ES2356382T3 - Métodos de detección de enfermedades renales tempranas en animales. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un animal que tiene enfermedad renal temprana o riesgo de desarrollar la enfermedad renal en fase final, dicho método comprendiendo la determinación de la cantidad de albúmina en una muestra de orina obtenida del animal, donde una cantidad de albúmina en un rango desde unos 10 μg/ml a unos 300 μg/ml en la muestra de orina, cuando el peso especifica de la muestra es normalizado a 1.010 g/ml, es indicativa de un animal que tiene la enfermedad renal temprana o esta en riesgo de enfermedad renal en su fase final, donde el animal es seleccionado del grupo que consiste de cánidos, félidos y équidos.
Description
Métodos de detección de enfermedades renales
tempranas en animales.
La presente invención se refiere a la detección
de la enfermedad renal temprana en animales, y más particularmente
a la utilización de la microalbuminuria como marcador de la
enfermedad renal temprana.
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La enfermedad glomerular es un término amplio
utilizado para describir un número de enfermedades renales que
puedan conducir a insuficiencia renal y la muerte. El daño al
glomérulo incrementa la permeabilidad capilar a proteínas tales
como la albúmina, que resultan en la presencia de proteínas en la
orina (referido como proteinuria).
En humanos, la proteinuria puede resultar de un
número de enfermedades, incluyendo diabetes, hipertensión y
nefropatía por IgA. La prueba convencional de proteinuria en seres
humanos es utilizar un análisis de la proteína de tira reactiva
normal como se describe, por ejemplo, en Bakris, Curr. Opin. en
Neph. y Hipertensión, 5:219-223 (1996). Las tiras
reactivas que son químicamente impregnadas con ácido sulfosalicilico
para medir proteínas en una muestra están disponibles
comercialmente, por ejemplo de Boehringer-Mannheim,
Germany (Chemstrips^{TM}) y Ames Co., USA (Albustix^{TM}). Un
inconveniente de estos ensayos de tiras reactivas es que requieren
una cantidad significativa de proteína en la orina para ser
detectada. Cantidades de proteínas en seres humanos de menos de 300
miligramos por día no son detectables por el análisis de tira
reactiva, sin embargo, la proteinuria puede estar aun presente.
Otro inconveniente de estos ensayos a base de proteínas es que son
incapaces de discriminar entre diferentes tipos de proteínas (ej.,
albúmina, globulina, etc.) que pueden estar presentes en la orina.
La proteinuria puede resultar de la fuga de proteínas séricas en
filtrado glomerular debido a glomerulernefritis; sin embargo, la
proteinuria puede también estar presente debido a problemas no
relacionados con enfermedad renal tales como infecciones de la
vejiga o una dieta alta en proteínas.
Cantidades mas bajas de albúmina en la orina, a
lo que se hace referencia como "microalbuminuria", indican un
nivel de albúmina que es mayor que en los pacientes normales, pero
menor que en los pacientes con proteinuria franca, i.e.,
clínicamente proteinuricos. En seres humanos, microalbuminuria se
refiere a cantidades de albúmina entre 30 miligramos por día y 300
miligramos por día según Watts, Clin. Chem.,
32(8):1544-1548 (1986). Los métodos para
detectar microalbuminuria humana son conocidos e incluyen métodos
que utilizan un anticuerpo de albúmina anti-humano
para detectar cantidades de albúmina humana que no son detectables
por métodos conocidos de tiras reactivas. Tales métodos para la
detección de microalbuminuria humana son descritos, por ejemplo, en
la Patente U.S. No. 5,246,835, publicado el 21 de septiembre de 1993
a Suzuki et al.
Aunque la microalbuminuria puede ser detectada
en humanos, la utilidad de detectar microalbuminuria en humanos
puede ser muy limitada, al menos según algunos informes. Por
ejemplo, utilizar las pruebas de microalbuminuria para predecir la
enfermedad renal solo ha sido recomendado para los seres humanos con
diabetes según Bakris, supra. Dado que los trastornos
distintos de la diabetes, como la hipertensión, enfermedad cardíaca
y la neuropatía IgA no dan lugar a la microalbuminuria consistente
en seres humanos, según Bakris, supra, la detección de
microalbuminuria tiene un valor predictivo pobre para la enfermedad
renal mas avanzada asociada con estos estados de trastornos no
diabéticos. En consecuencia, usar pruebas de microalbuminuria para
detectar el potencial o la enfermedad renal temprana en pacientes
humanos no diabéticos es generalmente no recomendado por Bakris,
supra.
La enfermedad renal es también un problema de
salud significativa en animales de compañía, en particular perros y
gatos. En perros, la causa primaria de la enfermedad renal es el
daño a los glomérulos del riñón. Aunque el daño glomerular en
perros puede ocurrir en cualquier numero de formas, es mas
comúnmente causado cuando complejos inmunes circulantes (i.e.,
anticuerpos/complejos antígeno) son depositados en los capilares
glomerular como consecuencia de una enfermedad sistemática como se
describe en Batamuzi, et al., Vet Record, 143;
16-20 (1988). Varias enfermedades han sido
implicadas en la patogénesis de la formación e complejos inmunes,
que incluyen por ejemplo, dirofilariosis y otras infecciones
parasitarias, diabetes, hipotiroidismo y otros.
La enfermedad renal temprana en la medicina
veterinaria ha sido caracterizado por cambios glomerulares
detectable por histopatología, que incluyen el uso de microcopia de
luz o en ocasiones inmunofluorescencia como se reporta en Vaden,
Proc. 17th ACVIM, 420 (1999). Sin embargo, según se informa en ese
documento, estas técnicas pueden conducir a errores de diagnostico
de la causa de la enfermedad renal. La determinación de la causa de
la enfermedad renal es útil en la formulación de un régimen de
tratamiento adecuado. Por ejemplo, si la causa de la enfermedad
renal es inmune mediada, entonces la terapia inmunosupresora puede
ser adecuada. Sin embargo, ensayos disponibles actualmente para
detectar la microalbuminuria humana no son lo suficientemente
sensibles para detectar la microalbuminuria canina.
WO 00/37944 describe un método para la detección
y tratamiento de la enfermedad renal.
\newpage
EP 0 198 639 se refiere a un método para la
determinación de la albúmina.
Así, existe la necesidad de ensayos para
detectar la enfermedad renal temprana en animales de compañía. La
presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas
relacionadas.
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La presente invención se refiere a un método
para la detección de la enfermedad renal temprana en cánidos,
felinos y equinos. Los animales preferidos para la prueba de la
enfermedad renal temprana son los perros, gatos y caballos.
Realizaciones de método descritas en este documento están basadas en
el descubrimiento de que la presencia de albúmina en una muestra de
una animal, en el rango de 10 \mug/ml a 300 \mug/ml puede ser
usada como un indicador de la enfermedad renal temprana. La muestra
a probar es una muestra de orina.
Cualquier ensayo capaz de detectar albúmina
puede ser utilizada en el método instantáneo aunque métodos
preferidos emplean ensayos basados inmunologicamente,
preferiblemente ensayos de un solo paso. El ensayo de mayor
preferencia es un ensayo basado inmunologicamente que utiliza un
anticuerpo anti-albúmina.
Cualquier anticuerpo que se una a la albúmina
del animal experimentado puede ser utilizado; anticuerpos preferidos
se unen a la albúmina canina y/o albúmina felina y/o albúmina
equina. Anticuerpos preferidos son TNB1, TNB3, TNB4, TNB5, TNB6,
H352, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H393, H394, H395, H396,
H397, H398, H399, H400, H401, y H402. Células cultivadas producen
anticuerpos adecuados para la práctica de la siguiente
invención.
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención generalmente se refiere a
un método nuevo en la detección de la enfermedad renal temprana en
cánidos, felinos y equinos y para el uso en el de nuevos anticuerpos
que selectivamente se unen a la albúmina de uno o más especies de
animales. Mas particularmente, la presente invención se refiere al
descubrimiento de que la presencia de microalbuminuria puede ser
usada para predecir la enfermedad renal temprana en cánidos,
felinos y equinos, particularmente las enfermedades renales
autoinmunes. Por lo tanto, los métodos pueden también ser útiles
para la prescripción de un tratamiento para un animal. Un
tratamiento adecuado puede ser diseñado para retrasar o prevenir la
aparición de la última etapa de la enfermedad renal. Ejemplos de tal
tratamiento incluyen, por ejemplo, modificación farmacológica o de
la dieta. La presente invención es también útil en el monitoreo de
la efectividad de un tratamiento prescrito. La invención proporciona
un método según la reivindicación 1. Una cantidad de albúmina en un
rango de unos 10 \mug/ml a unos 300 \mug/ml en la muestra es
indicativa de la enfermedad renal
temprana.
temprana.
Debe notarse que el término "una" entidad
se refiere a uno o mas de esa entidad. Por ejemplo, una proteína se
refiere a una o mas proteínas o al menos una proteína. Como tal, los
términos "un" "uno o mas" y "al menos uno" pueden
usarse indistintamente en este documento. Los términos "que
comprende" "que incluye" y "que tiene" pueden también
usarse indistintamente. En adición, los términos "cantidad" y
"nivel" son también intercambiables y pueden usarse para
describir una concentración o una cantidad especifica. Además, el
termino "seleccionado del grupo consistente de" se refiere a
uno o mas miembros del grupo en la lista que sigue, que incluye
mezclas (i.e., combinaciones) de dos o mas miembros.
Como se usa en este documento, el termino
"enfermedad renal" es definido como una disfunción del proceso
de filtración glomerular. La disfunción glomerular puede ser
transitoria o puede ser crónica, dependiendo de la causa subyacente
de la enfermedad. Una consecuencia de la disfunción glomerular es
que las proteínas que son normalmente retenidas en la sangre, fugan
a través del glomérulo, en el filtrado glomerular y finalmente en
la orina. Un ejemplo de una proteína que puede estar presente en la
orina debido a la disfunción glomerular es la albúmina y su
presencia en la orina a niveles bajos ha sido denominado
microalbuminuria. El termino "microalbuminuria", como se usa
en este documento, se refiere a una cantidad de albúmina que esta
presente en una muestra en un rango de unos 10 \mug/ml a unos 300
\mug/ml cuando la muestra se normaliza a un peso especifico de
1.010 gramos/mililitro (g/ml). Esta es mayor que la cantidad
encontrada en animales saludables que es normalmente bajo, i.e.,
menos de 10 \mug/ml. La microalbuminuria puede surgir como una
consecuencia de daño al riñón que resulta de, por ejemplo,
glomerulornefritis mediada por complejos inmunes. Como se usa en
este documento, el termino "enfermedad renal de ultima fase" es
usado para definir un estado en el cual un animal ha perdido 70% o
mas de su función renal, con su correspondientes niveles elevados de
metabolitos en el suero del animal, en particular el nitrógeno de
sangre-urea (NSU) y niveles de creatinina sérica.
Como se usa en este documento, el termino "enfermedad renal
temprana" es definido como la presencia de microalbuminuria en
un animal en la ausencia de cambios detectables en la función renal
(i.e., NSU incrementado, creatinina serica o disminución de la
capacidad de concentrar orina). Como tal, un nivel de albúmina en
una muestra de orina de un rango de unos 10 \mug/ml a unos 300
\mug/ml cuando la muestra se normaliza a una gravedad especifica
de 1.010 g/ml es indicativo de la enfermedad renal temprana.
Animales preferidos se incluyen, pero no se
limitan a, gatos, perros y caballos.
Como se usa en este documento, un gato se
refiere a cualquier miembro de la familia de gatos (i.e. Felidae),
incluyendo gatos domésticos, gatos salvajes y gatos del zoológico.
Ejemplos de gatos se incluyen, pero no se limitan a, gatos
domésticos, leones, tigres, leopardos, panteras, jaguares, gatos
monteses, linces, jaguares, guepardos, servales. Un gato preferido
es un gato domestico. Como se usa en este documento, un perro se
refiere a cualquier miembro de la familia de Canidae, incluyendo,
pero limitado a, perros domésticos, perros salvajes, zorros, lobos,
chacales y coyotes y otros miembros de la familia Canidae. Un perro
preferido es un perro domestico. Como se usa en este documento, un
caballo se refiere a cualquier miembro de la familia Equidae. Un
équido es un mamífero ungulado y incluye, pero no esta limitado a,
caballos domésticos y caballos salvajes, tales como, caballos,
asnos, burros y cebras. Caballos preferidos incluyen caballos
domésticos, incluyendo caballos de carrera.
En una realización de la presente invención, una
muestra se obtiene, o recolecta, de un animal para la detección de
microalbuminuria. El animal puede o no ser sospechoso de tener la
enfermedad renal en fase de inicio. Una muestra es cualquier
espécimen obtenido del animal que puede ser usada para medir la fuga
de albúmina del glomérulo.
La orina es la muestra utilizada. Las muestras
de orina pueden ser recolectadas de los animales por métodos
conocidos en la materia, que incluye, por ejemplo, recolectar
mientras el animal esta miccionando, o recolectar mediante
cateterización, o mediante cistocentesis. La orina puede ser
refrigerada o congelada antes del ensayo, pero es preferible que se
ensaye pronto antes de la recolección.
Aunque no es necesaria para la presente
invención, la muestra puede ser pretratada como se desee. Por
ejemplo, la muestra puede normalizarse a un peso específico
deseado. La normalización de la muestra por métodos de dilución
apropiados conocidos en la materia permite la cuantificación de la
microalbuminuria independiente de la concentración (ej., peso
específico) de la muestra. Aunque cualquier peso específico deseada
puede ser fácilmente seleccionada por aquellos expertos en la
materia, un peso específico particularmente adecuado es de 1.010.
Si otro valor de peso específico es deseado para la normalización de
una muestra, aquellos expertos en la materia pueden fácilmente
terminar las cantidades adecuadas de albúmina que entran en la
definición de la microalbuminuria para el peso específico
deseado.
Después de obtener la muestra, el nivel de
albúmina en esa muestra es determinado. Como se usa en este
documento, los términos "determinar," "determinar el nivel
de la albúmina," "determinar la cantidad de albúmina,"
"determinar el nivel de albúmina" y similares pretenden
abarcar cualquier técnica que puede ser usada para detectar o medir
la presencia de albúmina en una muestra. La albúmina es un ejemplo
de un analito. El término "analito," como se usa en este
documento, es usado para describir cualquier molécula o compuesto
presente en una muestra. Tales técnicas pueden dan resultados
cualitativos o cuantitativos. Los niveles de albúmina pueden ser
determinados mediante la detección de la proteína albúmina en su
totalidad o mediante la detección de fragmentos, productos en
degradación o de reacción de la albúmina. En un método preferido, el
nivel de albúmina se determina utilizando un compuesto adecuado
ligante de albúmina.
Como se usa en este documento, los términos
"molécula ligante de albúmina", "compuesto ligante de
albúmina", "compuesto anti-albúmina", y
similares se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier
molécula que se une a la albúmina y forma un complejo estable. Un
compuesto ligante de albúmina preferido es uno que selectivamente
une la albúmina de un animal. El termino "selectivamente une la
albúmina" significa que preferentemente se une a la albúmina en
lugar de unirse a otras proteínas relacionadas con la albúmina. Un
compuesto ligante de albúmina particularmente útil es un anticuerpo
anti-albúmina. Como se usa en este documento, los
términos "anticuerpo anti-albúmina,"
"anticuerpo a la albúmina," "anticuerpo a la albúmina
animal," "especificidad de anticuerpos con la albúmina de
animales," "anticuerpo albúmina animal," y similares se
refieren a un anticuerpo que une de manera preferencial la albúmina
de uno o mas animales. Un anticuerpo anti-albúmina
particularmente adecuado se une de forma preferencial a la albúmina
canina, felina y/o equina en lugar de unirse a las proteínas
canina, felina o equina diferentes sin relación. Otro anticuerpo
anti-albúmina particularmente adecuado se une de
manera preferencial a la albúmina canina en lugar de unirse a una
proteína canina diferente sin relación. Otro anticuerpo
particularmente adecuado a la albúmina de animales de compañía se
une de manera preferencial a la albúmina felina en lugar de unirse
a una proteína felina diferente sin relación. Otro anticuerpo
particularmente adecuado a la albúmina de animales de compañía se
une de manera preferencial a la albúmina equina en lugar de unirse
a una proteína equina diferente sin
relación.
relación.
La presente invención también utiliza
anticuerpos aislados (i.e., retirados de su medio natural) que de
forma selectiva se unen a la albúmina de una o mas especies de
animales. Anticuerpos aislados para su uso en la presente invención
pueden incluir anticuerpos en el suero, o anticuerpos que han sido
purificados en diversos grados. Los anticuerpos para su uso en la
presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, o pueden
ser equivalentes funcionales como los fragmentos del anticuerpo y
anticuerpos diseñados genéticamente, que incluyen anticuerpos de
cadena simple o anticuerpos quiméricos que se pueden unir a uno o
mas epítopos de albúmina. Un método adecuado para producir
anticuerpos efectivos para el uso en la presente invención incluye
(a) la administración a un animal una cantidad efectiva de una
proteína, peptido o mimetope del mismo para producir los
anticuerpos y (b) la recuperación de los anticuerpos. Los
anticuerpos contra las proteínas definidas o mimetopes pueden ser
ventajosos dado que tales anticuerpos no están sustancialmente
contaminados con anticuerpos contra las sustancias que otro modo
podría causar interferencias en un ensayo de diagnostico. Los
métodos para producir tales anticuerpos son conocidos en la materia
y están descritos en detalle en Harlow et al., Antibodies, a
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988), e incluyen
inmunizar a los animales para producir las preparaciones de los
anticuerpos policlonales que se recuperan de, por ejemplo, fluido de
ascitis y purificados por métodos conocidos en la materia para
obtener preparaciones que son reactivas a la albúmina animal.
Muchas especies tienen proteínas que comparten secuencias
cercanamente relacionadas y por tanto puede ser difícil si se
utiliza protocolos de inmunización estándar para producir
anticuerpos que reconocen una proteína de una sola especie. Por lo
tanto, la modificación de métodos estándar utilizados para producir
anticuerpos, tales como, por ejemplo, técnicas de hibridación
sustractiva, son también contempladas. Tales modificaciones pueden
ser aquellas conocidas por los expertos en la materia o las técnicas
modificadas adicionalmente como se describe dentro de esta
solicitud. En otro método, los anticuerpos para el uso en la
presente invención se producen de forma recombinante usando
técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989).
Como se aprecio previamente, otros métodos
adecuados incluyen la producción de anticuerpos monoclonales. En
pocas palabras, los anticuerpos monoclonales son producidos de la
fusión de células del bazo de un animal inmunizado y de células del
mieloma para producir un hibridoma. Los hibridomas pueden ser
examinados para la producción del anticuerpo adecuado, luego
cultivados y cosechados los anticuerpos. Como se utiliza en este
documento, el termino "células cultivadas" se refiere a los
hibridomas o cualquier célula que produce anticuerpos. Los métodos
para producir y examinar tales hibridomas están descritos en Harlow,
et al., supra. Los métodos para preparar un antígeno
para que los anticuerpos producidos sean reactivados con la albúmina
de los animales son conocidos en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Harlow, et al., supra. La preparación del
material antígeno para la inyección en el animal incluye cualquier
técnica conocida en la materia, y incluyen, por ejemplo, la
utilización de la proteína de larga duración, la utilización de
péptidos seleccionados de las regiones inmunogenicas de la
proteína, modificando el antígeno por métodos tales como, por
ejemplo, acoplamiento dinitrofenol, acoplamiento arsynyl, la
desnaturalización del antígeno, acoplamiento del antígeno a
proteínas transportadoras tales como, por ejemplo, hemaocianina
keyhole limpet, peptidos que contienen sitios de unión al receptor
de la célula-T de clase-II, a los
nódulos, y cualquier otro método conocido en la materia. Ver
Harlow, et, al., supra.
Los anticuerpos anti-albúmina
para su uso en la presente invención pueden incluir anticuerpos
multifuncionales, por ejemplo un anticuerpo bifuncional que tiene
al menos una porción funcional que se une de forma especifica a la
albúmina animal. Tales anticuerpos multifuncionales pueden incluir,
por ejemplo, una molécula quimérica que comprende una porción de la
molécula que se une a la albúmina animal y una segunda porción que
permite a la molécula quimérica enlazarse a un sustrato o ser
detectado de tal manera que la unión a la albúmina es
irreprochable. Ejemplos de adecuadas segundas porciones incluyen
pero no se limitan a un fragmento de una molécula inmunoglobulina,
una proteína fluorescente o un enzima.
En adición a anticuerpos
anti-albúmina, moléculas ligantes de albúmina pueden
también incluir proteínas y peptidos que se unen a la albúmina.
Tales proteínas y peptidos pueden ser de origen natural,
recombinante o sintético y pueden o no ser purificadas. Ejemplos de
proteínas no-anticuerpo, ligantes de albúmina,
incluyen, pero no se limitan a, la proteína A de
42-kilodalton (kDa) de Staphlococcus aureus,
la proteína G de S. aureus y Eschericia coli,
la albúmina de rata 60-kDa ligante de proteína de
(gp60) y la proteína renal humana cubilin túbulo. La utilización de
homólogos funcionales de tales proteínas, de estas u otras especies,
para la detección de la albúmina es también contemplada. Los
híbridos o fusiones de las proteínas ligantes de albúmina que
retienen su capacidad ligante de albúmina pueden también ser usados.
En tales híbridos, la porción ligante de albúmina de la proteína
podría ser unida a una segunda porción que permite al hibrido estar
enlazado a un sustrato o ser detectado. Ejemplos de adecuadas
porciones segunda incluyen, pero no se limitan a, un fragmento de
una molécula inmunoglobulina, una etiqueta del epítopo, una proteína
fluorescente o una enzima.
Una molécula ligante de albúmina para su uso en
la presente invención puede estar contenida en una formulación. Por
ejemplo, un anticuerpo puede combinarse con un amortiguador en el
cual el anticuerpo se solubiliza, y/o con transportador. Adecuados
amortiguadores y transportadores son conocidos por aquellos expertos
en la materia. Ejemplos de adecuados amortiguadores incluyen
cualquier amortiguador en el cual una molécula ligante de albúmina
pueda funcionar para de forma selectiva se una a la albúmina, tales
como, pero no limitados a, solución amortiguadora de fosfatos,
agua, salina, amortiguador fosfato, amortiguador HEPES
(N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-solución
amortiguadora de ácido etansulfonico) amortiguador TES(Tris
-solución amortiguadora EDTA), amortiguador Tris y amortiguador TAE
(Tris-acetato-EDTA). Ejemplos de
transportadores incluyen, pero no se limitan a, matrices
poliméricas, toxoides y albúminas séricas, tales como la albúmina
sérica bovina. Las transportadores pueden ser combinados con una
molécula ligante de albúmina o conjugada (i.e. adjuntada) a una
molécula ligante de albúmina de tal manera que no interfiera
sustancialmente con la capacidad de la molécula ligante de albúmina
para unirse de forma selectiva a la albúmina. En adición, adecuadas
formulaciones de la presente invención pueden incluir no solo la
molécula ligante de albúmina a la albúmina de especie especifica,
sino también a uno o más antígenos o anticuerpos adicionales útiles
para la detección de la albúmina.
Como se utiliza en este documento, el termino
"contacto" se refiere a la introducción de una muestra que
supuestamente contiene albúmina a un compuesto ligante de albúmina,
por ejemplo, mediante la combinación o mezcla de la muestra con el
compuesto ligante de albúmina. Cuando la albúmina esta presente en
la muestra, un complejo de albúmina es formado; tal formación de
complejo se refiere a la capacidad de un compuesto
anti-albúmina unirse de forma selectiva a la
albúmina con el fin de formar un complejo estable que puede ser
detectado. La detección puede ser cualitativa, cuantitativo, o
semi-cuantitativo. La unión de albúmina en la
muestra al compuesto ligante de albúmina se lleva a cabo bajo
condiciones adecuadas para formar un complejo. Tales condiciones
(ej., concentraciones apropiadas, amortiguadores, temperaturas,
tiempos de reacción) así como los métodos para optimizar tales
condiciones son conocidas por aquellos expertos en la materia. La
unión puede ser medida utilizando una variedad de métodos estándar
en la materia incluyendo, pero no limitado a, inmunoensayos
enzimáticos (ej., ELISA), inmunoprecipitaciones, ensayos inmunoblot
y otros inmunoensayos como se describen, por ejemplo, en Sambrook
et al., supra, y Harlow, et al., supra.
Estas referencias también proporcionan ejemplos de condiciones de
formación
compleja.
compleja.
En una realización, un complejo de compuesto
ligante de albúmina/albúmina, también citado en este documento como
un complejo de compuesto de albúmina, puede formarse en la solución.
En otra realización, un complejo de compuesto ligante de
albúmina/albúmina puede formarse en la que la albúmina o el
compuesto ligante de albúmina es inmovilizado en (ej., recubriendo)
un sustrato. Las técnicas de inmovilización son conocidas por
aquellos expertos en la materia. Adecuados materiales sustrato
incluyen, pero no se limitan a, plástico, vidrio, gel, celuloide,
tela, papel, y las partículas materiales. Ejemplos de materiales
sustrato incluyen, pero no se limitan a, látex, poliestireno,
nylon, nitrocelulosa, azarosa, algodón, PVDF
(poli-fluoruro de vinilideno) y resina magnética.
Formas adecuadas para el material de sustrato incluyen, pero no se
limitan a, un pozo (ej., pozo de plato microtulado), una placa de
microtulación, una tira reactiva, una tira, un aparato de flujo
lateral, una membrana, un filtro, un tubo, un plato, una matriz de
tipo celuloide, una partícula magnética, y otras partículas.
Particularmente sustratos preferidos incluyen, por ejemplo, una
placa de ELISA, una tira reactiva, una tira inmunodot, una placa
radioinmunoensayo, un tira de azarosa, una tira de plástico, una
tira de látex, una esponja, un hilo de algodón, una ficha de
plástico, una membrana inmunoblot, una papel inmunoblot y una
membrana de flujo continuo. En una realización, un sustrato, tales
como partículas, pueden incluir un marcador detectable. Para
descripciones de ejemplos de materiales sustrato, ver, por ejemplo,
Kemeny, D.M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press,
Elmsford, NY pp 33-44, y Price, C. y Newman, D. eds.
Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton
Press, NY,
NY.
NY.
En una realización preferida, un compuesto
anti-albúmina es inmobilizado sobre un sustrato,
tales como un pozo de plato microtulado, una tira reactiva, una
tira inmunodot, o un aparato de flujo lateral. Una muestra de orina
recogida de un animal es aplicada al sustrato y incubado bajo
condiciones adecuadas (i.e. suficiente) para permitir la formación
de complejo de compuesto de albúmina anti-albúmina
enlazado al sustrato (i.e. la albúmina en la muestra se une al
compuesto anti-albúmina inmovilizado sobre el
sustrato).
Según con la presente invención, una vez
formada, una molécula ligante de albúmina/complejo albúmina es
detectada. Como se utiliza en este documento, el termino
"formación compleja de detección" se refiere a la
identificación de la presencia del compuesto ligante de albúmina
complejos con la albúmina. Si se forman complejos, la cantidad de
complejos formados puede, pero no tiene por que ser cuantificado. La
formación de complejo, o la unión selectiva, entre una composición
de albúmina putativa con un compuesto ligante de albúmina pueden ser
medidos (i.e. detectado, determinado) usando una variedad de
métodos estándar en la materia (ver, por ejemplo, Smabrook et
al. supra), ejemplos de los cuales están descritos en
este documento. Un complejo puede ser detectado en una variedad de
formas incluyendo, pero no limitado al uso de uno o más de los
siguientes ensayos: un inmunoensayo enzimático, un inmunoensayo
competitivo ligado a enzimas, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo
fluorescente, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo de flujo
lateral, un ensayo de flujo continuo, un ensayo de aglutinación, un
ensayo basado en partículas (ej., utilizando partículas tales como,
pero no limitados a, partículas magnéticas o polímeros plásticos,
como el látex o tiras de poliestireno), un ensayo de
inmunoprecipitación, un ensayo de BioCore^{TM} (ej., utilizando
oro coloidal) un ensayo inmunodot (ej., sistema inmunodot de CMG,
Fribourg, Suiza), y un ensayo inmunoblot (ej., un western blot) un
ensayo de fosforescencia, un ensayo de flujo continuo, un ensayo
basado en partículas, un ensayo de cromatografía, un ensayo basado
en PAGe, un ensayo de resonancia de plasmones de superficie, un
ensayo espectrofotométrico y un ensayo sensorial electrónico. Tales
ensayos son muy bien conocidos por aquellos expertos en la
materia.
Los ensayos pueden ser utilizados para dar
resultados cualitativos o cuantitativos dependiendo en como son
utilizados. Los resultados de los ensayos pueden basarse en la
detección de la molécula de albúmina en su totalidad o fragmentos,
productos de degradación o productos de reacción de la albúmina.
Algunos ensayos, como la aglutinación, separación de partícula, y
inmunoprecipitación, pueden observarse de forma visual (ej., ya sea
mediante el ojo o mediante una máquina, como un densitómetro o
espectrofotómetro) sin la necesidad de una marcador
detectable.
detectable.
En otros ensayos, la conjugación (i.e., adjunto)
de un marcador detectable al compuesto anti-albúmina
o a un reactivo que se une selectivamente a las ayudas del
compuesto anti-albúmina en la detección de formación
de complejos. Un marcador detectable puede ser conjugado al
compuesto anti-albúmina o reactivo en un sitio que
no interfiera con la capacidad del compuesto
anti-albúmina de unirse a la albúmina. Los métodos
de conjugación son conocidos por aquellos expertos en la materia.
Ejemplos de marcadores detectables incluyen, peo no se limitan a,
una etiqueta radioactiva, una etiqueta fluorescente, una etiqueta
quimioluminiscente, una etiqueta de cromóforos, una etiqueta de la
enzima, una etiqueta fosforescente, una etiqueta electrónica; una
etiqueta de metal sol, una tira de color, una etiqueta física, o un
ligando. Un ligando se refiere a una molécula que se une
selectivamente a otro molécula. Marcadores detectables preferidos
incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, un radioisótopo, una
fosfatasa (ej., fosfatasa alcalina), biotina, avidina, una
peroxidasa (ej., peroxidasa de rabano),
beta-galactosidasa, y compuestos relacionados con
biotina o compuestos relacionados con avidita (ej., estreptavidina
o InmunoPure®
NeutrAvidin).
NeutrAvidin).
En una realización, un complejo de compuesto
albúmina animal puede detectarse mediante el contacto de una
muestra con un anticuerpo compuesto específico conjugado a un
marcador detectable. Un marcador detectable puede ser conjugado a
un anticuerpo anti-albúmina u otro compuesto que se
une al compuesto ligante de albúmina de tal manera que no bloquee
la capacidad del anticuerpo anti-compuesto u otro
compuesto para unirse al compuesto ligante de albúmina canino que
es detectado. Marcadores detectables preferidos incluyen, pero no se
limitan a, fluoresceína, un radioisótopo, una fosfatasa (ej.,
fosfatasa alcalina), biotina, avidita, una peroxidasa (ej.,
peroxidasa de rábano), beta-galactosidasa, y
compuestos relacionados con la biotina o compuestos relacionados
con la avidita (ej., estreptavidina o ImunoPure® NeutrAvidin).
En otra realización, un complejo es detectado
mediante el contacto con el complejo con una molécula de indicador.
Adecuadas moléculas indicador incluyen molécula que se pueden unir
al complejo de molécula ligante de albúmina/albúmina o a la
albúmina. Como tal, una molécula de indicador puede comprender, por
ejemplo, una reactivo ligante de albúmina, como un anticuerpo.
Moléculas indicador preferidas que son anticuerpos incluyen, por
ejemplo, anticuerpos reactivos con los anticuerpos de especies de
animal en el que los anticuerpos anti-albúmina son
producidos. Una molécula de indicador por si misma puede ser
adjuntada a un marcador detectable para su utilización en la
presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser conjugado a
biotina, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o
fluoresceína.
Uno o mas capas y/o tipos de moléculas
secundarias o otras moléculas ligantes capaces de detectar la
presencia de un molécula de indicador puede ser utilizada en la
practica de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo secundario sin
etiquetar (i. e., no conjugado a un marcador detectable) que
selectivamente se une a una molécula de indicador puede ser
enlazada a un anticuerpo terciario etiquetado (i.e., conjugado a un
marcador detectable) que selectivamente se une a un anticuerpo
secundario. Adecuados anticuerpos secundarios, anticuerpos
terciarios y otras moléculas secundarias o terciarias pueden ser
fácilmente seleccionados por aquellos expertos en la materia.
Moléculas terciarias preferidas pueden también ser seleccionadas por
aquellos expertos en la materia basados en las características de
la molécula secundaria. La misma estrategia puede ser aplicada para
las capas
posteriores.
posteriores.
Preferiblemente, la molécula de indicador es
conjugada a un marcador detectable. Un agente de desarrollo se
añade, si se requiere, y el sustrato es sometido a un dispositivo de
detección para el análisis. En algunos protocolos, procesos de
lavado se agregan después de uno o ambos pasos de formación de
complejos con el fin de eliminar los reactivos en exceso. Si tales
pasos son usados, envuelven condiciones conocidas por aquellos
expertos en la materia de modo el exceso de reactivos es eliminado
pero el complejo se conserva.
Una realización para la detección de
microalbuminuria implica el uso de un ensayo de flujo lateral,
ejemplos de los cuales están descritos en la Patente U.S. No.
5,424,193, publicado el 13 de junio de 1995, por Pronovost et
al.; Patente U.S. No. 5,415,994, publicado el 16 de mayo de
1995, por Imrich et al; WO94/29696, publicado el 22 de
diciembre de 1994, por Millar et al.; y WO94/01775, publicado
el 20 de enero de 1994, por Pawlak et al. Un ensayo de flujo
lateral es un ejemplo de un ensayo de un solo paso. En un ensayo de
un solo paso, una vez que la muestra se ha obtenido y preparado
para la prueba, solo una única acción es necesaria por parte del
usuario para detectar la presencia de un analito. Por ejemplo, la
muestra, en su totalidad o en parte, puede ser aplicada a un
dispositivo que luego mide el analito en la muestra. En una
realización, una muestra es colocada en un aparato de flujo lateral
que incluye los siguientes componentes: (a) una estructura de apoyo
definiendo una trayectoria de flujo; (b) un reactivo etiquetado que
comprende una tira conjugada a un anticuerpo especifico, el
reactivo etiquetado siendo impregnado dentro de la estructura de
apoyo en una zona etiquetada; y (c) un reactivo de captura.
Anticuerpos preferidos incluyen aquellos descritos en este
documento. El reactivo de captura esta localizado en una dirección
descendente del reactivo etiquetado dentro de una zona de captura
fluidamente conectado a la zona de etiquetado de tal manera que el
reactivo etiquetado puede fluir desde la zona etiquetada dentro de
la zona de captura. La estructura de soporte comprende un material
que no impide el flujo de las tiras de la zona etiquetada a la zona
de captura. Materiales adecuados para la utilización como una
estructura de apoyo incluyen material iónico (i.e., aniónicos o
catíonicos). Ejemplo de este tipo de material incluyen, pero no se
limitan a, nitrocelulosa, PVDF, o carboximetilcelulosa. La
estructura de apoyo define una trayectoria de flujo que es lateral
y es dividido en zonas, llamados una zona de etiquetado y una zona
de captura. El aparato puede también incluir una zona receptora de
muestra localizada junto a la trayectoria de flujo, preferiblemente
en dirección ascendente del reactivo etiquetado. La trayectoria de
flujo en la estructura de apoyo es creado mediante el contacto de
una porción de la estructura de apoyo en dirección descendente de
la zona de captura, preferible en el extremo de la trayectoria de
flujo, a un absorbente capaz de absorber excesos de líquido de las
zonas de etiquetado y de captura.
En otra realización, un aparato flujo lateral
utilizado para detectar albúmina incluye: (a) una estructura de
apoyo definiendo una trayectoria de flujo; (b) un reactivo
etiquetado que comprende un anticuerpo anti-albúmina
como se describe arriba, el reactivo etiquetado impregnado dentro
de la estructura de apoyo en una zona etiquetada; y (c) un reactivo
de captura, el reactivo de captura siendo localizado en dirección
descendente del reactivo etiquetado dentro de una zona de captura
fluidamente conectada a la zona etiquetada de tal manera que el
reactivo etiquetado pueda fluir de la zona etiquetada en la zona de
captura. El aparato de preferencia también incluye un absorbente
localizado en el extremo de la trayectoria de flujo. Una realización
preferida incluye un reactivo de captura que comprende un
anticuerpo albúmina anti-canino.
\newpage
Una vez que el nivel de albúmina ha sido medido,
una evaluación de si la enfermedad renal temprana esta presente
puede luego hacerse. Evaluando la presencia de la enfermedad renal
temprana significa comparar el nivel de albúmina en la muestra al
nivel encontrado en animales saludables. La presencia de
microalbuminuria en la muestra, en ausencias de cambio en la
función renal, es un indicativo de la enfermedad renal temprana.
Como se utiliza en este documento, el término "indicativo de la
enfermedad renal temprana" significa que suficiente disfunción
glomerular esta presente para permitir a la albúmina pasar en la
orina en el rango de unos 10 \mug/ml a unos 300 \mug/ml. La
cantidad de albúmina presente en la muestra puede variar dependiendo
en la cantidad de daño presente pero en la enfermedad renal
presente, el nivel de albúmina es mayor a la observada en animales
sanos pero menor a la detectable mediante métodos actuales
utilizados para medir la proteinuria. En la presente invención, una
determinación de la enfermedad renal temprana se hace cuando el
nivel de albúmina en la muestra es determinada para estar en el
rango de unos 10 \mug/ml a unos 300 \mug/ml. El rango superior
de los niveles de albúmina puede también ser de unos 25 \mug/ml,
unos 50 \mug/ml, unos 75 \mug/ml, unos 100 \mug/ml, unos 125
\mug/ml, unos 150 \mug/ml unos 175 \mug/ml, unos 200
\mug/ml, unos 225 \mug/ml, unos 250 \mug/ml, unos 275
\mug/ml, o unos 300 \mug/ml. El nivel de albúmina en la muestra
puede variar dependiendo en la severidad del daño al riñón.
Realizaciones preferidas de la presente invención pueden detectar
la albúmina cuando se pierde alrededor del 10%, alrededor del 20%,
alrededor del 30%, alrededor del 40%, alrededor del 50%, alrededor
del 60%, alrededor del 70%, alrededor del 80%, o alrededor del 90%
de la función del riñón. Una realización mas preferida puede
detectar la microalbuminuria a tiempo para la intervención médica lo
cual puede retardar o prevenir el inicio de la última etapa de la
enfermedad renal. Tal intervención puede, por ejemplo, incluir,
pero no se limita al uso de compuestos farmacológicos o
modificaciones dietéticas para retrasar o prevenir la progresión de
la enfermedad renal.
Una realización de la presente invención hace
uso de un dispositivo de "tira reactiva" el cual puede detectar
la microalbuminuria en los animales. Las tiras reactivas pueden
construirse en una variedad de formas que dependen en parte del
modo en que se van a utilizar. Pueden ser sujetados directamente en
una muestra (ej., un chorro de orina), sumergido directamente en
una muestra contenida en un recipiente de colección, o tienen la
muestra aplicada a una tira contenida en una cinta de plástico o
plataforma. Otro ejemplo de una tira reactiva es un dispositivo de
"flujo continuo", un ejemplo de que es un sistema de
inmunoanálisis heterogéneo basado en un anticuerpo de captura
inmovilizado sobre una membrana adjunta a un depósito absorbente.
Una "tira" se refiere a un sustrato en particular compuesto de
una matriz como el látex o poliestireno, que pueden ser enlaces
cruzados covalentes o no covalentes a una molécula de detección. Una
realización preferida del ensayo de "tira reactiva" es un
sistema inmunométrico descrito en la Patente U.S. No. 5,656,502,
publicado el 12 de agosto de 1997, a MacKay y Fredrickson, y la
Patente U.S. No. 6,001,658, publicado el 14 de diciembre de 1999 a
Fredrickson. Particularmente preferido es un dispositivo
ImmunoDip^{TM} disponible de Diagnostic Chemicals Ltd., PEI,
CA.
Métodos no inmunológicos también pueden ser
utilizados. Con el fin de detectar la microalbuminuria, métodos
tales como la preconcentración de la orina con el fin de concentrar
la albúmina puede ser utilizado para aumentar la sensibilidad de la
prueba a la proteína. Tales métodos no inmunológicos incluyen, por
ejemplo, electroforesis de orina, donde la detección de la
microalbuminuria puede ser determinado por métodos conocidos en la
materia, y incluyen, por ejemplo, tinción de proteínas. En otra
realización, una proteína basado en la prueba de albúmina puede ser
utilizado para determinar la microalbuminuria en una mezcla
pre-concentrada de orina de un
animal.
animal.
Los métodos de la presente invención pueden ser
utilizados para detectar la nefropatía en un cánido, félido o
équido, particularmente cuando la nefropatía es glomerulonefropatía,
y especialmente glomerulonefritis. Mas específicamente, la medición
de la microalbuminuria se correlaciona a la presencia de la
enfermedad renal temprana en un animal de destino. Como se utiliza
en este documento, el termino "nefropatía" y/o "enfermedad
renal" se refiere a cualquier enfermedad de los riñones, y pueden
incluir, por ejemplo, nefritis de los tejidos renales glomerulares,
tubulares, o intersticiales.
Tal nefropatía de fase temprana puede resultar
de muchas causas diferentes, incluyendo, por ejemplo, alergia,
cáncer, infección parasitaria, viral, o bacteriana de cualquier
tejido en el animal, exposición a toxinas renales, enfermedades
autoinmunes, tales como el lupus eritematoso sistémico y vasculitis,
tumores malignos, raticidas vitamina D3, pielonefritis, la
leptospirosis, la obstrucción del tracto urinario, enfermedad
inflamatoria crónica, pioderma, pancreatitis, prostatitis,
enfermedades autoinmunes, enfermedad dental, presión arterial alta,
o diabetes. Como se utiliza en este documento, un "agente
infeccioso" es uno que infecta animales e incluye, pero no se
limitan a, virus, bacterias, hongos, endoparásitos y ectoparásitos.
Ejemplos de agentes virales infecciosos incluyen, pero no se
limitan a, adenovirus, calicivirus, coronavirus, virus del
distemper, virus de la hepatitis, herpesvirus, virus de
inmunodeficiencia, peritonitis infecciosa virus, los virus de la
leucemia, el virus oncogénicos, los virus del papiloma, virus
parainfluenza, parvovirus, virus de la rabia, y reovirus, así como
otras que causan cáncer o virus relacionados con el cáncer. Ejemplos
de agentes bacterianas infecciosas incluyen, pero no se limitan a,
Actinomyces, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bordetella,
Borrelia, Brucella, Campylobacter, Capnocytophaga, Clostridium,
Corynebacterium, Coxiella, Dermatophilus, Ehrlichia, Enterococcus,
Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemobartonella,
Helicobacter, Klebsiella, L-_form bacteria,
Leptospira, Listeria, Mycobacteria, Mycoplasma, Neorickettsia,
Nocardia, Pasteurella, Peptococcus, Peptostreptococcus, Proteus,
Pseudomonas, Rickettsia, Rochalimaea, Salmonella, Shigella,
Staphylococcus, Streptococcus, y Yersinia. Ejemplos de agentes
infecciosos fungicidas incluyen, pero no se limitan a, Absidia,
Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Basidiobolus, Bipolaris,
Blastomyces, Candida, Chlamydia, Coccidioides, Conidiobolus,
Cryptococcus, Curvalaria, Epidermophyton, Exophiala, Geotrichum,
Histoplasma, Madurella, Malassezia, Microsporum, Moniliella,
Mortierella, Mucor, Paecilomyces, Penicillium, Phialemonium,
Phialophora, Prototheca, Pseudallescheria, Pseudomicrodochium,
Pythium, Rhinosporidium, Rhizopus, Scolecobasidium, Sporothrix,
Stemphylium, Trichophyton, Trichosporon, y Xylohypha. Ejemplos
de agentes infecciosos de parásitos protozoarios incluyen, pero no
se limitan a, Babesia, Balantidium, Besnoitia, Cryptosporidium,
Eimeria, Encephalitozoon, Entamoeba, Giardia, Hammondia,
Hepatozoon, Isospora, Leishmania, Microsporidia, Neospora, Nosema,
Pentatrichomonas, Plasmodium, Pneumocystis, Sarcocystis,
Schistosoma, Theileria, Toxoplasma, y Trypanosoma. Ejemplos de
agentes infecciosos de parásitos helminto incluyen, pero no se
limitan a, Acanthocheilonema, Aelurostrongylus, Ancylostoma,
Angiostrongylus, Ascaris, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia,
Cooperia, Crenosoma, Dictyocaulus, Dioctophyme, Dipetalonema,
Diphyllobothrium, Diplydium, Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius,
Filaroides, Haemonchus, Lagochilascaris, Loa, Mansonella,
Muellerius, Nanophyetus, Necator, Nematodirus, Oesophagostomum,
Onchocerca, Opisthorchis, Ostertagia, Parafilaria, Paragonimus,
Parascaris, Physaloptera, Protostrongylus, Setaria, Spirocerca,
Spirometra, Stephanofilaria, Strongyloides, Strongylus, Thelazia,
Toxascaris, Toxocara, Trichinella, Trichostrongylus, Trichuris.
Uncinaria, y Wuchereria. Ejemplos de agentes infecciosos de
ectoparásitos incluyen, pero no se limitan a, pulgas, garrapatas,
incluyendo las garrapatas duras y las garrapatas, moscas como la
cecidomia, mosquitos, moscas de la arena, moscas negras, tábanos,
moscas de los cuernos, moscas del venado, moscas
tse-tsé, la mosca del establo, moscas que causan
miasis y mosquitos picadores, hormigas, arañas, piojos, ácaros, y
chinches, como los insectos de la cama y insectos
besadores.
besadores.
La presente invención puede también incluir la
medición de múltiples analitos. Otros analitos pueden ser cualquier
analito que puede ser detectado en una muestra adecuada para el uso
en la detección de la enfermedad renal temprana. Analitos
adicionales pueden ser utilizados para detectar, por ejemplo,
enfermedades infecciosas o errores innatos del metabolismo.
La presente invención hace uso de los
anticuerpos que se unen a la albúmina de un animal siendo tratado.
Un anticuerpo preferido es uno que detecta los niveles de albúmina
cuando la cantidad en la muestra es unos 50 \mug/ml, mas
preferible 25 \mug/ml, mas preferible 10 \mug/ml. Otro
anticuerpo preferido es una que detecta los niveles de albúmina
cuando la cantidad en la muestra es unos 50 \mug/ml, mas
preferible unos 25 \mug/ml, mas preferible unos 10 \mug/ml y el
método de detección es un dispositivo de tira reactiva descrita en
la Patente U.S. No. 6,001,658. Un anticuerpo preferido es uno que
compite con cualquiera de los anticuerpos monoclonales TNB1, TNB3,
TNB4, TNB5, TNB6, H352, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H393,
H394, H395, H396, H397, H398, H399, H400, H401, o H402 para la
unión selectiva a la albúmina animal, preferiblemente albúmina
canina. Otra realización preferida es un anticuerpo que se une al
epítopo mismo o relacionado, como la definición de homología de
secuencia, enlazado por los anticuerpos TNB3, TNB6 y H402. Un
anticuerpo preferido es seleccionado del grupo consistente de TNB1,
TNB3, TNB4, TNB5, TNB6, H352, H386, H387, H388, H389, H390, H391,
H393, H394, H395, H396, H397, H398, H399, H400, H401, y H402. Mas
preferido es un anticuerpo seleccionado del grupo consistente de
TNB3, TNB6 y H402. Como se utiliza en este documento, los términos
"compite" y "inhibir la unión selectiva" se refiere a la
capacidad de un anticuerpo de prevenir a otro anticuerpo unirse a la
misma proteína como se describe en los ejemplos
incluidos.
incluidos.
La presente invención puede hacer uso de kits
adecuados para la detección de albúmina animal utilizando los
métodos descritos en este documento. Medios adecuados de detección
incluyen las técnicas descritas en este documento, utilizando
compuestos que unen la albúmina animal deseada, tales como, por
ejemplo, un anticuerpo anti-albúmina. Como tal, un
kit puede también comprender un marcador detectable, como un
anticuerpo que selectivamente se une al compuesto ligante de
albúmina u otras moléculas de indicador. El kit también puede
contener componentes asociados, tales como, pero no limitados a,
amortiguadores, etiquetas, recipientes, insertos, tubos, viales
jeringas y
similares.
similares.
La presente invención esta basada en un
descubrimiento sorprendente de que la microalbuminuria en cánidos
puede utilizarse como un marcador para predecir el desarrollo de la
enfermedad renal en perros no diabéticos así como en perros
diabéticos dado que la microalbuminuria no tiene claramente valor
predictivo en pacientes no diabéticos humanos. Usos similares están
contemplados en otros animales como se afirma. Sin embargo, a pesar
de este sorprendente descubrimiento, hasta la presente invención, no
existían métodos efectivos para detectar la micoralbuminuria en
perros. Métodos convencionales para la detección de la
microalbuminuria humana no detectan la microalbuminuria en los
perros como se describe en los ejemplos a continuación.
Se proporcionan los siguientes ejemplos con el
propósito de ilustrar y no están destinados a limitar el alcance de
la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se recogieron muestras de orina de 134 pacientes
caninos en el Hospital Universitario de Enseñanza del Estado de
Colorado. Estas muestras incluyen orina de perros normales, perros
que sufren insuficiencia renal crónica, perros que sufre
insuficiencia renal aguda, y perros proteinuricos sin insuficiencia
renal. Las muestras se enfriaron a -20ºC durante al menos 24 horas
y luego se descongelaron antes de su uso. Los niveles de albúmina
fueron cuantificados mediante un ensayo de inmundifusión microradial
como se describe en McDonald, Weber & Thiele, "Construction
and Use of a Template Block for Radial Immunodiffusion" Anal
Biochem 186:165-168 (1990) usando un anticuerpo
anti-albúmina comercial (albúmina policlonal de
conejo anti-perro, disponible de Nordic Immunology
distribuido por Accurate Chemical y Scientific Corp., Westbury,
N.Y.). Para este ensayo el anticuerpo en el 1.5% (vol/vol) se
añadió a agarosa derretida 0.75% (v/v) de EEO en PBS. Geles, con un
grosor de 0.75 mm se vierten entre dos placas de vidrio. Los geles
se dejan solidificar y después de que uno de las placas de vidrio
es removido, se deja secar un poco. Bloques acrílicos, descritos en
McDonald et al., supra., fueron incluidos en la
agarosa y 5 \mul de la muestra o estándar se coloco en cada
pocillo del bloque acrílico. Las muestras fueron ejecutadas ya sea
sin diluir o si el anillo resultante fue muy grande para medir la
muestra fue diluida y analizada de nuevo. La curva estándar que usa
albúmina de perro (fracción V de albúmina de perro, disponible de
Sigma, St. Louis, MO) fue lineal dentro del rango de 10 - 100
\mug/ml. Los bloques acrílicos se dejaron en la agarosa y la
unidad fue colocada en una cámara húmeda e incubada durante la noche
a temperatura ambiente. Los geles de agarosa fueron luego remojadas
en agua destilada durante varias horas para eliminar el exceso de
proteína del gel, el gel fue secado y luego teñido con Coomassie
Brilliant Blue de modo que los anillos de precipitación podían ser
fácilmente visualizados. El diámetro de cada anillo fue medido y el
diámetro del anillo de cada muestra se comparo a la curva estándar
y la concentración de albúmina de cada muestra fue
calculada.
calculada.
La ventaja de usar este sistema para la medición
de la albúmina en la orina es que este sistema es mas sensible que
el ensayo tradicional con pocillos cortados en los geles. Esta
sensibilidad aumentada es relacionada al suministro concentrado del
antígeno en un área pequeña en lugar del área de superficie mayor
creada por los bordes de un pocillo cortado en la agarosa. Para
este estudio inicial, las muestra que tenían menos de o igual a 50
\mug/ml se considero normal, las muestras que tenían niveles entre
51 y 300 \mug/mu se considero microalbuminuria, y aquellas que
tenían niveles sobre 300 \mug/mu se considero macroalbuminuria.
Los resultados de este estudio se muestran en la
Tabla 1.
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El suero de albúmina de conejo
anti-canino IgG (anti-CSA IgG) es
diluido a 375 ng/ml en un amortiguador de recubrimiento (50 mM
Na_{2}CO_{2}/NaCHO_{3}, pH 9.6). La solución
anti-CSA IgG diluida es añadida a una placa de
MaxiSorp^{TM} C8 Break-apart Microwells (Nunc Cat.
# 473768) a 100 \mul/pocillo, cubierto y incubado durante la
noche (16 a 24 horas) a 4ºC. La placa es lavada cuatro veces con
amortiguador fosfato salino con 0.05% de Tween 20
(PBS-T) en un lavador de placas automático y borrado
en seco. Un amortiguador de bloqueo (StabilCoat^{TM} disponible
de Surmodics Cat. #SC01-1000) es añadido a 200
\mul/pocillo, cubierto y incubado a temperatura ambiente durante
al menos 1 hora.
Mientras se bloquea, la serie de diluciones del
suero de albúmina canino (CSA) es preparado. Primero el CSA es
diluido a 120 ng/ml en un diluyente de ensayo (0.1% hidrolizado de
caseína en PBS-T). Esta solución es diluida en
serie (1 parte a 1 parte) para hacer 60 ng/ml, 30 ng/ml, 7.5 ng/ml,
3.75 ng/ml, y 1.875 ng/ml. Los 5 últimos estándares se utilizan
para la curva estándar (30 ng/ml y menos) junto con un "cero"
estándar (diluyente de ensayo sin CSA). Cada muestra de orina a ser
probada es diluida 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1/8000, 1/16000 y
1/32000 en un diluyente de ensayo.
La placa es lavada cuatro veces en un lavador de
placas automático y dejado a secar. El CSA estándar y la muestra de
orina diluida son añadidos a 100 \mul/pocillo de cada uno de los
pocillos de prueba. El diluyente de ensayo es añadido para duplicar
los pocillos para el control de bases. La placa es cubierta y
incubada durante 2 horas a temperatura ambiente. Como
anteriormente, la placa es lavada cuatro veces con
PBS-T y se deja secar.
Diluir biotina etiquetada de cabra
anti-CSA IgG (Laboratorios Bethyl, Cat.
#E40-113) a 125 ng/ml en diluyente de ensayo.
Agregar 100 \mul/pocillo de biotina etiquetada diluida de cabra
anti-CSA IgG a todos los pocillos de prueba. Cubrir
la placa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Como
anteriormente, lavar la placa cuatro veces con
PBS-T y dejar secar.
Diluir peroxidasa de rábano estreptavidina
etiquetada (KPL Cat.# 14-30-00) a
500 ng/ml (1/1000 de dilución) en diluyente de ensayo y agregar a
todos los pocillos de muestra a 100 \mul/pocillo. Cubrir e incubar
a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como anteriormente,
lavar la placa cuatro veces con PBS-T y dejar
secar.
Mezclar las soluciones de sistema de componente
TMB micropocillos peroxidasa 2 (KPL
Cat.#50-76-03) juntas a volúmenes
iguales y agregar 100 \mul/pocillo de la mezcla TMB a todos los
pocillos. Cubrir e incubar durante 30 minutos a temperatura
ambiente. La reacción se detiene añadiendo 100 \mul/pocillo de
solución de parada (1M H_{3}PO_{4}) directamente a la TMB en
cada pocillo. Lea los pocillos a 450 nm en un espectrofotómetro.
Promediar los valores de los pocillos duplicados, si hubiera, y
sustraer el valor base de todos los valores de prueba. Generar una
curva estándar de los valores estándares y generar una línea de
regresión (r^{2}>0.95). Usando la formula de regresión,
calcular el valor CSA (ng/ml) para cada muestra y multiplicar este
valor por el factor de dilución. Solo aquellos valores que caen en
la porción lineal de la curva estándar pueden ser usados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Tres tiras ImmunoDip^{TM} (numero de producto
700-01) para la detección de microalbuminuria en
seres humanos, se obtuvieron de Diagnostic Chemicals Limited,
Charlottetown, Prince Edward Island, Canada. Dos muestras de orina
canina (numerado 1086 y 1098) se seleccionaron de un grupo de
muestras obtenidas de perros en el Hospital Veterinario de
Enseñanza Universitaria del Estado de Colorado, Fort Collins,
Colorado. Las muestras 1086 y 1098 se seleccionaron basados en sus
niveles de albúmina según lo determinado por un ELISA interno para
detectar la microalbuminuria en perros. La muestra 1086 fue una
muestra negativa, y la muestra 1098 tuvo una concentración de
albúmina de 221 \mug/ml. Para un control positivo, aproximadamente
un 50 \mul de sangre humana se añadió a 5 ml de agua
desionizada.
La medición de la albúmina en la orina se
realizo siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas
palabras, 3 ml de orina o de agua enriquecida de sangre se añadió a
un tubo de ensayo. La tira ImmunoDip se retiro de la bolsa y se
coloco en el tubo de ensayo que contiene la orina asegurándose que
el nivel de liquido estaba por encima del orificio de ventilación
en el dispositivo. El dispositivo fue dejado en la muestra durante
un mínimo de 3 minutos después tras lo cual fue removido y leído por
la comparación de intensidades relativas de las dos bandas según el
inserto de interpretación de resultados que acompaña al kit de
prueba. Los resultados de ELISA interior y de las pruebas ImmunoDip
se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El limite de detección en la prueba de ImmunoDip
para la albúmina de orina humana es 12 \mug/ml. La muestra 1098
que contiene orina canina a un nivel significativamente por encima
de este limite inferior pero fue negativo para la albúmina por la
prueba de ImmunoDip^{TM}. Estos datos sugieren que este
dispositivo no reconoce la albúmina canina, al menos no con el fin
de detectar la microalbuminuria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Catorce tiras de prueba de orina Micral® (numero
de producto 417146) para la detección de microalbuminuria en seres
humanos, se obtuvieron de Roche BMC, Indianapolis, Indiana. Trece
muestras de orina canina se seleccionaron del grupo de muestras
obtenidas de perros de empleados. Las muestras para el uso se
seleccionaron basadas en sus niveles de albúmina como se determina
por un ELISA domestico para detectar la microalbuminuria en perros.
Las muestras 2A, 4A & 16 A fueron muestras negativas mientras
que las muestras sobrantes tenían concentraciones de albúmina que
van en valor de 31.3 a >650 \mug/ml. Como un control positivo,
50 \mul de sangre humana se añadió a 5 ml de agua
desionizada.
\newpage
La medición de la albúmina en la orina se
realizo siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas
palabras, cada orina de perro fue recogida en un recipiente de
recogida de muestras. En adición, el agua enriquecida en sangre fue
colocada en un tubo de ensayo. La tira Micral® fue retirado del vial
y colocado en el recipiente de recogida (o tubo de ensayo que
contiene agua enriquecida en sangre) asegurándose que el nivel del
liquido estaba por encima de los dispositivos de dos líneas en cada
caso. El dispositivo fue dejado en una muestra durante 5 segundos,
retirado y dejado a reposar horizontalmente durante 1 minuto. El
resultado se determino comparando el color del bloc de prueba a la
escala de color en la vial según el inserto resultante que acompaño
la prueba. Los resultados del ELISA domestico y de la prueba Micral®
se muestran en la Tabla 3.
El limite de detección en la prueba Micral® para
la albúmina humana es de unos 20 \mug/ml. Varias muestras con
contenido de niveles de albúmina canina significativamente por
encima del limite inferior pero fueron negativos para la albúmina
por la prueba Micral®. Estos datos sugieren que este dispositivo no
reconoce la albúmina de orina canina, al menos no con el fin de
detectar la microalbuminuria.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Catorce tiras ImmunoDip^{TM} (numero de
producto 700-01) para la detección de
microalbuminuria en seres humanos, se obtuvieron de Diagnostic
Chemicals Limited, Charlottetown, PE, Canadá. Trece muestras de
orina canina fueron seleccionadas del grupo de muestras obtenidas
de perros que estaban aparentemente normal. Las muestras para el
uso se seleccionaron basados en sus niveles de albúmina como se
determino por un ELISA domestico para detectar la microalbuminuria
en perros. Las muestras 2Ax, 4AA & 16AA fueron muestras
negativas mientras que las muestras sobrantes tenían
concentraciones de albúmina que van en valor de 31.3 a >650
\mug/ml. Como un control positivo, 50 \mul de sangre humana se
añadió a 5 ml de agua desionizada.
La medición de la albúmina en la orina se
realizo siguiendo las indicaciones del fabricante. En pocas
palabras, 3ml de orina o el agua enriquecida con sangre se añadió a
un tubo de ensayo. La tira ImmunoDip fuer retirada de la bolsa y
colocado en el tubo de ensayo que contiene la orina asegurándose que
el nivel liquido estaba por encima del orificio de ventilación del
dispositivo en cada caso. El dispositivo fue dejado en la muestra
por un mínimo de 3 minutos tras lo cual, fue retirado y leído por la
comparación de las intensidades relativas de las dos bandas según
el inserto de interpretación de resultados que acompaña el kit de
prueba. Los resultados de las pruebas del ELISA domestico y el
ImmunoDip se muestran en la Tabla 4.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
El límite de detección en la prueba
ImmunoDip^{TM} para la albúmina humana es de unas 20 \mug/ml.
Varias muestras con contenido de niveles de albúmina canina
significativamente por encima del límite inferior pero fueron
negativos para la albúmina por la prueba ImmunoDip^{TM}. Estos
datos sugieren que este dispositivo no reconoce la albúmina de
orina canina, al menos no con el fin de detectar la
microalbuminuria.
Ejemplo
6
Cinco tiras de prueba de orina Micral® (numero
de producto 417146) para la detección de microalbuminuria en seres
humanos se obtuvieron de BMC, Indianápolis, Indiana. Trece muestra
de orina canina se seleccionaron de un grupo de muestras obtenidas
de perros que estaban aparentemente normal. Las muestras para su uso
fueron seleccionados basados en sus niveles de albúmina como se
determino por un ELISA domestico para detectar microalbuminuria en
perros. Las muestras 7 y 12 fueron muestras negativas mientras que
las muestras 14 y 25 tenían niveles de albúmina de 621 \mug/ml y
>650 \mug/ml, respectivamente. Como un control positivo, 50
\mul de sangre humana se añadió a 5 ml de agua desionizada.
La medición de albúmina en la orina se realizo
siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cada
orina de perro fue recogida en una recipiente de recogida de
muestra. Para el control positivo, el agua enriquecida en sangre se
coloco en un tubo de ensayo. La tira Micral® fue retirada de la vial
y colocada en el recipiente de recogida (o tubo de ensayo que
contiene el agua enriquecida en sangre) asegurándose que el nivel
de liquido estaba por encima de los dispositivos dos líneas negras
en cada caso. El dispositivo fue dejado en una muestra durante 5
segundos, retirado y dejado a reposar horizontalmente durante 1
minuto. El resultado se determino comparando el color de la carpeta
de prueba a la escala de color n la vial según el resultado inserte
que acompaño a la prueba. Los resultados del ELISA domestico y de la
prueba Micral® se muestran en la Tabla 5.
El limite de detección en la prueba Micral® para
la albúmina de orina humana es de unas 20 \mug/ml. Las muestras
14 y 25 que contienen niveles de albúmina canina significativamente
por encima de estos niveles inferiores pero fueron negativos para
la albúmina por la prueba Micral®. Estos datos sugieren que este
dispositivo reconoce la albúmina de orina canina, al menos no con
el fin de detectar microalbuminuria.
Ejemplo
7
Para este estudio, dos poblaciones separadas
fueron examinadas. Una muestra de la población se deriva de perros
clínicamente normales (n=86). La segunda muestra de población se
deriva pacientes del Hospital de Enseñanza Universitario del Estado
de Colorado (n=150) presentados para evaluaciones de salud de
rutina, procedimientos electivos, así como la evaluación de
problemas de salud. La microalbuminuria fue cuantificada usando un
ELISA de captura de antígeno. Los resultados de esta medición se
normalizaron a un peso específico de 1.010 para dar cuenta de
distintas concentraciones en orina. La albúmina en la orina de los
pacientes del hospital fue también probado usando tiras de prueba
de proteína de orina Petstix 8^{TM} (Idexx Cat.#
98-06959-00).
De los 86 perros clínicamente normales, 68 (79%)
tenia concentraciones de albúmina normalizadas <1.0 mg/dL, 16
(19%) tenían concentraciones de albúmina normalizadas >1.0 mg/dL
y <30.0 mg/dL, y 2(2%) tenían concentraciones de albúmina
normalizadas >30.0 mg/dL. De los 159 pacientes del hospital, 112
(70%) fueron tira de prueba de orina negativos y 51 de las 112
(46%) muestras de tira de prueba negativas tenían concentraciones de
albúmina normalizadas >1.0 mg/dL. Por el contrario, 19 de 80
(24%) de las muestras con <1.0 mg/D1 de albúmina fueron
positivos en la tira de prueba de orina (ver Tabla 6).
En las dos poblaciones examinadas, la
prevalencia de microalbuminuria (>1.0 mg/dL y <30.0 mg/dL) que
va de 19% a 36%. De estos resultados, aparece que la
microalbuminuria es frecuente en un número significativo de perros.
Además, el uso de las comercialmente disponibles tiras de prueba de
la proteína de orina para la detección de rendimientos de
albuminuria un numero de considerable de resultados positivos
falsos.
Ejemplo
8
Este ejemplo describe un método para la
producción de suero de albúmina canino. El suero canino fue ajustado
a 50% (w/v) de sulfato de amonio, la solución sacudida durante 3
horas a 4ºC, y el material insoluble precipitado por centrifugación
a 10,000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante fue retirado y
dializado en 25 mM Tris, Ph 8.0. El material soluble fue cargado
sobre una pre-equilibrada, columna
Hi-Trap Q-Sepharose (Pharmacia,
Peapack, NJ) y las proteínas eluidas usando un gradiente lineal de 0
a 1.0 M NaCI sobre 25 volúmenes de columna (CV). Las fracciones
recogidas fueron analizadas por SDS-PAGe y
fracciones que contienen albúmina canina fueron agrupados y
almacenados hasta que sean necesarios. Usando este método, 414 mg de
albúmina fue purificado de 20 de suero canino. La secuenciación de
proteínas confirmo que la proteína purificada era albúmina
canina.
Ejemplo
9
Este ejemplo describe el método utilizado para
producir anticuerpos monoclonales (Mabs) TNB1, TNB2, TNB3, TNB4,
TNB5, TNB6 los cuales reconocen el suero de albúmina canino
(CSA).
Ratones Balb/C fueron inmunizados por inyección
subcutánea con Complete Freunds Adjuvant mezclado ya sea con 25
\mug, 50 \mug o 100 \mug de suero de albúmina canina
(disponible de Sigma, St. Louis, MO). Después de cuatro semanas,
las muestras de sangre fueron obtenidas y los concentraciones del
anticuerpo anti-CSA determinados por ELISA. Basados
en este dato, los tres ratones inmunizados con 100 \mug de CSA se
escogieron para un uso adicional en la producción de hibridomas.
Dos de estos ratones se les dio inyecciones intravenosas (IV)
conteniendo 100 \mug de CSA y el tercer ratón recibió 100 \mug
por vía intraperitoneal. Tres días mas tarde, los ratones fueron
sacrificados, el bazo removido y vaciado de las
células-T y las células del bazo fusionados con
SP2/0 de células mieloma de ratón siguiendo protocolos estándares.
Las colonias individuales del hibidroma fueron probados para la
producción de MAbs el cual reconoce CSA y colonias positivas se
expandieron y la dilución clonada hasta que se establecieron líneas
secretoras de MAB estables.
Ejemplo
10
Este ejemplo describe procedimientos que
utilizan técnicas de hibridación sustractiva para producir
anticuerpos monoclonales (Mabs) que reconocen el suero de albúmina
canina (CSA).
Las líneas celulares anti- canina CSA fueron
producidas utilizando el siguiente, método publicado de
hibridizacion sustractiva. Los ratones Balb/C fueron inyectados vía
intraperitoneal con 1.0 de Fracción V BSA (disponible de Boehringer
Manheim, Indianapolis, IN), seguido por inyecciones IP de
ciclofosfamida (CY)(100 mg/kg) a 10 minutos, 24, y 48 horas de
inyección post-BSA. Este tratamiento BSA/CY se
repitió dos semanas después. Después de otras dos semanas, se le
aplico al ratón una inyección subcutánea (SC) que contenía 100
\mug de CSA (producida tal como se describe en el Ejemplo 8)
mezclada con Complete Freunds Adjuvant. Después de que habían pasado
dos semanas adicionales, las muestras de sangre se obtuvieron y las
concentraciones del anticuerpo suero contra CSA y BSA fueron
determinados por ELISA. Una segunda inyección de CSA (100 \mug)
fue luego aplicada intraperitonealmente para incrementar las
concentraciones de anticuerpos animales anti-CSA.
Dos semanas mas tarde, se aplico al ratón un inyección intravenosa
(IV) de CSA (50 \mug) y después de tres días, el ratón fue
sacrificado, su splenocytes cultivado y fusionado con las células
mieloma de ratón SP2/0 utilizando polietileno glicol (PEG)
siguiendo procedimientos estándares. Colonias de hibridomas
individuales fueron probados para la producción de MAbs que
reconocen CSA y colonias positivas se expandieron y la dilución
clonada hasta que líneas de secreción MAb estables fueron
establecidas. El procedimiento resulto en la producción de líneas de
hibridoma H398 y H399.
En adición a las líneas celulares de hibridoma
producidas por el procedimiento anterior, el siguiente procedimiento
de hibridizacion sustractiva modificada se utilizo para producir
líneas celulares de hibridoma anti-CSA adicionales.
30 \mug de CSA (producido como se describe en el Ejemplo 8) fueron
inyectadas en la planta del pie de un ratón Balb/C. Tres meses
después, se le aplico al ratón una inyección intraperitoneal (IP)
que contiene 30 \mug de CSA. Cuatro meses después de la inyección
IP, se le aplico al ratón una segunda inyección IP que contiene 1.0
mg de BSA, seguido por inyecciones IP de cicofosfamida (CY)(100
mg/kg) a 10 minutos, 24, y 48 horas de inyección
post-BSA. Después de dos semanas, este tratamiento
BSA/CY se repitió y después de dos semanas mas que habían
transcurrido, se le aplico al ratón una inyección subcutánea (SC) de
CSA (100 \mum) mezclado con Complete Freunds Adjuvant. Después de
otras dos semanas, las muestras de sangre fueron obtenidas y las
concentraciones de suero del anticuerpo contra CSA y BSA fueron
determinados por ELISA. Se le aplico al ratón una inyección
intravenosa (IV) de CSA (50 \mug) y tres días después, el ratón
fue sacrificado, su splenocytos cultivados y fusionados con células
mieloma de ratón SP2/0 utilizando polietileno glicol (PEG) siguiendo
los procedimientos estándares. Colonias de hibridoma individuales
fueron probados para la producción de MAbs que reconocen CSA y
colonias positivas fueron expandidas y la dilución clonada hasta que
las líneas de secreción MAb estables fueron establecidas. Este
protocolo resulto en la producción de líneas celulares de hibridoma
H384, H385, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H392, H393, H394,
H395, H396, H400, H401 y H402.
Ejemplo
11
Este ejemplo describe el uso de un ELISA en fase
sólida para probar la capacidad de los anticuerpos de suero
albúmina anti-canino (CSA) para detectar CSA).
Los pocillos de una placa de microconcentración
fueron cubiertos con CSA (50 \mug/pocillo) (producido como se
describe en el Ejemplo 8) en un amortiguador carbonado (50 nM
carbonato/bicarbonato, pH 9.6)y la placa almacenada durante
la noche a 4ºC. El siguiente día, el exceso de liquido fue removido,
la placa se dejo a secar, y 150 \mul de amortiguador Bloqueante
(0.1% de caseína en PBS conteniendo 0.05% Tween-20)
fue añadido a cada pocillo. La placa fue incubada a temperatura
ambiente (RT) durante 30 minutos, tras lo cual, el amortiguador
Bloqueante fue removido y 50 \mul de hibridoma supernatante (ya
sea indiluida o diluida en el amortiguador bloqueante) fueron
añadidos a cada pocillo. Siguiendo a una hora de incubación a
temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados dos veces
utilizando un amortiguador de lavado (PBS conteniendo 0.05%
Tween-20), 50 \mul de
HRP-conjugado, cabra, IgG anti-ratón
y IgM (disponible de KPL Labs, Gaithersburg, MD) fueron añadidos a
cada pocillo y la placa incubada a temperatura ambiente durante 30
minutos. Los pocillos se lavaron dos veces con amortiguador de
Lavado, y 50 \mul de Sistema de Sustrato TMB (disponible de KPL
Labs) fueron añadidos a cada pocillo. La placa fue incubada a
temperatura ambiente durante 10 minutos después de cual, la reacción
fue paralizada por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 2N a
cada pocillo. La placa fue leída a 450 nM
\hbox{utilizando un
lector de placa ELISA y los resultados se muestran abajo en la Tabla
7.}
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Este ejemplo demuestra la capacidad de tres
albuminas anti-canino monoclonales Abs para
reconocer el suero de albúmina bovina (BSA), canino (CSA), equino
(HSA) o humana (HuSA) mediante ELISA utilizando el protocolo
esbozada en el Ejemplo 11 con la excepción de que los pocillos
fueron cubiertos con diluciones seriales 3X (de 5 \mug/ml a
0.002/ml) de la albúmina indicada. En adición, 10 \mug del
anticuerpo indicado fue utilizado en cada pocillo. Los resultados
se muestran en la Tabla 8.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Esta data demuestra que los TNB3, TNB6 y H402 de
mAb tienen una mayor afinidad para CSA si se compara con BSA, HSA o
Husa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Este ejemplo compara la capacidad de los
anticuerpos monoclonales H402, TNB3 y TNB6 para disputarse la unión
a la albúmina de suero canino (CSA). La competición entre los
anticuerpos fue medido cubriendo una placa ELISA en su totalidad
con CSA, añadiendo un anticuerpo primario etiquetado a todos los
pocillos de la placa y luego midiendo la capacidad de varios
anticuerpos sin etiquetar para competir con el anticuerpo primario
para unirse a la CSA. (Todos los anticuerpos primarios fueron
etiquetados utilizando biotina disponible de Pierce Chemical,
Rockford, IL según las instrucciones de los fabricantes). De esta
manera, cada placa fue utilizada para probar la capacidad de un
anticuerpo primario simple para competir con dos mas anticuerpos
anti-albúmina por la capacidad de unirse a CSA. En
adición, el anticuerpo creció en contra del dominio extracelular de
la afinidad humana elevada de IgE de la cadena alfa receptora
(anti-FceRl\alpha) fue utilizada en cada como un
control negativo. Los detalles del ensayo son como
siguen:
siguen:
Tres placas ELISA fueron cubiertas durante la
noche a 4ºC con CSA a 1\mug/ml. El siguiente día, los pocillos
fueron lavados utilizando amortiguador de Lavado (PBS + 0.05%
Tween-20) y bloqueado con Solución Bloqueante
(STABILCOAT®) IMMUNOASSAY STABILIZER; disponible de SurModics, Inc.,
Eden Prairie, Minnesota) según a las instrucciones del fabricante.
Los pocillos fueron luego lavados utilizando amortiguador de Lavado,
y 100 \mul de un simple, etiquetado, anticuerpo primario, ya sea
H402 a 20 ng/ml, TNB3 a 8 ng/ml o TNB6 a 12 ng/ml (las
concentraciones se ajustaron utilizando amortiguador de Dilución
(0.1% de caseína en PBS + 0.05% Tween-20)) fueron
añadidos a todos los pocillos de una placa individual de modo que
cada placa mantuvo un anticuerpo primario diferente. A una fila de
pocillos en cada placa se agrego 100 \mul de anticuerpo secundario
sin etiquetar, ya sea H402, TNB3, TNB6 o
anti-HuFCcR1 a 20 \mug/ml. Diluciones seriales de
dos tiempos fueron realizados, diluyendo cada anticuerpo secundario
a través de la placa de modo que las concentraciones finales del
anticuerpo secundario fueron de 10 \mug/ml a 9 ng/ml. Las placas
fueron incubadas a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas,
lavadas con amortiguador de Lavado y 100 \mul peroxidasa de rábano
picante conjugada estreptavidina (diluida 1:1000 en amortiguador de
dilución) fueron añadidos. Seguido de una hora de incubación a
temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados con amortiguador
de Lavado y 100 \mul de solución de desarrollo (Sustrato TMB;
disponible de KPL Labs, Gaithersburg, MD) fueron añadidos a cada
pocillo. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura
ambiente, las placas fueron leídas a 450 nm utilizando un lector de
placa ELISA. Los resultados de este ensayo se muestran debajo en
la
Tabla 9.
Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos demuestran que los anticuerpos
monoclonales H402 y TNB6 compiten para unir el suero de albúmina
canina consistente con estos anticuerpos compartiendo la misma, o
los cercanamente relacionados, epítopos. Los datos también
demuestran la unión del suero de albúmina canino por TNB3 no es
afectado por H402 o TNB6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Este ejemplo compara la capacidad de tres
anticuerpos anti-albúmina (H352, H398 & TNB3)
para unir la albúmina canina (CSA) o felina (FSA).
El ensayo de unión fue realizado como sigue.
Para habilitar la detección, peroxidasa de rábano picante (HRP)
(Pierce Chemical, Rockford, IL) fue conjugado ya sea a CSA o FSA
siguiendo el protocolo del fabricante. Los pocillos de una placa de
microconcentración fueron cubiertos con un rango (de 10\mug/ml a
9.77 ng/ml) de anticuerpo (ya sea H352, H398 o TNB3) en
amortiguador de carbonato (50 mM carbonato/bicarbonato, pH 9.6) y
las placas almacenadas durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, el
exceso de liquido fue retirado y los pocillos se bloquearon
utilizando solución de bloqueo (STABILCOAT® IMMUNOASSAY STABILIZER;
disponible de SurModics, Inc., Eden Prairie, Minnesota) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Seguido del retirado de la
solución de bloqueo, los pocillos fueron lavados usando
amortiguador de Lavado (PBS que contiene 0.05%
Tween-20) y HRP-FSA (diluido 1:400
en amortiguador de carbonato) o HRP-CSA (diluido
1:800 en amortiguador de carbonato) fueron añadidos a los pocillos
y la placa incubada a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos.
La conjugada HRP-albúmina fue retirado, los
pocillos lavados dos veces usando amortiguador de Lavado y 50 \mul
de sistema de sustrato TMB (disponible de KPL Labs, Gaitherburg,
MD) fueron añadidos a cada pocillo. La placa fue incubada a
temperatura ambiente durante 10 minutos tras lo cual la reacción fue
paralizada por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 2N a cada
pocillo. La placa fue leída a 450 nM usando un lector de placa
ELISA. Los resultados se muestran abajo en la Tabla
10.
10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos del anticuerpo monoclonal H352 se une
a FSA y CSA con afinidad más o menos igual. El anticuerpo
monoclonal H398 también reconoce FSA y CSA aunque tiene mayor
afinidad para CSA. Finalmente, los datos demuestran que el
anticuerpo monoclonal TNB3 se une específicamente a CSA y no se une
a FSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Este ejemplo describe los niveles de albúmina
presente en la nefropatía inducida Dirofilaria immitis
canina. En este modelo, los animales están infectados con D.
immitis lo cual resulta en daño renal debido al daño inducido
del complejo anticuerpo antígeno de los glomérulos como se describe
en Grauer, G.F., et. al., American Journal o Tropical
Medicine and Hygiene; 39(4), 1988, p380-387.
Se sabe en este modelo que el antígeno D. immitis aparece en
la sangre aproximadamente siete meses después de la post infección.
Para este ejemplo, los animales fueron infectados con D.
immitis y las muestras de orina recogidas cada mes por
cateterización. Debería notarse que en algunos casos, el proceso de
cateterización puede resultar en niveles de albúmina elevados; como
resultado, los animales fueron solo considerados positivos para la
microalbuminuria cuando se les descubrió que eran microalbuminurico
en dos muestras consecutivas. La cantidad de albúmina en cada
muestra se determino utilizando un ensayo ELISA. Los resultados se
muestran en la Tabla 11. Las cajas etiquetadas N/A indican en donde
la muestra no estaba
disponible.
disponible.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los datos demuestran que la infección siguiente
con D. immitis, hay un aumento progresivo en el nivel de
albúmina en la orina. Adicionalmente, la mayoría de los animales se
vuelven microalbuminuricos dentro de 1-2 meses
siguiendo el tiempo de la aparición del antígeno D. immitis
en la sangre. La microalbuminuria podría ser detectada en todos los
animales hacia el final del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Este ejemplo compara el nivel de
microalbuminuria (MA) con un marcador comúnmente usado para la
enfermedad renal, el porcentaje proteína urinaria/creatinina
(UP/C), sobre tiempo en animales que sufren de nefritis hereditaria
(HD). En este modelo, los animales llevan un defecto genético que
resulta en el desarrollo rápido de la enfermedad renal durante el
curso de la vida del animal como se describe en Lee, GE, American
Journal of Veterinary Research, 1999: 60, p373-383.
En este ejemplo, la orina fue recogida periódicamente de una colonia
de perros normales y de una colonia de perros que sufren nefritis
hereditaria. La cantidad de albúmina en cada muestra se determino
utilizando un ensayo ELISA. En adición, la enfermedad renales
considerada a estar presente cuando el porcentaje UP/C es mayor de
1.0. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos demuestran que hay un aumento
progresivo en la microalbuminuria en animales que sufren de nefritis
hereditaria. En adición, en prácticamente todos los animales, la
microalbuminuria fue detectado anterior al porcentaje UP/C siendo
superior a 1.0.
Claims (3)
1. Un método para identificar un animal que
tiene enfermedad renal temprana o riesgo de desarrollar la
enfermedad renal en fase final, dicho método comprendiendo la
determinación de la cantidad de albúmina en una muestra de orina
obtenida del animal, donde una cantidad de albúmina en un rango
desde unos 10 \mug/ml a unos 300 \mug/ml en la muestra de
orina, cuando el peso especifica de la muestra es normalizado a
1.010 g/ml, es indicativa de un animal que tiene la enfermedad
renal temprana o esta en riesgo de enfermedad renal en su fase
final, donde el animal es seleccionado del grupo que consiste de
cánidos, félidos y équidos.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
cantidad de albúmina en la muestra es determinada por:
- a)
- poner en contacto la muestra de orina con un anticuerpo anti-albúmina para formar un complejo que comprende albúmina y el anticuerpo anti-albúmina;
- b)
- la detección de dicho complejo; y
- c)
- la evaluación de la cantidad de albúmina presente en la muestra de orina de la cantidad de complejo de anticuerpo-albúmina detectado.
3. El método de la Reivindicación 1, donde la
cantidad de albúmina en la muestra de orina es determinada
utilizando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un
inmunoensayo ligado a enzimas, un radioinmunoensayo, un
inmunoensayo fluorescente, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo
de flujo lateral, un ensayo de tira reactiva, un ensayo de
aglutinación, un ensayo basado en partículas, un ensayo de
inmunoprecipitación, un ensayo inmunodot, un ensayo inmunoblot, un
ensayo de inmunodifusión, un ensayo de fosforescencia, un ensayo de
flujo continuo, un ensayo de cromatografía, un ensayo basado en
PAGe, un ensayo electrónico-sensorial, un ensayo de
resonancia de plasmones de superficie y un ensayo de espectroscopia
de correlación de fluorescencia.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27939101P | 2001-03-28 | 2001-03-28 | |
| US279391P | 2001-03-28 | ||
| US342268P | 2001-12-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2356382T3 true ES2356382T3 (es) | 2011-04-07 |
Family
ID=43769694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02733963T Expired - Lifetime ES2356382T3 (es) | 2001-03-28 | 2002-03-28 | Métodos de detección de enfermedades renales tempranas en animales. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2356382T3 (es) |
-
2002
- 2002-03-28 ES ES02733963T patent/ES2356382T3/es not_active Expired - Lifetime
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