JP3071678B2 - 免疫反応用緩衝液 - Google Patents
免疫反応用緩衝液Info
- Publication number
- JP3071678B2 JP3071678B2 JP7248523A JP24852395A JP3071678B2 JP 3071678 B2 JP3071678 B2 JP 3071678B2 JP 7248523 A JP7248523 A JP 7248523A JP 24852395 A JP24852395 A JP 24852395A JP 3071678 B2 JP3071678 B2 JP 3071678B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- buffer
- immunoreaction
- antifoaming agent
- surfactant
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘテロジーニアス
酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液に発生する泡の
抑泡に関する。
酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液に発生する泡の
抑泡に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、生物体液中の物質を測定するため
に免疫測定法が知られている。免疫測定法のきわめて重
要な方法の一つはヘテロジーニアス免疫測定法である。
ヘテロジーニアス免疫測定法としては、放射線免疫測定
法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測
定法が知られている。この中でも酵素免疫測定法は長期
の保存安定性が優れており、測定法が簡便かつ汎用性が
あり、高感度であることから、近年急速に普及してい
る。ヘテロジーニアス酵素免疫法では、文献［たとえ
ば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書
院）１９８２年］記載のサンドウィッチ法や競合法など
が広く用いられている。これらの方法では、抗体又は抗
原が結合した不溶性固体と被検体液や酵素標識物質を反
応させる際、免疫反応用緩衝液を用いる。ヘテロジーニ
アス酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液の組成は、
リン酸緩衝液などにウシ血清アルブミンや抗体などの蛋
白質、塩化ナトリウムなどの無機塩を含有させたものが
知られている。これらの組成物に加え、免疫反応に用い
る酵素標識物質や被検体液中の共存物質などの非特異的
な吸着を防止するための方法として界面活性剤を免疫反
応緩衝液に共存させる方法が特開昭５８−１８７８６２
号公報に記載されている。
に免疫測定法が知られている。免疫測定法のきわめて重
要な方法の一つはヘテロジーニアス免疫測定法である。
ヘテロジーニアス免疫測定法としては、放射線免疫測定
法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測
定法が知られている。この中でも酵素免疫測定法は長期
の保存安定性が優れており、測定法が簡便かつ汎用性が
あり、高感度であることから、近年急速に普及してい
る。ヘテロジーニアス酵素免疫法では、文献［たとえ
ば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書
院）１９８２年］記載のサンドウィッチ法や競合法など
が広く用いられている。これらの方法では、抗体又は抗
原が結合した不溶性固体と被検体液や酵素標識物質を反
応させる際、免疫反応用緩衝液を用いる。ヘテロジーニ
アス酵素免疫測定法に用いる免疫反応緩衝液の組成は、
リン酸緩衝液などにウシ血清アルブミンや抗体などの蛋
白質、塩化ナトリウムなどの無機塩を含有させたものが
知られている。これらの組成物に加え、免疫反応に用い
る酵素標識物質や被検体液中の共存物質などの非特異的
な吸着を防止するための方法として界面活性剤を免疫反
応緩衝液に共存させる方法が特開昭５８−１８７８６２
号公報に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、界面活
性剤を共存させた免疫反応用緩衝液を用いたヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法で免疫反応を行う際、正確な測定
値が得られないという問題が生じる。
性剤を共存させた免疫反応用緩衝液を用いたヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法で免疫反応を行う際、正確な測定
値が得られないという問題が生じる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、ヘテロジーニアス酵素
免疫測定法用の免疫反応緩衝液に消泡剤を共存させるこ
とにより、より精度の優れた酵素免疫測定が可能となる
ことを見いだし、本発明に到達した。
を解決すべく鋭意検討した結果、ヘテロジーニアス酵素
免疫測定法用の免疫反応緩衝液に消泡剤を共存させるこ
とにより、より精度の優れた酵素免疫測定が可能となる
ことを見いだし、本発明に到達した。
【０００５】即ち本発明は、ヘテロジーニアス酵素免疫
測定法用の免疫反応用緩衝液において、測定に供する前
の免疫反応用緩衝液に予め消泡剤とＨＬＢが１２以上の
界面活性剤を含有させてなることを特徴とする免疫反応
用緩衝液；並びに、抗体または抗原が結合した不溶性固
体と被検体液や酵素標識物質を、免疫反応用緩衝液を用
いて反応させるヘテロジーニアス酵素免疫測定法におい
て、測定に供する前の該緩衝液中に予め消泡剤とＨＬＢ
が１２以上の界面活性剤を含有させておくことを特徴と
する測定法。
測定法用の免疫反応用緩衝液において、測定に供する前
の免疫反応用緩衝液に予め消泡剤とＨＬＢが１２以上の
界面活性剤を含有させてなることを特徴とする免疫反応
用緩衝液；並びに、抗体または抗原が結合した不溶性固
体と被検体液や酵素標識物質を、免疫反応用緩衝液を用
いて反応させるヘテロジーニアス酵素免疫測定法におい
て、測定に供する前の該緩衝液中に予め消泡剤とＨＬＢ
が１２以上の界面活性剤を含有させておくことを特徴と
する測定法。
【０００６】本発明において消泡剤としては、文献［新
・界面活性剤入門（三洋化成工業株式会社発行）P.183-
188(1981)］記載の使用する免疫測定用緩衝液に不溶性
ないし難溶性のシリコーン系消泡剤や有機極性化合物系
消泡剤を用いることができる。これらのうち好ましいも
のは、ジメチルポリシロキザンを主成分とするエマルジ
ョン型シリコーン系消泡剤である。共存させる消泡剤の
濃度は、通常０．００１〜０．１ｗ／ｖ ％ 、好ましく
は０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％である。
・界面活性剤入門（三洋化成工業株式会社発行）P.183-
188(1981)］記載の使用する免疫測定用緩衝液に不溶性
ないし難溶性のシリコーン系消泡剤や有機極性化合物系
消泡剤を用いることができる。これらのうち好ましいも
のは、ジメチルポリシロキザンを主成分とするエマルジ
ョン型シリコーン系消泡剤である。共存させる消泡剤の
濃度は、通常０．００１〜０．１ｗ／ｖ ％ 、好ましく
は０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％である。
【０００７】界面活性剤としては、水溶性の非イオン界
面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤を
用いることができる。これらのうち好ましいものは、Ｈ
ＬＢが１２以上のポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレンオクチルエーテルなどのポ
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪族エステルであり、使用する免疫測定
用緩衝液に１０ｗ／ｖ％以上溶解するものである。共存
させる界面活性剤の濃度は、通常０．０１〜５．０ｗ／
ｖ％、好ましくは０．１〜１．０ｗ／ｖ％である。
面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤を
用いることができる。これらのうち好ましいものは、Ｈ
ＬＢが１２以上のポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレンオクチルエーテルなどのポ
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪族エステルであり、使用する免疫測定
用緩衝液に１０ｗ／ｖ％以上溶解するものである。共存
させる界面活性剤の濃度は、通常０．０１〜５．０ｗ／
ｖ％、好ましくは０．１〜１．０ｗ／ｖ％である。
【０００８】ヘテロジーニアス酵素免疫測定法として
は、文献［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治
ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドウィッチ
法、競合法や特開平６−１３００６３号公報記載の測定
法を用いることができる。サンドウィッチ法は、被検体
液中の測定の対象となる抗原性物質に不溶性固体と結
合しており、且つこの抗原性物質を認識する抗体酵素
により標識されており、且つこの抗原性物質を認識する
抗体を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定
することにより抗原性物質の量を測定する方法である。
競合法は、被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に
不溶性固体と結合しており且つこの抗原性物質を認識
する抗体酵素により標識されている抗原性物質を結合
させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定することに
より抗原性物質の量を測定する方法、又は、不溶性固
体と結合した抗原性物質酵素により標識されており且
つこの抗原性物質を認識する抗体を結合させて得た免疫
複合体中の酵素の活性を測定することにより抗原性物質
の量を測定する方法である。
は、文献［たとえば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治
ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドウィッチ
法、競合法や特開平６−１３００６３号公報記載の測定
法を用いることができる。サンドウィッチ法は、被検体
液中の測定の対象となる抗原性物質に不溶性固体と結
合しており、且つこの抗原性物質を認識する抗体酵素
により標識されており、且つこの抗原性物質を認識する
抗体を結合させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定
することにより抗原性物質の量を測定する方法である。
競合法は、被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に
不溶性固体と結合しており且つこの抗原性物質を認識
する抗体酵素により標識されている抗原性物質を結合
させて得た免疫複合体中の酵素の活性を測定することに
より抗原性物質の量を測定する方法、又は、不溶性固
体と結合した抗原性物質酵素により標識されており且
つこの抗原性物質を認識する抗体を結合させて得た免疫
複合体中の酵素の活性を測定することにより抗原性物質
の量を測定する方法である。
【０００９】ヘテロジーニアス酵素免疫測定法で対象と
なる抗原性物質としては、特開平２−２０５７７４号公
報記載の被測定抗原性物質があげられる。これらのう
ち、特に高感度の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関
連抗原及びウイルスの測定に本発明の測定法は好適であ
る。ヘテロジーニアス酵素免疫測定法に用いる抗体とし
ては、測定の対象となる抗原性物質を認識するモノクロ
ーナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれも用い
ることができる。
なる抗原性物質としては、特開平２−２０５７７４号公
報記載の被測定抗原性物質があげられる。これらのう
ち、特に高感度の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関
連抗原及びウイルスの測定に本発明の測定法は好適であ
る。ヘテロジーニアス酵素免疫測定法に用いる抗体とし
ては、測定の対象となる抗原性物質を認識するモノクロ
ーナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれも用い
ることができる。
【００１０】不溶性固体としては、特開平２−２０５７
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管など）、及びプラスチック（プラスチックチュー
ブ、プラスチックトレイなど）である。
【００１１】不溶性固体上に抗体を結合させる方法は、
特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様でよ
い。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合
させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号明
細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラスチ
ックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・エ
ングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン；
バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.Jons-
son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),Vol.251(1971)4
27〜434）がある。
特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様でよ
い。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合
させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号明
細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラスチ
ックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・エ
ングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン；
バイオキム．バイオフィス．アクタ(E.Engvall,J.Jons-
son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta),Vol.251(1971)4
27〜434）がある。
【００１２】抗体に標識する酵素としては、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼなどをあげられる。このうち好ましいものは、抗体
標識が容易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダー
ゼである。
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼなどをあげられる。このうち好ましいものは、抗体
標識が容易で、且つ高い感度が得られるペルオキシダー
ゼである。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ 消泡剤を含有する免疫反応緩衝液を用いたＣＡ１９−９
酵素免疫測定試薬（サンドウィッチ法）の同時再現性試
験をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル
ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Stepl
ewski,KennethMitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell
Genetics）Vol.5,pp.957-972(1979)］に記載の方法に
準じ次の通り製造した。ＳＷ１１１６細胞（大日本製薬
社から入手可能）1x106個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈
内に投与し免疫した。１ヶ月後に再びＳＷ１１１６細胞
1x106 個を投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採
取した。ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエ
チレングリコール１５４０および７．５％ジメチルスル
フォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ１６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９
６ウェル マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｇクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を産生す
る細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養し、培
養上清液を採取した。この培養液中のモノクローナル抗
体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキット（バ
イオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用い
た。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ 消泡剤を含有する免疫反応緩衝液を用いたＣＡ１９−９
酵素免疫測定試薬（サンドウィッチ法）の同時再現性試
験をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル
ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Stepl
ewski,KennethMitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell
Genetics）Vol.5,pp.957-972(1979)］に記載の方法に
準じ次の通り製造した。ＳＷ１１１６細胞（大日本製薬
社から入手可能）1x106個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈
内に投与し免疫した。１ヶ月後に再びＳＷ１１１６細胞
1x106 個を投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採
取した。ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエ
チレングリコール１５４０および７．５％ジメチルスル
フォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ１６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９
６ウェル マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｇクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を産生す
る細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養し、培
養上清液を採取した。この培養液中のモノクローナル抗
体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキット（バ
イオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用い
た。
【００１４】ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体結
合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体をコーティ
ングした。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体の作製 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,
et.al.;J.Biochem.),Vol.92(1982) 1413-1424］に記載
の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を得た。この
試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００倍に希釈
して使用した。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調製 ＳＷ１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上清液
中のＣＡ１９−９濃度をグラオザイムＣＡ１９−９（三
洋化成工業株式会社）を用いて測定し、濃度が３０、６
０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌなるように１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。
合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体をコーティ
ングした。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体の作製 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,
et.al.;J.Biochem.),Vol.92(1982) 1413-1424］に記載
の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を得た。この
試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００倍に希釈
して使用した。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調製 ＳＷ１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上清液
中のＣＡ１９−９濃度をグラオザイムＣＡ１９−９（三
洋化成工業株式会社）を用いて測定し、濃度が３０、６
０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌなるように１％牛血清アル
ブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。
【００１５】（２）免疫反応用緩衝液の作製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．１Ｗ／Ｖ％ノニポー
ル１００（三洋化成工業株式会社）含有０．０２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．２）にエマルジョン型シリコーン消
泡剤 アンチホームＡＦエマルジョン（ダウコーニング
社）を０．００５Ｗ／Ｖ％、０．０１Ｗ／Ｖ％、０．０
５Ｗ／Ｖ％、０．１Ｗ／Ｖ％の濃度になるように添加し
た免疫反応用緩衝液および消泡剤無添加の免疫反応用緩
衝液をそれぞれ作製した。 （３）同時再現性試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、免疫反応用緩衝液４５
０μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクローナル
抗体結合ガラスビーズを１個入れエアーバブリングしな
がらインキュベーション（３７℃、１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキ
シダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体含有免
疫反応用緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、エアーバ
ブリングしながらインキュベーション（３７℃、１５分
間）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルトーフェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、エアーバブリ
ングしながらインキュベーション（３７℃、１５分間）
したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反応を
停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、ビー
ズに結合した酵素の酵素活性を測定した。ＣＡ１９−９
標準溶液０、３０、６０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌの吸
光度から検量線を得た。被検試料を２０回測定し検量線
から濃度を読み取り、平均値と変動係数を算出した。そ
れぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結果を表１に示
した。
ル１００（三洋化成工業株式会社）含有０．０２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．２）にエマルジョン型シリコーン消
泡剤 アンチホームＡＦエマルジョン（ダウコーニング
社）を０．００５Ｗ／Ｖ％、０．０１Ｗ／Ｖ％、０．０
５Ｗ／Ｖ％、０．１Ｗ／Ｖ％の濃度になるように添加し
た免疫反応用緩衝液および消泡剤無添加の免疫反応用緩
衝液をそれぞれ作製した。 （３）同時再現性試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、免疫反応用緩衝液４５
０μｌを入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モノクローナル
抗体結合ガラスビーズを１個入れエアーバブリングしな
がらインキュベーション（３７℃、１５分間）したの
ち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキ
シダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体含有免
疫反応用緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、エアーバ
ブリングしながらインキュベーション（３７℃、１５分
間）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したの
ち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルトーフェニ
レンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、エアーバブリ
ングしながらインキュベーション（３７℃、１５分間）
したのち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反応を
停止した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、ビー
ズに結合した酵素の酵素活性を測定した。ＣＡ１９−９
標準溶液０、３０、６０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌの吸
光度から検量線を得た。被検試料を２０回測定し検量線
から濃度を読み取り、平均値と変動係数を算出した。そ
れぞれの免疫反応用緩衝液を用いた時の結果を表１に示
した。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例２ 消泡剤を含有する免疫反応緩衝液を用いたβ2-マイクロ
グロブリンの酵素免疫測定試薬（競合法）の同時再現性
試験をおこなった。 （１）β2-マイクログロブリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズの
作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗β2-マイクログロブリンポリクローナル抗体
（ダコ社）をコーティングした。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンの作
製 β2-マイクログロブリンに文献［ナカネ・ピー・ケイ、
カワオイ・エイ；ジェイ．ヒストケム．サイトケム(NAK
ANE,P.K.,KAWAOI,A.;J.Histochem.Cytochem.),Vol.22(1
974) 1084］記載の方法にてペルオキシダーゼを結合
し、ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンを得
た。この試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００
倍に希釈して使用した。 ｃ）β2-マイクログロブリン標準溶液の調製 ヒトβ2-マイクログロブリン（ゼルコ社）を１Ｗ／Ｖ％
牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で、濃度が１、２、４、８ｍｇ／Ｌとなるよう
に希釈した。
グロブリンの酵素免疫測定試薬（競合法）の同時再現性
試験をおこなった。 （１）β2-マイクログロブリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズの
作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗β2-マイクログロブリンポリクローナル抗体
（ダコ社）をコーティングした。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンの作
製 β2-マイクログロブリンに文献［ナカネ・ピー・ケイ、
カワオイ・エイ；ジェイ．ヒストケム．サイトケム(NAK
ANE,P.K.,KAWAOI,A.;J.Histochem.Cytochem.),Vol.22(1
974) 1084］記載の方法にてペルオキシダーゼを結合
し、ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンを得
た。この試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００
倍に希釈して使用した。 ｃ）β2-マイクログロブリン標準溶液の調製 ヒトβ2-マイクログロブリン（ゼルコ社）を１Ｗ／Ｖ％
牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で、濃度が１、２、４、８ｍｇ／Ｌとなるよう
に希釈した。
【００１８】（２）免疫反応用緩衝液の作製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．５Ｗ／Ｖ％オクタポ
ール１００（三洋化成工業株式会社）含有０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にエマルジョン型シリコーン
消泡剤 アンチホームＤＢ−１１０Ｎエマルジョン（ダ
ウコーニング社）を０．００５Ｗ／Ｖ％、０．０１Ｗ／
Ｖ％、０．０５Ｗ／Ｖ％、０．１Ｗ／Ｖ％の濃度になる
ように添加した免疫反応用緩衝液および消泡剤無添加の
免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製した。 （３）同時再現性試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識
β2-マイクログロブリン含有免疫反応用緩衝液４５０μ
ｌを入れた試験管に抗β2-マイクログロブリン抗体結合
ガラスビーズを１個入れエアーバブリングしながらイン
キュベーション（３７℃、１５分間）した。生理食塩水
にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化
水素含有オルトーフェニレンジアミン溶液）５００μｌ
中に移し、エアーバブリングしながらインキュベーショ
ン（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶
液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍ
の吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を
測定した。β2-マイクログロブリン標準溶液０、１、
２、４、８ｍｇ／Ｌの吸光度から検量線を得た。被検試
料を２０回測定し検量線から濃度を読み取り、平均値と
変動係数を算出した。それぞれの免疫反応用緩衝液を用
いた時の結果を表２に示した。
ール１００（三洋化成工業株式会社）含有０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にエマルジョン型シリコーン
消泡剤 アンチホームＤＢ−１１０Ｎエマルジョン（ダ
ウコーニング社）を０．００５Ｗ／Ｖ％、０．０１Ｗ／
Ｖ％、０．０５Ｗ／Ｖ％、０．１Ｗ／Ｖ％の濃度になる
ように添加した免疫反応用緩衝液および消泡剤無添加の
免疫反応用緩衝液をそれぞれ作製した。 （３）同時再現性試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識
β2-マイクログロブリン含有免疫反応用緩衝液４５０μ
ｌを入れた試験管に抗β2-マイクログロブリン抗体結合
ガラスビーズを１個入れエアーバブリングしながらイン
キュベーション（３７℃、１５分間）した。生理食塩水
にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化
水素含有オルトーフェニレンジアミン溶液）５００μｌ
中に移し、エアーバブリングしながらインキュベーショ
ン（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫酸水溶
液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９２ｎｍ
の吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を
測定した。β2-マイクログロブリン標準溶液０、１、
２、４、８ｍｇ／Ｌの吸光度から検量線を得た。被検試
料を２０回測定し検量線から濃度を読み取り、平均値と
変動係数を算出した。それぞれの免疫反応用緩衝液を用
いた時の結果を表２に示した。
【００１９】
【表２】
【００２０】本発明の免疫反応用緩衝液は、免疫反応時
にバブリングや振とう攪拌を行った場合でも泡がほとん
ど発生せず、バラツキの少ない正確な測定値を得ること
ができる。以上の点から、本発明は、すべてヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法に応用でき、特に高感度の測定系
が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイルスの測
定に有用である。
にバブリングや振とう攪拌を行った場合でも泡がほとん
ど発生せず、バラツキの少ない正確な測定値を得ること
ができる。以上の点から、本発明は、すべてヘテロジー
ニアス酵素免疫測定法に応用でき、特に高感度の測定系
が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイルスの測
定に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/543
Claims (5)
- 【請求項１】 ヘテロジーニアス酵素免疫測定法用の免
疫反応用緩衝液において、測定に供する前の免疫反応用
緩衝液に予め消泡剤とＨＬＢが１２以上の界面活性剤を
含有させてなることを特徴とする免疫反応用緩衝液。 - 【請求項２】 消泡剤がシリコーン系消泡剤である請求
項１記載の免疫反応用緩衝液 - 【請求項３】 界面活性剤がポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪族エステルから
なる群より選ばれる界面活性剤である請求項１または２
記載の免疫反応用緩衝液。 - 【請求項４】 消泡剤の濃度が０．００１〜０．１ｗ／
ｖ％であり、界面活性剤の濃度が０．０１〜５．０ｗ／
ｖ％である請求項１〜３のいずれか記載の免疫反応用緩
衝液。 - 【請求項５】 抗体または抗原が結合した不溶性固体と
被検体液や酵素標識物質を、免疫反応用緩衝液を用いて
反応させるヘテロジーニアス酵素免疫測定法において、
測定に供する前の該緩衝液中に予め消泡剤とＨＬＢが１
２以上の界面活性剤を含有させておくことを特徴とする
測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7248523A JP3071678B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫反応用緩衝液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7248523A JP3071678B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫反応用緩衝液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0968529A JPH0968529A (ja) | 1997-03-11 |
| JP3071678B2 true JP3071678B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=17179459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7248523A Expired - Fee Related JP3071678B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 免疫反応用緩衝液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3071678B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19742775B4 (de) * | 1997-09-27 | 2005-03-17 | Wolfhard Zittwitz | Einschlußmittel |
| KR101665999B1 (ko) * | 2008-08-22 | 2016-10-13 | 덴카 세이켄 가부시키가이샤 | 시스타틴 ｃ 흡착 억제제 |
| KR101826367B1 (ko) | 2009-11-30 | 2018-02-06 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | 균질 측정법 및 측정 시약 |
| WO2011125912A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | 積水メディカル株式会社 | 測定系外成分による干渉を低減させる方法 |
| CN116027019B (zh) * | 2022-12-23 | 2023-10-03 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种用于化学发光免疫分析的添加剂及其用途 |
-
1995
- 1995-08-31 JP JP7248523A patent/JP3071678B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0968529A (ja) | 1997-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107817354A (zh) | 一种白介素6的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| US4427781A (en) | Particle agglutination immunoassay with agglutinator for determining haptens; PACIA | |
| JPS6053846A (ja) | 免疫反応の成分を測定する方法及び試薬 | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| US4900685A (en) | Analyte detection in particulate-containing samples | |
| US4452903A (en) | Assay method and reagent kit means for lipid-containing body fluid | |
| JP3071678B2 (ja) | 免疫反応用緩衝液 | |
| EP0661540B1 (en) | Method for measuring free testosterone in biological fluids | |
| JPH03502248A (ja) | アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 | |
| EP0687910B1 (en) | Test kit and method for competitive specific binding assay | |
| WO1999060401A1 (fr) | Immunoreactifs et procede de dosage immunologique | |
| Rush et al. | Solid-phase radioimmunoassay on polystyrene beads and its application to dopamine-β-hydroxylase | |
| CN102369441A (zh) | 免疫分析方法及用于该方法的试剂 | |
| JP2932837B2 (ja) | ヒトポドカリキシンの測定方法 | |
| EP0685740B1 (en) | Separation-free specific binding assays using anti-inhibitor antibodies | |
| JP3228791B2 (ja) | 検体中の抗原又は抗体の測定法 | |
| JPH03170058A (ja) | イムノアッセイ用試薬複合体 | |
| Tsugawa et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate (cGMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody | |
| JPS60249058A (ja) | Ａｔｌウイルス抗体の測定方法および試薬 | |
| Tsugawa et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for adenosine 3′, 5′-cyclic monophosphate (cAMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody | |
| AU646738B2 (en) | Denatured vehicular proteins to improve enzyme linked immunosorbent assays | |
| US5916757A (en) | Specific binding assay using enzyme inhibitor and anti-inhibitor antibodies | |
| JPH0968531A (ja) | 免疫測定法 | |
| JP4585708B2 (ja) | 複合体を形成する物質の測定方法及び測定試薬 | |
| JPH11248703A (ja) | 遊離ハプテンの免疫学的測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090526 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |