按照Lipofectamine2000(Invitrogen公司)说明书进行。转染24小时候,加入G418溶液(含有新霉素的筛选溶液,购自Sigma公司)至终浓度为0.7g/L(为预实验确定的最佳筛选浓度)。由于以上质粒具有新霉素筛选标记,只有整合有该质粒的细胞才能在含有G418的培养基中存活,从而得到单克隆细胞,通过RT-PCR、免疫组化、免疫荧光等方法,筛选出目的单克隆细胞系HepG2/GDD和HepG2/GND。
实施例4、稳定细胞系中HCV抗原的检测
1、免疫荧光:将整合了实施例1制得的具有自剪切功能的质粒的HepG2细胞HepG2/GDD和没有被转化的阴性对照(HepG2)细胞均匀地铺于载玻片上,用37℃预温的1×PBS洗3次,每次10分钟,然后用4%的多聚甲醛(PBS稀释)室温固定30分钟,洗涤(洗涤方式同上)。再用0.2%Triton X-100(PBS稀释)浸泡5分钟以增强细胞膜的通透性,洗涤。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30分钟,PBS清洗后,加入1∶400稀释的抗HCV核心蛋白单抗,37℃孵育1小时,洗涤,加入1∶1000稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG,37℃避光孵育1小时,洗涤后加入含有DAPI(4′,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)的封片剂,荧光倒置显微镜下观察(见图9),分图1和2为空白对照,分图3和4为HepG2/GDD。可见在HepG2/GDD细胞胞浆区域有较强荧光出现,而空白对照则无此现象,由此表明,HepG2/GDD细胞中有HCV蛋白表达。
2、免疫印迹:收集整合了实施例1制得的具有自剪切功能的质粒的HepG2细胞HepG2/GDD,裂解缓冲液裂解后离心取上清,按照4∶1的体积比加入5倍上样缓冲液,沸水浴15分钟。最大量上样,进行SDS-PAGE电泳,之后转入PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上,5%脱脂牛奶37℃封闭2小时,抗HCV核心蛋白单抗(购自Thermo公司)4℃孵育过夜,HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1小时,ECL(购自Santacruz公司)显色,暗室内曝光于胶片上(见图10)。图中第一泳道为阴性对照,无条带产生,第二泳道为HepG2/GDD样品,与第三泳道的阳性对照均有条带显现,且大小相似(稍大于20kDa)。
实施例5、HCV病毒颗粒的观察
用细滴管吸取一滴制备好的HepG2/GDD培养上清,滴于铜网上,进行负染操作。完成负染后(具体操作见:Williams,B.D,Carter CB:Transmission Electron MicroscopyA Textbook for Materials Science:Springer US;2009.),置于电子显微镜下,80kv观察(见图11),箭头所指即为HCV病毒颗粒,直径约为55nm。
实施例6、抗HCV的药物筛选
将实施例3筛选到的HepG2/GDD和HepG2/GND的细胞系经胰酶消化后,加入新鲜培养基。转接入6孔板中,密度约1×106个细胞/孔。同时加入医院用IFN-α,使各孔中终浓度分别为0、50U/ml、500U/ml、5000U/ml。两天后,收集各孔上清,按照HCV PCR荧光定量检测试剂盒操作方法检测上清中HCV-RNA。
结果发现,HepG2/GDD的HCV-RNA浓度随干扰素浓度升高而呈降低趋势。到达5000U/ml时,HepG2/GDD的HCV-RNA浓度仅为不加药的1%,并且多次实验结果相似,具有极高的稳定性(图12,实验一、二、三)。而HepG2/GND则无此现象,其HCV-RNA浓度始终保持较低水平(图12,阴性对照)。
该模型具有两大优势:
一、稳定性高。由于Wakita报道的细胞模型每次实验均需进行体外转录出HCVRNA,不仅步骤繁琐,更重要的是RNA易于被环境中的RNase所降解,再加上电转会导致大量细胞死亡,从而极大地降低了模型稳定性。而本模型无需进行体外转录、电转等诸多步骤,HCV RNA的产生在细胞内完成,这最大限度地降低了人为操作引起的误差,从而提高了稳定性。
二、操作简便。正如上文所述,该模型在药物筛选阶段,无需进行体外转录、电转等诸多步骤,只需复苏细胞,直接便可完成HCV治疗药物的筛选和评价,无疑极大地提高了系统的简便性。
上述结果说明,本发明的HCV药物筛选细胞模型具有稳定性高、操作简便的特点,可灵敏地进行体外HCV药物筛选。
Claims (5)
1.一种重组表达质粒,其含有以下成分:真核表达载体pEGFP-N1,如GenBankID:AB047639.1所表示的丙型肝炎病毒的全基因组,以及位于所述全基因组两端的核酶序列,其中位于所述全基因组5’端的核酶序列为:
GGCAGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCACCTGCCCCTAA,
位于所述全基因组3’端的核酶序列为:
TGCAGATCATGTGACGGATCTAGATCCGTCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAACATGATC。
2.根据权利要求1所述的重组表达质粒,其特征在于,把所述HCV全基因组序列中第8618个碱基从G突变为A,使其编码产物失去RNA聚合酶活性。
3.一种含有权利要求1或2所述的重组表达质粒的哺乳动物细胞,其特征在于,所述细胞为Huh7细胞或HepG2细胞。
4.一种丙肝病毒治疗药物的筛选方法,所述方法包括:
(1)培养含有权利要求1所述重组表达质粒的哺乳动物细胞,培养含有权利要求2所述的重组表达质粒的哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞均为Huh7细胞或HepG2细胞;
(2)在上述两种哺乳动物细胞的培养物中加入待筛选的药物,并保持1-3天的作用时间;
(3)检测上述两种哺乳动物细胞的培养物上清中丙型肝炎病毒RNA的量;
(4)对照(3)中两种哺乳动物检测数值的差异,从而得出所述药物的筛选结果。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的丙型肝炎病毒RNA的检测为PCR荧光定量检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910260058A CN101748149B (zh) | 2009-12-24 | 2009-12-24 | 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910260058A CN101748149B (zh) | 2009-12-24 | 2009-12-24 | 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101748149A CN101748149A (zh) | 2010-06-23 |
CN101748149B true CN101748149B (zh) | 2012-09-05 |
Family
ID=42475762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200910260058A Expired - Fee Related CN101748149B (zh) | 2009-12-24 | 2009-12-24 | 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101748149B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2551345A1 (en) * | 2010-03-25 | 2013-01-30 | The University of Tokyo | Hcv variant with high productivity of infectious hepatitis c virus, and use thereof |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102023213B (zh) * | 2010-09-28 | 2014-04-02 | 汕头大学医学院 | 一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法 |
CN102517330B (zh) * | 2011-12-12 | 2015-07-08 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种腺病毒载体及其在制备hcv细胞和小鼠模型中的应用 |
-
2009
- 2009-12-24 CN CN200910260058A patent/CN101748149B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Takanobu Kato et al..Production of Infectious Hepatitis C Virus of Various Genotypes in Cell Cultures.《Journal of Virology》.2007,第81卷(第9期),4045-4411. * |
Theo Heller et al..An in vitro model of hepatitis C virion production.《PNAS》.2005,第102卷(第7期),2579-2583. * |
张丽颖等.丙型肝炎病毒全基因重组质粒的构建及其转染细胞系的建立.《中国生物制品学杂志》.2009,第22卷(第1期),45-48. * |
王永智等.HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析.《热带医学杂志》.2007,第7卷(第11期),1039-1043. * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2551345A1 (en) * | 2010-03-25 | 2013-01-30 | The University of Tokyo | Hcv variant with high productivity of infectious hepatitis c virus, and use thereof |
CN103339254A (zh) * | 2010-03-25 | 2013-10-02 | 国立大学法人东京大学 | 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用 |
EP2551345A4 (en) * | 2010-03-25 | 2014-01-29 | Univ Tokyo | VARIANT OF HCV WITH HIGH PRODUCTIVITY OF INFECTIOUS HEPATITIS C VIRUSES AND USE THEREOF |
US9057048B2 (en) | 2010-03-25 | 2015-06-16 | The University Of Tokyo | Infectious hepatitis C virus—high producing HCV variants and use thereof |
CN103339254B (zh) * | 2010-03-25 | 2016-04-27 | 国立大学法人东京大学 | 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101748149A (zh) | 2010-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mannová et al. | Activation of the N-Ras–PI3K–Akt-mTOR pathway by hepatitis C virus: control of cell survival and viral replication | |
ES2197031T3 (es) | Sistema de cultivo celular de virus de hepatitis c. | |
Pudupakam et al. | Mutational analysis of the hypervariable region of hepatitis e virus reveals its involvement in the efficiency of viral RNA replication | |
Krieger et al. | Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations | |
Hanley et al. | Paired charge-to-alanine mutagenesis of dengue virus type 4 NS5 generates mutants with temperature-sensitive, host range, and mouse attenuation phenotypes | |
Schmitt et al. | A comprehensive structure-function comparison of hepatitis C virus strain JFH1 and J6 polymerases reveals a key residue stimulating replication in cell culture across genotypes | |
Stupina et al. | Ribosome binding to a 5′ translational enhancer is altered in the presence of the 3′ untranslated region in cap-independent translation of turnip crinkle virus | |
Date et al. | Novel cell culture-adapted genotype 2a hepatitis C virus infectious clone | |
Gutiérrez-Escolano et al. | Interaction of cellular proteins with the 5′ end of Norwalk virus genomic RNA | |
EP2130912A1 (en) | Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system | |
CN103339254B (zh) | 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用 | |
CN101748149B (zh) | 含有丙肝病毒基因组的质粒、细胞、药物筛选系统和方法 | |
Lu et al. | A novel strategy to develop a robust infectious hepatitis C virus cell culture system directly from a clinical isolate | |
CN102210861A (zh) | 丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗 | |
Liu et al. | Hepatitis C virus (HCV) interaction with astrocytes: nonproductive infection and induction of IL-18 | |
Khuroo et al. | The discovery of hepatitis viruses: agents and disease | |
Wegelt et al. | Characterization and purification of recombinant bovine viral diarrhea virus particles with epitope-tagged envelope proteins | |
Li et al. | Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system | |
CN105396143A (zh) | 埃博拉病毒特异性的miRNA以及通过miRNA抑制埃博拉病毒的方法 | |
Orlinger et al. | Construction and mutagenesis of an artificial bicistronic tick-borne encephalitis virus genome reveals an essential function of the second transmembrane region of protein E in flavivirus assembly | |
CN103539839A (zh) | 肠道病毒71型的vp2抗原的中和表位多肽及其用途 | |
CN104611343B (zh) | 分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白trim32及抗病毒活性 | |
US20230285544A1 (en) | Synthetic defective interfering coronaviruses | |
CN107050425A (zh) | 新型抗病毒蛋白C19orf66在制备抗寨卡病毒药物中的应用 | |
Bhattacharjee et al. | 31 Years of Discovery and the Progress of Hepatitis C Virus: 2020, Nobel Prize in Physiology or Medicine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120905 Termination date: 20141224 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |