JPWO2016147747A1 - 電気的特性測定用試料及び電気的特性測定方法並びに電気的特性測定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定用試料を提供する。
前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に連銭形成が進行するように固定することが可能である。
また、前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、一定期間は所定の範囲内に維持されるように固定することも可能である。
更に、前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定することもできる。
加えて、前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、液体について周波数10MHzで経時的に測定した誘電率の最大値と最小値の差分が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定されていてもよい。
前記固定剤は、グルタルアルデヒドを含有することができる。
前記電気的特性測定用試料は、MAP液を含有していてもよい。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
(1)用途
(2)不完全に固定された赤血球
(3)固定剤
(4)固定処理
(5)任意成分
2.電気的特性測定方法
3.電気的特性測定装置
(1)用途
本技術に係る電気的特性測定用試料は、電気的特性の測定に用いられる。この電気的特性測定用試料は、好適には、測定対象である血液試料の電気的特性の測定に用いられ、その測定精度の検証に役立てられるものである。このことから、以下では、本技術に係る電気的特性測定用試料を「対照試料」と称することがある。その対照試料は、より好適には、測定対象である血液試料の電気的特性を測定する装置(電気的特性測定装置)に用いられる。対照試料を血液試料の電気的特性測定装置に用いることで、その装置における測定精度を検証することが可能となる。これにより、対照試料を電気的特性測定装置の品質を管理するための試料、いわゆる、QC(Quality Control)試料として用いることができる。
本技術に係る電気的特性測定用試料は、固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るものである。
固定された赤血球は、血漿成分と混合した際に、周波数10MHz又は1MHzで経時的に測定した誘電率の最大値と最小値の差分が、固定処理後25日間、好ましくは30日間において、±20%以内、好ましくは±10%以内に維持されるように、固定剤で固定されていることが好ましい。このように固定することで、一定の保存性を保ちながら、電気的特性の変化を確認しやすくなるため、本技術に係る対照試料を、QC試料としてより好適に用いることができる。
固定された赤血球は、血漿成分と混合した際に、周波数10MHzで経時的に測定した誘電率の最大値と最小値の変化率が、6%以上となるように、固定されていることが好ましい。このように固定することで、電気的特性の変化を確認しやすくなるため、本技術に係る対照試料を、QC試料としてより好適に用いることができる。
固定剤として、赤血球を不完全に固定できるものであれば、特に限定されず、例えば、アルデヒド、オキサゾリジン、アルコール、及び環状尿素などを用いることができる。そのような固定剤の好ましい具体例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、2−プロペナール、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール尿素、及び2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1,3−ジオールなどが挙げられる。これらの固定剤は1種を単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。これらの固定剤のうち、赤血球に対する固定処理を行い易いことから、グルタルアルデヒドがより好ましい。
固定剤により赤血球を固定する方法は、特に限定されないが、例えば、血液から血漿及び白血球(バフィーコート)を除去する工程と、赤血球を洗浄する工程と、洗浄した赤血球に固定剤を添加する工程とを含むことが好ましい。
対照試料には、固定剤により固定された赤血球のほか、前述したように、固定剤を希釈するのに用いることができるPBSなどの緩衝液や生理食塩水などの希釈液を含んでいてもよい。また、対照試料には、前述の固定処理の過程において固定された赤血球の保存に好適に用いることができる保存液を含んでいてもよい。この保存液としては、本技術の効果を損なわない限り、公知の保存液を1種又は2種以上、自由に選択して用いることができる。例えば、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸水和物及びブドウ糖をそれぞれ所定量含むACD液、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸水和物、ブドウ糖及びリン酸二水素ナトリウムをそれぞれ所定量含むCPD液、並びにMAP液、アデニン・イノシン・スクロースを含むAIS液などが挙げられる。これらの保存液はいずれも市販のものを用いることができ、これらのうち、赤血球の保存に適していることからMAP液が好ましい。なお、MAP液は、D−マンニトール、アデニン、リン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸水和物、ブドウ糖及び塩化ナトリウムをそれぞれ所定量含む保存液である。保存液としてMAP液を用いる場合、固定された赤血球がMAP液に分散した電気的特性測定用試料が得られる。
本技術に係る電気的特性測定方法は、血液試料の電気的特性を経時的に測定する前に、対照試料の電気的特性を経時的に測定する方法である。この方法では、対照試料により、血液試料についての測定に先だって、電気的特性の測定精度を検証することができる。したがって、検証後に測定する血液試料について信頼性の高い測定データを取得することが可能となる。対照試料及び血液試料についての測定には、誘電コアグロメーターなどの電気的特性測定装置を用いることが好ましい。
本技術に係る電気的特性測定装置は、対照試料を用いて経時的に測定された電気的特性に基づく測定値と、予め定められた基準値と、に基づき、測定精度を判定する判定部を備える。図2は、本技術に係る電気的特性測定装置の実施形態の一例である電気的特性測定装置1の概略構成を表すブロック図である。電気的特性測定装置1は、判定部2のほか、測定部3、評価部4、記憶部5、及び表示部(図示せず)などを備えることが好ましい。
判定部2は、対照試料について経時的に測定された電気的特性の測定値と、予め定められた基準値とに基づき、測定精度を判定する。例えば、対照試料の電気的特性の経時的な測定値を予め定められた基準値に照らし合わせ、測定値と基準値との差異に基づいて、測定値が正常か異常かにより測定精度の判定を行うことが可能である。判定部2による測定精度の判定結果において、測定値が異常であるなどの測定精度が低いことを表す内容であった場合、装置の使用者は、装置に異常があるか、対照試料に異常があるかを確認することができる。
測定部3では、特定の周波数又は周波数帯域で、対照試料及び血液試料の電気的特性を経時的に測定する。電気的特性測定装置1は、測定部3を備えていなくてもよく、その場合、外部の電気的特性測定装置を用いて測定したデータを用いることができる。測定部3で測定する電気的特性の具体例は、前述の判定部2の説明で述べたものと同様である。測定部3などで測定される電気的特性は、1種でもよく、2種以上であってもよい。なお、電気的特性測定装置1の内部に設けられたデータ処理部又は外部のデータ処理装置により、測定部3などで測定された電気的特性の経時変化データからノイズを除去するように構成してもよい。
評価部4は、血液試料の電気的特性の経時変化データに基づいて、血液の状態を評価する。評価対象とする血液の状態としては、血液の凝固状態、血液中の成分の凝集状態、赤血球の沈降や連銭の状態、血餅縮退状態などが挙げられる。評価部4における評価に用いる電気的特性は、予測又は検知したい血液状態に応じた任意の周波数(例えば周波数1kHz〜50MHz)における前述の電気的特性を用いることができる。
電気的特性測定装置1は、測定部3などで測定された対照試料や血液試料の測定結果や、対照試料の測定値と照らし合わせるための前述の基準値、評価部4での評価結果などを記憶する記憶部5を備えることができる。本技術に係る電気的特性測定装置において、記憶部5は必須ではなく、外部の記憶装置を接続することでもよい。記憶部5としては、例えばハードディスクなどを用いることができる。
また、本技術に係る電気的特性測定装置は、ネットワークを介してサーバ及びユーザーインターフェースなどに接続されたシステムの一部として利用されてもよい。
[実験1]
予め入手した健常者の血液を遠心分離して、上澄みの血漿を除去した。血漿及びバフィーコートを除去した血液(赤血球)にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて転倒混和し、その後、遠心分離して上澄みを除去することにより、赤血球を洗浄した。この赤血球の洗浄工程を2回繰り返し行った。洗浄した赤血球に、約5%のヘマトクリット値になるようにPBSを添加した。そこに、PBSで2.5質量%に希釈したグルタルアルデヒドをそれぞれ以下の濃度となるように加えた。
(1a)グルタルアルデヒド:0質量%(固定なしのコントロール)
(1b)グルタルアルデヒド:0.013質量%
(1c)グルタルアルデヒド:0.025質量%
グルタルアルデヒドを添加してから室温で5分間置いた後、遠心分離して上澄みを除去した。次いで、前記(1b)及び(1c)のグルタルアルデヒドで固定された赤血球(以下、「固定赤血球」と称する。)及び前記(1a)のグルタルアルデヒドで固定していない赤血球(以下、「非固定赤血球」と称する。)のそれぞれにPBSを添加して転倒混和し、遠心分離して上澄みを除去する洗浄工程を行った。この洗浄工程を数回繰り返し行った。洗浄した固定赤血球又は非固定赤血球の半分の体積のMAP液を加え、冷蔵保存し、対照試料1a〜cを作製した。
再現性を確認するために、前述の実験1で用いた血液とは別の血液を用いて、前述の実験1と同じ手順で作製した対照試料2a〜cを用意した。実験2で作製した対照試料2a〜2cでは、グルタルアルデヒドの濃度を以下の通りとした。
(2a)グルタルアルデヒド:0質量%(固定なしのコントロール)
(2b)グルタルアルデヒド:0.013質量%
(2c)グルタルアルデヒド:0.025質量%
再現性を確認するために、前述の実験1及び2で用いた血液とは別の血液を用いて、前述の実験1と同じ手順で作製した対照試料3a〜cを用意した。実験3で作製した対照試料3a〜3cでは、グルタルアルデヒドの濃度を以下の通りとした。
(3a)グルタルアルデヒド:0質量%(固定なしのコントロール)
(3b)グルタルアルデヒド:0.006質量%
(3c)グルタルアルデヒド:0.013質量%
再現性を確認するために、前述の実験1〜3で用いた血液とは別の血液を用いて、前述の実験1と同じ手順で作製した対照試料4a〜cを用意した。実験4で作製した対照試料4a〜4cでは、グルタルアルデヒドの濃度を以下の通りとした。
(4a)グルタルアルデヒド:0質量%(固定なしのコントロール)
(4b)グルタルアルデヒド:0.006質量%
(4c)グルタルアルデヒド:0.013質量%
各対照試料においてMAP液に保存した各赤血球(各固定赤血球及び各非固定赤血球)と、凍結乾燥血漿を規定量の水で再融解したものとを1:1(体積比)の割合で混合し、混合液を調製した。誘電コアグロメーターの試料保持部に試薬としてカルシウム水溶液を分注すると共に、前記混合液を試料保持部に注入し、周波数100Hz〜40MHz程度の範囲における誘電率の経時変化を測定した。
実験1で作製した対照試料1a〜cについての測定結果を図3に、実験2で作製した対照試料2a〜cについての測定結果を図4に、実験3で作製した対照試料3a〜cについての測定結果を図5に、実験4で作製した対照試料4a〜cについての測定結果を図6に、それぞれ示す。なお、図3〜6では、いずれも周波数1MHz及び10MHzにおける測定結果を示し、また、グラフの横軸は時間(s)、縦軸は誘電率をその初期値で規格化した値を示す。
一方、0.025質量%を超える濃度のグルタルアルデヒドで赤血球を固定した場合、その固定が強すぎて、赤血球本来の機能を発揮させることができず、血漿成分と混合した際の経時的な電気的特性の変化が小さくなってしまう可能性が示唆された。
従って、固定剤としてグルタルアルデヒドを用いる場合、その濃度は、0.006質量%以上が好ましく、0.025質量%以下が好ましいことが分かった。
前記試験例1の実験1で作製した対照試料1bに、前述と同様、対照試料1bにおいてMAP液に保存した固定赤血球と、凍結乾燥血漿を規定量の水で再融解したものとを1:1(体積比)の割合で混合し、混合液を調製した。この混合液自体とする対照試料5aと、この混合液に、ヘパリン及び/又はフィブリノゲンを以下の量で添加した対照試料5b〜dを作製した。
(5a)添加なし
(5b)ヘパリンを混合液に対して0.5体積%分添加した。
(5c)ヘパリンを混合液に対して0.5体積%分添加し、フィブリノゲンを2mg/mL添加した。
(5d)混合液に対して、フィブリノゲンを2mg/mL添加した。
その結果を図7に示す。図7では、周波数10MHzにおける測定結果を示し、また、グラフの横軸は時間(s)、縦軸は誘電率をその初期値で規格化した値を示す。
(1)
固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、
該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定用試料。
(2)
前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に連銭形成が進行するように固定されている、(1)に記載の電気的特性測定用試料。
(3)
前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、一定期間は所定の範囲内に維持されるように固定されている、(1)又は(2)記載の電気的特性測定用試料。
(4)
前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定されている、(3)に記載の電気的特性測定用試料。
(5)
前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、周波数10MHzで経時的に測定した誘電率の最大値と最小値の差分が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定されている、(4)に記載の電気的特性測定用試料。
(6)
前記固定剤は、グルタルアルデヒドを含有する(1)から(5)のいずれか一項に記載の電気的特性測定用試料。
(7)
MAP液を含有する(1)から(6)のいずれか一項に記載の電気的特性測定用試料。
(8)
血液試料の電気的特性を経時的に測定する前に、電気的特性測定用試料の電気的特性を経時的に測定する方法であって、
前記電気的特性測定用試料は、固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定方法。
(9)
電気的特性測定用試料を用いて経時的に測定された電気的特性に基づく測定値と、予め定められた基準値と、に基づき、測定精度を判定する判定部を備え、
前記電気的特性測定用試料は、固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定装置。
S2 第1の測定工程
S3 判定工程
S4 第2の測定工程
1 電気的特性測定装置
2 判定部
3 測定部
4 評価部
5 記憶部
Claims (9)
- 固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、
該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定用試料。 - 前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に連銭形成が進行するように固定されている、請求項1に記載の電気的特性測定用試料。
- 前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、一定期間は所定の範囲内に維持されるように固定されている、請求項1記載の電気的特性測定用試料。
- 前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、所定の周波数における電気的特性の所定の特徴点の値が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定されている、請求項3に記載の電気的特性測定用試料。
- 前記固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、周波数10MHzで経時的に測定した誘電率の最大値と最小値の差分が、固定処理後25日間において、±20%以内に維持されるように固定されている、請求項4に記載の電気的特性測定用試料。
- 前記固定剤は、グルタルアルデヒドを含有する請求項1に記載の電気的特性測定用試料。
- MAP液を含有する請求項1に記載の電気的特性測定用試料。
- 血液試料の電気的特性を経時的に測定する前に、電気的特性測定用試料の電気的特性を経時的に測定する方法であって、
前記電気的特性測定用試料は、固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定方法。 - 電気的特性測定用試料を用いて経時的に測定された電気的特性に基づく測定値と、予め定められた基準値と、に基づき、測定精度を判定する判定部を備え、
前記電気的特性測定用試料は、固定剤により不完全に固定された固定赤血球を含有し、該固定赤血球は、血漿成分と混合した際に、その電気的特性が経時的に変化し得るように固定されている、電気的特性測定装置。
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