KR940010308B1 - HBs항원 측정을 위한 방법, 하이브리도마, 단일클론성 항체 및 감작 혈구 - Google Patents

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Abstract

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Description

HBs항원 측정을 위한 방법, 하이브리도마, 단일클론성 항체 및 감작 혈구
본 발명은 항-HBs 단일클론성 항체, 고정 혈구를 항-HBs 단일클론성 항체로 감작시키는 방법, 항-HBs 단일클론성 항체로 감작시킨 혈구, 항-HBs 단일클론성 항체-감작 혈구를 이용하는 HBs 항원의 측정방법, HBs 항원의 측정에 있어서 비특이적 반응을 억제하는 단일클론성 항체 및 그의 억제방법에 관한 것이다.
B형 간염은 일반적인 감염 경로를 통해 혈액에 침입하는 B형 간염 비루스에 기인하는 질환이다. 아기들은 때때로 모자감염에 의해서 이 비루스에 의해 감염된다. 비루스 보균자의 약 90%가 증세를 나타내지 않지만 보균자의 혈액을 통해 다른 사람들이 이 비루스에 감열될 위험이 있으며, 이 비루스의 보균자의 수는 전세계적으로 약 2억 2천만명인 것으로 추정된다. 특히 보균자의 비율은 아시아에서 높고, 일본의 환자수는 약 100만명으로 추정된다. 게다가, B형 감염은 간경변 및 간암 같은 보다 심각한 질병으로 이행될 확률이 높다.
이러한 상황하에서는 B형 간염 환자 및 비루스 보균자를 발견 및 진단하고, 혈액 제제중에서 B형 간염 비루스를 검출하는 것이 매우 중요하다. 이러한 검출을 위해서는, 최근의 세포공학 기술의 발전에 수반하여, 표본중의 B형 감염 표면 항원(HBs로 약칭)을 항-HBs 단일클론성 항체를 이용하여 측정하게 되었다. 다양한 종류의 항-HBs 단일클론성 항체가 얻어졌다(예를들면, 일본국 특허 공개 제56-73029호, 제62-10098호, 제57-501493호 및 제58-500300호에 기재된 것), 항-HBs 단일클론성 항체로 감작시킨 적혈구를 함유하는 응집시약(예, 일본국 특허 공개 제58-127167호 및 제60-38656호) 및 이들을 이용하는 측정방법(예, 일본국 특허 공개 제57-501493호 및 제58-500300호)이 개발되어 왔다. 덧붙여 HBs에 대한 단일클론성 항체를 이용하는 진단키트가 각사에 의해 발매되었다.
역 수신 응집반응에서는, 비특이적 응집이 일어날 수 있고, 이들을 억제하기 위해서 측정하고자 하는 항원 이외의 다른 항원에 대한 단일클론성 항체를 반응용액에 첨가할 수 있다(예, 일본국 특허공개 제62-15464호).
역 수신 응집반응에 사용되는 혈구로는 양 또는 병아리의 고정 혈구가 일반적으로 사용되며, 이러한 혈구의 단일클론성 항체에 의한 감작은 지금까지는 주로 탄닌산의 존재하에 행해져 왔다.
지금까지, 많은 항-HBs 단일클론성 항체가 제조되고 각종 HBs 측정 키트가 개발되어 왔지만 비특이반응이 감소되고 감도가 높은 것이 요구되고 있다.
본 발명은 HBs 항원을 결정하는데 유용한 항-HBs 단일클론성 항체 HBs 8Cl, HBs 18E9 및 HBs 22B7, 역수신 응집에서 비특이 반응을 억제할 수 있는 항-인간 IgM 단일클론성 항체 HIgM 10C9 및 항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체 MPV 10G3을 제공하고 또한 이들을 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 나아가, 본 발명은 고감도의 HBs 항원 분석법을 제공하는, 염화크롬의 존재하에 항-HBs 단일클론성 항체를 사용하여 고정 혈구를 감작시키는 방법 및 상기 방법에 따라 감작된 고정혈구에 관한 것이다. 덧붙여, 본 발명은 상기 단일클론성 항체를 사용함으로써, HBs 항원 분석법에 정확도를 부여하는, 역수신응집에서의 비특이 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 상기한 것을 적절히 조합함으로써, 고감도 및 정확도를 갖는 HBs 항원 분석법이 실현된다.
공지의 키트에서는, 비특이 반응이 자주 일어나기 때문에, 사용전에 시료 혈청을 약 20배로 희석하는 것이 필요하다. 반면에 HBs 항원을 본 발명의 방법에 따라 측정할때에는, 그것을 약 6배로 희석하면 충분하다. 시료 혈청을 너무 많이 희석하면 분석의 부정확도를 유발한다. 즉, 본 발명에 의해서 고감도 및 낮은 비특이 반응성을 갖는 HBs 항원 분석법이 달성된다.
본 발명의 단일클론성 항체는 종래기술에 따라 아래와 같이 제조할 수 있다.
우선, BALB/c 또는 다른 계통의 쥐에게 목적하는 항원을 프로인드 완전 보조액 같은 보조제와 함께 투여하여 면역시키고, 면역후에 비장 세포를 꺼내어 항체-생산 세포로서 세포 융합시킨다. 얻어진 생쥐 비장 세포를 약 10내지 20%의 소태아 혈청(FCS)을 함유하는, 이글 MEM, 둘베코 변형 배지 및 RPMI 1640 같은 배양배지에 현탁시키고, 적혈구를 파괴한 후에, 세포를 히포크산틴-구아닌포스포리보실 트랜스퍼라제 결손(HGPRT-) 또는 티미딘 키나제 결손(TK-) 같은 적절한 마커를 갖는 생쥐 골수종 세포와 융합시킨다. 융합제로는, 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 가한다. 융합세포를 히포크산틴-아데닌-티미딘(HAT) 배지에 현탁시키고 HAT 배지의 반을 교환하면서 배양한다. 하이브리도마의 형성을 확인한 후에, 배양 상층액중의 항체 역가를, 상기 항원으로 감작시킨 혈구를 이용하는 수신 응집반응(PHA)에 의해 측정할 수 있다. 응집반응에서 양성을 나타내는 하이브리도마를 한계 희석법에 따라 수회 더 클로닝함으로써 목적 항체를 안정하게 생산할 수 있는 하이브리도마를 얻는다.
얻어진 하이브리도마를 시험관내 또는 생체내에서 증가시킴으로써 목적 단일클론성 항체를 제조한다. 시험관내에서는, 세포를 상술한 것과 같은 상용 배양 배지에 현탁시키고, 수일간 배양하여 배양 상층액으로부터 목적 항체를 얻는다. 생체내에서는, 하이브리도마를 생쥐 또는 다른 포유동물에게 복강내 접종하고, 10내지 20일 후에 복수를 채취하고, 복수로부터 목적 단일클론성 항체를 얻는다.
이렇게 얻어진 배양 상층액 또는 복수로부터, 황산암모늄 분획, DEAE 세파로스 이온 교환 컬럼 크로마토크래피, 히드록시-아파타이트 컬럼 크로마토그래피 및 단백질 A-친화 컬럼 크로마토그래피 같은 통상의 방법을 조합하여 목적 단일클론성 항체를 정제한다.
본 발명에 있어서는, 본 발명에 따라 각종 항-HBs 단일클론성 항체가 얻어진다. 이중에서, 이하에 나타내는 방법에 따라 HBs를 측정하는데 있어서 비특이 반응이 적고 감도가 높은 응집시약을 제공할 수 있는 단일클론성 항체 HBs 22B7, 18E9 및 8Cl을 얻는다. 한편, 하기 실시예에 나타내는 것처럼, 모든 항-HBs 단일클론성 항체가 비특이 반응성이 작고 감도가 높은 응집시약을 제공할 수 있는 것은 아니고, 이들 단일 클론성 항체가 특히 낮은 비특이 반응성 및 고감도를 가지므로 HBs 측정에 유용하다.
비슷하게, 본 발명에서 얻어지는 항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체 MPV 10G3 및 항-인간 IgM 단일클론성 항체는 하기의 HBs측정에서 비특이 반응을 억제하는데 특히 유용하다.
덧붙여, 본 발명은 HBs 항원을 면역원으로 이용하여 얻은 항-HBs 단일클론성 항체에 사용하여 혈구를 감작시키는 방법 및 이렇게 감작시킨 혈구를 이용하여 HBs 항원을 측정하는 방법도 제공한다.
본 발명에서 이용되는 혈구로는, 병아리 혈구가 바람직하다. 병아리 혈구는 진핵세포이고 포유동물의 세포와 비교할 때 침강 속도가 매우 빠르기 때문에, 병아리 혈구를 응집반응 시약으로 사용하면 약 1시간안에 판정이 가능하고 조작에 2시간이 소요되는 양 또는 다른 포유동물의 혈구와 비교하여 조작성이 우수하다. 인간 혈청중의 HBs 항원을 측정하는 경우에는, 응집반응 시약과 비특이적으로 반응하는, 이종 혈구에 대한 응집인자(이종 응집소)가 통상적으로 인간 혈청중에 존재한다는 것이 주목할 만하다. 병아리 혈구는 양 또는 거위 혈구와 비교하여, 인간 혈청중에 함유되어 있는 이종 응집소에 대해 낮은 반응성을 갖고, 위양성반응(false positive reaction)을 일으킬 수도 있는 비특이 응집반응의 발생이 낮다는 점에서 유리하다.
본 발명에서 이용되는 혈구는 용혈을 방지하기 위해서는 글루타르알데히드 또는 포르말린에 의해 고정화되어 있어야 바람직하며, 포르말린으로 고정화하면 혈액 세포가 서로 응집될 수 있기 때문에 특히 글루타르알데히드가 바람직하다. 혈구를 고정시키기 위한 글루타르 알데히드의 농도는 혈구의 양에 따라 비례하여 조정한다. 혈구를 약 5%의 농도로 사용하는 경우에는, 글루타르 알데히드의 최종농도는 0.05내지 0.2%로 조정하며 실온에서의 1 내지 2시간 동안의 반응에 의해 고정화가 완료된다. 10%농도의 혈구를 사용하는 경우에는 5%혈구에서 사용된 양의 2배 양의 글루타르알데히드를 사용할 수 있다. 그러나, 혈구 농도가 30%를 넘으면 비특이 혈구 응집이 일어나서 바람직하지 않다. 혈구 응집괴가 없는 안전한 고정혈구를 제작하기 위해서는 약 5 내지 7.5%농도의 혈구를 사용하면 고정에 충분하다. 글루타르알데히드의 농도가 0.05%이하인 경우에는, 반응시간을 더 길게하면 고정이 가능하다. 그러나 약 1시간 내에 간단히 고정시키기 위해서는, 바람직한 글루타르 알데히드 농도는 약 0.1%이다. 한편, 0.2%를 초과하면, 단축된 반응 시간내에 고정을 행할 수 있긴 하지만 고정이 매우 빠르게 진행되기 때문에 응집괴가 형성될 수 있어 균질한 고정혈구를 제조하기가 어렵다.
얻어진 고정 혈구를 단일클론성 항체로 감작시키는 것은 염화크롬법에 의해 달성될 수 있다. 탄닌산을 이용하는 공지방법에서는, IgGl 클래스에서의 흡수가 특히 불량하다. 그러나, 염화크롬에서는 IgGl 뿐만 아니라 IgG2a또는 IgM에서도 흡수가 더 양호하다. 이 감작은 1 내지 5%농도의 고정 혈구에 대해 5 내지 1,000㎛/ml의 단일클론성 항체 및 5 내지 600㎛/ml의 염화크롬의 존재하에 행한다. 바람직하게는, 약 2.5% 농도의 고정혈구에 대하여는 10 내지 500㎍/ml의 단일클론성 항체 및 10 내지 300㎍/ml의 염화크롬의 존재하에 감작을 행함으로써 고감도의 감작혈구를 얻는다. 고정 혈구의 농도를 변화시키면, 고정혈구의 농도변화에 비례하여 단일클론성 항체 및 염화크롬의 농도가 증가 또는 감소될 수 있다. 둘 이상의 항체로 감작시킨 경우에는, 동일 조작을 반복할 수 있다. 명세서에선, 고정혈구의 농도는 혈구 상당분의 백분율(v/v)로 나타내었다.
상술한 염화크롬법에 의해 IgM클래스의 항-HBs 단일클론성 항체를 혈구에 대해 감작시키면 공지의 생성물보다 높은 감도를 갖는 HBs 항원 측정 시약을 얻을 수 있다. 그러나 IgM은 일반적으로 감도가 높을 뿐만 아니라 비특이 반응성도 높다. 반면에, IgG는 감도에서 IgM만큼 높지는 않지만 특이성이 더 높다. 그러므로, IgM으로 감작시킨 혈구를 IgG클래스의 항-HBs 단일클론성 항체로 더 감작시키면, 공지 생성물 보다 높은 감도 및 낮은 비특이 반응성을 갖는 측정시약을 얻을 수 있다. 비특이 반응을 더 감소시키기 위해서는 IgG클래스의 각종 종류의 항-HBs 단일클론성 항체를 이용함으로써 IgM 및 IgG 모두를 이용하여 감작시킨 여러종류의 혈구를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 목적 응집 시약은 HBs 8Cl(IgG) 및 HBs 22B7(IgM)로 이중 감작시킨 혈구와 HBs 18E9(IgG) 및 HBs 22B7로 이중 감작시킨 혈구를 조합함으로써 목적 응집 시약을 얻는다.
덧붙여, 비특이 반응을 감소시키기 위하여, 글루타르알데히드 또는 열로 변성시킨 후에 반응용액에 감작에 사용된 IgM을 가할 수 있다. 또는 감작에 이용된 것과 다른 변성 또는 비변성 IgG 및 IgM을 가한 경우에는, 비특이 반응이 더 억제된다. 본 발명에서, 글루타르알데히드-변성 HBs 22B7, 및 필요에 따라, 비변성 HIgM 10C9 및 열변성 MPV 10G3을 반응용액에 가함으로써 비특이 반응을 억제할 수 있다. 첨가량은 반응을 저해하지 않는 한 가능한 많은 양이어야 한다. 특히 실질적으로 이들을 각각 1 내지 300㎍/ml의 양으로 가한 경우에는 비특이 반응에 대한 원하는 효과가 얻어진다.
한편, 상기 방법을 조합하면, 극히 고감도 및 특이적으로 HBs 항원을 측정할 수 있다.
[실시예 1]
항-HBs 단일클론성 항체
ⅰ. 면역원의 제조(표 1 참조)
HBs 항원-양성 혈청을 45% 황산암모늄에서 염석하여 HBs 항원을 첨강시킨다(회수율 85%). 이 HBs 항원을 50mM 시트레이트 완충액(pH 5.56)에 대하여 투석하고, 동일 완충액으로 평형화한 DEAE세파로스 CL-4B 컬럼에 넣고, 미흡착 분획을 모은다(수율 49%). 다음에 HBs 항원 분획을 80mM 시트레트 완충액으로 평형화한 CM세파로스 CL-48 컬럼에 넣고, 미흡착 분획을 모은다(회수율 37%). 이들 분획을 PBS에 대해 투석한 후에 이들을 염소 항-인간 혈청 IgG세파로스 컬럼에 통과시켜 인간 혈청 성분을 제거하고, 통과된 분획을 부분 정제된 HBs 항원(회수율 30%)으로서 수집하고 BALB/c 생쥐에서 면역원으로서 접종시킨다.
[표 1] 면역원의 제조
Figure kpo00001
단백질 함량은 로우리 등의 방법(Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265∼275, 1971)에 따라 측정하였다. HBs 항체 역가는, 항-HBs 항체로 감작시킨 양 적혈구를 이용하는 RPHA 시약 키트(Fuji Rebio, 세로디아-HBs)를 사용하여 측정하였다.
ⅱ) 생쥐 비장 세포의 제조
프로인드 완전 보조액과 함께 부분 정제된 HBsAg(100㎍)를 피하 주사하여 BALB/c 생쥐를 면역화하고, HBsAg(100㎍)만을 매 2주마다 3∼5회 피하 투여하고, 최종 면역 3일후에, 비장 세포 현탁액을 세포융합용으로 제조한다.
ⅲ) 하이브리도마의 제조
생쥐 비장 세포 및 생쥐 골수종 세포 SP2/O-Ag14(SP2)를 공지방법에 의해 융합시킨다.
생쥐 비장 세포를 추하고, 15%소태아 혈청(FCS)을 함유하는 RPMI 1640배양 배지 10ml에 현탁시킨다. 원심분리(200×g, 5분)후에, 세포를 적당량의 0.17M 염화암모늄으로 처리하여 함유되어 있는 적혈구를 파괴하고, FCS가 없는 RPMI 1640배양 배지 5ml에 현탁시킨다. FCS가 없는 동일한 배양 배지 5ml에 현탁시킨 SP2세포를 비장세포 양의 1/5만큼 가하고, 잘 혼합하고, 원심분리(200×G, 5분)하여 RPMI배지를 제거한다. 생성물에 37℃에서 예비 가온한 50%폴리에틸렌글리콜 4,000(동일 부피의 RPMI 1640배지와 혼합) 1ml를 점차 가하고 잘 교반하여 세포를 융합시킨다. 융합 후에 15%FCS를 함유하는 RPMI 1640배양 배지를 천천히 가하고, 세포를 원심분리(200×g, 5분)에 의해 세척하여 폴리에틸렌 글리콜을 제거하고, HAT(히포크산틴 아미노프테린 티미딘) 배양배지에 현탁시키고, 96웰 평편 바닥 마이크로플레이트에 매 웰당 약 5×106비장 세포/200㎕의 비율로 넣는다. 배양 시작 4 또는 5일 후에, 각 웰의 HAT 배지의 반을 교환하고, 9 내지 13일째에는 하이브리도마의 콜로니 형성이 관찰된다. 상층액의 HBs 항체 역가를 PHA응집시약(Eizai, PHA법 에이자이키트)을 이용하여 측정한다. 25㎕의 배양 상층액을 100㎕의 생리식염수에 5배 희석한 후에 그중 5㎕를 키트에 부착된 희석액 50㎕ 및 항원 감작 혈구 25㎕와 혼합하고, 양성 응집을 나타내는 웰을 항-HBs 항체 생산 하이브리도마를 함유하는 것을 간주한다.
HBs 항체-생산 하이브리도마를 한계희석법에 의해 3회 클로닝하여 안정한 항-HBs 단일클론성 항체 생산 하이브리도마 26주를 얻는다. 얻어진 하이브리도마를 90%FCS 및 10%디메틸술폭시드에 현탁시키고 -80%보관소 또는 액체 질소중에 보존한다.
ⅳ) 단일클론성 항체의 질소
생후 8주 이상된 HALB/c 생쥐에게 프리스탄(2, 6, 10, 14-테트라메틸-펜타데칸) 0.25ml를 복강내 투여하고, 3 내지 14일 후에, PBS에 현탁시킨 하이브리도마 1×106세포(1ml)를 복강내 투여한다. 축적된 복수를 10 내지 20일 후에 수집한다. 복수에서, 항-HBs 단일클론성 항체의 PHA역가는 40,000 내지 5,120,000이다. 수집된 복수의 부피는 BALBc 생쥐 한 마리당 1 내지 5ml이다.
ⅴ) 단일클론성 항체의 이소타입 및 상기 단일클론성 항체에 의해 인지되는 HBs 항원 서브 타입
분리 확립된 26종의 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체의 이소타입은 다음 방법으로 확인한다.
면역 글로불린의 이소타입은 HBs 항체-생산 하이브리도마의 배양 상층액 및 정제된 단일클론성 항체(후술)를 아가로스겔내에서 양 항-생쥐 면역 글로불린 M, G, A, G1, G2a, G2b, G3, K 및 λ 사슬 혈청과 반응시키는 오크테를로니(Ouchterlony) 이중 면역확산법에 의해 확인한다. 동시에, 배양 상층액과 각 항혈청을 1 : 1 비율로 반응시키고 정제된 단일클론성 항체의 10배 희석액을 각 항혈청과 반응시킴으로써 뚜렷한 침전선을 관찰한다.
단일클론성 항체에 의해 인지되는 HBs 항원의 서브 타입을 결정하기 위해, 우선 서브타입이 공지된 HBs 항원(adr, adw, ayr, ayw)을 이용하는 오크테를로니 이중 면역확산법에 의해 각 항원을 인지하는 단일클로형 항체, 즉 22B7(항-a), 11F1(항-ar), 5A5(항-d) 및 18E9(항-d)을 얻는다. 서브타입이 공지된 이들 단일클론성 항체로 감작시킨 병아리 혈구를 이용하는 RPHI법에 의해, 각 단일클론성 항체에 의해 인지되는 HBs 항원의 서브타입을 결정한다. 즉, HBs 항원-양성 혈청(항원역가 256)을 1 : 2 내지 1 : 256배로 약 2배 단계 희석한 후에, 각 웰에 25㎕의 항-HBs 단일클론성 항체(항체역가 1000)를 가하고, 37℃에서 1시간 동안 중화반응을 행한다. 각 웰에, 항-a(22B7), 항-ar(11F1), 항-d(5A5) 또는 항-d(18E9) 항체-감작 병아리 고정혈구를 각각 25㎕씩 가하고, 혼합하고 실온에서 40 내지 60분간 방치하고 응집을 관찰한다. HBs항원과 각 단일클론성 항체-감작 혈구사이의 응집반응의 2개 이상의 웰에 의해 억제되는 경우에는, 첨가된 단일클론성 항체를 감작에 사용된 단일클론성 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 서브타입을 인지하는 것으로 판정한다.
ⅵ) 단일클론성 항체의 정제
면역글로불린 클래스 IgG1에 속하는 단일클론성 항체를 단백질 A-친화 크로마토그래피에 의해 정제한다.
복수를 원심 분리하고, 0.45μm막 필터를 통해 여과하고 100mM인 산염 완충액(pH 9.2)에 대해 투석한다. 동일 완충액으로 평형화된 단백질 A-세파로스 컬럼에 넣고, 흡착된 IgG1을 0.1M아세트산 0.14M염화나트륨으로 용출시킨다. 즉시 적당량의 2M트리스-염산염 완충액(pH 9.0)을 가하여 중화시키고, PBS에 대해 투석하여 정제된 단일클론성 항체(IgG1)을 얻는다.
복수를 원심분리 및 여과한 후에, IgG2a클래스의 단일클론성 항체를, 100mM 인산염 완충액(pH 8.2)에 대해 투석하고 IgG1과 동일한 방법으로 처리하여 정제된 단일클론성 항체를 얻는다.
IgM클래스의 단일클론성 항체를 히드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제한다. 복수를 원심분리 및 여과하여 불용성 물질을 제거한 후에, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.8)에 대해 투석하고 동일 완충액으로 평형화한 히드록시 아파타이트 컬럼에 흡착시킨다. 흡착된 IgM을, 인산염 농도를 단계적으로 증가시켜(0.2 내지 0.4M)용출시키고, 용출액을 PBS로 평형화한 세파덱스 G-25컬럼에 통과시켜 완충액을 PBS로 교환한다. 이렇게 하여 정제된 단일클론성 항체(IgM)를 얻는다.
ⅶ) 등전점의 측정
상술한 정제된 단일클론형 항체중에서, 14종류의 등전점을 측정한다.
IgG클래스의 단일클론성 항체의 등전점을 박막 폴리아크릴아미드 겔의 등전점 포커싱에 의해 측정하고, IgM클래스의 단일클론성 항체의 등전점을 박막 아가로스의 등전점 포커싱에 의해 측정한다.
(1) 박막 폴리아크릴아미드 겔의 등전점 포커싱
암폴린 PAG판(Ampholine PAG plate, LKB제품, pH 3.5 내지 9.5)의 양극에는 1M인산에 담가 놓은 전극 여과지를, 그리고 음극에는 1M 수산화나트륨에 담가 놓은 전극 여과지를 세팅한다. 판에는, IgG클래스의 단일클론성 항체를 함유하는 시료 어플리케이터 여과지를 세팅한다. 30W의 일정 전력 및 10℃의 온도에서 90분간 전기영동을 행한다. 전기 영동후에, 겔 판을 고정액*에 담가 놓는다. 60분간 방치한 후에, 겔 표면을 탈색액*으로 헹구고, 60℃의 염색액*중에서 10분간 염색한다. 겔을 탈색액으로 옮기고, 과량의 염색액을 탈색시킨다. 겔을 보존액*에 60분간 담가 놓고, 실온에서 밤새 건조시킨 후에 플래스틱 시이트로 덮어서 보존한다.
단일클론성 항체의 등전점은, 동시에 전기 영동시킨 검정용의 공지 pI의 단백질의 이동거리를 기준으로 하여 결정한다.
*고정액
메탄올 150ml
증류수 350ml
술포살리실산 17.25g
트리클로로아세트산 57.5g
염색액
쿰마시 브릴리안트 블루 R250 0.115g
탈색액 100ml
탈색액
에탄올 500ml
아세트산 160ml
증류수를 가하여 전체를 2ℓ로 만든다.
보존액
글리세린 50ml
탈색액 500ml
(2) 암폴린 아가로스판(LKB제품, pH 3.5 내지 9.5)의 양극에는 0.5M아세트산에 담가 놓은 전극 여과지를, 음극에는 0.5M 염화나트륨에 담가놓은 전극 여과지를, 그리고 판에는 단일클론성 항체를 갖는 어플리케이터 여과지를 세팅한다. 최초 전압을 500V로 조정한 일정 전압에서 30분간 전기 영동을 행한다(10℃). 전기영동 후에, 아가로스겔을 고정액*에 10분간 그리고 에탄올에 10분간 담가 놓는다. 겔을 드라이어로 건조시키고 염색액*에 5분간 담가놓는다. 과량의 염색액을 탈색액*중에서 제거한다. 탈색후에, 겔을 건조시키고 보존한다.
단일클론성 항체의 등전점은, 동시에 전기 영동시킨 검정용의 공지 pI의 단백질의 이동거리를 기준으로하여 결정한다.
*고정액
트리클로로아세트산 100g
술포살리실산 10g
증류수 1000㎖
염색액
쿰마시 브릴리안트블루 R250 1.5g
탈색액 300ml
탈색액
95%에탄올 350ml
빙초산 100ml
증류수를 가하여 1000ml로 만든다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2] 단일클론성 항체의 특성
Figure kpo00002
ⅷ) 단일클론성 항체-감작 혈구에 의한 HBs 항원의 검출
얻어진 단일클론성 항체중에서, HBs 항원의 검출 감도를 12종류에 대해 측정한다.
(1) 병아리 고정혈구의 제조
병아리 보존 혈액을 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버리고 나머지 생리식염수에 현탁시킨다. 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버린다. 이 조작을 3회 반복한 후에, 혈구를 PBS에 5%(v/v)이 농도로 현탁시키고 1 내지 1.2%(v/v, PBS)의 글루타르알데히드를 1/10량 가하다. 실온에서 1 내지 2시간 동안 천천히 혼합하여 고정시킨다. 그후에 혈구를 증류수 중에서 5회 원신분리 세척하고(600×g, 5분), 농도를 5%로 조정한다. 아지드화나트륨을 0.1%량 가하고, 제제를 냉장고내에서 보존한다.
(2) 단일클론성 항체-감작 혈구의 제조
병아리 고정 혈구(5%(v/v)) 2ml를 생리식염수를 이용하여 3회 원심분리 세척하고(600×g, 5분), 항-HBs 단일클론성 항체의 생리식염수(25 내지 500㎍/ml) 2ml를 등량 혼합한다. 염화크롬을 25 내지 200㎍/ml의 최종농도로 가하고, 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반한다. 감작후에, 세포를 0.5%BSA/PBS를 이용하여 5회 동안 원심분리 세척하고(600×g, 5분), 0.5%BAS/PBS(16ml)에 최종적으로 현탁하여 단일클론성 항체-감작 혈구를 얻는다.
감작 혈구의 HBs 항원-검출 감도를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
*1 RIA법에 의해 양성으로 판정된 표본에 있어서의 검출율
*2 HBs 항원-음성 표본에 대한 비특이 반응의 출현율
그러므로, 단일클론성 항체 HBs 18E9, HBs 8C1 및 HBs 22B7을 사용하면, 검출감도가 가장높고 비특이 반응이 거의 없다.
이들 항-HBs 항체 생산 하이브리도마는 영국 월트셔 SP4 OJG 살리스버리 포톤 다운에 있는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 부다페스트 조약하에 기탁되어 있다. 수탁번호 및 수탁일은 다음과 같다.
Figure kpo00004
[ 실시예 2 ]
항-인간 IgM 단일클론성 항체
ⅰ. 면역원의 제조
인간 보존 혈청(100ml)을 원심분리하고(2000×g, 10분) 0.45㎛ 막 필터를 통해 여과한다. 생성물을 100mM 인산염 완충액(pH 6.8)에 대해 투석하고, 동일 완충액으로 평형화한 히드록시 아파타이트 컬럼에 흡착시킨다. 흡착된 IgM을, 인산염 농도를 단계적으로 증가시켜(0.2 내지 0.4M) 용출시키고, PBS로 평행화한 세파덱스 G-25컬럼에 용출액을 통과시켜 완충액을 PBS로 교환시킴으로써 정제된 IgM을 얻는다.
[표 4] 인간 IgM의 정제
Figure kpo00005
단백질은 로우리 등의 방법(Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265∼275, 1971)에 의해 측정한다.
ⅱ. 인간 IgM-감작 혈구의 제조
항-인간 IgM 항체-검출시약으로서, 단계 ⅰ에서 정제한 인간 IgM을 병아리 고정 혈구에 감작시켜서 PHA법 시약을 제조한다.
(1) 병아리 고정 혈구의 제조
병아리 보존 혈액을 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버리고 나머지를 생리식염수에 현탁시킨다. 이 조작을 3회 반복한 후에, 혈구를 PBS에 5v/v%의 농도로 현탁시키고, 1 내지 1.2%(v/v PBS) 글루타르알데히드의 1/10양을 가하고 실온에서 1 내지 2시간 동안 천천히 혼합한다. 그후에, 혈구를 증류수를 이용하여 5회 원심분리 세척하고(600×g, 5분), 농도를 5v/v%로 조정하고, NaN3를 0.1%양으로 가하고 제제를 냉장고내에서 보존한다.
(2) 인간 IgM-감작 병아리 고정 혈구의 제조
병아리 고정 혈구(5v/v%) 2ml를 PBS를 이용하여 2회 원심분리 세척하여 (600×g, 5분)PBS에 현탁시킨 현탁액 4ml를 얻는다. PBS에 용해시킨 탄닌산(5ml/dl)과 등량 혼합하고 37℃에서 10분간 천천히 교반하며 탄닌산 처리한다. 탄닌산 처리된 혈구를 PBS로 2회 원심분리 세척하여 (600×g, 5분)PBS에 현탁된 현탁액 8ml를 얻는다. 정제된 인간 IgM(100㎍/ml PBS, pH 6.2)을 등량 가하고 실온에서 2시간 동안 교반한다. 이어서, 0.001%양의 글루타르알데히드를 가하고 실온에서 1시간동안 더 교반한다. 0.5% BSA/PBS로 5회 원심분리 세척(600×g, 5분)함으로써 16ml의 현탁액을 얻어 인간 IgM-감작 혈구를 제조한다.
ⅲ. 생쥐 비장 세포의 제조
프로인드 완전 보조액과 함께 정제 IgM(100㎍)을 피하 주사하여 BALB/c 생쥐를 면역화한 후 매 2주마다 IgM(50㎍)만을 3내지 피하 5회 투여한다. 최종 면역의 3일 후에, 비장 세포 현탁액을 세포 융합용으로 제조한다.
ⅳ. 하이브리도마의 제조
생쥐 비장 세포 및 생쥐 골수종 세포 SP2/O-Ag 14(SP2)를 공지방법에 의해 융합시킨다.
생쥐 비장 세포를 15%FCS를 함유하는 RPMI 1640 배양 배지 10ml에 현탁시킨다. 200×g에서 5분간 원심분리한 후에, 세포를 0.17M NH4Cl로 처리하여 함유되어 있는 적혈구를 파괴하고 FCS를 함유하지 않는 RPMI 1640 배양 배지 5ml에 현탁시킨다. 비슷하게 FCS를 함유하지 않는 배양 배지 5ml에 현탁된 SP2세포를 상기 방법에 의해 제조된 비장 세포의 1/5의 양으로 첨가하고 잘 혼합한다. 200×g에서 5분간 원심분리하여 RPMI 1640 배지를 제거하고, 37℃에서 예비 가온한 50% 폴리에틸렌 글리콜 4,000(RPMI 1640배지와 등량 혼합) 1ml를 천천히 가하고 잘 교반하여 세포를 융합시킨다. 융합후에, 15% FCS를 함유하는 PRMI 1640배양 배지를 천천히 가하고, 세포를 원심분리(200×g, 5분)에 의해 세척하여 폴리에틸렌글리콜을 제거한다. 생성물을 HAT(히포크산틴 아미노프테린 티미딘) 배양 배지에 현탁시키고, 96웰 평면 바닥 마이크로플레이트에 매 웰당 약 5×106비장세포/200㎕의 비율로 넣는다. 배양 시작 4 또는 5일 후에, 각 웰의 HAT 배지의 반을 교반하고, 9 내지 13일째에는 하이브리도마의 콜로니 형성이 관찰된다. 배양 상층액의 항-IgM 항체 역가를 단 ii에서 얻은 PHA 응집시약으로 측정한다.
10㎕의 배양 상층액을 200㎕의 PBS로 20배 희석한 후에, 그중 25㎕를 25㎕의 인간 IgM-감작 혈구와 혼합하고, 응집을 나타내는 웰을 항-인간 IgM항체-생산 하이브리도마를 함유하는 것으로 간주한다. 항-인간 IgM항체-생산 하이브리도마를 한계 희석법에 의해 3회 클로닝하고, 안정한 항-인간 IgM 항체-생산 하이브리도마를 함유하는 것으로 간주한다. 항-인간 IgM 단일클론성 항체 생산 하이브리도마 5주를 얻는다. 얻어진 하이브리도마를 90%FCS 및 10%디메틸 술폭시드에 현탁시키고 -80℃냉장고 또는 액체 질소중에서 보존한다. 이들중 한주를 HIgM 10C9로 명명하였다.
이 항-인간 IgM 항체 생산 하이브리도마 HIgM 10C9는 영국 윌트셔 SP4 OJG 살리스버리 포톤 다운에 있는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 부다페스트 조약하에 1987년 3월 19일부터 수탁번호 87031903으로 기탁되어 있다.
ⅴ. 단일클론성 항체의 제조
생후 8주 이상된 BALB/c (2,6,10,14-테트라메틸-펜타데칸) 0.25ml를 복강내 투여하고, 3 내지 14일후에, PBS에 현탁시킨 하이브리도마 1×106세포(1ml)를 복강내 투여한다. 투여 10 내지 20일 후에 복수를 수집한다. 복수에는, 항-인간 IgM 단일클론성 항체(PHA 역가 160,000 내지 640,000)가 함유되어 있다. 복수의 샘플링 부피는 BALB/c 생쥐 한 마리당 1 내지 5ml이다.
ⅵ. 단일클론성 항체의 특성
분리 확립된 하이브리도마 HIgM 10C9에 의해 생산된 단일클론성 항체의 특성을 표 5에 나타낸다.
아가로스겔 중에서 양 항-생주 면역글로불린 M, G, A, G2, G2a, G1b, G3, K 및 λ사슬 혈청에 대한 항-인간 IgM 항체 생산 하이브리도마의 배양 상층액의 오크테를로니 이중면역확산법에 의해 면역글리불린의 이소타입을 확인한다.
단일클론성 항체와 면역글로불린 사이의 반응성을, 탄닌산법에 의해 병아리 고정 혈구에 감작시킨(ii 참조·인간 IgM-감작 혈구의 제조) 정제 인간 IgM, 인간 IgM, 및 인간 IgG 및 인간 IgA(Cappel제품)를 함유하는 PHA 시약에 의해 확인한다.
[표 5]
Figure kpo00006
*각 PHA 시약의 혈구 응집역가
[등전점의 측정]
단일 클론성 항체의 등전점을 박막 아가로스 등전점 포커싱에 의해 측정한다.
암폴린 아가로스 판(LKB제품, pH 3.5 내지 9.5)의 양극에는 0.5M아세트산에 담가놓은 전극 여과지를, 그리고 음극에는 0.5M염화나트륨에 담가놓은 전극 여과지를 놓고, 판에는 단일클론성 항체를 갖는 어프리케이터 여과지를 놓고, 최초 전압을 500V로 조정한 일정 전압에서 30분간 10℃에서 전기영동을 행한다. 전기영동 후에, 아가로스 겔을 고정액*에 10분간, 그리고 에탄올에 10분간 담가놓는다. 겔을 드라이어로 건조시키고 염색액*에 5분간 담가놓는다. 과량의 염색액을 탈색액*으로 제거한다. 탈색후에, 겔을 건조시키고 보존한다.
단일클론성 항체의 등전점은, 동시에 전기영동시킨 검정용의 공지 pI의 단백질의 이동거리를 기준으로 하여 결정한다.
*고정액
트리클로로아세트산 100g
술포살리실산 10g
증류수 1000㎖
염색액
쿰마시브릴리안트 블루 R250 1.5g
탈색액 300ml
탈색액
95% 에탄올 350ml
빙초산 100ml
증류수를 가하여 1000ml로 만든다.
vii. 단일클론성 항체의 정제
항-인간 IgM단일클론성 항체 HIgM 10C9를 히드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제한다. 복수를 원심분리하고 여과하여 불용성 물질을 제거하고 0.1M인산염 완충액(pH 6.8)에 대해 투석한다. 생성물을 동일 완충액으로 평형화한 히드록시 아파타이트 컬럼에 흡착시킨다. 인산염의 농도를 단계적으로(0.2내지 0.4M)증가시켜 흡착 IgM을 용출시키고, 용출액을 PBS로 평형화한 세파덱스 G-25컬럼에 통과시켜 완충액을 PBS로 교환한다. 이렇게 해서 정제된 단일클론성 항체(IgM)을 얻는다.
[실시예 3]
항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체
i. 면역원의 제조
(1) 유행성 이하선염 비루스 조 HA항원액의 제조
베로세포(Flow Laboratories Inc.)를 유행성 이하선염 비루스(EXCH-2균주)로 접종시키고, 생산된 HA항원을 정제하여 HA항원을 얻는다. 베로 세포(5×107)를 5%CS(송아지 혈청)를 함유하는 MEM(이글최소필수)배지와 함께 롤로 보틀(roller bottle)에 넣어(0.3ppm, 37℃) 단층 배양물을 얻는다. 이들 베로 세포를 유행성 이하선염 비루스(EXCH-2균주) 0.001 내지 .1의 복수 감염(M.O.I ; multiplicity of infection)에 의해 감염시키고 2%CS를 함유하는 MEM배지에서 5 내지 7일간 배양한다. CPE(세포변성 효과, cytopathic effect)가 100%로 인지되면 세포를 수집하여 PBS에 현탁시키고 초음파 처리한다(10kHz, 2.1A, 10분). 세포의 잔류물을 원심분리(6000×g, 20분)에 의해 제거하고, 상충액을 조 HA 항원액으로 수득한다.
(2) HA 항원의 불활성화
조 HA항원액에 1% 트윈 80수용액 1/7양으로 가하고 실온에서 5분간 격렬하게 진탕한다. 그후에, 디에틸 에테르의 1/2양을 가하고, 4℃에서 15분간 격렬하게 진탕한다. 이 용액을 1,600×g에 20분간 원심 분리하고, 에테르 층을 흡입제거한다. 적당량의 질소기체를 수층에 통과시켜 남아 있는 에테를 제거함으로써 불활성화된 조 HA항원액을 얻는다.
(3) 거위 고정 혈구의 제조
거위 보존 혈액을 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버린다. 나머지를 생리식염수에 현탁시키고 600×g에서 5분간 원심분리 세척한다. 이 조작을 3회 반복한 후에, 혈구를 PBS에 5v/v%의 농도로 현탁시키고, 1.2%글루타르알데히드(v/vPBS)의 1/10양을 가한다. 실온에서 1 내지 2시간동안 천천히 혼합한다. 고정후에, 혈구를 증류수를 이용하여 5회 원심분리 세척한다(600×g, 5분). 농도를 10v/v%로 조정하고, NaN₃를 0.1%양으로 가한다. 제제를 냉장고내에서 보존한다.
(4) HA항원의 제조
불활성화 조 HA항원액에 거위 고정 혈구 100ml를 가하고 4℃에서 밤새 부드럽게 교반하여 HA항원을 혈구에 흡착시킨다. 미흡착 단백질을 4℃에서 3회 원심분리하여(6000×g, 5분)제거하고, 혈구를 50ml의 PBS에 현탁시키고 37℃에서 3시간동안 방치하여 혈구로부터 HA항원을 유리시킨다. 원심분리된 상층액을 정제된 유행성 이하선염 비루스 HA 항원(HA역가 384, 단백질 420μg/ml)으로 사용한다.
ii. 유행성 이하선염 비루스 HA항원-감작 혈구의 제조
(1) 병아리 고정 혈구의 제조
병아리 보존 혈액을 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버리고 나머지를 생리식염수에 현탁시키고 600×g에서 5분간 원심분리한 후에, 상층액을 버린다. 이 조작을 3회 반복한 후에, 혈구를 PBS에 5(v/v)%의 농도로 현탁시킨다. 현탁액에 1 내지 1.2%(v/v, PBS)의 글루타르알데히드를 1/10양 가하고 실온에서 1 내지 2시간동안 천천히 혼합한다. 고정후에 혈구를 증류수와 함께 5회 원심분리 세척하고(600×g, 5분), 농도를 5(v/v)%로 조정한다. NaN₃를 0.1%양 가하고 제제를 냉장고에서 보존한다.
(2) 유행성 이하선염 비루스 HA항원-감작 병아리 고정혈구(PHA 응집시약)의 제조
병아리 고정 혈구(5v/v%) 2ml를 PBS를 이용하여 2회 원심분리 세척하여(600×g, 5분) PBS에 현탁시킨 현탁액 4ml를 얻는다. 고정 혈구를 PBS에 용해시킨 탄닌산(5mg/dl)용액과 등량 혼합하고 37℃에서 10분간 부드럽게 교반한다. 탄닌산 처리된 혈구를 PBS로 2회 원심분리 세척하여(600×g, 5분) PBS에 현탁된 현탁액 8ml를 얻는다. 정제된 유행성 이하선염 비루스 HA항원(100μg/ml PBS, pH 6.2)을 가하고 실온에서 2시간 동안 교반한다. 0.5%BSA/PBS로 5회 원심분리세척(600×g, 5회)함으로써 16ml의 현탁액 액을 얻어 유행성 이하선염 비루스 HA 항원-감작 혈구로 사용한다.
iii. 생쥐 비장세포의 제조
프로인드 완전 보조액과 함께 유행성 이하선염 비루스 항원(HA 100μg)을 피하주사하여 BALB/c 생쥐를 면역화한다. 매 2주마다 HA항원(50μg)만을 3 내지 5회 투여하고, 최종 면역의 3일후에, 비장 세포 현탁액을 세포 융합용으로 제조한다.
iv. 하이브리도마의 제조
생쥐 비장 세포 및 생쥐 골수종 세포 SP2/O-Ag14(SP2)를 공지방법에 의해 융합시킨다. 생쥐 비장 세포를 15%FCS를 함유하는 RPMI 1640배지 10ml에 현탁시킨다. 200×g에서 5분간 원심분리한 후에, 세포를 적당량의 0.17M NH₄CL로 처리하여 그안에 함유되어 있는 적혈구를 파괴한다. FCS를 함유하지 않는 RPMI 1640배지 5ml에 현탁된 SP2 세포를 비장세포의 1/5의 양으로 첨가하고 잘 혼합하고, 200×g에서 5시간 원심분리하여 RPMI 1640배지를 제거한다. 생성물에 37℃에서 예비가온한 50%폴리에틸렌글리콜 4,000(RPMI 1640배지와 등량 혼합) 1ml를 천천히 가하고 잘 혼합하여 세포를 융합시킨다. 융합후에, 15%FCS를 함유하는 RPMI 1640배지를 천천히 가하고, 원심분리(200×g, 5분)로 세척하여 폴리에틸렌글리콜을 제거한다. 생성물을 HAT(히포크산틴 아미노프테린 티미딘) 배지에 현탁시키고, 96웰 평면 바닥 마이크로플레이트에 매 웰당 약 5×106비장세포/200㎕의 비율로 넣는다. 배양시작 4 또는 5일 후에, 각 웰의 HAT배지의 반을 교환하고, 9 내지 13일째에는 하이브리도마의 콜로니 형성이 관찰된다. 배양 상층액의 항-유행성 이하선염 비루스 항체 역가를 단계 ii에서 얻은 PHA응집 시약으로 측정한다. 10㎕의 배양상층액을 2%CS-함유 PBS 100㎕에 가하여 11배로 희석하고, 그중 25㎕를 25㎕의 유행성 이하선염 비루스 HA항원-감작 혈구와 혼합한다. 양성 응집을 나타내는 웰을 항-유행성 이하선염 비루스 항체-생산 하이브리도마를 함유하는 것으로 간주한다. 항-유행성 이하선염 비루스 항체-생산 하이브리도마를 한계희석법에 의해 3회 클로닝하고, 안정한 항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체-생산 하이브리도마 6주를 얻는다. 얻어진 하이브리도마를 90%FCS 및 10%디메틸 술폭시드에 현탁시키고 -80℃보관소 또는 액체 질소 중에서 보존한다. 이들 중 한주를 MPV 10G3으로 명명하였다.
이 항-유행성 이하선염 비루스 항체-생산 하이브리도마 MPV 10G3은 영국 윌트셔 SP4 OJG 살리스버리 포톤 다움에 있는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 부다페스트 조약하에 1987년 3월 19일부터 수탁번호 97031902로 기탁되어 있다.
v. 단일클론성 항체의 제조
생후 8주 이상된 BALB/c 생쥐에게 프리스탄(2, 6, 10, 14-테트라메틸-펜타데칸) 0.25ml를 복강내 투여하고, 3 내지 14일 후에, PBS에 현탁시킨 하이브리도마 1×106세포(1ml)를 복강내 투여한다. 투여 10 내지 20일후에 축적된 복수를 수집한다. 복수에는, 항-유행성 이하선염 비루스 단일 클론성 항체(PHA 역가 250,000)가 함유되어 있다. 복수의 채취 부피는 BALB/c 생쥐 한마리당 1 내지 5ml이다.
vi. 단일클론성 항체의 특성
분리 확립된 단일클론성 항체 MPV 10G3의 특성을 표 6에 나타낸다.
아가로스 겔 중에서 양 항-생쥐 면역글로블린 M, G, A, G2a, G2b, G3, 항-K 및 λ혈청에 대한 항-유행성 이하선염 비루스 항체-생산 하이브리도마의 배양 상층액의 오크테를로니 이중 면역확산법에 의해 면역글로불린의 이소타입을 확인한다.
[표 6]
Figure kpo00007
단일클론성 항체는 유행성 이하선염 비루스 EXCH-2균주 HA 항원과는 잘 반응하지만 엔더스 균주 HA 항원과는 약하게 반응한다. 유행성 이하선염 비루스 CF 항원과는 반응하지 않는다.
[등전점의 측정]
단일클론성 항체의 등전점을 박막 폴리아크릴아미드 겔 등전점 포커싱에 의해 측정한다.
암폴린 PAG 판(LKB제품, pH 3.5 내지 9.5)의 양극 및 음극에 각각 1M 인산에 담가놓은 전극 여과지 및 1M NaOH에 담가놓은 전극 여과지를 세팅한다. 판에는 IgG클래스의 단일클론성 항체에 담가놓은 시료 어플리케이터 여과지를 세팅하고, 10℃의 온도 및 30W에 일정 전력에서 90분간 전기영동을 행한다. 전기영동 후에, 겔 판을 고정액*에 담가놓고 60분간 방치한다. 겔 표면을 탈색액*으로 헹구고, 60℃의 염색액*중에서 10분간 염색한다. 겔을 탈색액으로 옮기고, 과량의 염색액을 탈색시킨다. 겔을 보존액*에 60분간 담가놓고, 실온에서 밤새 건조시킨 후에 제제를 플래스틱 시이트로 덮어서 보존한다.
단일클론성 항체의 등전점은, 동시에 전기영동시킨 검정용의 공지 pI의 단백질의 이동거리를 기준으로하여 결정한다.
*고정액
메탄올 150ml
증류수 350ml
술포살리실산 17.25g
트리클로로아세트산 57.5g
염색액
쿰마시 브릴리안트블루 R25 0.115g
탈색액 100ml
탈색액
에탄올 500ml
아세트산 160ml
증류수를 가하여 2ℓ로 만든다.
보존액
글리세린 50ml
탈색액 500ml
ⅶ. 단일클론성 항체의 정제
면역글로불린 클래스 IgG1에 속하는 항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체 MPV 10G3을 단백질 A친화 크로마토그래피에 따라 정제한다. 복수를 원심분리하고, 0.45㎛막 필터를 통해 여과하고 100mM 인산염 완충액(pH 9.2)에 대해 투석한다. 동일 완충액으로 평형화한 단백질-A세파로스 컬럼에 넣고 0.1 M아세트산 및 0.14M NaCl로 흡착 IgG1을 용출시킨다. 즉시 적당량의 2M트리스-염산 완충액(pH 9.0)을 가하여 중화시키고, 생성물을 PBS에 대해 투석하여 정제된 단일클론성 항체(IgG1)을 얻는다.
[ 실시예 4 ]
[고정혈구의 제조]
병아리 보존 혈액을 생리식염수중에서 3 내지 5회 원심분리 세척하여(1,500rpm, 5분) 혈청 성분 및 백혈구를 제거한다. 얻어진 적혈구를 PBS에 약 7.5%(w/v)로 현탁시킨다. 1.5% 글라타르 알데히드를 적혈구의 1/10의 양으로 가한 후에, 실온에서 90분간 교반기를 이용하여 천천히 혼합한다. 증류수를 이용하여 5회 이상 원심분리 세척한 후에(상기와 동일한 조건), 생성물을 0.1%아지드화나트륨을 함유하는 증류수에 약 10%로 현탁시킨다. 항체-감작때까지 4℃에서 보존한다. 고정 적혈구는 약 2년간 보존할 수 있다.
글루타르알데히드에 의한 고정 이외에, 포르말린으로 적혈구를 고정하고자 하는 시도를 해보았지만 이들은 고정 후에 서로 응집되어 적혈구를 사용할 수 없다.
[고정 혈구에의 단일클론성 항체의 감작]
0.85%생리식염수와 함께 원심 분리 세척된(2000rpm, 5분) 5%분 병아리 고정 혈구와 125 내지 500㎍/ml의 단일클론성 항체 HBs 11F1(IgG2a)를등량 혼합한다. 나아가, 염화크롬을 12.5 내지 150㎍/ml로 가하고, 혼합물을 교반기를 이용하여 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반한다. 반응후에, 생성물을 0.5% BSA-PBS와 함께(5회) 원심분리 세척하여(2,000rpm, 5분)미흡착 항체를 제거한다. 이렇게 해서 항체-감작 혈구를 제조한다.
이렇게 얻어진 항체-감작 혈구의 HBs 항원에 대한 최소 감출 감도의 측정 결과를 하기에 나타내었다.
Figure kpo00008
IgG타입, 특히 IgG2a타입의 단일클론성 항체로 혈구를 감작시키는 경우에는, 2.5%의 고정 적혈구를 50 내지 150㎍/ml의 염화크롬 존재하에 50 내지 250㎍/ml의 단일클론성 항체로 감작시키면 감도가 높고 비특이 반응이 적은 감작 혈구가 얻어진다. 비슷하게, 고정 혈구를 HBs 22B7(IgM)로 감작하고, 검출 감도를 측정하고 그 결과를 다음에 나타내었다.
Figure kpo00009
이러한 방법으로, IgM타입의 단일클론성 항체로 부터도, 염화크롬법에 의해 고감도의 감작 혈구를 제조할 수 있다.
그러므로, 10 내지 300g/ml의 염화크롬의 존재하에 10 내지 500㎍/ml의 단일클론성 항체로 2.5%고정혈구를 감작함으로써 고감도의 감막 혈구를 제조할 수 있다.
[탄닌산법과의 비교]
탄닌산법에 의해 단일클론성 항체 HBs 18E9(IgG1), HBs 11F1(IgG2a) 및 HBs 22B7(IgM)을 감작시킨다. 5% 병아리 고정 혈구를 PBS와 함께 2회 원심분리 세척한 후에(2,000rpm, 5분), 이것을 5mg/ml탄닌산과 동량 혼합하고 37℃의 수조내에서 10분간 반응시킨다. PBS로 2회 세착한 후에, 생성물을 PBS(pH 6.4)에 2.5%의 농도로 현탁시키고 100㎍/ml 단일클론성 항체와 함께 등량 혼합한다. 실온에서 2시간동안 교반기를 이용하여 천천히 혼합하여 단일클론성 항체를 혈구에 흡착시킨다. 미흡착 항체를 원심분리 세척에 의해 제거하여 항체-감작 혈구를 얻는다. 탄닌법에 의해 얻어진 항체-감작 혈구와 염화크롬법(염화크롬 농도 100㎍/ml, 항체 농도 200㎍/ml)에 의해 얻은 항체-감작 혈구 사이의 HBs 항원의 최소 검출감도를 비교한다.
Figure kpo00010
상기 결과로부터 맹백히 알 수 있듯이, 고정 혈구를 단일클론성 항체로 감작시키는데 있어서, 공지의 탄닌산법 보다는 염화크롬법에 의해서 보다 높은 감도의 항체-감작 혈구가 얻어진다.
[비특이 반응의 억제]
5%의 병아리 고정 혈구를 100㎍/ml의 염화크롬에 용해시킨 항-HBs 단일클론성 IgG(HBs 8Cl 또는 HBs 18E9) 100㎍/ml와 등량 혼합하고, 실온에서 1시간동안 서로 반응시켜 혈구를 항체로 감작시킨다. 나아가 염화크롬 및 항-HBs 단일클론성 IgM(HBs 22B7)을 각각 25㎍/ml 및 20㎍/㎖씩 가하고 1시간 동안 반응시킨다. 이들 혈구를 0.5% BSA-PBS와 함께 5회 원심분리 세척하고(2,000rpm, 5분) 0.5%로 현탁시킨다. 이렇게 해서 항-HBs 단일클론성 항체-감작 혈구를 얻는다.
시험을 위해, 180혈청 시료를 제조한다(HBs 항원 음성, 시판되는 R-PAA시약으로 측정). 마이크로플레이트의 각웰에 0.25%BSA-PBS 25㎕, 상기 혈청 5㎕ 및 상기에서 제조한 감작 혈구 50㎕를 가한다. 1시간 후에 응집을 관찰한다. 결과로서, 180시료중 88개에서 완전한 응집이 관찰되고, 42시료에서는 약한 응집이 관찰되는데 이는 비특이 반응이 강하게 발생하였다는 것을 시사한다.
감작에서 사용된 단일클론성 IgM(HBs 22B7)을 글루타르알데히드로 변성시키고 0.25%BSA-PBS에 10 내지 100㎍/ml로 가한다. 동일한 180시료에서의 비특이 반응의 출현을 비슷하게 관찰하면 비특이 반응이 일어난 시료의 수는 88애서 39로 감소된다.
덧붙여 HBs 항원과 결합할 수 없는 인간 IgM(HIgM 10C9)에 대한 단일클론성 IgM을 10 내지 100㎍/ml로 가하면, 비특이 반응이 23시료로 감소한다.
이어서, 열처리된(60℃, 30분) 항-유행성 이하선염 비루스 단일클론성 항체 MPV 100G3(IgG1)을 10 내지 100㎍/ml로 가하면, 명백한 비특이 반응을 나타내는 시료의 수는 23개에서 13개로 감소된다.
단일클론성 IgM(HBs 22B7)이 항-HBs 항체 활성을 갖기 때문에 이것을 직접 첨가하면 HBs 항원이 중화되고 키트의 감도가 감소된다. 그러므로 항체 활성을 제거하기 위해 변성시킨 후에 가할 필요가 있다. 변성 방법으로는 글루타르알데히드 처리, 2-메르캅토메탄올 처리, 및 열(65℃)처리 등이 이용된다. 이중에서, 0.01 내지 0.1%농도의 글루타르알데히드로 처리하여 변성시키면 항-HBs 항체 활성이 손실되거나 감소되어 비특이 반응-억제 효과도 얻어진다. 다른 방법, 2-메르캅토 에탄올 및 열처리에서는, 항체 활성 뿐만 아니라 비특이 반응-억제효과도 손실되어 효과적인 방법이 못된다.
반응액에 가해지는 IgG1(MPV 10G3)에 대해 열 변성된 물질과 비변성 물질을 비교한다. 류마티스 인자 양성시료에 대한 비특이 반응에 관하여는, 열변성된 물질이 비특이 반응에 대해 더 큰 억제효과를 나타낸다.
[HBs 항원의 측정]
5% 병아리 고정혈구를 100㎍/ml의 염화크롬의 존재하에 100㎍/ml의 항-HBs 단일클론성 IgG(HBs 8Cl 또는 HBs 18E9)와 등량 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켜 항체를 혈구에 대해 감작시킨다. 덧붙여, 25㎍/ml의 염화크롬 및 20㎍/ml의 항-HBs 단일클론성 IgM(22B7)을 가한후, 1시간동안 더 반응시킨다. 이들 혈구를 0.5%BSA-PBS와 함께 5회 원심분리 세척하고, 0.5%로 현탁시켜 HBs 8Cl- 및 HBs 22B7- 감작 혈구 및 HBs 18E9- 및 HBs 22B7-감작 혈구를 얻는다.
0.25%BSA-PBS에 상기 감작에 사용된 글루타르알데히드-변성 단일클론성 항체 HBs 22B7 및 단일클론성 항체 HIgM 10C9를 각각 25㎍/ml씩 가한 후에, 열 변성 단일클론성 항체 MPV 10G3을 50㎍/ml로 가한다.
상기 반응용액을 25㎕씩 마이크로플레이트에 옮기고 5㎕의 시료를 가한다. 덧붙여, 8Cl/22B7-감작 혈구 50㎕, 18E9/22B7-감작 혈구 50㎕, 또는 8Cl/22B7-감작 혈구 및 18E9/22B7-감작 혈구의 당량 혼합물 50㎕를 가하고 1시간후에 응집상을 관찰한다. 결과를 아래에 나타내었다.
Figure kpo00011
어느 경우에든 바람직한 감도가 얻어지고 비특이 반응이 거의 없지만, 다른 두 종류의 감작 혈구를 사용하는 경우에는 비특이 반응이 더 억제된다. 그러므로 8Cl/22B7 및 18E9/22B7의 조합이 최상의 결과를 낳는다.

Claims (36)

  1. 항-HBs 단일클론성 항체 HBs 8C1, HBs 18E9 또는 HBs 22B7.
  2. 제 1 항에 있어서, 하이브리도마 HBs 8C1에 의해 생산되고, HBs의 d-항원을 인지하고, IgG1/k에 속하는 단일 클론성 항체 HBs 8C1.
  3. 제 1 항에 있어서, 하이브리도마 HBs 18E9에 의해 생산되고, HBs의 d-항원을 인지하고, IgG1/k에 속하는 단일 클론성 항체 HBs 18E9.
  4. 제 1 항에 있어서, 하이브리도마 HBs 22B7에 의해 생산되고, HBs의 d-항원을 인지하고, IgM1/k에 속하는 단일 클론성 항체 HBs 22B7.
  5. 제 4 항에 있어서, 글루타르알데히드로 변성시킨 후, 반응용액에 가하면, 항-HBs 단일 클론성 항체로 감작된 혈구를 사용하는 역수신 응집반응에서, 비특이 반응을 억제할 수 있는 단일 클론성 항체 HBs 22B7.
  6. 항-인간 IgM 단일 클론성 항체 HIgM 10C9.
  7. 제 6 항에 있어서, 하이브리도마 HIgM 10C9에 의해 생산되고, IgM/k에 속하는 단일 클론성 항체 HIgM 10C9.
  8. 제 6 항에 있어서, 반응용액에 가하면 항-HBs 단일 클론성 항체로 감작된 혈구를 사용하는 역수신 응집반응에서 비특이 반응을 억제할 수 있는 단일클론성 항체 HIgM 10C9.
  9. 항-유행성 이하선염 비루스 단일 클론성 항체 MPV 10G3.
  10. 제 9 항에 있어서, 하이브리도마 MPV 10G3에 의해 생산되고, IgG1/k에 속하는 단일 클론성 항체 MPV 10G3.
  11. 제 9 항에 있어서, 열변성후 반응용액에 가하면 항-HBs 단일 클론성 항체로 감작된 혈구를 사용하는 역 수신 응집반응에서 비특이 반응을 억제할 수 있는 단일 클론성 항체 MPV 10G3.
  12. 항-HBs 단일 클론성 항체 HBs 8C1을 생산하는 하이브리도마 HBs 8C1.
  13. 항-HBs 단일 클론성 항체 HBs 18E9을 생산하는 하이브리도마 HBs 18E9.
  14. 항-HBs 단일 클론성 항체 HBs 22B7을 생산하는 하이브리도마 HBs 22B7.
  15. 항-인간 IgM 단일 클론성 항체 HIgM 10C9을 생산하는 하이브리도마 HIgM 10G9.
  16. 항-유행성 이하선염 비루스 단일 클론성 항체 MPV 10G3을 생산하는 하이브리도마 MPV 10G3.
  17. 염화 크롬의 존재하에서 항-HBs 단일 클론성 항체로 고정된 혈구를 감작시킴을 특징으로 하는 항-HBs 단일 클론성 항체에 의한 고정된 혈구의 감작 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 고정 혈구를 염화 크롬 5 내지 600㎍/ml의 존재하에서 항-HBs 단일 클론성 항체 5 내지 1000㎍/ml를 이용하여 1 내지 5%의 농도로 감작시키는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 고정 혈구가 글루타르 알데히드로 고정된 병아리 적혈구인 방법.
  20. 제 17 항 내지 19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 항-HBs 단일 클론성 IgG 및 항-HBs 단일 클론성 IgM으로 감작된 고정 혈구.
  21. 제 20 항에 있어서, 항-HBs 단일 클론성 IgM이 HBs 22B7이고, 항-HBs 단일클론성 IgG가 HBs 8C1 또는 HBs 18E9인 고정 혈구.
  22. 제 20 항에 있어서, 고정 혈구가 글루타르 알데히드로 고정된 병아리 적혈구인 고정 혈구.
  23. 변성후 반응용액에 감작에서 사용된 항-HBs 단일 클론성 항체를 가하고 또한 필요하다면, HBs 이외의 다른 항원에 대한 변성 및/또는 비변성 단일 클론성 항체를 가함을 특징으로 하는 항-HBs 단일 클론성 항체로 감작된 고정 혈구를 사용하는 역수신 응집반응에서 비특이 반응의 억제 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 항-HBs 단일 클론성 항체가 IgM에 속하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 항-HBs 단일 클론성 항체가 HBs 22B7이고 글루타르알데히드로 변성된 HBs 22B7을 반응용액에 가하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 고정 혈구를 감작시킨 항-HBs 단일 클론성 항체가 IgG 및 IgM이고, IgM을 변성시켜 반응용액에 가하는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, IgG가 HBs 8C1 및/또는 HBs 18E9이고, IgM이 HBs 22B7이고, 글루타르알데히드로 변성된 HBs 22B7을 반응용액에 가하는 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 두 타입의 고정 혈구를 사용하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 두 타입의 고정 혈구가 HBs 8C1 및 HBs 22B7로 감작된 혈구 및 HBs 18E9 및 HBs 22B7로 감작된 혈구이며, 글루타르알데히드로 변성된 HBs 22B7을 반응용액에 가하는 방법.
  30. 제 23 항에 있어서, HBs 외의 다른 항원에 대한 단일 클론성 항체가 IgG 및/또는 IgM인 방법.
  31. 제 23 항에 있어서, HBs 외의 다른 항원에 대한 단일 클론성 항체가 항-인간 IgM 단일 클론성 항체 및/또는 항-유행성 이하선염 비루스 단일 클론성 항체인 방법.
  32. 제 23 항에 있어서, HBs 외의 다른 항원에 대한 단일 클론성 항체가 비변성된 HIgM 10C9 및/또는 열변성된 MPV 10G3인 방법.
  33. 제 23 항에 있어서, 각각의 단일 클론성 항체를 반응용액에 1 내지 100㎍/ml로 가하는 방법.
  34. 제 23 항에 있어서, 고정 혈구가 글루타르알데히드로 고정된 병아리 적혈구인 방법.
  35. 제 23 항에 있어서, 감작을 염화 크롬의 존재하에서 수행하는 방법.
  36. 제 23 항 내지 35 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 비특이 반응이 억제된, 제 20 항 내지 22 항 중 어느 한 항의 고정 혈구를 사용하는 역수신 응집반응에서 HBs 항원의 측정방법.
KR1019880010566A 1987-08-19 1988-08-19 HBs항원 측정을 위한 방법, 하이브리도마, 단일클론성 항체 및 감작 혈구 KR940010308B1 (ko)

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JP20595587 1987-08-19
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