ES2197031T3

ES2197031T3 - Sistema de cultivo celular de virus de hepatitis c.

Info

Publication number: ES2197031T3
Application number: ES00105929T
Authority: ES
Inventors: Ralf Dr. Bartenschlager
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-03
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: JP2001017187A; ATE236988T1; US6630343B1; DK1043399T3; PT1043399E; SE1043399T5; EP1043399A3; JP4903929B2; ES2197031T4; AU2518000A; AU770486B2; CA2303526C; SE1043399T3; DE19915178A1; DE50001673D1; HK1034094A1; EP1043399A2; CA2303526A1; DK1043399T5; EP1043399B9

Abstract

Estructura de virus de hepatitis C (VHC)-ARN con la capacidad de replicación en celulas eucariotas, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según uno de los protocolos de secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, que codifican al menos para las secciones de ARN especificas de VHC 5¿ NTR, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y 3¿ NTR y adicionalmente un gen marcador seleccionable (gen de selección), siendo el gen marcador seleccionable el gen de neomicinfosfotransferasa, y pudiendo estar contenido en lugar del gen de neomicinfosfotransferasa otro gen de resistencia antibiótico u otro gen de resistencia.

Description

Sistema de cultivo celular de virus de hepatitis C.

La invención se refiere a una estructura de virus de hepatitis C (VHC)-ARN con la capacidad de replicación en células eucariotas, así como un sistema de cultivo celular de virus de hepatitis C (VHC), que comprende esencialmente células eucariotas, que contienen material génico específico de VHC introducido, es decir, que están transferidas con el material génico específico de VHC.

El virus de hepatitis C (VHC) es una de las causas principales de enfermedades del hígado crónicas y esporádicas mundialmente. La mayor parte de infecciones de VHC se desarrollan sin síntomas clínicos identificables, sin embargo, un 80 - 90% de los infectados se convierten en portadores de virus duraderos, y en un 50% de estos portadores de virus duraderos se llega a una inflamación crónica del hígado con diferentes grados de gravedad. Aproximadamente un 20% los infectados crónicos desarrollan en el transcurso de 10 a 20 años una cirrosis hepática, sobre cuya base se puede desarrollar un carcinoma celular hepático primario. La hepatitis C crónica es actualmente la indicación principal para un transplante de hígado. Hasta el momento no existe una terapia causal. La única terapia disponible actualmente es la administración altamente dosificada de alfa interferona o una combinación de alfa interferona y el análogo nucleósido de purina ribavirina. Sin embargo, sólo un 60% de todos los tratados responden a esta terapia, y en estos, en más de la mitad de todos los casos, se llega a una nueva viremia después de retirar el tratamiento.

Debido a la alta prevalencia, precisamente también en los países industriales, las graves consecuencias de infecciones crónicas y la falta de una terapia causal, el desarrollo de una quimioterapia específica de VHC es un objetivo esencial de la investigación y desarrollo farmacéuticos. En este caso, el problema principal, es hasta la fecha, la falta de un sistema de cultivo celular apropiado, que posibilite un estudio de la replicación de virus y la patogénesis en células eucariotas.

Debido a las bajas cantidades de virus en la sangre, o bien tejidos, la falta de sistemas de cultivo celular apropiados o modelos animales (hasta hoy, el chimpancé es el único animal de ensayo posible), así como la falta de sistemas eficientes para la producción de partículas similares a virus, hasta el momento no se pudo aún investigar, o bien elucidar detalladamente la composición molecular de la partícula de VHC. Los resultados presentes actualmente se pueden resumir como sigue: el VHC es un virus de ARN de hebra positiva envuelto con un tamaño de partícula de 50 - 60 nm y una densidad media de 1,03 - 1,1 g/ml. En 1989 se clonó y caracterizó molecularmente por primera vez (Choo et al., 1989; Science, 244, 359-362). El VHC-ARN tiene una longitud de aproximadamente 9.6 kb (= 9.600 nucleótidos), una polaridad positiva, y posee un único marco de lectura abierto (ORF = open reading frame), que codifica una poliproteína lineal de aproximadamente 3.010 aminoácidos (véase Rice 1996, in Virology, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds, (Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 1996), vol. 1 pp. 931-960; Clarke 1997, J. Gen. Virol 78, 2397; y Bartenschlanger 1997, Intervirology 40, 378 y vgl. Fig. 1 A). En la replicación de virus se disocia la poliproteína mediante proteasas celulares y virales en las proteínas puras y funcionalmente activas.

Dentro de la poliproteína, las proteínas están dispuestas como sigue (de término amino a carboxi): núcleo-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. La proteína de núcleo es el componente principal del núcleo cápsido. Las glicoproteínas E1 y E2 son proteínas de transmembrana y componentes principales de la envoltura de virus. Probablemente juegan un papel esencial en la fijación del virus en las células huésped. Estas tres proteínas núcleo, E1 y E2 forman las partículas de virus, y por consiguiente se denominan proteínas estructurales. La función de la proteína p7 no está aún clara. La proteína NS2 es probablemente el dominio catalítico de la proteasa NS2-3, que es responsable del procesado entre las proteínas NS2 y NS3. La proteína NS3 tiene dos funciones, es decir, en el dominio aminoterminal una actividad de proteasa que es esencial para el procesado de poliproteínas, y en el dominio carboxiterminal una función NTPasa/helicasa, que juega un papel probablemente en la replicación ARN viral. La proteína NS4A es un cofactor de proteasa NS3. La función de la proteína NS4B es desconocida.

El marco de lectura abierto está flanqueado en su extremo 5' de una región no trasladada de aproximadamente 340 nucleótidos de longitud (NTR = non-translated region), que actúa como punto de entrada de ribosomas interno (IRES = internal ribosome entry site), y en su extremo 3' por un NTR de aproximadamente 230 nucleótidos de longitud, que es significativo muy probablemente para la replicación de genoma. Tal 3' NTR es objeto de la solicitud de patente PCT/US 96/14033. Las proteínas estructurales en el cuarto amino-terminal de la poliproteína se disocian por la peptidasa de señal de la célula huésped. Las proteínas no estructurales (NS) 2 a (NS) 5B son procesadas por dos enzimas virales, esto es, por las proteinasas NS2-3 y la NS3/4A. La proteinasa NS3/4A se requiere para todas las disociaciones más allá del término carboxi de NS3. El papel de NS4B no es conocido. NS5A, una proteína altamente fosforilada, parece ser responsable de la resistencia a interferona de diferentes genotipos de VHC (véase Enomoto et al. 1995, J. Clin. Invest. 96, 224; Enomoto et al. 1996, N. Engl. J. Med. 334, 77; Gale Jr. Et al. 1997, Virology 230, 217 ; Kaneko et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 320 ; Reed et al., 1997, J. Virol. 71, 7187) y NS5B se identificó como la polimerasa de ARN dependiente de ARN.

Por medio de estos conocimientos se desarrollaron los primeros sistemas de diagnosis, que se basan en la identificación de anticuerpos específicos de VHC en el suero del paciente, o en la identificación de ARN específico de VHC por medio de RT-PCR (= Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), y que se aplican, entre tanto, según rutina y/o prescripción, en todas las conservas de sangre.

Desde la primera descripción del genoma 1989 se clonaron y caracterizaron con ayuda del método PCR numerosas secuencias parciales y completas de VHC. Una comparación de estas secuencias muestra una alta variabilidad del genoma viral, en especial en la zona del gen NS5B, lo que ha conducido en último lugar a una división en 6 genotipos, que están subdivididos a su vez de nuevo en subtipos a, b y c.

La variación genómica no está dividida uniformemente a través del genoma. De este modo, están aún conservadas la 5'NTR y partes de la 3'NTR, mientras que determinadas secuencias codificantes varían parcialmente en gran medida, sobre todo las proteínas envolventes E1 y E2.

Las secuencias parciales y completas clonadas y caracterizadas del genoma de VHC se investigaron además con respecto a objetivos de ataque apropiados para un terapéutico antiviral prospectivo. En este caso se encontraron tres enzimas virales, que se ofrecen como tal objetivo de ataque. Estas son (1) el complejo de proteasa NS3/4A, (2) la helicasa NS3 y (3) la ARN polimerasa dependiente de NS5B-ARN. El complejo de proteasa NS3/4A y la helicasa NS3 se pudieron ya cristalizar y elucidar con respecto a su estructura tridimensional (Kim et al., 1996, Cell, 87, 343; Yem et al., 1998, Protein Science, 7, 837; Love et al., 1996, Cell, 87, 311; Kim et al., 1998, Structure, 6, 89; Yao et al., 1997, Nature Structural Biology, 4, 463, Cho et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 15045); en el caso de ARN polimerasa dependiente de NS5B ARN, no se ha conseguido esto hasta la fecha.

A pesar de que con estos enzimas están definidos objetivos de ataque significativos para un desarrollo de terapia de infección de VHC crónica, y a pesar de que tanto con ayuda de ``rational drug design'', como también con ayuda de ``high throughput screens'', se busca intensivamente inhibidores apropiados a nivel mundial, el desarrollo de terapia padece un gran déficit, esto es la falta de sistemas de cultivo celular como de los animales sencillos, que permitan identificar VHC-ARN o antígenos de VHC directamente, de manera segura y con métodos simples habituales en laboratorio. La falta de tales sistemas de cultivo celular es también el motivo principal por el cual la comprensión de la replicación de VHC es hasta el momento muy deficiente, y en amplias partes sólo hipotético.

Aunque según opinión del mundo especializado existe una estrecha relación de evolución entre VHC y los flavi- y pestivirus, y se describen para estos ARNs replicantes de manera autónoma, que se pueden llevar a replicación en diferentes líneas celulares sin mayor problema, y en este caso muestran rendimientos relativamente elevados (siehe Khromykh et al., 1997, J. Virol. 71, 1497; Behrens et al., 1998, J. Virol. 72, 2364; Moser et al., 1998, J. Virol. 72, 5318), los ensayos similares con VHC no tuvieron éxito hasta la fecha.

Si bien se conoce por diversas publicaciones que se pueden infectar líneas celulares o cultivos celulares primarios con suero de paciente altamente titrado, que contiene VHC (Lanford et al. 1994, Virology 202, 606; Shimizu et al. 1993, Procedings of the National Academy of Sciences, USA, 90, 6037-6041; Mizutani et al. 1966, Journal of Virilogy 70, 7219-7223; M. Ikeda et al. 1998, Virus Res. 56, 157; Fournier et al. 1998, J. Gen.Virol. 79, 2376, y citas bibliográficas indicadas en la misma, Ito et al. 1996, Journal of General Virilogy, 77, 1043-1054), estas líneas celulares o cultivos celulares infectados por virus no permiten la identificación directa de VHC-ARN o antígenos de VHC. El ARN viral en estas células no es detectable en un Nothern-Blot (un procedimiento estándar para la identificación cuantitativa de ARN) ni la proteína viral es detectable en un Western-Blot o por medio de precipitación inmunitaria. Sólo con métodos muy costosos e indirectos se ha conseguido identificar una replicación de VHC. Estas circunstancias desventajosas muestran claramente que la replicación en estas líneas celulares infectadas por virus conocidas, o cultivos celulares, es absolutamente insuficiente.

Por lo demás, por las publicaciones de Yoo et al. (1995, Journal of Virology, 69, 32-38) y de Dash et al., (1997, American Journal of Pathology, 151, 363-373) se sabe que se pueden transferir líneas celulares de hepatoma con VHC-ARN sintético, que se obtuvo por medio de trascripción in vitro de genoma de VHC clonado. En ambas publicaciones, los autores partieron de la idea básica de que el genoma de VHC viral es un ARN de hebra positiva, que actúa directamente como mARN tras la inclusión en la célula, a la que se adhieren ribosomas, y en el transcurso de procesos de traslación forman proteínas virales, a partir de las cuales se pueden formar en último lugar nuevas partículas de VHC. Esta replicación de virus, es decir, estos virus de VHC recién formados, o bien su ARN se identificó por medio de RT-PCR. No obstante, los resultados publicados de RT-PCR llevados a cabo sostienen que la eficiencia de la replicación de VHC en las células de hepatoma transferidas con VHC descritas es muy reducida, y en cualquier caso no es suficiente para medir cualitativamente, y ni mucho menos cuantitativamente, fluctuaciones en la velocidad de replicación tras acción selectiva con terapéuticos virales prospectivos. Además, en el estado de la técnica se sabe entre tanto (Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2291-95, 1999), que el 3'NTR altamente conservado esencial para la replicación de virus, lo que se opone claramente a las afirmaciones de Yoo et al. y Dash et al., que han empleado para sus ensayos, en desconocimiento del auténtico extremo 3' del genoma de VHC, exclusivamente genomas de VHC con 3'NTRs acortados.

Rice et al. describen en la WO 98 39031 la obtención de un genoma de VHC infeccioso y su análisis en chimpancés. Los autores afirman que tales genomas VHC infecciosos o partes de los mismos son apropiados para diferentes fines, entre otros para la formación de sistemas de cultivo celular para el VHC, pero en ningún punto de D1 se describe una estructura de VHC específica, reproducible, que se replica principalmente en el cultivo celular.

En la WO 99/04008 se describe un genoma de VHC clonado, que es infeccioso en el chimpancé. No obstante, una infecciosidad en chimpancés no permite la conclusión de que el genoma en cuestión se replica también en cultivo celular, o bien el modelo in vitro.

La US 5,851,758 describe clones celulares derivados de la línea celular humana T H9, que son infectables con VHC, presentándose tras la infección con VHC efectos citopáticos. Para la infección de las células se emplea suero de paciente con VHC no definido. A diferencia del objeto de la presente solicitud de patente, no se emplean genomas de VHC clonados, en especial genomas de VHC clonados con un marcador de selección, o bien gen delator, y el cultivo celular no se efectúa con células de hepatoma sino con células T humanas. El D5 adopta las estructuras de VHC, y el modelo de cultivo celular obtenido de este modo según la formulación de reivindicación válida, por lo tanto, no se anticipa ni guarda relación con estas.

En la US 5,874,565 se describe una secuencia conservada en el extremo 3' de VHC, que es esencial para la replicación viral. No obstante, no es suficiente suspender la secuencia 3' descrita en cualquier genoma, y obtener de este modo replicación en el cultivo celular, ya que esta secuencia es necesaria para la replicación en el cultivo celular, pero no suficiente.

Es tarea de la presente invención la puesta a disposición de una estructura de virus de hepatitis C (VHC)-ARN con la capacidad de replicación de las células eucariotas, así como un sistema de cultivo celular VHC, en el que ARN viral en las células transferidas se replica de manera autónoma y con eficiencia tan elevada, que se pueden medir fluctuaciones en la velocidad de replicación tras acción selectiva con terapéuticos específicos de virus, y en especial de VHC antivirales, de manera cualitativa y cuantitativa y con ayuda de procedimientos de medida comunes, habituales en laboratorio.

Una solución de este problema consiste en la puesta a disposición de una estructura de virus de hepatitis C (VHC)-ARN del tipo definido al inicio, que se distingue porque comprende una secuencia de nucleótidos según uno de los protocolos de secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, que codifican al menos para las secciones de ARN específicas de VHC 5' NTR, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y 3' NTR y adicionalmente un gen marcador seleccionable (gen de selección), siendo el gen marcador seleccionable el gen de neomicinfosfotransferasa, y pudiendo estar contenido, en lugar del gen de neomicinfosfotransferasa, otro gen de resistencia antibiótico u otro gen de resistencia.

Otra solución de este problema consiste en la puesta a disposición de un sistema de cultivo celular de VHC del tipo definido al inicio, en el que las células eucariotas son células humanas, en especial células de hepatoma, que proceden preferentemente de una línea celular de hepatoma comercial, pero que también se pueden haber obtenido a partir de un correspondiente cultivo celular primario, y en el que el material génico específico de VHC incluido es una estructura VHC-ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos según uno de los protocolos de secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, que codifican al menos las secciones de ARN específicas de VHC 5' NTR, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y 3' NTR, y adicionalmente un gen marcador seleccionable (gen de selección), siendo el gen marcador seleccionable el gen de neomicinfosfotransferasa, y pudiendo estar contenido, en lugar del gen de neomicinfosfotransferasa, otro gen de resistencia antibiótico, u otro gen de resistencia. ``NTR'' representa en este caso y a continuación ``región no trasladada'', y es conocida y común para el especialista del sector como concepto, o bien abreviatura. El concepto ``estructura de VHC-ARN'' comprende en este caso, y a continuación, tanto estructuras que contienen el genoma de VHC completo, como también aquellas que contienen únicamente una parte del mismo, es decir, un subgenoma de VHC.

El concepto 5' NTR, o bien NS3, o bien NS4A, o bien NS4B, o bien NS5A, o bien NS5B, o bien 3' NTR en el presente contexto comprende cualquier secuencia de nucleótido que se describe en el estado de la técnica como secuencias de nucleótidos para la sección funcional respectiva del genoma de VHC.

La puesta a disposición de la estructura de VHC-ARN según la invención posibilita por primera vez un análisis detallado de la replicación, patogénesis y evolución de VHC en cultivos celulares. El ARN viral específico de VHC -como genoma completo o como subgenoma- se puede generar selectivamente en cualquier cantidad, y existe la posibilidad de manipular la estructura de ARN y con ello de investigar y elucidar las funciones de VHC en el plano genético.

Ya que todos los enzimas de VHC investigados actualmente como objetivo de ataque principal para una terapia, esto es la proteasa NS3/4A, la helicasa NS3 y la polimerasa NS5B, están contenidos en la estructura de VHC-ARN según la invención, se puede utilizar para todas las investigaciones correspondientes.

El gen marcador (gen de selección) seleccionable contenido en las estructuras VHC-ARN según la invención, preferentemente un gen de resistencia, en especial un gen de resistencia antibióticos, tiene la ventaja de que las células transferidas con esta estructura se pueden seleccionar fácilmente por las células no transferidas, añadiéndose al medio de cultivo celular, por ejemplo en el caso de un gen de resistencia a antibióticos, el antibiótico en cuestión.

En el presente contexto se entiende por ``antibiótico'' cualquier substancia que impide vivir o crecer las células huésped no transferidas a las células en las que el VHC-ARN se replica sólo con baja eficiencia, en especial venenos celulares, como por ejemplo puromicina, higromicina, zeocina, bleomicina o blasticidina.

Una alternativa a genes de resistencia antibióticos es, por ejemplo, el gen timidín-quinasa, con el que se puede llevar a cabo una selección HAT.

La posición del gen marcador seleccionable (gen de selección), o bien del gen de resistencia preferente, o bien del gen de resistencia antibióticos especialmente preferente en la estructura de VHC-ARN se sitúa preferentemente detrás del VHC 5' NTR, es decir, en sentido descendente de hebra de 5' NTR, o bien en sentido ascendente de hebra del marco de lectura de VHC. No obstante, también es concebible una inserción en la zona de 3' NTR o en otro punto del genoma o subgenoma de VHC, por ejemplo dentro de la poliproteína.

En una forma alternativa de realización de la estructura de VHC-ARN según la invención, el gen marcador seleccionable (gen de selección), en especial un gen de resistencia antibióticos, está unido a través de un ribozima, o bien un punto de reconocimiento para un ribozima, con el VHC-ARN o bien la secuencia de genoma o subgenoma de VHC.

A ello acompaña la ventaja de que, una vez efectuada la selección de aquellas células en las que se replica productivamente el VHC-ARN, en los clones celulares obtenidos de este modo se puede separar el gen de resistencia mediante disociación mediada por ribozima de la secuencia de subgenoma de VHC, esto es, mediante activado del ribozima introducido por clonación, o, en el caso de una estructura con un punto de identificación para un ribozima, mediante inclusión del ribozima en las células (por ejemplo por medio de transfección de una estructura de ribozima o infección con un vector de expresión viral, en el que se empleó el correspondiente ribozima). De este modo se obtiene una auténtica estructura de genoma de VHC sin gen de resistencia, que es apta para la formación de partículas virales infecciosas auténticas.

Otra forma preferente de realización de la estructura de VHC-ARN según la invención se distingue porque la estructura presenta, en lugar del gen marcador, o adicionalmente al gen marcador, un gen delator integrado.

A continuación se entiende por gen delator cualquier gen cuya presencia, tras traslado a un organismos objetivo, se pueda identificar fácil y generalmente con métodos bioquímicos, o también histoquímicos sencillos, es decir, que codifica para una proteína que se puede identificar y cuantificar de manera sencilla y segura con los métodos de medida habituales de laboratorio.

Esta variante de la estructura de VHC-ARN tiene la ventaja de que la extensión de la replicación de esta estructura se puede medir por medio del producto de gen delator de manera sencilla y rápida con métodos habituales de laboratorio.

El gen delator es preferentemente un gen del grupo constituido por genes de luciferasa, gen de CAT (gen de cloroanfenicol-acetil-transferasa), el gen de lacZ (gen de beta-galactosidasa), los genes de GFP (gen de proteína fluorescente verde), el gen de GUS (gen de glucoronidasa) o el gen de SEAP (gen de fosfatasa alcalina segregado). Estos genes delatores, o bien sus productos, esto es, las correspondientes proteínas delatoras, se pueden determinar, por ejemplo, por medio de fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimetría, o con ayuda de métodos inmunológicos (por ejemplo ELISA).

No obstante, como gen delator entra en consideración también un gen marcador sucedáneo. En este contexto se debe entender por este aquellos genes que codifican para proteínas celulares, ácidos nucleicos o -generalmente- para aquellas funciones que están sujetas a una variación dependiente de la replicación de virus, y que, a consecuencia de ello, se reprimen, o bien se activan en aquellas células en las que el VHC o bien la estructura de VHC-ARN se propaga. Es decir: la reducción, o bien activado de esta función es un marcador sustitutivo para la replicación de virus, o bien la replicación de la estructura de VHC-ARN. Una variante de la estructura de VHC-ARN según la invención está caracterizada, por consiguiente, porque su replicación influye sobre la expresión de un gen marcador sucedáneo (celular).

El gen delator y el gen marcador seleccionable pueden estar dispuestos especialmente en la estructura, de tal manera que exprimen conjuntamente una proteína de fusión. En este caso, existe la posibilidad ventajosa de que estos dos genes estén dispuestos en la estructura de VHC-NRA de manera que sus dos proteínas exprimidas se fusionen en primer lugar a través de un punto de corte para la proteasa (por ejemplo ubiquitina) o a través de un péptido que se autodisocia (por ejemplo la proteína 2A de picornavireno), y sólo después se separan de nuevo por vía proteolítica.

Del mismo modo, estas dos posiciones se pueden situar también separadas entre sí, de modo que ambos productos génicos se expriman por separado (por ejemplo en el orden: gen marcador, o bien gen de resistencia -punto de unión interno de ribosomas- gen delator).

En el caso del gen delator ha dado buen resultado especialmente una variante de realización en la que el gen delator en el marco de lectura abierto del genoma o subgenoma VHC está introducido por clonación, y precisamente de manera que en primer lugar se transforma en una forma activa tras un procesado proteolítico.

La estructura de VHC-ARN según la invención considerada en sí misma se puede emplear en todas sus variaciones igualmente para múltiples fines. A estos pertenecen, sobre todo:

\bullet: la construcción de virus de hepatitis C atenuados, o bien partículas similares a VHC, y su producción en cultivos celulares.

: Mediante mutaciones casuales o provocadas selectivamente, a modo de ejemplo mutaciones puntuales, deleciones o inserciones, se pueden generar partículas de VHC atenuadas o similares a VHC, es decir, virus, o bien partículas similares a virus con competencia de replicación plena, pero carácter patógeno reducido, o bien ausente. Tales partículas de VHC atenuadas o similares a VHC son empleables en especial como vacunas.

\bullet: La construcción de VHC-ARN con genes ajenos integrados, a modo de ejemplo para el empleo como portadores génicos específicos de células hepáticas en la terapia génica. Debido al marcado tropismo celular hepático de VHC y a la posibilidad de sustituir partes de genoma por secuencias heterólogas, se pueden obtener estructuras de VHC-ARN, en las que las proteínas estructurales se substituyen por medio de un gen eficaz terapéuticamente. La estructura de VHC-ARN obtenida de este modo se incluye en células, preferentemente por medio de transfección, que exprimen las funciones de VHC ausentes, a modo de ejemplo las proteínas estructurales, de manera constitutiva o inducible. Mediante esta técnica conocida por el especialista bajo el concepto de ``transcomplementación'' se pueden generar partículas de virus en las que se incorpora la estructura de VHC-ARN. Las partículas obtenidas de este modo se pueden emplear para la infección, preferentemente de células de hígado. En esta se lleva a expresión el gen ajeno eficaz desde el punto de vista terapéutico, y este desarrolla con ello su acción terapéutica.

\bullet: El hallazgo de células permisivas, es decir, células en las que se efectúa una propagación de virus productiva. Con este fin se emplea una de las estructuras de genoma de VHC-ARN, citadas anteriormente, que es apta para la formación de virus infecciosos completos, o se emplea una de las estructuras de subgenoma de VHC citadas anteriormente, que se transfiere, sin embargo, en primer lugar según el ejemplo citado anteriormente, en una línea celular que exprime las funciones que faltan de manera constitutiva o inducible. En todos estos casos se producen partículas de virus que portan un gen de resistencia y/o delator adicionalmente a la secuencia de VHC. Para el hallazgo de células en las que se puede replicar el VHC, se infectan estas células con los virus obtenidos de este modo y se someten a una selección de antibiótico, o se investigan en dependencia de la estructura de VHC-ARN por medio de identificación de la expresión del gen delator. Ya que una resistencia a antibióticos, o bien una expresión del gen delator es identificable sólo si se replica la estructura de VHC-ARN, las células encontradas de este modo deben ser permisivas. De este modo se pueden analizar y encontrar casi cualquier tipo de líneas celulares o cultivos celulares primarios con respecto a la permisividad.

Otra variante de la estructura VHC-ARN según la invención está caracterizada porque la estructura de VHC-ARN presenta un gen ajeno integrado y es apropiada para introducir este gen ajeno en una célula objetivo, que es apropiada para la expresión de este gen ajeno.

Otra variante de la estructura de VHC-ARN según la invención se distingue porque la estructura de VHC-ARN presenta mutaciones de nucleótidos y/o aminoácidos, está adaptada al cultivo celular, se replica con eficiencia elevada, y es obtenible cultivándose un sistema de cultivo celular según la invención según la reivindicación 1, en el que el material génico específico de VHC introducido es una estructura de VHC-ARN según la invención con gen de selección según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el medio de selección correspondiente al gen de selección, cosechándose los clones celulares desarrollados, y aislándose de estos clones celulares la estructura de VHC-ARN o partes de las mismas.

Un perfeccionamiento de esta variante consiste en introducir de nuevo la estructura de VHC-ARN aislada a partir de los clones celulares, o partes de la misma, al menos una vez, esto es, incluir en células del sistema de cultivo celular según la invención conforme a la reivindicación 11, y cultivar estas células en el medio de selección correspondiente a gen de selección, cosechar los clones celulares desarrollados, y aislar a partir de estos clones celulares la estructura de VHC-ARN o partes de la misma.

Una estructura de VHC-ARN completamente preferente, con eficiencia de replicación elevada y muy elevada y, a consecuencia de ello, muy buena actitud para la aplicación práctica, está caracterizada porque contiene uno o varios de todos los intercambios de aminoácidos, o bien nucleótido alistados en la tabla 3 y/o uno o varios de los intercambios de aminoácidos alistados a continuación: 1283 arg -> gly, 1383 glu -> ala, 1577 lys -> arg, 1609 lys -> glu, 1936 pro -> ser, 2163 glu -> gly, 2330 lys -> glu, 2442 ile -> val. (Los números se refieren a las posiciones de aminoácido de la proteína del producto aislado de VHC con 1, véase tabla 1).

Una variante preferente del sistema del cultivo celular según la invención, que ha dado muy buen resultado en la práctica, está depositada bajo el número DSM ACC2394 (denominación de laboratorio HuBl 9-13) en la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig, Alemania.

Con el sistema de cultivo celular según la invención se pone a disposición por primera vez un sistema in vitro en el que el VHC-ARN se replica y exprime por vía intracelular, de manera autónoma y en cantidades suficientemente grandes, de modo que se puede llevar a cabo una determinación cuantitativa tanto de las cantidades de VHC-ARN, como también de proteínas específicas de VHC con métodos de medida bioquímicos convencionales y de precisión segura. Es decir: por primera vez se dispone de un sistema de replicación de VHC aproximadamente auténtico basado en células (``cell-based''), que se requiere forzosamente para el desarrollo y análisis de productos farmacéuticos antivirales. Este sistema de ensayo ofrece ahora la posibilidad de identificar objetivos de ataques potenciales para una terapia específica de VHC eficaz, y desarrollar y evaluar productos quimioterapéuticos específicos de VHC.

La invención se basa en el conocimiento sorprendente de que una replicación eficiente de VHC-ARN tiene lugar sólo en células si estas se transfirieron con una estructura de VHC-ARN, que comprende al menos las regiones 5' y 3' no trasladadas (NTR) y las proteínas no estructurales (NS) 3 a 5B y presenta adicionalmente un gen marcador seleccionable (gen de selección). Aparentemente, los genes estructurales carecen de significado esencial para el desarrollo de la replicación, mientras que, por otra parte, una replicación eficiente de VHC-ARN parece tener lugar sólo si las células transferidas se someten a una presión de selección permanente, que se ocasiona mediante el gen marcador seleccionable unido con el VHC-ARN, (gen de selección). El gen marcador (gen de selección), por consiguiente, parece provocar por una parte la selección de aquellas células en las que se replica productivamente el VHC-ARN, y por otra parte parece aumentar de manera esencial la eficiencia de la replicación de ARN.

El sistema de cultivo celular según la invención en todas sus variaciones se puede emplear para múltiples fines. Estos comprenden:

\bullet: el hallazgo de substancias eficaces como antivirales. Estas pueden ser, a modo de ejemplo: compuestos orgánicos, que intervienen directa o indirectamente en la propagación de virus (por ejemplo inhibidores de proteasas virales, de helicasas NS3, de polimerasa de ARN dependiente de NS5B ARN), oligonucleótidos antisentido, que hibridan en cualquier secuencia objetivo dentro de la estructura de VHC-ARN (por ejemplo la 5' NTR), y conducen indirecta o directamente a una influencia de la propagación de virus, por ejemplo debido a una reducción de la traslación de la poliproteína VHC o ribozimas, que disocian cualquier secuencia de VHC-ARN, y con ello reducen la replicación de virus.

\bullet: La evaluación de cualquier tipo de substancias eficaces como antivirales en el cultivo celular. Tales substancias se pueden encontrar, a modo de ejemplo, por medio de ``rational drug design'' o ``highthroughput screening'', aislado purificado. Se debe entender por evaluación sobre todo la determinación de propiedades inhibidoras de la correspondiente substancia, así como su mecanismo de acción.

\bullet: La identificación de nuevos objetivos de ataque, de origen viral o celular, para una terapia antiviral específica de VHC. A modo de ejemplo, si una proteína celular es esencial para la replicación de virus, por medio de inhibición de esta proteína celular se puede influir igualmente sobre la replicación de virus. El hallazgo de tales factores auxiliares es igualmente posible con el sistema según la invención.

\bullet: El empleo para la determinación de resistencia. Se debe suponer que, debido a la alta velocidad de mutación del genoma de VHC, se presentan resistencias a la terapia. Tales resistencias, que son de gran significado precisamente en la admisión clínica de una substancia, se pueden determinar con el sistema de cultivo celular según la invención. Las líneas celulares en las que la estructura de VHC-ARN o bien el genoma o subgenoma de VHC se replica, se incuban con concentraciones crecientes de la correspondiente substancia, y se determina la replicación de ARN viral por medio de un delator introducido, o mediante determinación cualitativa o cuantitativa de ácidos nucleicos virales o proteínas. Será resistencia si no se puede observar inhibición de la replicación en concentración de producto activo normal. Mediante reclonación de VHC-ARN (por medio de RT-PCR) y análisis secuencial, se pueden determinar los intercambios de nucleótidos, o bien aminoácidos responsables de la resistencia a la terapia. Mediante introducción a la clonación del (de los) correspondiente(s) intercambio(s) en la estructura original, se puede identificar su causalidad para la resistencia a la terapia.

\bullet: La producción de proteínas virales auténticas (antígeno) para el desarrollo y/o evaluación de diagnósticos. El sistema de cultivo celular según la invención permite también la expresión de antígenos VHC en cultivos celulares. Estos antígenos se pueden emplear en principio también para la estructura de procedimientos de identificación diagnósticos.

\bullet: La producción de virus de VHC y partículas similares a virus, en especial para el desarrollo u obtención de productos terapéuticos y vacunas, así como para fines diagnósticos. En especial genomas de VHC completos adaptados al cultivo celular, que se pueden obtener con el sistema de cultivo celular según la invención, son aptos para replicar en cultivos celulares con alta eficiencia. Estos genomas poseen en su totalidad funciones de VHC y, por consiguiente, son aptos para producir virus infecciosos.

Por consiguiente, la invención se refiere también al empleo de un sistema de cultivo celular según la invención y/o de una estructura de VHC-ARN según la invención para la obtención y/o evaluación y/o análisis de productos terapéuticos y/o diagnósticos para el tratamiento, en especial, de infecciones de VHC, así como para la obtención de una vacuna contra infecciones de VHC.

La invención se refiere además al empleo de una estructura de VHC-ARN según la invención para la obtención de un portador génico específico a células del hígado para la terapia génica.

El sistema de cultivo celular según la invención permite también el hallazgo selectivo de estructuras de VHC-ARN, en las cuales se llega a un aumento de la eficiencia de replicación debido a mutaciones, que suceden casualmente en el ámbito de la replicación de VHC-ARN, o que se introducen selectivamente en la estructura. Tales mutaciones, que conducen a una modificación de la replicación de la estructura de VHC-ARN, son conocidas por el especialista como mutaciones de adaptación.

Por lo tanto, la invención comprende también el empleo de una estructura de VHC-ARN según la invención según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de mutantes adaptados al cultivo celular de una estructura de VHC-ARN, según la anterior descripción, presentando los mutantes una eficiencia de replicación elevada frente a la estructura de VHC-ARN originaria. Este empleo está caracterizado porque se cultiva un sistema de cultivo celular según la reivindicación 11 o 12, que contiene estructuras de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el medio de selección correspondiente al gen de selección, se cosecha los clones celulares desarrollados, y se aísla a partir de estos clones celulares las estructuras de VHC-ARN o partes de las mismas. Una variante ventajosa de este empleo consiste en introducir de nuevo al menos una vez las estructuras de VHC-ARN aisladas, esto es, incluir en células de un sistema de cultivo celular según la invención, y cultivar las mismas en el medio de selección correspondiente al gen de selección, cosechar los clones celulares desarrollados, y aislar a partir de estos clones celulares las estructuras de VHC-ARN o partes de las mismas.

Con esta variante de procedimiento se puede aumentar aún el grado de mutaciones por adaptación, y con ello el grado de eficiencia de replicación en las correspondientes estructuras de VHC-ARN.

Las estructuras de VHC-ARN adaptadas al cultivo celular obtenidas según la invención con alta eficiencia de replicación están caracterizadas porque son derivables mediante intercambio de nucleótidos y/o aminoácidos de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6, y por que son obtenibles con uno o varios de los procedimientos de obtención citados anteriormente.

Por lo demás, la invención comprende el empleo de una estructura VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de mutantes de un genoma de longitud parcial de VHC-ARN o de un genoma parcial VHC-ARN, o de cualquier estructura de VHC-ARN con eficiencia de replicación elevada en comparación con el genoma de longitud completa o genoma parcial de VHC-ARN original o estructura de VHC-ARN. Este empleo está caracterizado porque, según la reivindicación 16 o la reivindicación 17, se obtiene un mutante adaptado al cultivo celular de la estructura de VHC-ARN, porque se determina la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de estos mutantes, y mediante comparación con la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la estructura de VHC-ARN original se determina el tipo, número y posiciones de mutaciones de nucleótidos y aminoácidos, y porque se introduce estas mutaciones, mediante mutagénesis selectiva, o bien mediante intercambio de secciones de secuencia, que contienen las respectivas mutaciones, en un genoma de longitud completa VHC aislado, o un genoma parcial de VHC, o cualquier estructura de VHC-NRA.

Para la identificación, o bien para la verificación de aquellas mutaciones que provocan de hecho una modificación de la replicación y en especial un aumento de la replicación, se puede llevar a cabo un test en el que se introduce los intercambios de nucleótidos y/o aminoácidos determinados en la estructura de VHC-ARN original, y se incluye de nuevo ésta en el cultivo celular. Si la mutación introducida conduce de hecho a un aumento de la replicación, en el caso de una estructura de VHC-ARN con gen marcador seleccionable, el número de clones celulares resistentes en la estructura mutada artificialmente debía ser claramente más elevado que en el caso de la estructura no tratada. En el caso de una estructura con un gen delator, la actividad, o bien cantidad de delator en la estructura mutada artificialmente debía ser claramente más elevada que en la estructura no tratada.

Estas estructuras de VHC-ARN adaptadas al cultivo celular se pueden emplear para obtener cualquier estructura de VHC-ARN o genomas de longitud plena o parciales de VHC con eficiencia de replicación elevada. En este caso se pueden obtener tanto estructuras con un gen de resistencia seleccionable, como también estructuras sin tal gen, o bien con un gen delator no seleccionable (por ejemplo luciferasa), ya que debido a la muy elevada eficiencia de replicación de la estructura de VHC-ARN adaptada al cultivo celular se puede identificar su replicación también en células no seleccionadas.

Los mutantes adaptados al cultivo celular según la invención de una estructura de VHC-ARN o de un genoma de longitud plena de VHC o de un genoma parcial de VHC con eficiencia de replicación elevada en comparación con la estructura de VHC-ARN original o el genoma de longitud plena de VHC original, están caracterizados porque son obtenibles con un procedimiento en el que se determina el tipo y número de mutaciones en una estructura de VHC-ARN adaptada al cultivo celular mediante análisis secuencial y comparación de secuencias, y se introduce estas mutaciones en una estructura de VHC-ARN, en especial en una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 4 a 19, o en un genoma de longitud plena VHC-ARN (aislado), mediante mutagénesis selectiva o mediante intercambio de secciones de secuencia, que contienen las mutaciones en cuestión.

No en último término la invención se refiere también al empleo de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la generación de partículas de virus de hepatitis C o partículas similares a virus.

Propiedades especiales de las secuencias indicadas en los protocolos de secuencia

SEQ ID-NO: 1

Nombre: I389/núcleo 3'/wt

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

2.: 342-1193: VHC proteína de núcleo-proteína de fusión neomicina fosfotransferasa; marcador seleccionable

3.: 1201-1812: punto de unión interna ribosomas del virus de encefalomiocarditis; permite la traslación del marco de lectura abierto situado tras VHC

4.: 1813-10842: VHC poliproteína de núcleo a proteína no estructural 5B

5.: 1813-2385: VHC proteína de núcleo; proteína estructural

6.: 2386-2961: proteína envolvente 1 (proteína de cubierta 1); proteína estructural

7.: 2962-4050: proteína envolvente 2 (proteína de cubierta 2); proteína estructural

8.: 4051-4239: proteína p7

9.: 4240-4890: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

10.: 4891-6783: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

11.: 6784-6945: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

12.: 6946-7728: proteína no estructural 4B (NS4B)

13.: 7729-9069: proteína no estructural 5A (NS5A)

14.: 9070-10842: proteína no estructural 5B (NS5B); ARN-polimerasa dependiente de ARN

15.: 10846-11076: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 2

Nombre: I337/NS2-3'/wt

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

2.: 342-1181: VHC proteína de núcleo-proteína de fusión neomicina fosfotransferasa; marcador seleccionable

3.: 1190-1800: punto de unión interna ribosomas del virus de encefalomiocarditis; permite la traslación del marco de lectura abierto situado tras VHC

4.: 1801-8403: VHC poliproteína de proteína no estructural 2 a proteína no estructural 5B

5.: 1801-2451: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

6.: 2452-4344: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

7.: 4345-4506: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

8.: 4507-5289: proteína no estructural 4B (NS4B)

9.: 5290-6630: proteína no estructural 5A (NS5A)

10.: 6631-8403: proteína no estructural 5B (NS5B); ARN-polimerasa dependiente de ARN

11.: 8407-8637: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 3

Nombre: I389/NS3-3'/wt

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

3.: 1202-1812: punto de unión interna ribosomas del virus de encefalomiocarditis; permite la traslación del marco de lectura abierto situado tras VHC

4.: 1813-7767: VHC poliproteína de proteína no estructural 3 a proteína no estructural 5B

5.: 1813-3708: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

6.: 3709-3870: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

7.: 3871-4653: proteína no estructural 4B (NS4B)

8.: 4654-5994: proteína no estructural 5A (NS5A)

9.: 5995-7767: proteína no estructural 5B (NS5B); ARN-polimerasa dependiente de ARN

10.: 7771-8001: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 4

Nombre: I337/NS3-3'/wt

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1801-7758: VHC poliproteína de proteína no estructural 3 a proteína no estructural 5B

5.: 1801-3696: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

6.: 3697-3858: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

7.: 3859-4641: proteína no estructural 4B (NS4B)

8.: 4642-5982: proteína no estructural 5A (NS5A)

9.: 5983-7755: proteína no estructural 5B (NS5B); ARN-polimerasa dependiente de ARN

10.: 7759-7989: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 5

Nombre: I389/NS2-3'/wt

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-8418 VHC poliproteína de proteína no estructural 2 a proteína no estructural 5B

5.: 1813-2463: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

6.: 24644356: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

7.: 4357-4518: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

8.: 4519-5301: proteína no estructural 4B (NS4B)

9.: 5302-6642: proteína no estructural 5A (NS5A)

10.: 6643-8415: proteína no estructural 5B (NS5B); ARN-polimerasa dependiente de ARN

11.: 8419-8649: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 6

Nombre: I389/NS3-3'/9-13F

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-7767: VHC poliproteína de proteína no estructural 3 a proteína no estructural 5B del mutante 9-13F adaptado al cultivo celular

5.: 1813-3708: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

6.: 3709-3870: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

7.: 3871-4653: proteína no estructural 4B (NS4B)

8.: 4654-5994: proteína no estructural 5A (NS5A)

10.: 7771-8001: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 7

Nombre: I389/núcleo-3'/9-13F

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-10842: VHC poliproteína de núcleo 3 a proteína no estructural 5B del mutante 9-13F adaptado al cultivo celular

5.: 1813-2385: VHC proteína de núcleo; proteína estructural

8.: 4051-4239: proteína p7

9.: 4240-4890: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

10.: 4891-6783: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

12.: 6946-7728: proteína no estructural 4B (NS4B)

13.: 7729-9069: proteína no estructural 5A (NS5A)

15.: 10846-11076: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 8

Nombre: I389/NS3-3'/5.1

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

3.: 1202.1812: punto de unión interna ribosomas del virus de encefalomiocarditis; permite la traslación del marco de lectura abierto situado tras VHC

4.: 1813-7767: VHC poliproteína de proteína no estructural 3 a proteína no estructural 5B del mutante 5.1 adaptado al cultivo celular

5.: 1813-3708: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

6.: 3709-3870: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

7.: 3871-4653: proteína no estructural 4B (NS4B)

8.: 4654-5994: proteína no estructural 5A (NS5A)

10.: 7771-8001: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 9

Nombre: I389/núcleo-3'/5.1

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-10842: VHC poliproteína de núcleo a proteína no estructural 5B del mutante 5.1 adaptado al cultivo celular

5.: 1813-2385: VHC proteína de núcleo; proteína estructural

8.: 4051-4239: proteína p7

9.: 4240-4890: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

10.: 4891-6783: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

12.: 6946-7728: proteína no estructural 4B (NS4B)

13.: 7729-9069: proteína no estructural 5A (NS5A)

15.: 10846-11076: VHC 3' región no trasladada

SEQ ID-NO: 10

Nombre: I389/NS3-3'/19

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-7767: VHC poliproteína de proteína no estructural 3 a proteína no estructural 5B del mutante 19 adaptado al cultivo celular

5.: 1813-3708: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

6.: 3709-3870: proteína no estructural 4A (NS4A); NS3 cofactor de proteasa

7.: 3871-4653: proteína no estructural 4B (NS4B)

8.: 4654-5994: proteína no estructural 5A (NS5A)

10.: 7771-8001: VHC 3' región no trasladada.

SEQ ID-NO: 11

Nombre: I389/núcleo-3'/19

Estructura (posiciones de nucleótidos):

1.: 1-341: VHC 5' región no trasladada

4.: 1813-10842: VHC poliproteína de núcleo 3 a proteína no estructural 5B del mutante 19 adaptado al cultivo celular

5.: 1813-2385: VHC proteína de núcleo; proteína estructural

8.: 4051-4239: proteína p7

9.: 4240-4890: proteína no estructural 2 (NS2); VHC NS2-3 proteasa

10.: 4891-6783: proteína no estructural 3 (NS3); VHC NS3 proteasa/helicasa

12.: 6946-7728: proteína no estructural 4B (NS4B)

13.: 7729-9069: proteína no estructural 5A (NS5A)

15.: 10846-11076: VHC 3' región no trasladada.

La invención se explica más detalladamente a continuación por medio de ejemplos de realización y tablas y figuras correspondientes. Las figuras mencionadas muestran

Figura 1 A: La estructura de un elemento de VHC-ARN según la invención.

En la parte superior se da una representación esquemática de la estructura del genoma de VHC parental completo con las posiciones de genes para los productos de disociación núcleo, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B dentro de la poliproteína, y las regiones 5' y 3' no trasladadas (5' NTR y 3' NTR) -representados como barras horizontales-, y con ambas posiciones seleccionadas para la generación de estructuras de subgenoma, esto es, la posición del ``dominio catalítico de GDD'' de NS5B ARN polimerasa (GDD) y la posición del límite 3' de VHC-IRES (posiciones de nucleótidos 1 a 377, o bien 1 a 389) -representado por encima del esquema de genoma-. Los números por debajo del esquema de genoma designan las correspondientes posiciones de nucléotidos.

Bajo los mismos se muestran representaciones esquemáticas de estructuras de dos elementos de VHC-ARN modificados según la invención (subgenoma), constituido por 5' VHC-IRES, el gen de neomicinfosfotransferasa (Neo^{R}), el EMCV-IRES (E-I) y las secuencias VHC de NS2, o bien NS3 hasta el auténtico extremo 3'. La posición de la deleción de 10 aminoácidos que comprende el motivo NS5B polimerasa GDD está marcada respectivamente con un triángulo (\bullet ).

Figura 1 B: El resultado de una electroforesis en formadehído-gel de agarosa desnaturalizante para la identificación de ARN de hebra positiva replicado en clones celulares Huh-7 transferidos sub-introducidos.

Las posiciones de ARNs específicos de VHC (flechas) y el 28S rARN se indican a la derecha de la vía 12, las magnitudes (números de nucleótidos) del marcador de ARN (M) se indican a la izquierda de la vía 1.

Figura 1 C: El resultado de un ensayo de PCR con subsiguiente Southern-Blot para la identificación de la ausencia de ADN replicón integrado en la mayor parte de clones celulares seleccionados.

Las vías 1 y 2 muestran los controles positivos, la vía 13 los controles negativos. Los datos numéricos a la izquierda de la vía 1 denominan el tamaño de la molécula de marcador de nucleótidos.

Figura 2 A: El resultado de un ensayo de PCR con subsiguiente Southern-Blot para la disgregación sensitiva de ADN replicón integrado (moléculas de plásmido I_{377}/NS3-3'/wt) en un clon celular que contiene la estructura VHC-ARN y (9-13). Las vías 7 a 11 representan el resultado de una titración de moléculas de ADN de la estructura I_{377}/NS3-3'/wt sin adición de ADN total del clon celular 9-13, y las vías 2-6 representan las mismas moléculas de plásmido con adición de 1 \mug de 9-13 ADN respectivamente antes de PCR (con el fin de disgregación de un inhibidor de PCR en la preparación de ADN). La vía 13 representa el control negativo (PCR sin sonda de ADN). La vía 1 muestra el resultado que se obtuvo con un \mug de ADN del clon celular 9-13.

Figura 2 B: El resultado de un ensayo Northern-Blot para la cuantificación de ARN de hebra positiva y negativa de VHC.

Las flechas marcan las posiciones del ARN replicó. Los datos ``más'' y ``menos'' designan la polaridad positiva (más), o bien negativa (menos) de los controles de ARN, que se aplicaron sobre el gel. ``Hebra negativa'' y ``hebra positiva'' designan la especificidad de las sondas de ARN radioactivas.

Figura 2 C: Resultado de una electroforesis en formaldehído-gel de agarosa tras marcaje radioactivo de VHC-ARN replicado intracelularmente para la identificación de la resistencia de la replicación de VHC-ARN contra dactinomicina.

Figura 3 A: Identificación de antígenos específicos de VHC en los clones celulares seleccionados por medio de inmunoprecipitación tras marcaje radioactivo metabólico. Las vías 7-9 representan auténticos marcadores de tamaño (que se obtuvieron tras expresión transitoria de una estructura de VHC-ARN en células Huh-7); las proteínas de VHC identificadas están marcadas en el margen izquierdo de la vía 1. Los pesos moleculares (en kilodalton) están indicados en el margen derecho de la vía 9.

Figura 3 B: Resultados de un ensayo de inmunofluorescencia para la identificación de la localización subcelular de antígenos de VHC.

Figura 4: Representación esquemática de la estructura de un elemento de VHC-ARN seleccionable según la invención (genoma completo) constituido por 5' VHC-IRES, el gen de neomicinfosfotransferasa (NeoR), un elemento IRES heterólogo, por ejemplo del virus de encefalomiocarditis (E-I), el marco de lectura de VHC completo y el auténtico 3'NTR.

Figura 5: Representación esquemática de la estructura de elementos de VHC-ARN con gen de resistencia antibióticos insertado (A) dentro de la secuencia de nucleótidos que codifica para la poliproteína (ARN monocistrónico), y (B) dentro de 3' NTR (ARN bicistrónico).

Figura 6: Representación esquemática de la estructura de elementos de VHC-ARN con gen delator insertado (A) como parte de un replicón VHC de NS3 a NS5B; -la proteína de delator se disocia en último lugar mediante proteasas virales o celulares a partir de la poliproteína, y el gen marcador seleccionable (gen de selección), o bien el gen de resistencia se incluye en las células mediante con transfección, (B) como parte de un gen de fusión a partir de gen de resistencia y gen delator (por ejemplo para la neomicinfosfotransferasa y proteína fluorescente verde) (C) como parte de un replicón a partir de gen de resistencia y gen delator (por ejemplo para la neomicinfosfotransferasa y la proteína fluorescente verde), que están unidos a través de una secuencia de nucléotidos, que codifica para una secuencia de aminoácidos (zona a trazos), que se puede disociar por una proteasa o que dispone de una actividad de autodisociación (autocatalítica), (D) como gen independiente (en este caso proteína fluorescente verde), que se exprime desde un punto interno de unión de ribosomas propio (IRES); - el gen de resistencia (aquí: gen de neomicinfosfotransferasa) se exprime independientemente, del mismo modo desde un punto interno de unión de ribosomas propio (IRES) (estructura policistrónica).

Figura 7: Representación esquemática de la estructura de un elemento de VHC-ARN en el que el gen de resistencia está unido a la secuencia de VHC-ARN a través de un ribozima, o bien un punto de reconocimiento para un ribozima. Las líneas gruesas representan los VHC 5' y 3' NTR, E-I es un punto de unión interno de ribosomas heterólogo, que es necesario para la expresión del gen de resistencia, y el cuadrado gris representa el ribozima, o bien un punto de reconocimiento para un ribozima.

Figura 8: Representación esquemática de la estructura de un elemento de VHC-ARN con gen de resistencia y gen ajeno integrado.

Figura 9: Procedimiento metódico para la comparación de infecciosidad específica (expresada como número de colonias celulares formadas) de ARN tal frente a estructuras in vitro. Se obtiene VHC-ARN por medio de trascripción in vitro de una correspondiente estructura de ARN, y se cuantifica mediante medida de la densidad óptica a 260 nm (OD 260 nm). Se mezcla un número definido de estas moléculas con una determinada cantidad de ARN total de células Huh-7 naive, y se introduce esta mezcla con ayuda de electroporación en células Huh-7 naive. Paralelamente se aisló el ARN total de un clon celular, que se obtuvo con el método descrito en la figura 1, con un procedimiento conocido en el estado de la técnica, y se determinó la cantidad de VHC-ARN contenido en el mismo por medio de Northern-blot bajo empleo de una sonda de ARN específica de VHC, y subsiguiente cuantificado por medio de Phosphoimager. Se transfiere una cantidad definida de ARN total en células Huh-7 naive análogamente a las estructuras in vitro. Estas células en ambas cargas se someten a continuación a una selección G418, y se determina el número de colonias formadas mediante recuento después de fijación y teñido con Coomassie-Brilliant-Blau. Para la determinación de la eficiencia de transfección se añade a cada carga de transfección 1 \mug de un plásmido, que permite la expresión de luciferasa, se cosecha una alícuota de células transferidas después de 24 horas, y se determina la actividad de luciferasa en el respectivo lisado celular. Se normaliza el número de colonias respectivamente a la expresión de luciferasa.

Figura 10: Análisis secuencial de clones 9-13. Se aisló el ARN total del clon celular 9-13, que se produjo mediante transfección de la estructura VHC-ARN I377/NS3-3', con un procedimiento conocido en el estado de la técnica, y se amplificó la estructura de VHC-ARN de la posición de nucleótido 59 a 9386 con ayuda de ``long-distance RT-PCR'' bajo empleo del cebador S59 y A9413. Se clonaron los fragmentos de PCR y se secuenciaron completamente 11 clones (llamados 9-13 A - K), mostrándose idénticos los clones D e I, E Y G, así como H y J. Las posiciones de diferencias de aminoácidos en la región NS3-5B entre el VHC-ARN reclonado y la estructura parental están marcados con un trazo grueso vertical en el respectivo clon. Se digirió cada clon con el enzima de restricción Sfi I, y se insertó el fragmento respectivo en la estructura parental. Se transfirieron estos clones respectivamente a células Huh-7 y se sometieron las células a una selección como se describen en la figura 1. El número de clones celulares obtenido con cada estructura se señala a la derecha junto a la respectiva estructura.

Figura 11 A: Principio de determinación de replicación con ayuda de un gen delator. En la anterior parte de la figura se representa la estructura VHC-ADN I_{389}/Luc/NS3-3', constituida por VHC 5' NTR (posición de nucleótido 1-389), el gen de luciferasa (luc), el IRES del virus de encefalomunicarditis, el VHC-NS3- 5B y el 3' NTR. La posición del centro activo de NS5B ARN polimerasa, en la que se introdujo un intercambio de aminoácido desactivante, está indicado con ``GND''. Los plásmidos que codifican para la estructura de VHC-ARN competente en replicación, o bien defectuosa, se digieren con el enzima de restricción Sca I y se emplean en una trascripción in vitro con la polimerasa T7 ARN. Tras eliminación del ADN matriz se introducen las respectivas estructuras de VHC-ARN por medio de electroporación en células Huh-7 naive, y se cosechan las mismas a intervalos regulares.

Figura 11 B: Comparación de actividades de luciferasa en células transferidas con la estructura VHC-ARN parental I_{389}/Luc/NS3-3'/wt (wt) o la siguientes variantes: el ARN inactivo (318 DN), la variante 9-13-F o la variante 5.1. Se cosecharon las células 6 (no mostradas), 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas después de la transfección, y se determinó mediante luminometría las actividades de luciferasa.

Figura 12: Genomas de longitud completa VHC seleccionables (estructuras I_{389}/núcleo-3'/5.1 y I_{389}/núcleo-3'/9-13F).

(A): Representación esquemática de la estructura de la longitud completa. La zona entre ambos puntos de reconocimiento indicados para el enzima de restricción Sfi I corresponde a las secuencias de variantes de ARN altamente adaptadas 5.1. o 9.13F.

(B): Número de colonias que se obtuvieron tras transfección de, respectivamente, 0,1 \mug de ARN trascrito in vitro de las estructuras representadas en A I_{389}/núcleo-3'/5.1 en células HUH7. Se indica el resultado de un experimento representativo.

(C): Identificación de ARNs de longitud completa de VHC replicante de manera autónoma en clones celulares resistentes a G418, que se obtuvieron tras transfección de la correspondiente estructura in vitro. La figura muestra el auto-radiograma de un Northern Blot, que se híbrido con una sonda contra el gen de neo-resistencia y VHC 5' NTR. Los controles representados en la vía 1 y 2 corresponden respectivamente a 10^{8} moléculas de las estructuras indicadas in vitro, mezcladas con ARN total a partir de células Huh-7 naive. El control negativo contiene exclusivamente ARN total a partir de células Huh-7 naive (vía 3). Las vías 4-9 contienen 3-10 \mug de ARN a partir de clones celulares resistentes a G418, que se obtuvieron tras transfección de I_{389}/núcleo-3'/5.1-ARN, o bien I_{389}/núcleo-3'/9-13F-ARN trascrito in vitro. La concentración de G418 empleada para selección se indica en cada caso. Cinco de los clones celulares representados contienen la variante de ARN altamente adaptada 5.1 (vía 4-8), una variante adaptada a ARN 9-13F (vía 9).

Figura 13: Estructuras de VHC-ARN con un gen delator. (A) estructuras de VHC-ARN bicistrónicas. Se traslada el gen delator con ayuda de IRES separado. (B) estructuras de VHC-ARN monocistrónicas. Se exprime el producto de gen delator como proteína de fusión con una proteína de VHC. Ambas fracciones están unidas a través de una secuencia de identificación para una proteasa viral o celular, que permite una separación proteolítica de ambas fracciones proteicas fusionadas. En el ejemplo mostrado se fusionaron el producto de gen delator y la respectiva proteína de VHC a través de una secuencia de identificación para ubiquitina (Ub).

Figura 14: Estructura de VHC-ARN tricistrónica de longitud completa, que posee adicionalmente al gen de resistencia un gen ajeno insertado.

Figura 15: Estructuras de VHC-ARN monocistrónicas, en las cuales el producto de gen de resistencia se exprime como proteína de fusión con la fracción de VHC. El gen de resistencia (RG) es activo como proteína de fusión, o bien se fusiona con una secuencia disociable por vía proteolítica con la fracción de VHC, de modo que el producto de gen de resistencia se disocia de la formación de VHC a través de una proteasa celular o viral. En el ejemplo mostrado se fusionó el gen de resistencia a través de la secuencia que codifica ubiquitina (Ub) con la respectiva fracción de VHC.

Ejemplo 1 Obtención de estructuras de VHC-ARN (A) Síntesis y clonación de un genoma de consenso de VHC completo por medio de RT-PCR

Del hígado de un paciente infectado crónicamente se aisló el genoma de VHC es decir, el VHC-ARN como se describe a continuación.

A partir de aproximadamente 100 mg de hígado se aisló el ARN completo según el procedimiento de Chomczynski und Sacci (1987, Anal. Biochem. 162, 156). Con 1 \mug de este ARN aislado se llevó a cabo una trascripción inversa con los cebadores A6103 (GCTATCAGCCGGTTCATCCACTGC) O A9413 (CAGGATGGCCTATTGGCCTGGAG) y el sistema ``expand reverse transcriptase'' (Boehringer Mannheim, Alemania) según las prescripciones del fabricante. Con los productos de esta trascripción inversa (RT) se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa (PCR = polymerase chain reaction), y precisamente bajo empleo de ``expand long template''-Systems (Boehringer Mannheim, Alemania), empleándose el tampón con un 2% de contenido en sulfóxido de dimetilo. Después de una hora a 42ºC se empleó 1/8 de esta carga de reacción en un primer paso de PCR con los cebadores A6103 y S59 (TGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAG) o A9413 y S4542 (CATGAGCT CGCCGCGAAGCTGTCC). Después de 40 ciclos se empleó 1/10 de esta carga de reacción en un segundo paso de PCR con los cebadores S59 y A4919 (AGCACAGCCCGCGTCATAGCACTCG) o S4542 y A9386 (TTAGCTCCCCG TTCATCGGTTGG). Después de 30 ciclos se purificaron los productos de PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa preparativa, y se ligaron los fragmentos eluidos en este caso en el vector pCR2.1 (gen in vitro) o pBSK II (Stratagen). Se analizaron y secuenciaron cuatro clones de cada fragmento, y se determinó una secuencia de consenso. Con este fin se compararon las secuencias de ADN entre sí. Las posiciones en las que la secuencia de uno de los fragmentos se diferencia de las demás, se consideraron mutación indeseable. En el caso de ambigüedades de secuencia se amplificaron fragmentos de PCR más cortos solapantes de la respectiva región, y se secuenciaron varios clones. De este modo se pudo identificar numerosas mutaciones potenciales en cada fragmento, y establecer con ello una secuencia de consenso específica del producto aislado. Esta secuencia de consenso establecida, o bien este genoma, pertenece al genotipo 1b extendido mundialmente. La región no trasladada en el extremo 3' (=3' NTR) se obtuvo por medio de PCR convencional, empleándose un cebador antisentido, que cubría los 24 últimos nucleótidos de ``X-tails'' (Tanaka et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun, 215, 744; y Rice, PCT/US 96/14033) conocido en el estado de la técnica. La auténtica región no trasladada en el extremo 5' (=5' NTR) en sentido de hebra descendente del promotor T7 se generó por medio de PCR, empleándose por una parte un oligonucleótido que corresponde a un promotor acortado T7 (TAA TAC GAC TCA CTA TAG) y los primeros 88 nucleótidos de VHC, y por otra parte se empleó uno de los plásmidos citados anteriormente, que porta uno de los fragmentos 5' del genoma. A partir de los fragmentos subgenómicos con el número mínimo de intercambios no consenso se compuso un genoma de consenso VHC completo y se insertó en un vector pBR322 modificado. Se eliminaron divergencias de la secuencia de consenso por medio de mutagénesis orientada al lugar (``site-directed'' mutagénesis). Para obtener elementos de transcripción ``run-off'' con un extremo 3' auténtico se modificó el 3'-NTR de los productos aislados (con el extremo TGT) a AGT (según la secuencia de genotipo 3 = clon ``WS según Kolykhalov et al., 1996, J. Virol. 70, 3663), y además se efectuó un intercambio de nucleótido adicional en la posición 9562, para mantener el apareamiento de bases A:T en la estructura de agujas capilares en el extremo 3' de 3' NTR (Kolyhalov et al. ibid). Para eliminar un punto de restricción interno para el enzima Scal se efectuó un intercambio de nucleótidos denominado silencioso ("silent"). Tras el ensamblaje del genoma de longitud completa con 5'-3'NTR apropiados se verificó la secuencia de VHC completa. En este caso no se encontró intercambio de nucléotidos indeseable.

El genoma de VHC obtenido de este modo debía ser hepatótropo por definición.

(B) Síntesis de estructuras subgenómicas de VHC seleccionables

Bajo empleo del genoma de consenso descrito en (A) se obtuvo estructuras subgenómicas de VHC, que contienen el gen de resistencia antibióticos neomicinfosfotransferasas (NPT) y dos secuencias de puntos internos de unión de ribosomas (IRES). Las técnicas de procedimiento bioquímicas aplicadas a tal efecto son conocidas y habituales para el especialista (véase: Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecularcloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (eds.), 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-3, John Wiley & Sons Inc., New York). El gen de resistencia antibiótico se insertó inmediatamente tras el 5' NTR, mediante lo cual se obtuvo un ARN bicistrónico (véase la figura 1 A). No obstante, del mismo modo se puede insertar el gen de resistencia a antibióticos en otro punto de la estructura subgenómica de VHC, a modo de ejemplo dentro de la secuencia de nucleótidos codificante para la poliproteína, mediante lo cual se obtiene un ARN monocistrónico (véase la figura 5 A) o en el 3' NTR (véase la figura 5 B). En el caso de elementos IRES se trata por una parte de una de ambas variantes VHC-IRES de nucleótidos 1-377 o nucleótidos 1-389, y por otra parte de IRES del virus de encefalomiocarditis, que controla la traslación de la secuencia de VHC en sentido de hebra descendente de los genes para NS2 o NS3 hasta el extremo 3' auténtico del genoma.

Las dos variantes de VHC-IRES conocidas se determinaron como sigue:

A base de análisis de deleción del límite 3' de VHC-IRES (Reynolds et al. 1995, EMBO J. 14, 6010) se fusionaron diversas fracciones de 5' NTR con el gen de NPT, y se analizaron por medio de contransfecciones con un plásmido que contiene el gen T7 ARN-polimerasa con respecto al máximo número de colonias formadas. Se obtuvo los mejores resultados con la secuencias de VHC de 1-377 y 1-389. Ya que el codón inicial de AUG de la poliproteína de VHC se encuentra en la posición 342, y por consiguiente está contenido en la secuencia de IRES, se llega a una fusión de 12, o bien 16 aminoácidos de la proteína de cápsida VHC ("proteína de núcleo") con la neomicinfosfotransferasa (véase la figura 1 A).

Estas estructuras subgenómicas de VHC modificadas recibieron correspondientemente las denominaciones I_{377}/NS2-3' (o I_{377}/NS3-3') e I_{389}/NS2-3' (o I_{389}/NS3-3'). Estas están representadas esquemáticamente en la figura 1A.

Con elementos de transcripción in vitro de estas estructuras subgenómicas de VHC parentales modificadas I_{377}/NS2-3' (o I_{377}/NS3-3') e I_{389}/NS2-3' (o I_{389}/NS3-3') se sometió a transfección diferentes líneas celulares y cultivos de células primarias de hepatocitos humanos.

Como control negativo paralelo a todos los experimentos de transfección se construyó en cada estructura subgenómica de VHC parental modificada un correspondiente subgenoma modificado, pero defectuoso, que se diferenciaba del parental por presentar dentro del marco de lectura una deleción de 10 aminoácidos, que comprende el centro activo de NS5B ARN polimerasa (Behrens et al., 1996, EMBO J. 15, 12; y Lohmann et al., 1997, J. Virol. 71 8416).

(C) Síntesis de estructuras genómicas de VHC seleccionables

Se restringió una estructura subgenómica de NS2-3', que está unida en el extremo 5' con un fragmento del gen de luciferasa y el EMCV-IRES completo, con NcoI y SpeI, y se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa preparativa. Se ligó el vector obtenido de este modo en una ligación de factor 3 con un fragmento NcoI/NotI-VHC, correspondiente a las posiciones de nucleótidos 342 a 1968 del genoma de VHC y con un fragmento NotI/SpeI correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1968-9605. Después se restringió la estructura producida, en la que el marco de lectura VHC completo y el 3' NTR se encuentran en sentido descendente del fragmento génico de luciferasa y el EMCV-IRES, con PmeI y SpeI, y se ligó con el vector de estructura subgenómica I_{389}/NS3-3'/wt restringido análogamente. Esta estructura genómica de VHC seleccionable está representada en la figura 4.

(D) Obtención de elementos de transcripción in vitro correspondientes a las estructuras de VHC-ARN correspondiente a

Se linealizó el plásmido de ADN purificado descrito anteriormente con ScaI, y tras extracción con fenol/cloroformo y precipitación con isopropanol se empleó en una reacción de transcripción in vitro bajo empleo de los siguientes componentes: 80 mM HEPES, pH 7.5, 12,5 mM MgCl, 2 mM de espermidina, 40 mM de ditiotreitol, 2 mM de cada NTP, 1 unidad de RNasin/\mul, 50 \mug/ml ADN restringido y aproximadamente 2 unidades/\mul de polimerasa. Después de 2 horas a 37ºC se añadió la mitad de la cantidad de T7 polimerasa y se incubó la carga de reacción 2 horas más. Para la eliminación de ADN se extrajo la mezcla con fenol ácido (U. Kedzierski, J.C. Porte, 1991, Bio Techniques 10, 210), se precipitó con isopropanol, se lavó el comprimido en agua y se incubó con DNasa (2 unidades por \mug ADN) durante 60 minutos a 37ºC. Tras extracción subsiguiente con fenol ácido, fenol/cloroformo ácido y precipitación con cloroformo e isopropanol se cuantificó el ARN disuelto por medio de medidas de densidad ópticas, y se verificó su integridad por medio de electroforesis en formaldehído-gel de agarosa.

Ejemplo 2 Experimentos de transfección con la línea de células de hepatoma Huh-7

En todos los experimentos de transfección se procuró cuidadosamente que cualquier ADN matriz se hubiera eliminado previamente, para evitar que tales ADN se integraran en células sometidas a transfección, y se pudiera provocar en éstas una resistencia a neomicina, independientemente de una replicación VHC. Por lo tanto, a continuación de la transcripción in vitro (ejemplo 1 D) se trató la mezcla de reacción con 2 unidades de DNasa por \mug de ADN durante 60 minutos a 37ºC, y se extrajo con fenol ácido, fenol/cloroformo ácido y cloroformo. Antes del empleo para la transfección se analizó el ARN precipitado por medio de electroforesis en formaldehído-gel de agarosa.

Se llevó a cabo tres experimentos de transfección separados con la línea celular de hepatoma humano altamente diferenciado Huh-7 (según Nakabayashi et al. 1982, Cancer Res. 42, 3858). En este caso se introdujo respectivamente 15 \mug de ARN en 8 x 10^{6} células Huh-7 con ayuda de electroporación, y a continuación se sembraron estas células en placas de cultivo de 10 cm de diámetro. 24 horas después de la siembra se añadió neomicina (= G418) en una concentración final de 1 mg/ml. Se cambió el medio de cultivo dos veces por semana. Después de 3-5 semanas no se pudo identificar colonias, que se aislaron e introdujeron bajo las mismas condiciones de cultivo.

Se aislaron y sub-introdujeron los clones celulares que se obtuvieron en el desarrollo del primer experimento. Durante este proceso murieron la mayor parte de clones y el rendimiento final ascendía sólo a 9 clones de células, que se habían sometido a transfección con las estructuras subgenómicas de VHC parentales, y un clon (clones 8-1) de células que se habían sometido a transfección con una estructura genómica de VHC defectuosa, esto es un NS2-3' VHC-ARN defectuoso. Además de un tiempo de duplicación acortado, y la presencia ocasional de células conformadas regularmente, no se encontró diferencias morfológicas estables entre estos 9 clones celulares y el único clon celular (clon 8-1) o las células Huh-7 parentales.

Los criterios principales para estructuras genómicas de VHC en función son la formación de ARN viral con tamaño correcto, y la ausencia de plásmido de ADN (integrado), que puede transferir, o bien mediar una resistencia a G418.

Para determinar el VHC-ARN en las células Huh-7 se aisló el ARN total, y se analizó por medio del procedimiento Northern-Blot de uso común bajo empleo de una ribosonda específica de hebra positiva (= sonda de ARN). A tal efecto se aisló de los respectivos clones celulares el ARN total según el método de Chomczynski y Sacchi 1987, Anal. Biochem. 162, 156, y se separaron 10 \mug de ARN, lo que corresponde al contenido total en ARN de 0,5 - 1 x 10^{6}, por medio de electroforesis desnaturalizante en formaldehído-gel de agarosa (vías 3 a 12 de la figura 1 B). Como marcador de tamaño con secuencia auténtica se separaron simultáneamente 10^{9} de elementos de transcripción in vitro (ivtr.), que correspondían al ARN replicón I_{389}/NS2-3'/wt o al I_{389}/NS3-3'/wt (vía 1, o bien vía 2). El ARN separado se transfirió a membranas de nylon, y se híbrido con sonda de ARN específica de hebra positiva marcada radioactivamente, que era complementaria al gen de NPT completo y al VHC-IRES del nucleótido 377 al nucleótido 1. Las posiciones de ARN específicos de VHC (flechas) y el 28S rARN se indican a la derecha de las vía 12, los tamaños (números de nucleótidos) del marcador de ARN se indican a la izquierda de la vía 1. Los fragmentos de marcador de ARN contienen secuencias de VHC, y por consiguiente hibridan con la ribosonda (=sonda de ARN). Los resultados de este análisis están representados en la figura 1 B.

Con excepción del clon 8-1 sometido a transfección con la estructura genómica de VHC defectuosa, todos los clones celulares proporcionaron VHC-ARN homogéneos de longitud correcta (aproximadamente 8640 nucleótidos en el caso de NS2-3' y aproximadamente 7970 nucléotidos en el caso del replicón de NS3-3'). Este hallazgo es un indicio de que el replicón funcional, o bien las estructuras genómicas de VHC funcionales transfieren la resistencia a G418. Para excluir que la resistencia a G418 se puede atribuir a un ADN de plásmido, que está integrado en el genoma de la célula huésped Huh-7, y se transcribe bajo el control de un promotor celular, se analizó el ADN de cada clon por medio de una CPR específica del gen NPT. En este caso se aisló a partir de los clones celulares Huh-7 seleccionados el ADN por medio de digestión con proteinasa K (40 \mug/ml, 1h, 37ºC) en 10 mMTris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0,5% SDS y subsiguiente extracción con fenol, fenol/cloroformo y precipitación con isopropanol. Se disolvió el precipitado de ADN en 10 mM Tris (pH 7.5) y 1 mM EDTA y se incubó 1 hora con RNasa A. A continuación de una extracción de fenol/cloroformo y precipitación con etanol se analizó 1 \mug de ADN, correspondiente a 4 - 8 x 10^{4} células, por medio de PCR bajo empleo del cebador específico del gen NPT (5'-TCAAGACCGACCTG TCCGGTGCCC-3' y 5'-CTTGAGCCTGGCGAACAG TTCGGC-3'), y se generó un fragmento de ADN constituido por 379 nucleótidos. Se identificó la especificidad del producto de PCR por medio del procedimiento Southern Blot, empleándose un fragmento de ADN marcado con digoxigenina, que corresponde al gen de NPT. Como controles positivos (para la identificación de ácidos nucleicos contaminados, presentes eventualmente) se llevó a cabo el procedimiento PCR con 10^{7} de moléculas de plásmido o 1 \mug de ADN de una línea celular BHK, que se había sometido a transfección de manera estable con un gen de resistencia de neomicina, y como control negativo se llevó a cabo la PCR con los mismos reactivos, pero sin ADN añadido.

Los resultados de esta investigación se representan en la figura 1 C. Las vías 1 y 2 representan los controles positivos, la vía 13 representa el control negativo. Los datos números a la izquierda de la vía designan el tamaño de moléculas marcadores de nucleótido. Además de en el clon 7-3 (figura 1C, vía 3), que procede de células tras transfección con una estructura replicón NS2-3'/genoma NS2-3'VHC, y en el clon 8-1 (figura 1C, vía 12), que procede de células tras transfección con una estructura genómica de VHC defectuosa, no era identificable un NPT-ADN en ningún clon celular. Este hallazgo es un indicio adicional de que la resistencia a G418 de la mayor parte de clones se ocasionó por medio del VHC-ARN replicante. Pero también independientemente de estos resultados es improbable que se genere VHC-ARN con tamaño correcto de ADN de plásmido integrado, ya que los plásmidos empleados para la transcripción in vitro no contienen promotor eucariota ni una señal de poliadenilado. En el caso del clon 7-3, por lo tanto, la resistencia se ha ocasionado probablemente tanto mediante la estructura de VHC-ARN, o bien el VHC-ARN replicante, como también mediante una secuencia de NPT ADN integrada, mientras que la resistencia de las células del clon 8-1 se puede atribuir exclusivamente al ADN de plásmido integrado.

Para confirmar que la resistencia a G418 se ha ocasionado por un VHC-ARN replicante de manera autónoma, se sometió el clon 9-13 (figura 1 B, vía 11) a ensayos adicionales. El clon 8-1, que porta copias integradas del gen NPT se empleó en cualquier caso como control negativo. Con el objetivo de excluir la presencia de NPT- ADN en el clon 9-13 de manera rigurosa, se llevó a cabo una PCR, que permitió la identificación de < 1.000 copias génicas de NPT en \sim 40.000. El resultado de esta PCR que se representa en la figura 2A. En particular se procedió como sigue en esta PCR.

Se emplearon respectivamente 10^{6} - 10^{2} de moléculas de plásmido I_{377}/NS3-3'/wt de manera directa (vías 7-11) o tras adición de respectivamente 1 \mug de 9-13 ADN (vías 2-6) en el ensayo. La especificidad del fragmento de ADN amplificado se determinó por medio de Southern Blot bajo empleo de una sonda específica de NPT. Se llevó a cabo una PCR sin sonda ADN como control negativo (vía 12).

Incluso con este método sensitivo no se encontró en un \mug de ADN del clon celular 9-13 ningún ADN de plásmido (vía 1). Para estimar la cantidad de ARN de hebra positiva y negativa de VHC en estas células, se analizó una serie de dilución de ARN total con el procedimiento Northern-Blot bajo empleo de una ribosonda marcada radioactivamente específica de hebra positiva o negativa (= sonda de ARN). A tal efecto se analizaron respectivamente 8, 4 ó 2 \mug de ARN total, que se habían aislado a partir de los clones celulares 9-13 y 8-1, paralelamente a cantidades conocidas de elementos de transcripción in vitro con polaridad de hebra positiva o negativa (ARN de control) en procedimiento Northern-Blot, y a continuación se sometieron a una hibridación. Se llevó a cabo la hibridación con una ribosonda específica de hebra positiva, que cubría el gen de NPT completo y el VHC-IRES ("hebra positiva", cuadro superior), o con una sonda de ARN específica de hebra negativa, que era complementaria a la secuencia de NS3 ("hebra negativa", cuadro inferior). Las flechas marcan las posiciones del ARN replicón. Los resultados de estos análisis se representan en la figura 2 B.

En el caso de hebra positiva se identificaron aproximadamente 10^{8} copias/\mug de ARN, lo que corresponde a 10.000 - 5.000 moléculas de VHC-ARN por célula, mientras que la cantidad de ARN de hebra negativa era 5 a 10 veces más reducida. Este resultado coincide con la suposición de que el ARN de hebra negativa es la forma intermedia replicativa, o bien copia intermedia, que sirve como base para la síntesis de la hebra positiva.

Ya que la reacción se cataliza esencialmente por la ARN-polimerasa dependiente de ARN viral, la síntesis de VHC-ARN debía ser resistente frente a dactinomicina, un antibiótico que inhibe selectivamente la síntesis de ARN de matrices de ADN, pero no la síntesis de ARN de matrices de ARN. Para confirmar esta suposición se incubaron células con [^{3}H] uridina en presencia de dactinomicina, se extrajo los ARNs marcado radioactivamente, se separaron por medio de electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, y se analizaron por medio de un Bio-Image comercial bajo empleo de una placa de imagen sensible a [^{3}H]. A tal efecto se incubaron aproximadamente 5 x 10^{5} células de clones 9-13 y 8-1 con 100 \mu Ci [^{3}H] de uridina durante 16 horas en ausencia (-) o presencia (+) de 4 \mug/ml de dactinomicina (Dact). A continuación de esta reacción de marcaje se preparó el ARN total y se analizó por medio de electroforesis y formaldehído-gel de agarosa. En las dos primeras vías se representa sólo 1/10 del ARN total. Los ARN marcados radioactivamente se visibilizaron con un BAS-2500 Bio-Imager (Firma Fuji).

Los resultados de este análisis se representan en la figura 2 C. En coincidencia con el perfil inhibidor de NS5B polimerasa (Behrens et al., 1996, EMBOJ. 15, 12 y Lohmann et al., 1997, J. Virol. 71, 8416), la replicación de VHC ARN no se había influenciado por medio de dactinomicina, mientras que la síntesis de ARN celular se había inhibido. Para confirmar la identidad de ARN viral, se llevó a cabo una RT-PCR para la reclonación de secuencias replicadas. El análisis secuencial de ARN reclonado mostró que el ARN en el clon 9-13 es específico de VHC, y coincide con el elemento de transcripción sometido a transfección de la estructura de VHC I_{377}/NS3-3'/wt.

Para el análisis de las proteínas virales se marcaron radioactivamente en primer lugar las células respectivas por vía metabólica con [^{35}S] metionina/cisteina a continuación se lisaron y después se aislaron las proteínas específicas de VHC por medio de inmunoprecipitación a partir de los productos de lisis celulares. Los resultados de estos análisis están representados en la figura 3 A. En este caso se procedió en particular como sigue: las células de clones celulares 9-13 (WT) y 8-1 (\bullet ) estaban marcadas radioactivamente por vía metabólica mediante tratamiento durante 16 horas con una mezcla de marcaje proteico habitual para el especialista y adquirible en el comercio (por ejemplo NEN Life Science). Por medio de inmunoprecipitación (IP) bajo condiciones no desnaturalizantes (por ejemplo según Bartenschlanger et al., 1995, J. Virol. 69, 7519) y bajo empleo de tres antisueros diferentes (3/4, 5A, 5B, según marcaje en el extremo superior de las vías 1 a 12), las proteínas específicas de VHC se habían separado del lisado celular. Los inmunocomplejos se analizaron por medio de Tricine SDS-PAGE, y se visibilizaron por medio de auto-radiografía. Para obtener marcadores de tamaño auténticos se sometió la estructura de replicón homóloga I_{377}/NS3-3'/wt de una expresión transiente con el sistema híbrido Vaccinia Virus T7 en células Huh-7. Los productos obtenidos de este modo se habían tratado como marcadores de tamaño (vías 7-9) paralelamente a las células de los clones 9-13 y 8-1. Las proteínas de VHC identificadas están marcadas en el margen izquierdo de la vía 1, los pesos moleculares (en kilodanton) están indicados en el margen derecho de la vía 9. Se puede observar que el antisuero empleado específico de NS3/4 (3'/4') reacciona preferentemente con NS4A y NS4B, lo que conduce a una subrepresentación de NS3.

Todos los antígenos virales eran claramente identificables, y sus pesos moleculares aparentes no mostraban divergencias frente a aquellos que se ocasionaron tras expresión transiente de la misma estructura bicistrónica VHC-ARN en las células Huh-7 originales. Para determinar la distribución subcelular de antígenos virales, se llevó a cabo una reacción de identificación por inmunofluorescencia bajo empleo de antisueros específicos de NS3 y NS5A (por ejemplo según Bartenschlager et al., 1995, J. Virol. 69, 7519). A tal efecto se fijaron células de los clones 9-13 (wt) y 8-1 (\bullet ) sobre vidrios de reloj con metanol/acetona 24 horas después de la siembra, y se incubaron con antisueros policlonales específicos de NS3 o NS5A. Los anticuerpos unidos se visibilizaron con un antisuero de caniche conjugado con FITC adquirible comercialmente. Para la supresión de señales de fluorescencia inespecíficas se tiñeron en contraste las células con el colorante "Evans Blue".

Los resultados de este ensayo de identificación están representados en la figura 3 B. Con ambos antisueros era identificable una fuerte fluorescencia en el citoplasma. Los antisueros específicos de NS5A condujeron además a una débil fluorescencia del núcleo celular, lo que indica que al menos cantidades reducidas de este antígeno llegan también al núcleo celular. No obstante, la presencia dominante generalmente de antígenos virales en el citoplasma es un indicio de que la replicación de VHC-ARN tiene lugar en el citoplasma -así como es el caso en la mayor parte de virus de ARN-.

Estos resultados justifican claramente que, con la carga de ensayo aquí descrita, se consigue la estructura de un sistema de cultivo celular para el VHC, cuya eficiencia sobrepasa todos los órdenes de magnitud conocidos hasta la fecha, y permite por primera vez la identificación de ácidos nucleicos virales y proteínas con métodos convencionales y bioquímicos probados. En primer lugar esta eficiencia permite investigaciones absolutamente detalladas de la patogénesis de VHC, análisis genéticos de diferentes funciones de VHC y un estudio exacto de las interacciones virus/célula huésped, mediante lo cual se pueden definir nuevos puntos de partida para el desarrollo de una terapia antiviral.

Ejemplo 3 Transfección de células Huh-7 con estructuras genómicas de VHC

Se transfieren y seleccionan células Huh-7 como se describe en el ejemplo 2, empleándose en este caso, no obstante, estructura seleccionables que contienen el genoma viral completo. Los clones celulares obtenidos se investigan de manera análoga a la del ejemplo 2 por medio de PCR para verificar la ausencia de VHC-ADN, y la replicación productiva de VHC-ARN se identifica después por medio de Northern Blot, [^{3}H] marcaje de uridina en presencia de dactinomicina, identificación de proteínas virales, o bien antígeno, preferentemente con ayuda de Western Blots, inmunoprecipitación o inmunofluorescencia. En contra partida a las cargas descritas en el ejemplo 2, con la estructura descrita en este caso se pueden obtener además virus completos y muy probablemente infecciosos, lo que no es el caso en las estructuras subgenómicas aquí descritas (en el ejemplo 2). Estos virus, que están presentes en la célula y en el exceso del cultivo celular, se concentran, a modo de ejemplo, por medio de ultracentrifugado, precipitación inmunológica o precipitación con polietilenglicol, y se digieren en su totalidad por vía exógena, es decir, los ácidos nucleicos no incorporados en la partícula viral se digieren por medio de incubación con nucleasas (RNasa, DNasa, nucleasa de micrococo). De este modo se pueden eliminar todos los ácidos nucleicos contaminantes, que no están contenidos en la partícula viral a proteger. El ARN protegido se aísla tras desactivado de nucleasas, a modo de ejemplo por medio de incubación con proteinasa K en un tampón que contiene SDS mediante extracción con fenol y fenol/cloroformo y se identifica por medio de Northern Blot o RT-PCR bajo empleo de cebador específico de VHC. También en este planteamiento de ensayo, la combinación del genoma de consenso VHC descrito con un marcador de selección es decisiva para la producción eficiente de ARN, proteína viral, y con ello de partículas de VHC.

Ejemplo 4 Obtención y aplicación de una estructura de VHC-ARN, en la que el gen de resistencia está unido a través de un ribozima, o bien un punto de identificación para un ribozima, con la secuencia subgenómica VHC

Se obtiene una estructura de VHC-ARN según el ejemplo 1 o el ejemplo 3, en la cual un gen de resistencia a antibióticos está unido a la secuencia de VHC-ARN a través de un ribozima, o bien un punto de identificación para un ribozima. Tales estructuras se representan esquemáticamente en la figura 7. Se someten las células Huh-7 a transfección con esta estructura de VHC-ARN como se describe en el ejemplo 2. Tras la transfección en las células se efectúa en primer lugar la selección con el correspondiente antibiótico. En los clones celulares obtenidos en este caso se activa el ribozima introducido por clonación, o, en el caso de una estructura que porta un punto de identificación para un ribozima, se introduce el ribozima en la célula (por ejemplo por medio de transfección de una estructura de ribozima o infección con un vector de expresión viral, en el que se empleó el correspondiente ribozima). En ambos casos se separa el gen de resistencia de la secuencia de VHC-ARN por medio de disociación ocasionada por ribozima. En el caso de la estructura genómica de VHC, el resultado es un genoma de VHC auténtico sin gen de resistencia, que es apto para la formación de partículas virales infecciosas auténticas. En el caso de la estructura subgenómica de VHC se produce un replicón de VHC sin gen de resistencia.

Ejemplo 5 Cotransfección de una estructura de VHC-ARN con una estructura de transfección de luciferasa separada

Se obtiene una estructura de VHC-ARN según el ejemplo 1 (A) o el ejemplo 3 o el ejemplo 4. Paralelamente se obtiene una estructura de transfección, que comprende el gen de luciferasa, estando unido este gen de luciferasa, por medio de una primera secuencia de nucleótidos, que codifica para un punto de disociación de proteasa VHC (por ejemplo NS3 proteasa), con una segunda secuencia de nucleótidos, que codifica para otra proteína o una parte de otra proteína. La estructura de VHC-ARN y la estructura de transfección se introducen en células huésped arbitrarias, preferentemente células de hepatoma, en especial células Huh-7. Esto se puede efectuar del modo descrito en el ejemplo 2. El producto del gen de luciferasa modificado es un producto de fusión de luciferasa en el que la luciferasa es inactiva debido a la fusión con la fracción ajena. En células sometidas a transfección con alta replicación de VHC se disocia la proteína de fusión, que contiene efectivamente un punto de corte para una proteasa de VHC, y con ello se libera la forma activa de luciferasa, que se puede determinar mediante medida luminométrica. Si se inhibe la replicación de la estructura de VHC-ARN, no se disocia la proteína de fusión y no se libera luciferasa activa. A consecuencia de ello, la determinación cuantitativa de luciferasa es una medida de la replicación de la estructura subgenómica de VHC. El lugar del gen de luciferasa se puede emplear igualmente otro gen delator, que está modificado de modo análogo, de modo que su expresión dependa de la replicación de virus, a pesar de que este gen delator no es componente de la estructura subgenómica de VHC. También se puede emplear como el denominado marcador sucedáneo una proteína celular que se desactiva o activa mediante las proteínas de VHC o ácidos nucleicos. En este caso, la expresión, o bien actividad de este marcador sucedáneo, es una medida de la replicación de ADN viral.

Ejemplo 6 Obtención de estructuras subgenómicas de VHC con genes ajenos integrados para el empleo como portadores génicos específicos de células del hígado para la terapia génica

Se someten a transfección estas estructuras subgenómicas de VHC recombinantes y seleccionables, es decir, en líneas celulares que exprimen las funciones ausentes de manera inducible o constitutiva (a modo de ejemplo las proteínas estructurales). Los clones celulares que contienen una estructura subgenómica de VHC funcional se puede establecer mediante correspondiente selección. Las proteínas estructurales de virus exprimidas por la célula huésped permite la formación de partículas virales, en las que se introduce el ARN de estructuras subgenómicas de VHC. Por lo tanto, el resultado son partículas similares a virus, que contienen una estructura subgenómica de VHC según la invención incluyendo el gen ajeno introducido por clonación, y que pueden transferir el mismo por medio de infección a otras células. Un ejemplo de tal estructura se representa en la figura 8. También existe la posibilidad de emplear directamente como vector de expresión la estructura subgenómica de VHC según la invención aquí descrita con gen ajeno integrado. En este caso se procede análogamente al procedimiento citado con anterioridad, pero con la diferencia de someter a transfección líneas celulares que no exprimen factores transcomplementarios. Por lo tanto, en este caso, la estructura de VHC sirve únicamente como vector de expresión.

Ejemplo 7 Obtención de estructuras de VHC-ARN adaptadas al cultivo celular (A) Procedimiento de aislamiento

Para la determinación de mutaciones por adaptación y la obtención de estructuras de VHC-ARN adaptadas al cultivo celular, se procedió de la siguiente manera: se someten a transfección células con una estructura de VHC-ARN como se describe en los ejemplo 1 y 2, y se obtienen clones celulares resistentes a G418. Para la determinación de la competencia de replicación (en este contexto se entiende por esta el número de clones celulares resistentes a G418, que se obtiene por microgramo de estructura de VHC-ARN,o bien VHC-ARN sometida a transfección) se aisló de manera ejemplar el ARN total a partir de uno de los clones celulares, llamado 9-13 (figura 1 B, vía 11), y se determinó la cantidad de VHC-ARN contenido en el mismo por medio de Northern-blot como se describe en la figura 2 B. A continuación se introducen 10 microgramos de ARN tal, que contenía aproximadamente 10^{9} de moléculas de VHC-ARN, en células Huh-7 naive por electroporación (figura 9). Paralelamente se sometieron a transfección 10^{9} estructuras in vitro de neo-VHC-ARN que se había completado con ARN total aislado a partir de células Huh-7 naive a una cantidad total de ARN de 10 \mug, en células Huh-7 naive. Tras selección con G418 se determinó el número de colonias celulares, expresado en "colony forming units (cfu) pro Mikrogramm ARN" en ambas cargas. En una concentración de 500 \mug/ml de G418 en el medio de selección, el número de colonias que se obtuvo con el VHC- ARN contenido en el ARN total aislado, ascendía aproximadamente a 100.000 cfu por microgramo de VHC-ARN. Por el contrario, con la misma cantidad de VHC-ARN trascrito in vitro se obtuvo sólo 30 - 50 colonias. Este resultado demuestra que la infecciosidad específica de VHC-ARN que se aisló a partir de los clones celulares, es aproximadamente 1.000 - 10.000 veces más elevada que la infecciosidad de elementos de transcripción in vitro. El proceso metódico se presenta en la figura 9.

Con ayuda de "long-distance RT-PCR" se amplificó el VHC-ARN a partir de ARN total de 9-13 células, se clonaron los amplificados de PCR, y se secuenciaron numerosos clones. Una comparación de las secuencias de estos ARN reclonados con la secuencia de ARN que se incluyó originalmente en las células Huh-7 naive, dio por resultado que los ARNs reclonados poseían numerosos intercambios de aminoácido, que estaban distribuidos a través de la secuencia total de VHC (figura 10). Los fragmentos SfiI de estos mutantes reclonados, en substitución del fragmento SfiI análogo de la estructura de replicón original, se introducen en el mismo, y se incluye ARN de los respectivos mutantes en células Huh-7 naive. Tras selección con G418 se determinó después el número de colonias formadas para cada mutante de VHC-ARN. Mientras que con el ARN de partida se obtuvo sólo 30 - 50 colonias por microgramo de ARN el número de colonias en el caso de dos de las variantes reclonadas es claramente superior (figura 10). En el caso de estructuras de VHC-ARN 9-13I y 9-13C la infecciosidad específica ascendía a 100 - 1.000 cfu por microgramo de ARN, y en el caso de replicón 9-13F, incluso a 1.000 - 10.000 cfu por microgramo de ARN. Estos resultados muestran que los intercambios de aminoácido en la zona NS3-5B analizada de los mutantes 9-13I, 9-13C, y en especial 9-13F, condujeron a un claro aumento de la competencia de replicación. Por el contrario, todas las demás estructuras de VHC-ARN (9-13 A, B, G, H y K) ya no eran competentes en replicación, es decir, contenían mutaciones letales.

Con el fin de responder cual de los intercambios de aminoácidos en la estructura de 9-13F conduce a aumento de la replicación, se introdujeron los intercambios por separado o en combinación en la estructura de VHC-ARN de partida, y se incluyeron los correspondientes ARNs en células Huh-7 naive. El resultado de las transfecciones con estos ARNs se reúne en la tabla 1. De ello se desprende que, el presente ejemplo, la competencia de replicación elevada está ocasionada por varias mutaciones. Los intercambios de aminoácidos en las secciones VHC-ARN NS5A y NS4B proporcionan la mayor contribución. También los intercambios aislados en la región NS3 proporcionan una contribución que se basa posiblemente en un sinergismo de estos intercambios aislados.

Estos hallazgos justifican que, mediante la selección de G418 de las células, que se sometieron a transfección con las estructura neo-VHC-ARN, se llega al enrequecimiento de tales VHC-ARN, que tienen una competencia de replicación claramente más elevada. Con el planteamiento de ensayo aquí descrito se pueden seleccionar estructuras de VHC-ARN con eficiencia de replicación muy diferente. Cuanto más elevada es la concentración de antibiótico en el medio de selección, en/sobre el cual se cultivan células que contienen estructuras de VHC-ARN con el fin de selección, tanto más elevado es el grado de mutaciones por adaptación, y por ello la eficiencia de replicación en las respectivas estructuras de VHC-ARN, para que las células puedan desarrollarse. Si se llevan a cabo las selecciones con concentraciones en antibióticos más reducidas, también pueden sobrevivir y propagarse tales células, que presentan mutaciones por adaptación más reducidas y una eficiencia de replicación menos elevada en comparación.

La estructura de VHC-ARN 9-13F descrita hasta la fecha, que contenía varias mutaciones por adaptación, tenía una eficiencia de replicación en cierta medida más elevada que el VHC-ARN parental. Para obtener VHC-ARN con replicación más elevada en el cultivo celular, se introdujo el VHC-ARN, que estaba contenido en el ARN total de un clon celular seleccionado, varias veces en células Huh-7 naive. Este clon celular seleccionado, llamado 5-15, se obtuvo mediante transfección de estructura de VHC-ARN I_{389}/NS3-3' (figura 1). Este corresponde sensiblemente al clon celular 9-13, que se obtuvo mediante transfección con una estructura de VHC-ARN, que poseía un VHC-IRES más corto en 22 nucleótidos (I_{377}/NS3-3'; fig. 1). Se introdujeron 10 microgramos de ARN total, aislados a partir del clon celular 5-15, en células Huh-7 naive por medio de electroporación, y se sometieron las células a una selección con 1 mg/ml de G418. A partir de uno de los clones celulares generados de este modo se aisló de nuevo ARN total, se transfirió en células Huh-7 naive, y se seleccionó análogamente. Este proceso se repitió en total cuatro veces. Después del cuarto pasaje se aisló a partir de un clon celular el ARN total y se amplificó el neo-VHC-ARN con ayuda de "long-distance RT-PCR". El fragmento de ADN amplificado se digirió con el enzima de restricción SfiI y se insertó en la estructura de partida restringida SfiI I_{389}/NS3-3'. En total se obtuvo más de 100 clones de ADN, y se analizaron en primer lugar por medio de digestión por restricción. Se introdujeron ARN transcritos in vitro de aproximadamente 80 de estos clones en Huh-7 naive respectivamente, y se sometieron a una selección con 500 mg/ml de G418. De las 80 variantes de neo-VHC-ARN investigadas, la mayor parte de ellas se muestran como defecto de replicación. En el caso de dos mutantes, llamadas 5.1 y 19, la infecciosidad específica, expresada, como "colony forming units" por microgramo de ARN, era claramente más elevada (tabla 2). Mediante pasaje múltiple de ARN en el cultivo celular se pueden obtener VHC-ARN aparentemente, cuya eficiencia de replicación, debido a mutaciones (las denominadas mutaciones "por adaptación"), es varios órdenes de magnitud más elevada que la del ARN clonado originalmente a partir del paciente.

(B) Procedimiento de modificación

Tales mutaciones por adaptación generadas e identificadas según (A) se pueden transferir a una estructura de VHC-ARN menos competente en replicación, y conducen a un aumento masivo de la replicación de esta estructura. Este aumento es tan elevado, que con ello se pueden llevar a replicación en el cultivo celular, como se puede demostrar, VHC-ARN que ya no poseen ningún gen marcador seleccionable. La figura 12 muestra una comparación de la eficiencia de replicación de VHC-ARN, que correspondían a la secuencia de partida o a las secuencias adaptadas 9-13F, o bien 5.1. Con el fin de medida sencilla se eliminó neo-gen, y se reemplazó por el gen para la luciferasa. Como control negativo sirvió de nuevo una estructura de VHC-ARN, que presentaba defectos de replicación debido a una mutación desactivante de NS5B ARN-polimerasa. Ya 24 horas después de la transfección se identifica una clara diferencia en la actividad de luciferasa entre el ARN defectuoso y las estructuras 9-13F, o bien 5.1, mientras que entre el ARN defectuoso (318 DN) y la estructura de partida ARN (wt), que no poseen mutaciones por adaptación, apenas se podía ver una diferencia. Durante el tiempo de observación total se obtuvo la máxima actividad de luciferasa, y con ello la máxima replicación con el 5.1-ARN. Estos hallazgos no demuestran la alta eficiencia de replicación de este ARN, sino que muestran también que es posible constituir un sistema de cultivo celular con estructuras de VHC-ARN adaptadas, para el que ya no es necesario la presencia de un gen seleccionable. En la tabla 3 se da una recopilación de conjunto de diferencias de nucleótidos y aminoácidos entre la estructura de partida y los mutantes 9-13F, 5.1 y 19.

Ejemplo 8 Obtención de genomas de longitud completa VHC-ARN adaptados al cultivo celular

En los ejemplos 1 a 7 se empleó siempre un VHC-ARN, subgenómico, al que faltaba la región de proteína estructural total de núcleo hasta p7, o bien NS2 inclusive. En el presente ejemplo 8 se muestra que es posible, con ayuda de la secuencia NS3-5B adaptada y llevar a replicación un genoma de longitud completa de VHC en el cultivo celular. Con este fin se transfirió en primer lugar el fragmento SfiI de VHC-ARN 5.1 altamente adaptado, obtenido según el ejemplo 7, en un genoma de longitud completa VHC seleccionable (figura 12). Este genoma de VHC se sometió a transfección en células Huh-7 naive, y se sometió a una selección con diferentes concentraciones de G418. En dependencia de la intensidad de selección (de la concentración de G418) se obtuvo un número relativamente grande de clones celulares (figura 12 B). En comparación, con el genoma de longitud completa VHC o modificado, que no contenía mutaciones por adaptación, no se obtuvo ninguna colonia así como con el control negativo, que presentaba defectos de replicación debido a una mutación desactivante en la NS5B ARN-polimerasa. Para identificar que los clones celulares producidos de este modo contenían de hecho una estructura de longitud completa de VHC replicante de manera autónoma, se aisló ARN total a partir de varios clones celulares, y se analizó por medio de Northern-Blot. En todos los clones celulares era claramente identificable el VHC-ARN de longitud completa (figura 12). Con ello se demuestra claramente que, con ayuda de secuencias de VHC adaptadas a cultivos celulares, es posible obtener un genoma de longitud completa de VHC, que replica con alta eficiencia y de manera autónoma en una línea celular, es decir, con el sistema según la invención se puede obtener también genomas de longitud completa de VHC adaptados. Ya que este clon posee además la secuencia de VHC completa, es decir, también las proteínas estructurales necesarias para la formación de partículas de virus, con este sistema es posible obtener grandes cantidades de partículas virales infecciosas en cultivos celulares. Para la identificación de estos virus se añaden excesos de células que portan un genoma de longitud completa de VHC replicante, sobre células Huh-7 nativas, y se someten las células infectadas de este modo a una selección con G418. Cada clon celular que se desarrolla bajo estas condiciones se atribuye a una célula infectada. Los virus en los excesos de cultivo celular de células que poseen un genoma de longitud completa de VHC replicante, se pueden enriquecer y purificar también con diferentes procedimientos conocidos en el estado de la técnica, como ultracentrifugado o microdiálisis, y emplear después para la infección de células naive. Con este procedimiento se muestra claramente que, con el sistema de cultivo celular de VHC según la invención se pueden obtener genomas de longitud completa de VHC adaptados a cultivos celulares, que replican con alta eficiencia en células, y producen virus infecciosos. Esto se pueden identificar igualmente mediante infección de un animal de ensayo, preferentemente el chimpancé.

Ejemplo 9 Obtención de estructuras de longitud completa de VHC y estructuras subgenómicas de VHC con gen delator

Se obtiene una estructura de VHC-ARN, en la que se inserta un gen delator en lugar del gen de resistencia a antibióticos (figura 13). En este caso se puede determinar la replicación por medio de la cantidad, o bien la actividad del gen delator, o bien producto de gen delator. El gen delator es preferentemente un gen del grupo de genes de luciferasa, el gen de CAT (gen de cloroanfenicol-acetil-transferasa), el gen de lacZ (gen de beta-galactosidasa), el gen de GFP (gen de proteína verde fluorescentes), el gen de GUS (gen de glucuronidasa) o el gen de SEAP (gen de fosfatasa alcalina segregada). Estos genes delatores, o bien sus productos, esto es, las correspondientes proteínas delatoras, se pueden determinar, por ejemplo, por medio de fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimetría o con ayuda de métodos inmunológicos (por ejemplo enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Se puede exprimir el gen delator por un IRES propio, o en forma de una proteína de fusión, que es activa como tal, o bien está unida con una proteína de VHC por medio de una secuencia de aminoácidos disociable por vía proteolítica, de modo que se disocia de la misma por una proteasa celular o viral (VHC).

Ejemplo 10 Obtención de estructuras de longitud completa de VHC con genes ajenos integrados para el empleo como portadores génicos específicos de células de hígado para la terapia génica o como vector de expresión

La estructura (figura 14) se produce en células, y en estas conduce a la formación de partículas virales VHC, que se pueden emplear para la infección de otras células. Ya que las partículas virales de un ARN se han encapsidado con un gen ajeno, se pueden utilizar este en las células infectadas de este modo para la producción de proteína codificada por este gen ajeno. Las células que se transfirieron con la estructura exprimen igualmente el gen ajeno.

Ejemplo 11 Obtención de estructuras de VHC-ARN monocistrónicas, en las cuales el producto de gen de resistencia se exprime como proteína de fusión con la fracción de VHC

Para determinadas investigaciones es ventajoso que la estructura de VHC-ARN no posea elementos IRES incluso heterólogos. Tales investigaciones son, a modo de ejemplo, la determinación de la resistencia a interferona. Si se incuba una célula, que posee una estructura de VHC-ARN con alfa o beta interferona, se llega a una reducción de la replicación de VHC-ARN. Para la elucidación del mecanismo de acción es necesario que la estructura de VHC-ARN no posea IRES heterólogo, ya que, en caso contrario, no se puede determinar si la inhibición provocada por interferona se ocasiona mediante una inhibición de la replicación de VHC o mediante una inhibición de IRES heterólogo. Por lo tanto, se obtienen estructuras en las cuales el gen de resistencia se fusiona con una proteína de VHC (figura 15). La proteína de fusión es activa como tal, o bien el producto de gen de resistencia se une a una proteína de VHC por medio de una secuencia de aminoácidos disociable por vía proteolítica, de modo que se disocia de la misma por una proteasa celular o viral (VHC).

TABLA 1 Infecciosidades específicas (cfu/\mug de ARN) de estructuras de VHC-ARN con mutaciones por adaptación, que se encontraron en el mutante 9-13F y se introdujeron en la estructura de VHC-ARN parental I_{389}/NS3-3'/wt.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
 Intercambio de aminoácido ^{1}   \+ Proteína de VHC  \+ cfu/ \mu g
ARN ^{2}  \\\hline  Nulo  \+  \+ 30 – 60 \\\hline  1283 arg -
>gly  \+ NS3  \+ 200 – 250 \\\hline  1383 glu - >ala  \+ NS3 
\+ 30 – 60 \\\hline  1577 lys - >arg  \+ NS3  \+ 30 – 60 \\\hline
 1609 lys - >glu  \+ NS3  \+ 160 – 300 \\\hline  (1283 arg -
>gly + 1383 glu - >ala + 1577 lys - >arg  \+ NS3  \+ 360 –
420 \\  +1609 lys - >glu) \+ \+ \\\hline  1936 pro - >ser  \+
NS4B  \+ 500 – 1000 \\\hline  2163 glu - >gly  \+ NS5A  \+ 1000 –
5000 \\\hline  2330 lys - >glu  \+ NS5A  \+ 30 – 60 \\\hline 
2442 ile - >val  \+ NS5B  \+ 30 – 60 \\\hline  Todos juntos  \+ 
\+ 5000
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

^{1}Intercambio de aminoácidos en la poliproteína del producto aislado VHC Con-1 (banco génico EMBL Nº AJ238799); los aminoácidos están indicados en códigos de tres letras.

^{2} Colony forming units (número de clones celulares) en una selección de 500 \mug/ml de G418.

TABLA 2 Infecciosidades específicas (cfu/\mug de ARN) de estructura de VHC-ARN parental I_{389}/NS3-3'/wt y de las variantes 9-13C, 9-13I, 9-13F, 5.1 y 19.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline
 Variante de ARN sometido a transfección  \+ cfu/ \mu g ARN ^{1} 
\\\hline  Tipo salvaje  \+ 30 – 50 \\\hline  9  -  13 C 
\+ 100 -1.000 \\\hline  9  -  13 I  \+ 100 - 1.000
\\\hline  9  -  13 F  \+ 1.000 - 10.000 \\\hline  5.1 
\+ 50.000 - 100.000 \\\hline  19  \+ 50.000 - 100.000
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

^{1} Colony forming units (número de clones celulares) en una selección de 500 \mug/ml de G418.

\newpage

TABLA 3 Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de la estructura VHC-ARN I_{389}/NS3-3'/wt y los mutantes 9-13I, 9-13F, 5.1 y 19

\begin{longtable}{|l|l|l|l|}\hline  Mutante de VHC \+ Posición
de nucleótido \+ Intercambio de \+ Intercambio de\\  \+ \+
nucleótido \+ aminoácido\\\hline  9  -  13 I \+ 3685 \+
C>T \+ Pro>Leu\\\hline  \+ 4933 \+ C>T \+
Thr>Met\\\hline  \+ 5249 \+ T>C \+ -\\\hline  \+ 8486 \+
C>T \+ -\\\hline  \+ 8821 \+ G>A \+ Trp>stop\\\hline  \+
8991 \+ C>G \+ Arg>Gly\\\hline  \+ 9203 \+ A>G \+ -\\\hline
 \+ 9313 \+ T>C \+ Phe>Ser\\\hline  \+ 9346 \+ T>C \+
Val>Ala\\\hline  9  -  13 F \+ 3866 \+ C>T \+
-\\\hline  \+ 4188 \+ A>G \+ Arg>Gly\\\hline  \+ 4489 \+
A>C \+ Glu>Ala\\\hline  \+ 4562 \+ G>A \+ -\\\hline  \+
4983 \+ T>C \+ -\\\hline  \+ 5071 \+ A>G \+ Lys>Arg\\\hline
 \+ 5166 \+ A>G \+ Lys>Glu\\\hline  \+ 6147 \+ C>T \+
Pro>Ser\\\hline  \+ 6829 \+ A>G \+ Glu>Gly\\\hline  \+ 7329
\+ A>G \+ Lys>Glu\\\hline  \+ 7664 \+ A>G \+
Ile>Val\\\hline  \+ 8486 \+ C>T \+ -\\\hline  \+ 8991 \+
C>G \+ Arg>Gly\\\hline  NK5.1 \+ 4180 \+ C>T \+
Thr>Ile\\\hline  \+ 4679 \+ C>T \+ -\\\hline  \+ 4682 \+
T>C \+ -\\\hline  \+ 5610 \+ C>A \+ Leu>Ile\\\hline  \+
6437 \+ A>G \+ -\\\hline  \+ 6666 \+ A>G \+ Asn>Asp\\\hline
 \+ 6842 \+ C>T \+ -\\\hline  \+ 6926 \+ C>T \+ -\\\hline  \+
6930 \+ T>C \+ Ser>Pro\\\hline  \+ 7320 \+ C>T \+
Pro>Ser\\\hline  \+ 7389 \+ A>G \+ Lys>Glu\\\hline  NK19 \+
3946 \+ A>G \+ Glu>Gly\\\hline  \+ 4078 \+ C>G \+
Ala>Gly\\\hline  \+ 4180 \+ C>T \+ Thr>Ile\\\hline  \+ 4682
\+ T>C \+ -\\\hline  \+ 5610 \+ C>A \+ Leu>Ile\\\hline  \+
5958 \+ A>T \+ Met>Leu\\\hline  \+ 6170 \+ T>A \+ -\\\hline
 \+ 6596 \+ G>A \+ -\\\hline  \+ 6598 \+ C>G \+
Ala>Gly\\\hline  \+ 6833 \+ C>T \+ -\\\hline  \+ 6842 \+
C>T \+ -\\\hline  \+ 6930 \+ T>C \+ Ser>Pro\\\hline  \+
7141 \+ A>G \+ Glu>Gly\\\hline  \+ 7320 \+ C>T \+
Pro>Ser\\\hline  \+ 7389 \+ A>G \+ Lys>Glu\\\hline  \+ 7735
\+ G>A \+
Ser>Asn\\\hline\end{longtable}

Se indican las diferencias de secuencias y nucleótidos aminoácidos entre la secuencia de partida de VHC-ARN Con 1 (banco génico EMBL Nº AJ238799) y las de VHC- ARN adaptados al cultivo celular. Los números se refieren a las posiciones de nucleótidos y aminoácidos del producto aislado de VHC Con 1.

Claims

1. Estructura de virus de hepatitis C (VHC)-ARN con la capacidad de replicación en células eucariotas, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según uno de los protocolos de secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, que codifican al menos para las secciones de ARN específicas de VHC 5' NTR, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B y 3' NTR y adicionalmente un gen marcador seleccionable (gen de selección), siendo el gen marcador seleccionable el gen de neomicinfosfotransferasa, y pudiendo estar contenido en lugar del gen de neomicinfosfotransferasa otro gen de resistencia antibiótico u otro gen de resistencia.

2. Estructura de VHC-ARN según la reivindicación 1, caracterizada porque, en lugar del gen marcador o adicionalmente al gen marcador, presenta un gen delator integrado.

3. Estructura de VHC-ARN según la reivindicación 2, caracterizada porque el gen delator es seleccionado a partir del grupo constituido por el gen de luciferasa, gen de CAT (gen de cloroanfenicol-acetil-transferasa), el gen de lacZ (gen de beta-galactosidasa), los genes de GFP (gen de proteína fluorescente verde), el gen de GUS (gen de glucoronidasa) y el gen de SEAP (gen de fosfatasa alcalina segregado).

4. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque su replicación influye sobre la expresión de un gen marcador sucedáneo (celular).

5. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el gen delator y el gen marcador seleccionable están dispuestos espacialmente en la estructura de tal manera que exprimen conjuntamente una proteína de fusión.

6. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque presenta un gen ajeno integrado y es apropiada para introducir este gen ajeno en una célula objetivo, que es apropiada para la expresión de este gen ajeno.

7. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta mutaciones de nucleótidos y/o aminoácidos, está adaptada al cultivo celular, replica con alta eficiencia, y es obtenible cultivándose un sistema de cultivo celular según la reivindicación 1, en el cual el material génico específico de VHC introducido es una estructura de VHC-ARN con gen de selección según una de las reivindicaciones 1 a 6, sobre/en el medio de selección correspondiente al gen de selección, cosechándose los clones celulares desarrollados, y aislándose a partir de estos clones celulares la estructura de VHC-ARN o partes de las mismas.

8. Estructura de VHC-ARN según la reivindicación 7, caracterizada porque la estructura de VHC-ARN aislada a partir de los clones celulares, o partes de la misma, se hace pasar de nuevo al menos una vez, esto es, se introduce en células del sistema de cultivo celular según la reivindicación 11, y se cultiva estas células sobre/en el medio de selección correspondiente al gen de selección, porque se cosecha los clones celulares desarrollados, y porque se aísla a partir de estos clones celulares la estructura de VHC-ARN o partes de la misma.

9. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque presenta uno o varios de los intercambios de aminoácidos indicados a continuación, esto es, 1283 arg -> gly y/o 1383 glu -> ala y/o 1577 lys -> arg y/o 1609 lys ->glu y/o 1936 pro -> ser y/o 2163 glu -> gly y/o 2330 lys -> glu y/o 2442 ile -> val, está adaptada al cultivo celular y replica con eficiencia elevada.

10. Estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque presenta uno o varios de los intercambios de nucleótidos y/o aminoácidos indicados en la tabla 3, siendo la tabla 3 componente de esta reivindicación.

11. Sistema de cultivo celular de VHC que comprende esencialmente células eucariotas, que contienen material génico específico de VHC incluido, caracterizado porque las células eucariotas son células de hepatoma humanas, y porque el material génico específico de VHC incluido es una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Sistema de cultivo celular según la reivindicación 11, caracterizado porque las células que contienen la estructura de VHC-ARN están depositadas en la DSMX, Braunschweig, BRD, bajo el número de depósito DSM ACC2394 (denominación de laboratorio HuBI 9-13).

13. Empleo de un sistema de cultivo celular según una de las reivindicaciones 11 ó 12 y/o de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la obtención y/o evaluación de productos terapéuticos y/o diagnósticos para infecciones por VHC.

14. Empleo de un sistema de cultivo celular según una de las reivindicaciones 11 ó 12 y/o de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la obtención de una vacuna contra las infecciones por VHC.

15. Empleo de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la obtención de un portador génico específico de células de hígado para la terapia génica.

16. Empleo de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de mutantes adaptados al cultivo celular de esta estructura de VHC-ARN, presentando los mutantes una eficiencia de replicación elevada frente a la estructura de VHC-ARN caracterizada porque se cultiva un sistema de cultivo celular según la reivindicación 11 ó 12, que contiene estructuras de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6, sobre/en el medio de selección correspondiente al gen de selección, porque se cosecha los clones celulares desarrollados, y porque se aísla a partir de estos clones celulares las estructuras de VHC-ARN o partes de las mismas.

17. Empleo de una estructura de VHC-ARN según la reivindicación 16, caracterizada porque se hace pasar de nuevo al menos una vez las estructuras de VHC-ARN aisladas, esto es, se introduce las mismas en un sistema de cultivo celular según la reivindicación 11 ó 12, y se cultiva estas sobre/en el medio de selección correspondiente al gen de selección, se cosecha los clones celulares desarrollados, y se aísla a partir de estos clones celulares las estructuras de VHC-ARN o partes de las mismas.

18. Empleo de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de mutantes de un genoma de longitud completa de VHC o de un genoma parcial de VHC, o de una estructura de VHC arbitraria con eficiencia de replicación elevada en comparación con el genoma de longitud completa o genoma parcial de VHC original, o la estructura de VHC-ARN, caracterizado porque

-: se obtiene según la reivindicación 16 o la reivindicación 17 un mutante de la estructura de VHC-ARN adaptada al cultivo celular,

-: se determina la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de este mutante, y mediante comparación con la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la estructura de VHC-ARN original se determina el tipo, número y posiciones de mutaciones de nucleótidos y de aminoácidos,

-: y se introduce estas mutaciones mediante mutagénesis selectiva, o bien mediante intercambio de secciones de secuencia, que contienen las correspondientes mutaciones, en un genoma de longitud completa de VHC (aislado) o un genoma parcial VHC, o una estructura de VHC-ARN arbitraria.

19. Empleo de una estructura de VHC-ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la generación de partículas virales de hepatitis C o partículas similares a virus.