JPH03505521A - エンテロウイルスに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンテロウィルスに対するモノクローナル抗体本発明は、エンテロウィルスに対 するモノクローナル抗体、その産生方法、および血清および他の液体試料中のエ ンテロウィルスの抗原およびエンテロウィルスに対する抗体についての検査にお けるその使用ならびＩこ免疫吸収剤の製造および使用に関する。

エンテロウィルスは、胃腸管中で増殖する一層のウィルスである。

これらのウィルスは正の極性を有する一重鎮多シストロン性ＲＮＡを含有するこ と、および直径約２７ｎｍであることが報告されている。

アントリユース（Ａｎｄｒｅｗｓ）らの「ウイルシズ・オブ・パーティブレイテ イス（Ｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）Ｊ、第４版、第１頁７ 第３７頁、ベイラーリック−チンダル（Ｂａｉｌｌｅｒｉｃ　−Ｔ　１ｎｄａｌ ｌ）、ロンドン（１９７８）によると、これらは立方対称性を呈しており、Ｃ５ ＣＱ中の浮遊密度１　、３４９／１１１１２を有している。構造上、エンテロウ ィルスは、４つの主要なピリオンポリペプチド、すなわち、ＶＰ　］−、ＶＰ２ 、ＶＰ３およびＶＰ４を有している。エンテロウィルスは、ポリオ、ポーンホー ルム病、急性髄膜炎、急性心筋炎、ｌ型真性糖尿病、季丸炎および上部気道の感 染のような種々の臨床的状態に関係している。

この群には、ポリオウィルス、コクサンキーＡ１　コクサンキーＢおよびエコー ウィルスが含まれる。近年、この群にＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）が加えられて 、現在までのところ、７２種類はどの異なった血清型が確認されている。

エンテロウィルス感染が、「ウィルス性疲労後症候群」としても知られている筋 痛性脳を８炎（ＭＥ）の原因であることも、近年、立証された。非常に多くの種 類のエンテロウィルスについて適当な診断的検査が存在しないために、この感染 の治療は、これまで妨げられてきた。

臨床学的見地において、実施期間中、全体としてこの群について１つの検査で充 分である場合がしばしばあるが、種々の血清型の各々について、別々の固有の検 査を必要とする。

エンテロウィルスは、通常、各血清が１以上のプールと一体化されるように設計 された組合せを用いて交差抗血清プールを用いる中和によって同定される。した がって、通常、同定は遅く、高価で、長い。

ＶＰＩとして知られているタンパク配列が、部分的に、全エンテロウィルス群の 全体にわ／こって保有されていることは知られている。

しかしながら、この配列に対する抗体を生じることはできるが、全血清型に対し て結合する抗体：ＶＰＩエピドーグおよび全群の全体にわたって保有されていな い他のタンパク系上のエピトープに対して結合する全ての上記抗体を製造するこ とができなかった。

本発明の目的は、エンテロウィルスに対する非血清型特異性抗体を提供すること である。

本発明は、本明細書に定義するようなエンテロウィルス群の全血清型に対して結 合するモノクローナル抗体５−Ｄ８／１を提供するものである。

さらに、本発明は、ハイブリドーマセルラインによって産生されるモノクローナ ル抗体であって、エビドーグがＡ型肝炎ウィルスを除くエンテロウィルスとして 知られているウィルス群の全体にわたって保有すれているエンテロウィルスのＶ ＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有することを特徴とするモノクロー ナル抗体を提供するものである。該ハイブリドーマセルラインは、マウスのよう な誓歯類から誘導されるのが好ましい。

したがって、本発明は、先の研究から得られた指摘にもかかわらず、ＶＰｌタン パク自身がこの群の全体にわたって高度に保有されているだけではなく、エピド ーグもそこに保有されているという驚くべき発見に基づくものである。

広範囲のエンテロウィルス血清型に対して試験をすると、本発明の抗体は、Ａ型 肝炎ウィルスを顕著に除いて結合することが分かった。しかしながら、該この群 の他のメンバーとの有意な遺伝学上の変化についてのこの明白な証拠は、他の無 関係な研究による最近の他の指摘と共に、ＨＡＶウィルスがエンテロウィルス群 に間這って置かれていることを示佼しようとしている。故に、本明細書に関して 、「エンテロウィルスＪという定義は、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡ　Ｖ）を除く。

本発明は、特に好ましくは、エンテロウィルス群（本明細書で定義した）の全血 清型に対して結合し、受託番号第８８０４１４０１号の下、連合王国ンールズベ リー・ニス・ピー・フォー・オー・ジェイ・ジー、ポートン・ダウン、ビー・エ イチ・エル・ニス・センター・フォー・アプライド・マイクロバイオロジー・ア ンド・リサーチ、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチ ャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ １ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ。

Ｐ　ＨＬ　Ｓ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ　＆　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　　５ａｌｉｓｂｕｒｙ　Ｓ　Ｐ　４　０　Ｊ　Ｇ、 　Ｕ、に、）に１９８８年４月１４日に寄託されたハイブリドーマセルラインに よって分泌される５−Ｄ８／ｌと命名されたモノクローナル抗体を提供するもの である。

本発明は、本発明の抗体を分泌する、受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨー ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４ 月１４日に寄託されたノ・イブリドーマセルラインを提供するものである。本発 明は、さらに、受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピアン・コレクショ ン・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１４日に寄託したノ １イブリドーマセルラインのものと実質的に同一の特性を有するクローン、サブ クローンおよび細胞にまで及ぶ。

本発明者らは、さらに、驚くべきことに、５−Ｄ８／ｌと命名されたモノクロー ナル抗体が、エンテロウィルス（本明細書で定義した）のＶＰＩタンパクに対す るヒト抗体の存在にかかわらず、該ＶＰＩタンパクに対して結合能を有すること を見いだした。故に、このモノクローナル抗体は、エピトープが（ｉ）エンテロ ウィルス群（Ａ型肝炎ウィルスを除く）の全体にわたって保有されており、（ｉ ｉ）ヒト抗体が結合するものとは異なるエピトープであるエンテロウィルスのＶ ＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有するｌ（ラトープを有すると思わ れる。

また、エンテロウィルス群の全体にわたって保有されているｖＰｌタンパクのエ ピトープに対して結合能を有するパラトープを有するモノクローナル抗体の少な くとも１つの７ラグメントからなる／＼イブリッド抗体であって、この少なくと も１つのフラグメントがＦａｂフラグメントバラトープおよびイディオタイプか ら選択されることを特徴とするハイブリッド抗体も本発明の範囲内に含まれる。

通常、モノクローナル抗体に免疫測定マーカーを供給するのが好都合である。故 に、本発明は、エンテロウィルスのＶＰＩタンパクのエピトープに対して結合す るモノクローナル抗体からなり、該エピトープが全エンテロウィルス（Ａ型肝炎 ウィルスを除く）のＶＰＩタンパクの全体にわたって保有されており、該抗体が 免疫測定マーカーで標識されていることを特徴とする標識化抗体も包含する。こ のような免疫測定マーカーは、発蛍光団マーカー、発光測定マーカー、酵素マー カー、ハプテンマーカーまたは放射性同位体であり得る。モノクローナル抗体へ のマーカーの導入は、標準的技術を用いて行うことができる。発蛍光団マーカー は、米国特許ＵＳ−Ａ−３９４０４７５に開示されている。発光測定マーカーと しては、ルミノールが挙げられる。酵素マーカーは、米国特許ＵＳ−Ａ−３６４ ５０９０に開示されている。セイヨウワサビペルオキシダーゼは好適なｍ素マー カーであり、グルタルアルデヒドのような架橋結合分子によって抗体とコンジュ ゲートし得る。／為ブテンマーカーとしては、ビオチンが挙げられる。放射性同 位体の例としては、１２″■のようなヨウ素の放射性同位体を挙げることができ る。

本発明は、エンテロウィルスのＶＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有 するモノクローナル抗体からなり、該エピトープがエンテロウィルス群（本明細 書で定義した）の全体にわたって保護されており、該抗体が固相に結合している ことを特徴とする免疫吸収剤を提供するものでもある。標準的技術を用いて、例 えば、ビーズもしくは管状、まｌ；は例えば、マルチウェルプレートのウェル面 のようなウェル面状の、濾紙、ナ７０ン、ポリエチレン、ポリスチレンまたはポ リプロピレンのようなポリマーであってもよい固相に抗体を結合させることがで きる。固相は、アガロースのようなシュガー、または変性アガロースのような変 性シュガー、または架橋デキストランであってもよい。多糖類支持体に抗体を結 合させる方法は、米国特許ＵＳ−Ａ−３６４５８５２に開示されている。

本発明は、さらに、 （ａ）エピトープがエンテロウィルス群の全体にわたって保有されているエンテ ロウィルスのｖＰ１タンパクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナ ル抗体からなり、該モノクローナル抗体が固相に結合している免疫吸収剤を製造 し、（ｂ）該免疫吸収剤と、エンテロウィルスのＶＰＩタンパクヲ含有している 液体媒質を接触させ、 （ｃ）次いで、吸収されたＶＰＩタンパクを免疫吸収剤から溶離する工程 かもなるエンテロウィルスのＶＰＩタンパク含有液体媒質からエンテロウィルス のＶＰＩタンパクを分離する方法を提供する。

また、本発明は、モノクローナル抗体５−Ｄ８／ｌを利用して、血清および他の 生物学的液体のような液体試料中のエンテロウイルス、その抗原、およびそれに 対する抗体に関する検査を提供するものである。

また、本発明は、 （ａ）免疫測定マーカーで標識した抗体を含む液体媒質であって、該抗体が、エ ピトープが全エンテロウィルスのＶＰＩタンパク中に保有されており、かつヒト 抗体を結合するＶＰＩタンパクのエピトープとは異なるエピトープである液体媒 質を製造し、（ｂ）該液体媒質中で組織試料をインキュベートし、（Ｃ）インキ ュベートしｊ；組織試料を洗浄し、（ｄ）組織試料中の結合標識化抗体の存在ま たは非存在を測定し、結合標識化抗体の存在によって組織試料中のエンテロウィ ルスの抗原の存在が示される ことを特徴とするヒト組織試料中のエンテロウィルスの抗原の存在または非存在 を測定する免疫細胞化学的方法を提供するものである。

液体試料中のエンテロウィルスの抗原の存在または非存在を検出する方法は、 （ａ）ハイブリドーマセルラインによって産生されたモノクローナル抗体であっ て、該抗体が、エピトープがＡ型肝炎ウィルスを除くエンテロウィルスとして知 られているウィルス群の全体にわたって保有されているエンテロウィルスのＶＰ Ｉタンパクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体を製造し、 （ｂ）液体試料の存在下で組繊細胞を培養し、（ｃ）得られた培養細胞を固定化 し、 （ｄ）該固定化細胞と工程（ａ）のモノクローナル抗体とを接触させ、次いで、 （ｅ）結合抗体の存在または非存在について固定化細胞をモニターし、結合抗体 の存在によって液体試料中のエンテロウィルスの抗原の存在が示される ことからなる。

本発明の別の態様は、 （ａ）エピトープが（１）エンテロウィルス群の全体にわたって保有されており 、かつ（ｕ）ヒト抗体が結合するものとは異なるエピトープであるＶＰＩタンパ クのエピトープに対して結合能を有するバラトープヲ有スるエンテロウィルスの ＶＰＩタンパクに対するモノクローナル抗体である第１抗体を含有している液体 媒質を製造し、（ｂ）抗−１ｇＧおよび抗−１ｇＭから選択される固定化第２抗 体と液体試料とを接触させ、 （Ｃ）接触した固定化第２抗体を洗浄し、（ｄ）洗浄した固定化第２抗体とエン テロウィルスのＶＰＩタンパクとを接触させ、 （ｅ）次いで、ｖＰｌタンパク処理した固定化第２抗体と工程（ａ）の液体媒質 とを接触させ、そして、 （ｆ）得られた抗体処理固定化第２抗体を結合第１抗体の存在または非存在につ いてモニターし、結合第１抗体の存在によって試料中のエンテロウィルスに対す る抗体の存在が示されることを特徴とする抗体の患者から採取しｌ；液体試料中 のエンテロウィルスに対する抗体の存在を検出する方法を提供するものである。

液体試料は、例えば、血液、血清、脳を髄液または心腹輸液であり得る。この方 法では、予め決定されｌ；量のＶＰｌタンパクを工程（ｄ）で使用することがで き、一方、予め決定された量の第１抗体を含む量の工程（ａ）の液体媒質を工程 （ｅ）で使用し、その結果、工程（ｆ）で観察された結合第１抗体の量によって 液体試料中のエンテロウィルスに対する抗体のレベルの程度が得られる。

さらに、本発明は、 （ａ）エピトープがＡ型肝炎ウィルスを除くエンテロウィルスとして知られてい るウィルス群の全体にわＩ；って保有されているエンテロウィルスのＶＰＩタン パクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体である第１抗体を 製造し、（ｂ）液体試料と予め決定された量の第１抗体の混合物を平衡させ、（ Ｃ）固定されたエンテロウィルスのＶＰＩタンパクからなる第１基質を製造し、 （ｄ）工程（ｂ）の平衡化混合物と工程（ｃ）の第１基質とを接触させ、（ｅ） 接触した第１基質を洗浄し、 （ｆ）固定されたエンテロウィルスのＶＰｌタンパクからなり、工程（ｃ）の第 １基質と実質的に同一である第２基質を製造し、（ｇ）工程（ｂ）で使用した予 め決定された量の第１抗体と工程（ｆ）の第２基質とを接触させることによって 得られる対照試料と、工程（ｅ）の洗浄された第１基質上の結合第１抗体の量と を比較し、次いで、接触した第２基質を洗浄し、第２基質上の結合基質の量と比 較して第１基質上の結合第１抗体の量の減少によって液体試料中のエンテロウィ ルス抗原レベルの程度が得られることを特徴とする液体試料中のエンテロウィル スの抗原を検出する方法を提供するものである。

免疫検査キットは、別々の容器に入れた、（１）エピトープが（１）エンテロウ ィルス群の全体にわたって保有されており、（ｕ）ヒト抗体と結合するものとは 異なるエピトープである、ＶＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有する バラトープを有するエンテロウィルスのＶＰＩタンパクに対するモノクローナル 抗体、 （ｎ）抗−１ｇＧ３よび抗−１ｇＭから選択される固定化第２抗体、および （１）エンテロウィルスのＶＰＩタンパクからなり得る。

他の免疫検査キットは、別々の容器に入れた、（Ｉ）エピトープがＡ型肝炎ウィ ルスを除くエンテロウィルスとして知られているウィルス群の全体にわたフて保 有されているエンテロウィルスのＶＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を 有するモノクローナル抗体、および （ＩＩ）固定されたエンテロウィルスのＶＰｌタンパクからなる基質からなって いる。

図面を介して、以下の記述において、本発明の種々の態様について説明する。

ウィルスおよびマウス ウィルスストックを種々の連続的なセルライン中で調製し、−７０℃で貯蔵した 。使用したウィルスは、ツクサラキーウィルス８１〜Ｂ６、エコーウィルス１１ ．２２および２４、ポリオウィルス］、２および３、コクサラキーウィルスＡ７ ．９８よび１６、ライノウィルス】Ａ％Ａ！肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、黄熱病（ ＹＥ）、麻疹ならびにロタウィルスであった。

ＨＡＶを除く全エンテロウィルス菌株を、プラスチック製ペトリ皿上で増殖させ たヘラ（Ｈｅｌａ）　Ｓ−３ｍ砲車層上で、プラーク方法によって検査した。ウ ィルス濃度は、ストックウィルス調製物１１１Ｑ当たりのＰＦＵの数で定義した 。ＨＡＶの感染性検査は、定量的酵素−結合免疫吸収剤検査を用いて行った。マ ウスの免疫のためにコクサラキーＢ５　［ＣＢＳ　（７＃−フナ−（Ｆ　ａｕｌ ｋｎｅｒ）菌株）］の原型菌株を使用した。２つのＣ５ＣＱ勾配液中におけるバ ンディングによって該ウィルスを精製した。雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを使用した 。

ハイブリドーマ調製 １０’ＰＦＵ／！１＋＜１を含有するウィルスの試料を、５６℃で３０分間加熱 し、雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに完全７０インドアジユバント（ＣＦＡ）中で皮下 的に接種した。２週間後に不完全アジュバントヲ用いてこの投与を繰り返し、融 合の３日前に静脈内に水性ブースター投与を行った。

コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスティン（Ｍ　ｉ　１ｓｔｅｉｎ）の技術 ［ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２５６．４９５−４９７　（１９７５）］ によって免疫されたマウス由来の牌臓リンパ球とマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ）を 非経口的に融合させることによって、ハイブリドーマセルラインを調製した。Ｃ ＢＳと反応性のある抗体を分泌するハイブリドーマラインを間接免疫蛍光検査法 （Ｉ　Ｆ）によって同定し、マクヵーン（ＭｃＫｅａｒｎ）の限界希釈方法［「 モノクローナル・アンチボディズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ）Ｊ、プレナム・プレス（Ｐ　Ｉｅｎｕｍ　Ｐ　ｒｅｓｓ）、ニュ一ヨーク、 （］、９８Ｑ）、＄４０３頁〜第４０４頁〕によってクローンした。その後、こ れらのクローンを、ＣＢＩ、ＣＢ２．ＣＢ３、ＣＢ４、ＣＢ６、コクサラキーウ ィルスＡ７（ＣＡ７）、ＣＡ９、ＣＡｌ６．エコーウィルス１１２２および２４ 、ポリオウィルス１．２および３、ＨＡＶ、ライノウィルスＩＡ、　ヒトロタウ ィルス、麻疹ウィルス、ＹＦならびにアデノウィルスに対するＩＦによって試験 した。

間接免疫蛍光検査法 マルチスポットスライドガラス上に感染培養物からトリプシン分散細胞をスポッ トすることによって、ＩＦに関する抗厚基質を調製した。非感染細胞を対照とし て同様に処理した。これらの調製物をアセトン中で２０分間固定し、乾燥し、使 用するまで凍結させておいた。該スポットを非希釈および１：１０希釈のハイブ リドーマ上澄み液に暴露した。次いで、蛍光抗マウス免疫グロブリンを使用して 、ガードナー（Ｇ　ａｒｄｎｅｒ）およびマクイーン（ＭｃＱｕｉｎｎ）のＩＦ 法［「ラビッド・ウィルス・ダイアグノウンス、アプリケーション・オブ・イム ／フルオレセンス（Ｒａｐｉｄ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）Ｊ、バターワース 、ロンドン（１９７４）］によって、結合マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）を検出 した。

免疫プロッティング検査法 ナズ（Ｎ　ａｚ）らの方法［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２５．３４２ 〜３４４（１９８４）］の変形を用いてＩＦによって試験したものと同一の範囲 のウィルスを用いて酵素免疫結合技術を使用することによって、ＣＢＳ反応性モ ノクローナル抗体の交差反応性を確認した。

すなわち、バイオラッド（Ｂ　ｉｏＲａｄＴＭ）ドツト−プロット装置を用いて 、ニトロセルロース（ＮＣ）膜のストリップ上に抗体を吸着させた。

次イテ、０．０５Ｍ　　）リス（ｔｒｉｓ）、０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．５％ トゥイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０　ＴＭＸｐＨ１０、３）に入れた３％ウシ 血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）でブロックすることによって残存結合部位を飽和 させた。次いで、ストリップをモノクローナル抗体（５−Ｄ８／ｌ）でインキュ ベートし、適当に洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗−マウスγ−グロ ブリンでインキュベートした。次いで、ジアミノベンジジンおよび過酸化水素で 免疫プロットを展開させた。

非感染組織培養細胞およびエンテロウィルスとは異なったウィルスを対照として 使用した。

ウェスターンプロット ウェスターンプロットを用いて、５−Ｄ８／ｌモノクローナル抗体によって認識 されたエピトープを図形化した。１２．５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ ゲル電気泳動によって、精製したウィルスタンパクを分離し［レムリ（Ｌａｅｍ ｍｌｉ）、ネイチＪＦ　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）２２７、第６８０頁〜第６８５頁 （１９７０）参照］、電気溶離によってＮＣ膜に移動させ、次いで、上記のよう に免疫プロットするために処理した。ビオチン化した分子量マーカーも電気泳動 し、プロットシ、ペルオキシダーゼ結合ストレプタビジンで染色して、反応性ピ リオンタンパクの位置を確めた。

モノクローナル抗体アイソタイプの測定特異性ウサギ−抗−マウスＩｇＧ、、１ ｇＧ２い　１ｇＧ２い　ＩｇＧ、およびＩｇＭを使用して二重免疫拡散法によっ て、上澄み液調製物中のモノクローナル抗体のサブクラスを測定した。

中和、補体結合および赤血球凝集抑制試験グリスト（Ｇｒｉｓｔ）らのマイクロ タイター中和試験［「ニュートラリゼーシ３ン・テスラ：イン・ダイアグノステ ィック・メソッズ・イン・クリニカル・パイロロジイ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔ ｉｏｎ　Ｔｅ５ｔｓ　：　ｉｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｖｉｒｏｌｏｇｙ）Ｊ、第８１頁〜第９４頁、ブラックウェ ル、オフスフオード（１９７９）］の変形を使用した。すなわち、５−Ｄ８／ｌ 免疫性腹水（５０μｇ）の一連の２倍希釈液を、１００　　ＰＦＵの攻撃ウィル ス（ＣＢＩ、ＣＢ３またはＣＢＳ）と反応させた。次いで、ベロ（Ｖ　ｅｒｏ） 細胞（１，５ＸｌＯつを添加し、プレートを、空気中５％ＣＯ８中、３７℃で７ 日間インキュベートした。力価は、ウィルス−特異性細胞変性効果（ＣＰＥ）に 対する完全な保護を示す最大希釈として顕微鏡的に読み取った。

マイクロタイタープレートを用いて、ホークス（Ｈａｖｋｅｓ）の方法［レネッ テ（Ｌ　６ｙ１ｎｅｔｅ）、シュミット（Ｓ　ｃｈｍｉｄｔ）、「ダイアグノス ティック・プロシージャーズ・フォー・バイラル、リケッチアル・アンド・クラ ミジアＡｙ−イン７エクシ３ンズ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｓｆｏｒ　ｖｉｒａｌ、　ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ　ａｎｄ　ｃｈｌａｍｙｄｉ ａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」：　嬉５版、第３頁〜第４９頁、アメリカン・ パブリック・ヘルス・アソシエイシツン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈ ｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、ワシントン（１９７９）］によって補 体結合試験（ＣＦ　Ｔ）および赤血球凝集抑制試験（ＨＡＩ）を行った：　５− Ｄ８／１免疫性腹水を試験抗体として使用し、ウサギ過剰免疫性血清を陽性対照 として使用した。標準化したＣＢＩ、Ｃ８４およびＣＢ５ウィルスを抗原として 使用した。

ＣＦＴに対する力価は、指示細胞（合成ヒツジ赤血球）の完全な溶解を示す抗体 の最大希釈として表した。ＨＡＩ力価は、Ｏ型とと赤血球の凝集を完全に抑制す る抗体の最大希釈として読み取った。

１０８個のハイブリドーマの全部を６つの融合法で誘導した。これらのうち、７ ５個は適切な特異性を示さず、９個はＩＦ試験において対照ベロ細胞と反応した ので、無視した。１４個のハイブリッド上澄み液は、最初のスクリーニング試験 においてコクサノキーウイルスＢ５と特異的に反応し、６個だけが限界希釈での クローニングにおいて活性を維持した。これらのモノクローナル抗体のうち４個 は同様の免疫化学的性質および他のエンテロウィルスとの広範な反応性を有して いた。これに基づいて、これらのうちの１つ、５−Ｄ８／１を別の研究の！こめ に選択した。抗体５−Ｄ８／Ｉを分泌するハイブリドーマセルラインは、受託番 号筒８．！１１０４１４０］号の下、ヨーロピアン・フレクション・オン・アニ マル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１４日に寄託された。

免疫化学的性質 ゲル拡散法によって決定する免疫グロブリンアイソタイプによって５−Ｄ８／１ がＩｇＧ、、サブクラスのものであることが分かつｊ；。

広範なエンテロウィルスならびにピコルナウィルス以外のウィルスを使用して行 ったウェスターン・プロットによって、モノクローナル抗体が相対分子量３４， ０００〜３７，０００を有する単一のペプチドと反応することが分かった。銀染 色データ８よびエンテロウィルスペプチドの公知の電気泳動移動度［カッンエ（ Ｋａｔｚｅ）およびクロウエル（Ｃｒｏｗｅｌｌ）、ジャーナル・オン・ゼネラ ル・パイロロジイ（Ｊ　、ｇｅｎ、Ｖ　１ｒｏ１．）、５０、第３５７頁〜第３ ６７頁（１９８０）］を用いることによって、５−Ｄ８／ｌ抗体がＶＰＩペプチ ドと反応することは明らかである。ウェスターン・プロットによって、全エンテ ロウィルスが５−Ｄ８／ｌ抗体と反応し、ＨＡＶが唯一の例外であることが分か った。対照ウィルス（エンテロウィルスではないＹＦおよび麻疹）は陰性であっ ｌ；。

コクサラキーウィルスＢ３、Ｂ５、ポリオウィルス１１エコーウイルス１１，２ ２、ＹＦおよび麻疹ウィルスを全て部分的に精製し、力価１０’ＰＦＵ／ｌ１ｌ ｆｆで使用した。ＨＡＶもゲアリック（Ｇａｒｅｌｉｃｋ）らの開示した方法［ プロシーデインダス・オン・ジ・インターナショナル・フンフエレンス・オン・ バイラル・ヘバティティス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉ　ｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｅｅ　ｏｎ　ＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉ ｔｒｓ’ｔ、ロンドン（１９８７））によって検査したものと一致する力価で部 分的に精製しｌ；。コクサラキーウィルスＡ７およびＡ９を力価ｌＯ・ＰＦＵ／ ｍＱで組織培養上澄み液として使用し、これは、ウェスターン・プロットにおけ る比較的弱いバンドの原因でありｌ；。

免疫蛍光検査法および酵素免疫測定法 １Ｆによると、５−Ｄ８／１抗体は、試験したエンテロウィルスの全部と反応し たが、無関係のウィルスまたは細胞対照とは反応しなかった。結果を下記第１表 に示す。定量的には、使用しｔ；腹水によって、種々のエンテロウィルスに対し て１０！〜１０’の範囲の力価が得られｔ；。

第４表の注意書： ■、交差反応は、酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）および間接免疫蛍光検査法（Ｉ Ｆ）によって検査した。

２、力価は、ｌｏｇ＋。の逆数で表した。

酵素免疫測定法によると、非特異性反応を伴わず、高い抗体希釈液で強く染色す ることが非常に明確であった。定量的には、この測定法は、ＩＦよりも敏感であ り、１０倍またはそれ以上の力価を得た。面測定法は、エンテロウィルスの遺伝 子に対するこのモノクローナル抗体の群特異性を確認した。他方、ＨＡＶは２つ の系のいずれにおいても反応しなかった。

生物学的性質 ＝１］、５−Ｄ８／Ｉ抗体は、試験しｌ：免疫性腹水の最低希釈液（１：ｌＯ） でさえ、ＣＢＩＳＣＢ３、ＣＢ５ウィルスを中和しないことが分かった。

補体結合：ＣＦＴにおいて、モノクローナル抗体は、非常に高い希釈液で使用し ても有効に補体を固定することが分かった。結果を下記第２表に示す。

第２表 第２表の注意書： 抗体の３種類の生物学的機能は、中和する能力、補体を固定する能力、赤血球凝 集を抑制する能力をｌｏｇ、。の逆数で表した力価で評価した。

赤血球凝集＋５−Ｄ８／ｌ抗体は、ＣＢＩ、Ｃ８４およびＣＢＳによって赤血球 凝集の特異的な抑制を示した。第２表は、ＨＡＩ試験によってモノクローナル抗 体免疫性腹水の高い力価が得られたことを示している。ＣＢＩ、Ｃ８４およびＣ ＢＳウィルスに対するウサギ免疫性抗血清は、３つの生物学的試験において陽性 対照として挙げられており、結果、５−Ｄ８／′１データの有効性が確認された 。

叩 エンテロウィルス感染は、非常に大部分が無症状であり、しばしば気付かれずに 通過するけれども、急性および慢性のヒト疾患に対するこれらのウィルスの寄与 力は重要である［キング（Ｋｉｎｇ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　ｉ　１ 第１３９７頁〜第１３９９頁（１９８３）およびポウルズ（Ｂｏｙｌｅｓ）ら、 ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　　ｉ　、第１１２０頁〜第１１２２頁（１９８６ ）参照］。エンテロウィルスに関連する疾患は、ある血清型と特異的には関係し ていないので、中和−特異性エピトープ自体は、少しは病因に含まれるとしても 、有意には病因に含まれていないと推測し得る。この疾患原因に関する群特異性 研究の概念は、疾患進行の開始あるいは維持における群特異性エピトープの役割 に疑問を抱かせる。

研究および診断の両方においてエンテロウィルスの研究室調査の現在の複雑性を 与えると、本発明のエンテロウィルス群反応性抗体５−Ｄ８／１は、非常に有用 な分析学的試薬であると思われる。新しいデータによって、ＶＰｌペプチドがグ ループＢコクサッキーウイルスの主な一般的抗原決定要素を含むことが分かった けれども、本発明は、これがＨＡＶ以外の試験したエンテロウィルス全てに対し て真実であることを示す。本発明は、抗体５−Ｄ８／ｌによって認識されるＶＰ Ｉタンパクの適切なエビドーグが高度に保有されており、これは、トレイシー（ Ｔ　ｒａｃｙ）ら［アブストラクッ・オン・ジ・インターナショナル・シンポジ ウム・オン・インフラマトリ−・ハート・ディシーズ（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｉｎｆｌ ａｍｍａｔｏｒｙ　Ｈｅａｒｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、第８０頁、ヨーロピアン・ ソサイエテイ−やオン拳カージオロジ−（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　 ｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ）、ウルッパーグ（１９８７）］によって作成された Ｃ８４から誘導されたｃＤＮＡプローブを使用する近年のゲノム研究と一致する 。

エピトープを生じる中和抗体が血清型−特異性であることが知られているので、 抗体５−Ｄ８／１が中和抗体ではないことは予測することができた。検査がさら に好都合である研究室において、エンテロウィルス単離体を同定するために５− Ｄ８／１抗体の有効補体結合力を確寅に利用することができる。該抗体は、明ら かに、エンテロウィルスの研究および診断において有用性を有する。

診断方法におけるモノクローナル抗体５−Ｄ８／ｌの適用について、以下に説明 する。

臨床学的単離体の同定 これらの試験において、上記ナズらの方法によるドツト−プロット酵素免疫測定 法によってエンテロウィルスの１３０種類のフィールド単離体を２回スクリーニ ングした。該試験において、対照として、８種類のヒトアデノウィルスの臨床学 的単離体、２種類のロタウィルスの単離体、黄熱病ウィルスおよび麻疹ウィルス ワクチン菌株、ならびに非感染組織培養細胞が含まれた。ＮＣ膜のストリップ上 における抗原の吸着の後、まず、５−Ｄ８／ｌ抗体と共にインキュベートし、次 いで、ペルオキシダーゼ標識化ウサギ抗マウスγグロブリンと共にインキュベー トした。次に、ジアミノベンジジンおよび過酸化水素を用いて色素を展開させ、 該ストリップを乾燥させ、色濃度を濃度計で読み取った。

慢性ウィルス性疲労後症候群（ｐｏｓｔ−ｖｉｒａｌ　ｆａｔｉｇｕｅ　ｓｙｎ ｄｒｏｍｅ）にかかっている８７人の患者から血清を得た。別の血清群は、免疫 複合体の形成に関連する他の疾患、例えば、亜急性細菌性心内膜炎、全身性エリ トマト−デス（紅斑性狼η）、および慢性関節リウマチにかかつている３２人の 患者から得た。第３の血清群は、性、年齢および地理学的位置が同一である３５ 人の正常な個体から得た。第２群および第３群は、対照として作用した。第１群 および第２群の血清の全ては、バートン−キー（Ｂ　ｕｒｔｏｎ−Ｋ　ｅｅ）ら ［ジャーナル・オン・クリニカル・パンロジー（Ｊ　、ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ、） 、３３：第６５３頁〜第６５９頁（１９８０））のポリエチレングリコール沈殿 法によって測定すると、循環１ｇＭ複合体を有することが予め分かった。ダンバ イアント（Ｄａｍｂｕｙａｎｔ）ら［クリニカル・アンド・エキスベリメンタＬ −パソロジー（ＣＩｉｎ、ｅｘｐ、Ｐａｔｈ、）、３７：第４２４頁〜第４３２ 頁（１９７９）］およびゼウジー（Ｚｅｗｄｉｅ）　［Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉ ｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８３）］の方法の変形を 用いて、複合化抗原の性質を研究した。すなわち、非希釈ペルオキシダーゼ結倉 ５−Ｄ８／１抗体１０ｐＱを患者の血清１００μ４４ｍ添加シ、０゜０２＋ｌ１ ＭＥＤＴＡの存在下、４℃で６日間インキュベートした。血清内で標識化抗体が ＩｇＭ循環免疫複合体の抗原性特性と反応すると、多少の標識化５−Ｄ８／ｌ抗 体が複合体中で結合した。６日間の平衡の後、免疫複合体をｌｏ＋ｎＭＥＤＴＡ 中２％の最終濃度のエチレングリフールで沈殿させた。次いで、基質（４−アミ ノ７エナゾンおよび過酸化水素）を添加し、分光測定的に色を測定することによ って、沈殿したｉ脆化抗体の量を測定した。

免疫組織化学的染色 立証されたコクサッキーＢ４心筋炎によって死亡した子供からの固定化凍結心筋 炎切片を、上記ガードナーおよびマクィーンの間接免疫蛍光検査法によって試験 した。アセトン固定化凍結切片をリン酸塩緩衝化食塩水中で洗浄し、次いで、温 室中、３７°Ｃで１時間、５−Ｄ８／］抗体腹水のｌ＋ｌｏＯ希釈液と共にイン キュベートした：これに次いで、イソチオシアン酸フルオレセイン結合つサギ抗 でウスグロブリンを塗布した。さらに３７℃で１時間インキュベートした後、切 片をエバンスブルーで対比染色し、グリセロール中にコクサラキーウィルスＢｌ （タクソン（Ｔｕｃｓｏｎ）菌株）に感染したＣＤ−１マウスおよびコクサラキ ーウィルスＡ９に感染したＥ　ａｌｂ／Ｃマウス由来のホルマリン固定化パラフ ィン包埋骨格筋剖検体を免疫ペルオキシダーゼ染色法によって試験した。脱蝋お よび再水化の後、ノーバート（ＮｏｒｂｅｒＬ）らの方法によって染色を行った 。グラハム（Ｇ　ｒａｈａｍ）ら［ジャーナル・オン・ヒストケミストリー・ア ンド・サイトケミストリー（Ｊ　−Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ）、１４：第２９１頁〜第３０２頁（１９６６）］によって記載された方法によ って、ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジンおよび過酸化水素で展開させ た。次いで、切片をヘマトキシリンで対比染色し、ＤＰＸＴＭ封入剤（ｍｏｕｎ ｔａｎｔ）中に封入した。

フィールド単離体のドツト−プロット酵素免疫測定法による同定の結果を第１図 に示す。各試料は２回操作し、各々の平均値を算出し、該平均値のｌｏｇ＋ｏ値 をプロットした。陽性と思われる試料の切断レベルは、対照試料の平均値に２つ の標準偏差値を加えたものとした。これらの結果から、臨床学的単離体１３０個 のうち１２２個（９５％）が５−０８／１抗体によってエンテロウィルスである と好都合に同定されたことが明らかである。対照試料の全てがこの試験において 陰性であった。

循環免疫複合体における抗原の検出 ペルオキシダーゼ標識化エンテロウィルス群反応性抗体５−Ｄ８／ｌによる患者 の血清および対照間の交差反応を第２図に示す。ウィルス性疲労後症候群にかか つている患者の血清は、対照グループと比較して、標識化５−Ｄ８／１抗体との 結合において有意な増大を示した（Ｘ２−２４．１　；　ｐ＜０．０１）。これ によって、これら患者における複合体が５−Ｄ８／ｌモノクローナル抗体が指向 するエンテロウィルスエピトープと同一またはそれと交差反応性である抗原を含 有していることが分かった。

ｉｎ　５ｉｔｕ　＆Ｌｆｆ、検出 間接免疫蛍光検査法によって、コクサンキーウィルスＢ４感染に関連する致命的 な急性心筋炎が確認された患者から得た死後の心臓切片において、５−Ｄ８／ｌ 抗体は、抗原を選択的に染色した。

５−Ｄ８／ｌの代わりにモノクローナル抗体１４ｂを用いることによって特異性 を確認した。免疫蛍光検査法は、ウィルスの細胞質複製と一致する個々の筋原線 維の細胞質に限定された。

間接免疫ペルオキシダーゼ染色法によって、マウス組織において、５−Ｄ８／ｌ はコクサラキーウィルスＢｌおよびＡ９抗厚と顕著に反応シた。コクサラキーウ ィルスＢ］（タクソン菌株）に感染した後、筋炎を発病したマウス由来の切片に おいて、感染の５週間後でも、群反応性抗原は検出可能である。ウィルス接種の 後、致命的な筋炎全発病したマウスにおいてコクサッキーウイルスＡ９抗原を検 出することができる抗体５−Ｄ８／ｌの能力が、明らかに示された。

５−Ｄ８／１の代わりにモノクローナル抗体１４ｂで染色した対照切片は、如何 なるペルオキシダーゼ活性をも示さなかった。

想 本発明の単一のドットーブロフト酵素免疫測定法は、フィールド単離体の９５％ を同定することができた。残り５％の同定されなかった単離体は、その結果とし て、低い力価（＜１０’プラーク−形成ユニット／＋ａＮ）を有することがわか り、間接免疫蛍光検査法によって５−Ｄ８／ｌ抗体によって同定された。この結 果は、５−Ｄ８／１モノクローナル抗体によって認識される適切なＶＰＩエピト ープが高度に保有されていることを明白に示した。５−Ｄ８／ｌ抗体を用いて行 った検企が特定の血清型を同定しないという事実は、臨床学的に非常に重要なも のであるとは思われない。

循環免疫複合体の検出および測定において用いた方法の主たる利点は、免疫複合 体関連疾患における疾患活性を伴わない、このような疾患の予後の治療効果をモ ニターすることにある。しかしながら、これらの方法によって、疾患の原因であ る抗原の性質について診断的助力は得られなかった。本発明において使用される 緩慢な反応方法は、平衡状態で抗原／抗体反応の可逆性の簡単な原理を利用する 。

この方法は、循環複合体に存在する特異性ウィルス抗原の同定を可能にし、した がって、感染原因の同定を可能にする。ウィルス性疲労後症候群とエンテロウィ ルスとの関係は開示されている［ビハン（Ｂ　ｅｈａｎ）ら、ジャーナル・オン ・インフェクション（Ｊ　、　Ｉ　ｎｆｅｃｔ、）、１０５：第２１１頁〜第２ ２２頁（１９８５）およびマツカートニー（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ）ら、ジャーナ ル・オン・メディシナル・パイロロジー（Ｊ　、ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、）、１９ ：第２０５頁〜第２１２頁（１９８６）］。

モノクローナル抗体５−Ｄ８／Ｉに基づく試験によって、この症候群を有する患 者の約５０％がベルオキンダーゼ標識化５−Ｄ８／１抗体と強く反応するＩｇＭ 複合体を有していることが分かり、これは、複合体中の抗原がエンテロウィルス 群反応性抗体に対する特異性を有することを示している。

免疫蛍光検査法または免疫ペルオキシダーゼ法のいずれを用いても固定または凍 結させｊ：切片を染色することの困難性は、あるとしても小さい。この群反応性 抗体５−Ｄ８／ｌは、エンテロウィルス研究に対する免疫組織化学的研究を現実 にする。

５−Ｄ　８　／　ｌ抗体の精製および標識化腹腔内にハイブリドーマを接種して から１４日後、ハイブリドーマを産生ずるマウス由来の腹水６３０ｉ（ｌのプー ルを集めた。０．１５塩化ナトリウムに入れたｌｏｍＭＥＤＴＡ中１％アガロー ス中に１．５％ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清を含有している２ｍｍゲルにおいて 単一放射状免疫拡散法を行った。腹水ｌＯμａを４０ｍｍウェル中に置き、他の ウェル中に精製したマウスＩｇＧ標準物を置いた。

該プレートを３７℃で一晩インキユベートし、翌日、リングの直径を測定した。

プール中の■ｇＧの合計量を算出すると、２４５１ｇであった。小さい直径１５ ｍｍのカラム中、ｌ　ＯｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ７，６を用いて、タンパクＡ−セファ０−ス（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　［７ フルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］　ｌ　２ｍＱを含有するアフィニティーカ ラムを調製した。同一緩衝液に対して腹水を透析し、カラムに入れた。全ての液 体をカラムに通過させた後、溶出液が検出可能なタンパクを含有しなくなるまで 、該カラムを緩衝液で洗浄した。次いで、該カラムをＯ，１Ｍクエン酸ナトリウ ム／クエン酸緩衝液、ｐＨ３，０で溶離し、ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　 １ａ）ＦＰＬＣンステムを用いて、タンパク含有画分を集めた。限外濾過によっ て溶出液を濃縮し、０．１Ｍリン酸塩緩衝液に対して透析し、抗マウス血清に対 する免疫電気泳動によって純度を示した。使用するまで、最終溶液を一７０°Ｃ でアリクオツド中に貯蔵した。

放射性標識化 １５０μＣのヨウ化ナトリウム（Ｈａｌ！Ｂ　■）を用いて、ハンター・アンド ・グリーンウッド（Ｈｕｎｔｅｒ　＆　Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）　［ｒハンドブッ ク・オン・イムノロジカル・メソッズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ）Ｊ、第１７．２頁〜第１７．１２頁、ウィア ー・デー・エム（Ｗｅｉｒ　ＤＭ）！、ブラックウェル・サイエンティフィック ・パブリケーションズ、ロンドン（１９７４）］の方法によって、アフィニティ ー精製した５−Ｄ８／１　１０μりを１２５■で標識した。該反応まで一７０℃ で貯蔵した。容量２ｍＱ中における最終調製物の比活性は、９０００ｃｐｍ／μ ｆｆ、または１．８　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ／μｌ’あった。

セイヨウワサビペルオキシダーゼによる標識化２工程法を使用した。セイヨウワ サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを、０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７− ５）１０ｍＱ中、４倍モル過剰の再蒸留グルタルアルデヒドで処理した。リン酸 塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対して透析することによって、遊離クルタルアルデ ヒドを除去した。該グルタルアルデヒド−Ｈ−ＲＰを、ＰＢＳ　　２ｍＱに入れ た５−Ｄ８／１モノクローナル抗体１２ｍｇにゆっくり添加した。

該混合物を室温で一晩撹拌しＩ；。残存する遊離グルタルアルデヒド基を過剰量 のエタノールアミンと反応させ、最終生成物をＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳ 　　ＰＡＧＥ電気泳動によって、ＨＲＰの９５％以上がマウスＩｇＧに結合した ことが分かった。最終溶液を、使用するまで一７０℃で貯蔵した。

ＶＰＩタンパク ウニルナ−（Ｗｅｒｎｅｒ）ら［ディー・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、第７巻、第５ 号、第３０７頁〜第３１６頁（１９８８）］の方法によって、ＶＰＩタンパクを 調製した。

！り惇Σ７−１ニティー力ラム ＶＰＩ調製物を精製するために、５−Ｄ８／ｌモノクローナル抗体に結合したセ ファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　［ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａ ｃｉａ）］のカラムを調製した。セファロース　４Ｂ２５ｍ（２の懸濁液を、０ 　、１　Ｍ　Ｎａ２ＣＯｓによる平衡化の後、４℃に冷却した。

さらに溶解しなくなるまで、固体臭化シアンの小さいフラグメントを添加した。

添加の間、ｐＨをモニターし、１．ＯＭ　Ｎａ２ＣＯ１を添加して、ｐＨをｐＨ ９，５またはそれ以上に維持した。反応の終わりに、多量の水を用いて、デカン テーションによって、ゲルを洗浄し、次いで、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７ ，５巾約２０％ｖ／　ｖ懸濁液中に再懸濁させた。同一緩衝液に入れた５−Ｄ８ ／ｌモノクローナル抗体］、７ｍｇを添加し、該溶液を４°Ｃで６時間撹拌した 。次いで、該ゲルをＰＢＳで洗浄し、直径１５ｍｍのカラム中に注いだ。

ｌ　Ｑ　’ｐｆｕコクサツキー８４ウィルスを接種したペロ（Ｖｅｒｏ）細胞の ６日培養物の組織培養上澄み液４．５ｍ（１を５６℃で３０分間加熱し、同量の ０．０５％デオキンコール酸ナトリウムで処理した。該溶液を１４．０００ｇで ３０分間遠心分離することによって透明にした。上澄み液を５−Ｄ８／ｌモノク ローナル抗体修飾アガロースカラムに入れ、次いで、溶出液がタンパクを含有し なくなるまでＰＢＳで洗浄した。次いで、該カラムを０．１Ｍクエン酸塩緩衝液 ｐＨ３，０で溶離し、Ｑ、５ｍｆｆ画分を集めた。

タンパク含有画分をプールし、限外濾過によって濃縮しＩ；。溶出し１２画分５ ０．ｃｒ（＋を、バイオラッド（ＢｌｏＲａｄ７′″）を気泳動装置を用いて、 ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけた。２つのゲルを調製した。一方は、タ ンパク帯についてオーロダイ（Ａｕｒｏｄｙｅ”）テ染色し、他方は、ニトロセ ルロース膜に対して電気溶離によって移し、次いで、ＨＲＰ標識化５−Ｄ８／ｌ モノクローナル抗体でプロットした。３７ｋｄの１つの主要な帯および２つの非 常に微かな汚染帯があっｌ：。ジアミノベンジジン／過酸化水素で対比染色する と、主要な帯だけがＨＲＰ標識化５−Ｄ８／ｌモノクローナル抗体で染色され、 これは、溶離したタンパクの純度が高いことを示した。汚染帯のうちの１つ、分 子量１５０ｋｄを存している汚染帯は、カラムに共有結合しているのではなく吸 着していた少量の５−Ｄ８／１モノクローナル抗体を表していると思われる。

ＶＰＩ抗原検出に関する免疫組織化学染亀囚免疫組織化学染色法によって組織試 料中のＶＰ１抗原を検出するために、モノクローナル抗体５−Ｄ８／Ｉを使用す ることができる。

組織標本 突発性多発性筋炎、ＰＶＦＳ、および急性心筋炎にかかつている患者由来の剖検 体または生検体として、ヒト起源の組織標本を得た。

多発性筋炎および心筋炎のマウス実験モデルから別の組織標本を得た。試料の大 半を、ホルマリン固定化およびパラフィン包埋し、残りを凍結した。

緩衝化ホルマリン（ｐＨ７，４のＰＢＳ中１０％ホルマリン）中で固定した組織 試料をパラフィン中に包埋し、マイクロドーム刃で厚さに、接着剤としてポリ− １−リジンを薄く塗り、その直後に組織学的切片を水浴から掬い上げた。過剰量 の水を排出し、該スライドガラスを６０°Ｃで１時間放置し、次いで、使用する まで貯蔵した。

凍結試料の低温槽切片（８μ次）をカバーガラス上に置き、冷アセトン（−２０ ℃）中で２０分間固定し、使用するまで凍結させ続けた。

間接免疫蛍光検査法（ＩＦ） 以下のように、免疫蛍光検査法によって、凍結試料の低温槽切片をエンテロウィ ルス群特異性抗原の存在について試験した。

切片をＰＢＳ中で再水化し、温室中、室温で１時間、５−Ｄ８／ｌモノクローナ ル抗体腹水の１＝５０希釈液中でインキュベートした。ＰＢＳ中で２０分間洗浄 した後、ＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスγグロブリン（１：５０）を適用し、室温 で１時間、温室中でインキュベートした。グリセロール中にこれらの組織を封入 する直前に、ＰＢＳ中で再度洗浄しく１０分間）、次いで、蒸留水中で洗浄しく １分間）、エバンズブルー中で５秒間対比染色した。

間接免疫ペルオキシダーゼ 組織切片を、キジロールを３回替えて脱パラフィンし、グレーディト（ｇｒａｄ ｅｄ）エタノール（７４％および６４％）を介して再水化し、蒸留水にした。こ れらを、溶液のｐＨを７．８に調節した蒸留水中０゜１％トリズシン［シグマ（ Ｓｉｇｍａ）］および０．１％塩０．１％塩化カルシラるコブリンジャー（Ｃｏ ｐｌｉｎ　ｊａｒ）中に置き、３７℃で３０分間インキュベートした。該切片を ＰＢＳ中で完全に洗浄し、消化した組織を色鉛筆で囲み、試薬と血清を限定した 。その後、以下の工程を行った。

ａ−蒸留水中で５分間、７．５％Ｈ，Ｏ□で酸ヘマチンをブリーチした。水道水 で洗浄した。

ｂ−蒸留水中で５分間、２．２％過ヨウ素酸で内因性ペルオキシダーゼを抑制し た。水道水で洗浄した。

Ｃ−蒸留水中で２分間、０．０２％ホウ水素化カリウムでアルデヒド基をブロッ クした。０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ｐＨ７，２）で洗浄し ｔ；。

、：ｊ−ＰＢＳ中１％オポアルブミン中で希釈した第１抗体（マウス腹水または 血清）を用いて、温室中、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し た。

ｅ−ＰＢＳ浴中で１５分間撹拌した。

ｆ−Ｆｃレセプターをブロックするためにｌ：１０に希釈した正常ウサギ血清と 共に１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した。

ｇ−ＰＢＳ中、ｌ　：　１００に希釈したＨＲＰ標識化ウサギ抗マウスγグロブ リンと共に、室温で３０分間、インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した。第２抗 体（酵素結合）を第１抗体を誘導した種類に従って変化させた。

ｈ−ＰＢＳ浴中で１５分間撹拌した。

ｉ−ＰＢＳ中０．０３％Ｈｚｏｚ　ｌ　Ｏ’ｒｎＱに新しく溶解シタジアミノベ ンジジン５ｍｇ中でインキュベートした。茶色の色素が現れるとすぐに水道水で 洗浄した。

ノー　ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、ＤＰｘマウンタント中に封入した 。

結果 セイヨウワサビペルオキシダーゼで直接標識したか、または間接免疫酵素法もし くは免疫蛍光検査法に用いたモノクローナル抗体５−Ｄ８／ｌを使用して、エン テロウィルスに可能的に感染した種々の組織を研究した。明らかにされていない 心筋炎にかかっている子供の９／１５および「ウィルス性髄膜炎」にかかってい る子供の脳を髄液由来の細胞の７／ｌＯは陽性であった。ウィルス性脳炎と同定 されていない初期は、５−Ｄ８／ｌ抗体で脳生検を染色することによってエンテ ロウィルスによるものであることが分かった。マウスの慢性エンテロウィルス感 染の研究において、感染の５．７．１４．２１．２８８よび３５日後に得た筋肉 試料は、各々の期間の後に試験した５匹の各動物においてＶＰＩタンパクについ て特異性染色を示した。

組織培養物中のウィルス抗原の検出 モノクローナル抗体５−Ｄ８／ｌは、組織培養物中のウィルス抗原の検出に使用 することもできる。

間接免疫蛍光検査法（Ｉ　Ｆ） 上記ガードナーおよびマクイーンによって開示された方法を多少変形して使用し た。ＩＦに関する抗原基質を、マルチスポットスライドガラス上に感染または非 感染細胞培養由来のトリプシン分散細胞をスポットすることによって調製し、２ ０分間アセトン中で固定し、次いで、乾燥させ、使用するまで凍結させ続けた。

脳を髄液（Ｃ５Ｆ）標本の場合、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物をア セトン中で固定した。スポットを、温室中、３７°Ｃで３０分間、非希釈または １：１０希釈ハイブリドーマ上澄み液に暴露した。ＰＢＳ中で洗浄した後、同一 スポットを、温室中、３７℃で３０分間、ｌ：４０希釈インチオシアン酸フルオ レセイン結合（ＦＩＴＣ）１　：　４０希釈ウサギ抗マウスγグロブリンに暴露 し、ＰＢＳ中で洗浄し、エパンズブルーで対比染色し、次いで、グリセロール中 に封入した。この方法を用いて、ハイブリッド上澄み液をスクリーニングし、フ ィールド標本におけるウィルス抗原を検出し、モノクローナル抗体の交差反応性 を研究した。

酵素免疫結合検査法（Ｅ　Ｉ　Ａ） 上記ナズらによって記載された方法を変形させてドットーブロッ）ＥＸＡを行っ た。すなわち、バイオランド（Ｂ　１ｏＲａｄ”）ドツト−プロット装置を用い て、ニトロセルロース（ＮＣ）膜のストリップ上に抗原を吸着させた。残ってい る結合部位は、０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２．０．０５％トウィ ーン　２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０　ＴＭ）（ｐＨ１ｏ、３）中３％ウシ血清アル ブミンでブロックすることにょって飽和させた。該ストリップをモノクローナル 抗体５−Ｄ８／ｌでインキュベートし、適当な洗浄の後、ペルオキシダーゼ結合 ウサギ抗マウスγグロブリンのＩ　：　２００希釈液と共にインキュベートした 。冷ＰＢＳ中０．０５％ジアミノベンジジンおよび０．０３％過酸化水素を用い て、免疫プロットを展開させ、色濃度を濃度計［シマズ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）　 −ＣＳ　　９３０］でスキャンし、ピーク下面積の積分によって定量化した。こ の方法を用いて、エンテロウィルスのフィールド単離体を同定し、エンテロウィ ルス群特異性モノクロ−個体からの野生型菌株単離体としてエンテロウィルスの 単離体の培養物１４８個をペロ（Ｖ　ｅｒｏ）細胞中で培養し、第２抗体として 蛍光性抗マウスＩｇＧを用いて、間接免疫蛍光検査法によって、該培養物を５− Ｄ８／ｌ抗体で染色した。培養物中の染色暴露した強い蛍光性の感染細胞の１４ ５／１４８個、および対照ウィルス培養物２５個において、陽性が見られなかっ ｔ；。どのウィルスがどの培養物中にあるか知らなかった観察者によってもこの 結果が得られた。

エンテロウィルス培養物の同定は、１日以内に１４８個の全試料において行われ 、結果は、従前の利用可能な方法によって得ることはできなかった。

ヒト血液試料中のＶＰＩの検出 １、第１の方法は、血清に対する標識化抗体を添加し、免疫複合体を沈殿させ、 次いで、該沈殿物において標識化抗体を含有する画分を測定することを含む。

患者がタンパクに対する抗体を産生じ得る場合、ヒトおよび標識化付加抗体がウ ィルス抗原のエピトープに対して同様の特異性を有するならば、このような血清 への標識化抗体の添加は、平衡を生じるために長い時間を必要とするであろう。

（本発明者らは、その後、第１抗体およびマウスモノクローナル抗体が別のエピ トープと反応することを見いだしたので、平衡時間は問題ではない。そうでない 場合は、この第１検出方法において、１００時間のインキュベーション時間が用 いられた。、） 血清１００．ｕｆｆをペルオキシダーゼ標識化５−Ｄ８／］モノクローナル抗体 ２０ｐｇとを混合し、食塩水中ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７，６で希釈した。該ＥＤＴ Ａは、緩衝液としての、および４°Ｃで１００時間のインキュベーションの間に マイクロバイアル増殖を抑制するための２つの役割を有している。この時間の終 わりに、ＥＤＴＡ食塩水中２．６％ポリエチレングリコール５００μｇを添加し 、４℃で４時間後、沈殿物を遠心分離によって除去し、２％ポリエチレンレグリ コール２ｍＱ中で２回洗浄した。洗浄した沈殿物をＥＤＴＡ食塩水５００μｇに 再溶解し、該試料を２＊Ｑの円錐形オートアナライザー（ＡｕｔｏＡｎａｌｙｚ ｅｒ”）カップに移しｊ；。基質として過酸化水素を使用し、標準的なフェノー ル／アミノフェナジン法を使用することによって、オートアナライザー　ＩＩ　 （ＡｕｔｏＡｎａｌｙｚｅｒ　Ｕ　”）中で、沈殿したペルオキシダーゼを測定 した。光学密度を測定し、５−０８／ｌ抗体が全て沈殿した場合に生じた色素の 割合（％）としてプリントアウトした。これは該検査において標準として操作し た５−Ｄ８／ｌ抗体の希釈液から算出した。１０個の正常な健康体由来の試料を 各々の検査操作において添加し、正常な試料に関する値の平均および標準偏差を 算出した。正常な対照体に関する平均値に２つの標準偏差値を加えｔ；値以上の 血清試料は、陽性、すなわち、血清中に検出可能な量のＶＰＩを有していると考 えられる。エンテロウィルスＶＰＩ抗原を検出することができる能力は高く、該 検査は、重労働であるけれども、感染を検出するのに機械的に使用され得ること が分かる。１に人の技術者を用いて、１３，０００件／年の割合で検査を行うこ とができる。

２、循環ＶＰＩ抗厚を測定するための第２の方法は、表面結合免疫検査法の使用 による。このような方法は、ヒトおよびマウスモノクローナル抗体が実際にＶＰ Ｉの分離部位と反応する場合に、唯一、成功することができる。これは以下のよ うに行った。

試験した抗血清は、天然の免疫性ヒト対象体、コクサッキーＢ３由来の組換えＶ Ｐｌで免疫したウサギ、およびコクサラキーＢ！８よびＢ３ウィルスを７回投与 して過剰免疫したサルからのものであった。

２．５−のポリスチレン管を０．１Ｍ炭酸塩１０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９ ，２１に入れた精製ＶＰＩのｌ　：　５００希釈液１ｍＯで１時間塗布した。次 いで、洗浄した管を、室温で３０分間、リン酸緩衝化食塩水に入れｊ；ヘモグロ ビンの１％溶液でブロックした。

ＰＢＳ１ｍＱ中で希釈した放射性標識化５−Ｄ８／ｌ抗体２μＱを血ｆ＃１０μ ａと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、放射性５−Ｄ８／ ｌ抗体／血清混合物を、ＶＰＩ塗布管に入れ、３７℃で１時間インキュベートし た。ＰＢＳで３回洗浄（７た後、次に、結合放射性をγ計数器において測定した 。結果を第３表に示す。

第３表 様々な種類の抗血清による、ＶＰＩ塗布管に対する放射性標識化５−Ｄ８／ｌ抗 体（寧Ｄ８）の結合の抑制免疫ウサギ血清は、、ｖｐｌに対する標識化５−Ｄ８ ／Ｉ抗体の結合を顕著に抑制するけれども、エンテロウィルスの３回分割投与に よって免疫した動物由来の過剰免疫性サル血清または高濃度の抗エンテロウィル ス抗体を含有する成人血清のいずれも抑制を生じなかったことが第３表かられか る。過剰免疫性サル血清の場合、結合量は実際に増加した。この結果は、このよ うな過剰免疫性血清中に存在するりウマチ様因子の量によって説明できる。

ヒトまたはサルのいずれの血清においても、５−Ｄ８／ｌ抗体の結合を抑制せず 、２つの抗体特異性がＶＰＩにおける別のエピトープについてらしいことを示し た。しかしながら、ウサギまたはマウス血清を使用する場合、結合の抑制が投与 量に依存し、この場合、抗血清が標識化５−Ｄ８／ｌ抗体の結合の立体化学的妨 害を生じるほどに、２つの抗体が同一のものまたは非常に近接した部位に結合し ていたこ゛とが分かった。

抗体を含有しているヒト血清がｖＰｌ塗布管に対する５−Ｄ８／ｌ抗体の結合を 抑制しなかったことを確認し、ＶＰＩの添加の効果を研究した。ヒト抗体の存在 にかかわらずに、該管に対する七ツクローナル抗体の結合の抑制が投与量に依存 することが分かるであろう。すなわち、この検査法は、ＶＰＩ抗原を検出するこ とができるがヒト抗体を検出することはできない。これは、試験抗体が、ヒト抗 体によって認識されるエピトープとは異なる部位と反応する場合にだけ可能であ り、５−Ｄ８／Ｉはこの目的に適している抗体である。

次に、該塗布管に対する５−Ｄ８／ｌ抗体の結合の抑制によってヒト血清中に存 在するＶＰＩの量を測定した。結果は、ＶＰＩをしだいに量を変化させて添加し た対照正常血清の使用によって標準とした。得られた抑制は、当量の抑制を生じ ることができる対照血清に添加したＶＰｌの当量によって表した。結果を第４表 に示す。

第４表に示した実験において、ＶＰＩ塗布管に対する放射性標識化５−Ｄ８／ｌ 抗体の結合の抑制によって血清中のＶＰＩを検出した。各々の場合、添加した既 知量の純粋なりＰｌを有する血清試料を放射性標識化５−Ｄ８／ｌ抗体と混合し 、次いで、該塗布管に入れた。３０分間のインキュベーションの後に結合した放 射性を記録した。第１方法では、血清ＳｌはＶＰＩに対して陽性であり、ＶＰｌ 約１／７Ｑを含有していた。該血清Ｓ１だけの値は、血清ｓ２の場合に見られる 値以下に減少すし、これは検出可能な両のＶＰＩを含有していない。

塗布管検査法の最も効果的な活用条件は、様々な投与量で該管に添加した場合に 結合した標識化５−Ｄ８／Ｉ抗体の量を測定することによって決定され、塗布条 件の最も効果的な活用である。これらの結果を第５表および第６表に示す。

第５表 管を塗布するために使用したＶＰＩの濃度の変化による影響第５表の試験におい て、各試験で１８０００ｃｐｍの放射性標識化５−Ｄ８／ｌ抗体を使用した。

第６表 適切にＶＰＩ塗布した管に対する放射性標識化５−Ｄ８／ｌ抗体の結合 これらの実験は、ヒト血清中で正常に見つけられるＶＰＩに対するヒト抗体の存 在によって影響されずに、ヒト血清中でＶＰＩを測定するためにモノクローナル 抗体を使用することができる能力を示す（下記参照）。

使用した方法は、直接ペルオキシダーゼ標識化５−Ｄ８／ｌ抗体をポリクローナ ルウサギ抗エンテロウィルス検出用抗体に代えるエルーハグラッシー（Ｅ　１− 　Ｈａｇｒａｓｓｙ）ら［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　ｉｉ：第１１５９頁〜 第１１６２頁（１９８０）］のＥＬＩＳＡ法の変形であった。次いで、該実験は 、抗ヒトＴｇＧまたは抗ヒトＩｇＭ抗体を用いてマイクロタイタープレートを塗 布し、該プレートにヒト血清を添加し、ヒト免疫グロブリンを結合させることを 含む。ヒト免疫グロブリン中のエンテロウィルス抗体は、エンテロウィルス調製 物から抗原を捕えることができ、次いで、これに検出用抗体を結合させて、結合 したウィルス抗原の量を測定する。

抗ヒトＩｇＭを使用するこの試験は、コクサッキーＢウィルスに対して生じた多 価ウサギ血清またはモノクローナル抗体５−Ｄ８／ｌのいずれかの検出用抗体を 用いて血清において２回行った。結果を第７表に示す。

第７表から分かるように、成人血清において、５−Ｄ８／］抗体はポリクローナ ル抗体と同様に多くの陽性を検出するが、幼い子供において、標準的な検査によ って血清型特異性抗厘に対する抗原タイプ応答を有する子供が同定される場合の 例がある。標準的な血清によって陽性であることを示す幼い子供の侵入かは、そ れらの抗体がＶＰＩタンパクに対して指向しないので、５−Ｄ８／ｌモノクロ− ナル抗体を用いて陰性である。成人においては、ＶＰＩタンパクに対するペテロ タイプ応答が存在するので、「疑似陰性」が５年齢以下の子供において非常ｊこ 多く見いだされる。時間によって、暴露が数種類のエンテロウィルスに対して得 られ（５〜６年齢Ｉこよる）、全ての個体は、ＶＰＩタンパクに対する抗体を産 生ずる。標準的な検査によって、コクサラキーＢと重複する血清型から分離した ウィルスに対する免疫応答を為す人々において若干の抗体が失われる。

また、ポリクローナルウサギ抗血清よりも５−Ｄ８／ｌ抗体を使用する方が全体 的な陽性が見られる。

この検査において、５−Ｄ８／ｌ抗体は、エンテロウィルス感染、またはポリオ ウィルスによる免疫化さえ検出することができ、標準的な方法によって失われた 全抗体を検出すると思われる。標準的な再生可能な試薬の使用は、異なるウサギ ポリクローナル抗血清の産生を繰り返すよりも、試験の標準化および結果の一致 をより良くするにちがいない。

ウィルス後症候群　　　正常対照　慢性炎症性疾患＋ＳＢＥ補正書補正状文提出 書 （特許法第１８４条の８） 平成２年１０月１２日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８９１００３８６ ２、発明の名称 エンテロウィルスに対するモノクローナル抗体３、特許出願人 住所　イギリス国ロンドン、ニス・イー１８エツクス・ビーウォータールー・ロ ード９１番 名称　スリーアイ・リサーチ・エクスブロイチージョン・住所　大阪府大阪市中 央区域見２丁目１番６１号請求の範囲 （１）　　モノクローナル抗体が、エピトープが（ｉ）エンテロウィルス群（Ａ 型肝炎を除く）の全体にわたって保育されており、（ｉｉ）ヒト抗体が結合する 如何なるエピトープとも異なるエピトープであるＶＰＩタンパクのエピトープに 対して結合能を有するパラトープを有することを特徴とする、表面結合免疫検査 法によって、エンテロウィルスに対するヒト抗体を含有している試料中のエンテ ロウィルスの抗原を検出するためのエンテロウィルスのＶＰＩタンパクに対する 七ツクローナル抗体の使用。

（２）表面結合免疫検査法によって、エンテロウィルスによって生じた感染にか かっていると思われる患者から採取した血清試料に中のエンテロウィルスの抗原 および該血清試料中にエンテロウィルスに対する抗体を有することを検出するた めの、受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピアン・コレクション・オン ・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１４日に寄託されたハイブリ トーマセルラインによって分泌された５−Ｄ８／ｌと命名されたモノクローナル 抗体の使用。

（３）（ａ）％ツクローナル抗体が、エピトープが（１）エピトープ群（Ａ型肝 炎ウィルスを除く）の全体にわたって保有されており、（ｉｉ）ヒト抗体が結合 する如何なるエピトープとも異なるエピトープであるＶＰＩタンパクのエピトー プに対して結合能を有するパラトープを有しているエンテロウィルスのＶＰＩタ ンパクに対するモノクローナル抗体と共に血清試料をインキュベートし、次いで 、 （ｂ）平衡が生じるのを待たずに、モノクローナル抗体および抗原を含有する複 合体の存在についてインキュベートした試料を検査する ことを特徴とする、エンテロウィルスによって生じた感染にかがっていると思わ れる患者から採取した血清試料中のエンテロウィルス（Ａ型肝炎ウィルス以外） の抗原の存在を検出する方法。

（４）モノクローナル抗体を免疫測定マーカーで標識化する請求項（３）記載の 方法。

（５）免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカー、酵素マーカ、 −、ハプテンマーカー、および放射性同位体から選択される請求項（４）記載の 方法。

（６）免疫測定マーカーがセイヨウワサビペルオキシダーゼである請求項（５） 記載の方法。

（７）免疫測定マーカーが放射活性ヨウ素である請求項（５）記載下、ヨーロピ アン・コレクション・オン・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１ ４日に寄託されたハイブリドーマセルラインによって分泌された５−Ｄ８／ｌと 命名されたモノクローナル抗体である請求項（３）〜（７）のいずれか１つに記 載の方法。

（９）（ａ）エピトープが（ｉ）エンテロウィルス群の全体にわたって保有され ており、かつ（ｉｉ）ヒト抗体が結合する如何なるエピトープとも異なるエピト ープであるＶＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有するパラドーグを有 するエンテロウィルスのＶＰＩタンパクに対する七ツクローナル抗体である第１ 抗体を含有している液体媒質を製造し、 （ｂ）該液体試料と、抗−ＩｇＧおよび抗−１８Ｍから選択される固定化第２抗 体とを接触させ、 （ｃ）接触した固定化第２抗体を洗浄し、（ｄ）洗浄した固定化第２抗体とエン テロウィルスのＶＰＩタンパクとを接触させ、 （ｅ）次いで、ｖｐｉルミタンパクした固定化第２抗体と工程（ａ）の液体媒質 とを接触させ、そして、 （ｆ）得られた抗体処理固定化＠２２抗を結合第１抗体の存在または非存在Ｉ； ついてモニターし、結合１ｇ１抗体の存在によって液体試料中のエンテロウィル スに対する抗体の存在が示されることを特徴とする患者から採取した液体試料中 のエンテロウィルスに対する抗体の存在を検出する方法。

（ｌＯ）工程（ａ）の第１抗体を免疫測定マーカーで標識する請求項（９）記載 の方法。

（１１）免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカー、酵素マーカ ー、ハブテンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（ｌＯ）記載の 方法。

（１２）免疫測定マーカーがセイヨウワサビペルオキシダーゼである請求項（１ ０）記載の方法。

（１３）免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（１０）記載の 方法。

（１４）予め決定された量のＶＰＩタンパクを工程（ｄ）で使用し、予め決定さ れた量の第１抗体を含む量の工程（ａ）の液体媒質を工程（ｅ）で使用し、工程 （ｆ）で観察された結合第１抗体の量によって液体試料中のエンテロウィルスに 対する抗体のレベルの程度を得る請求項（９）記載の方法。

（１５）モノクローナル抗体が、受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピ アン・コレクション・オン・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１ ４日に寄託されたハイブリドーマセルラインによって分泌される５−Ｄ８／ｌと 命名されｌ；モノクローナル抗体である請求項（９）〜（１４）のいずれか１つ に記載の方法。

（１６）（ａ）エピトープがＡ型肝炎ウィルスを除くエンテロウィルスとして知 られているウィルス群の全体Ｉ−わたって保有されているエンテロウィルスのＶ ＰＩタンパクのエピトープに対して結合能を有するモ、ツクローナル抗体である 第１抗体を製造し、（ｂ）液体試料と予め決定されｊ；量の第１抗体の混合物を 平衡させ、（ｃ）固定されたエンテロウィルスのＶＰ１タンパクからなる第１基 質を製造し、 （ｃｉ）工程（ｂ）の平衡化混合物と工程（ｃ）の第１基質とを接触させ、（ｅ ）接触した第１基質を洗浄し、 （ｆ）固定されたエンテロウィルスのＶＰＩタンパクからなり、工程（ｃ）の第 １基質と実質的に同一である第２基質を製造し、（ｇ）工程（ｂ）で使用した予 め決定された量の第１抗体と工程（ｆ）の第２基質とを接触させることＩこよっ て得られる対照試料と、工程（ｅ）の洗浄された詔Ｉ基質上の結合第１抗体の量 とを比較し、次いで、接触した第２基質を洗浄し、第２基質上の結合基質の量と 比較して第１基質上の結合第１抗体の量の減少によって液体試料中のエンテロウ ィルス抗原レベルの程度を得ることを特徴とする液体試料中のエンテロウィルス の抗原を検出する方法。

（１７）工程（ａ）の第１抗体を免疫測定マーカーで標識する請求項（１６）記 載の方法。

（１８）免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカー、酵素マーカ ー、ハプテンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（１７）記載の 方法。

（１９）免疫測定マーカーがセイヨウワサビペルオキシダーゼである請求項（１ ７）記載の方法。

（２０）免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（１６）記載の 方法。

（２１）モノクローナル抗体が、受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピ アン・コレクション・オン・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１ ４日に寄託されたハイブリドーマセルラインによって分泌される５−Ｄ８／１と 命名されたモノクローナル抗体である請求項（１６）〜（２０）のいずれか１つ に記載の方法。

（２２）別々の容器に入れｔ；、 （Ｉ）エピトープが（ｉ）エンテロウィルス群の全体にわたって保有されており 、（Ｕ）ヒト抗体と結合するものとは異なるエピトープである、ＶＰｉタンパク のエピトープに対して結合能を有するバラトープを有するエンテロウィルスのＶ ＰＩタンパクに対するモノクロ（Ｉｆｆ）エンテロウィルスのＶＰＩタンパクか らなることを特徴とする免疫検査キット。

（２３）別々の容器に入れた、 （Ｉ）エピトープがＡ型肝炎ウィルスを除くエンテロウィルスとして知られてい るウィルス群の全体にわたって保有されているエンテロウィルスのＶＰＩタンパ クのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体、および （ＩＩ）固定されたエンテロウィルスのＶＰＩタンパクからなる基質からなるこ とを特徴とする免疫検査キント。

国際調を報告 ＋ｍｍｘ−＾一番＾−−仁ａｂｅｌＩ−拳ＰＣＴＩＧＲＲＱ／ｎｎ１ＱＫ国際調 査報告 ＧＢ　８９００３８６ ＳＡ　　　　２８０５８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）エンテロウイルス群の全血清型に対して結合能を有するモノクローナル抗 体。 （２）ハイプリドーマセルラインによって産生されるモノクローナル抗体であっ て、エピトープがＡ型肝炎ウイルスを除くエンテロウイルスとして知られている ウイルス群の全体にわたって保有されているエンテロウイルスのＶＰ１タンパク のエピトープに対して結合能を有することを特徴とするモノクローナル抗体。 （３）ハイプリドーマセルラインが齧歯類由来の組織から誘導される請求項（２ ）記載のモノクローナル抗体。 （４）ハイプリドーマセルラインがマウス由来の組織から誘導される請求項（３ ）記載のモノクローナル抗体。 （５）エンテロウイルス群の全血清型に結合し、受託番号第８８０４１４０１号 の下、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに１ ９８８年４月１４日に寄託されたハイプリドーマセルラインによって分泌される ５−Ｄ８／１と命名されたモノクローナル抗体。 （６） ＶＰ１タンパクに対するヒト抗体の存在にもかかわらず、エンテロウイルスのＶ Ｐ１タンパクに対して結合能を有するモノクローナル抗体。 （７） コクサッキーウイルスＢ１〜Ｂ６、エコーウイルスｌｌ、２２および２４、ポリ オウイルス１、 ２および３ならびにコクサッ キーウイルスＡ７、Ａ９およびＡ１６から選択される如何なるエンテロウイルス にも結合能を有するモノクローナル抗体。 （８） コクサッキーウイルスＢＩ〜Ｂ６、エコーウイルス１１、２２および２４、ポリ オウイルス１、 ２および３ならびにコクサッ キーウイルスＡ７、Ａ９およびＡ１６から選択される如何なるエンテロウイルス のＶＰ１タンパクにも結合能を有するモノクローナル抗体。 （９） エピトープが（ｉ）エンテロウイルス群の全体にわたって保有されており、（ｉ ｉ）ヒト抗体が結合するものとは異なるエピトープであるＶＰ１タンパクのエピ トープに対して結合能を有するパラトープを有することを特徴とするエンテロウ イルスのＶＰ１タンパクに対するモノクローナル抗体。 （１０） エンテロウイルス群の全体にわたって保有されているＶＰｌタンパクのエピトー プに対して結合能を有するパラトープを有するモノクローナル抗体の少なくとも １つのフラグメントからなり、この少なくとも１つのフラグメントがＦａｂフラ グメント、パラトープおよびイディオタイプから選択されることを特徴とするハ イブリッド抗体。 （１１） エピトープがエンテロウイルス群の全ウイルスのＶＰｌタンパクの全体にわたっ て保有されているエンテロウイルスのＶＰ１タンパクのエピトープに対して結合 するモノクローナル抗体からなり、 該抗体がイムノメトリックマーカーで標識されていることを特徴とする標識化抗 体。 （１２） 免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカ、酵素マーカー、ハプテ ンマーカー、および放射性同位体から選択される請求項（１１）記載の標識化抗 体。 （１３） マーカーがセイヨウワサピペルオキシダーゼである請求項（１１）記載の標識化 抗体。 （１４） マーカーがヨウ素の放射性同位体からなる請求項（１１）記載の標識化抗体。 （１５） エピトープがエンテロウイルスの全体にわたって保有されているエンテロウイル スのＶＰ１タンパクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体か らなり、該抗体が固相に結合していることを特徴とする免疫吸収剤。 （１６） 固相が濾紙、ポリマー、シュガー、変性シュガー、および架橋デキストランから 選択される請求項（１５）記載の免疫吸収剤。 （１７） 固相がアガロースおよび変性アガロースから選択される請求項（１６）記載の免 疫吸収剤。 （１８） ビーズ状の請求項（１４）記載の免疫吸収剤。 （１９） 管状の請求項（１４）記載の免疫吸収剤。 （２０） ウエル面状の請求項（１４）記載の免疫吸収剤。 （２１） 受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピアン・コレクション ・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１４日に寄託されたハ イプリドーマセルライン。 （２２） 受託番号第８８０４１４０１号の下、ヨーロピアン・コレクション ・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに１９８８年４月１４日に寄託されたハ イプリドーマセルラインと実質的に同一の特性を有するクローン、サブクローン および細胞。 （２３） （ａ）エピトープがエンテロウイルス群の全体にわたって保護されているエンテ ロウイルスのＶＰｌタンパクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナ ル抗体からなり、該モノクローナル抗体が固相に結合している免疫吸収剤を製造 し、（ｂ）該免疫吸収剤と、エンテロウイルスのＶＰ１タンパクを含有している 液体媒質を接触させ、 （ｃ）次いで、吸収されたＶＰ１タンパクを免疫吸収剤から溶離する 工程からなるエンテロウイルスのＶＰ１タンパク含有液体媒質からエンテロウイ ルスのＶＰ１タンパクを分離する方法。 （２４）（ａ）免疫測定マーカーで標識した抗体を含む液体媒質であって、該抗 体が、エピトープが全エンテロウイルスのＶＰ１タンパク中で保有されておりか つヒト抗体を結合するＶＰ１タンパクのエピトープとは異なるエピトープである エンテロウイルスのＶＰ１タンパクのエピトープに対して結合能を有するパラト ープを有している液体媒質を製造し、 （ｂ）液体媒質中で組織試料をインキュベートし、（ｃ）インキュベートした組 織試料を洗浄し、（ｄ）組織試料中の結合標識化抗体の存在または非存在を測定 し、結合標識化抗体の存在によって組織試料中のエンテロウイルスの抗原の存在 が示される ことを特徴とするヒト組織試料中のエンテロウイルスの抗原の存在または非存在 を測定する免疫細胞化学的方法。 （２５）免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカ、酸素マーカー 、ハプテンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（２４）記載の方 法。 （２６）免疫測定マーカーがセイヨウワサピペルオキシダーゼである請求項（２ ４）記載の方法。 （２７）免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（２４）記載の 方法。 （２８）（ａ）ハイプリドーマセルラインによって産生されたモノクーロナル抗 体であって、該抗体が、エピトープがＡ型肝炎ウイルスを除くエンテロウイルス として知られているウイルス群の全体にわたって保有されているエンテロウイル スのＶＰｌタンパクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体を 製造し、（ｂ）液体試料の存在下で組織細胞を培養し、（ｃ）得られた培養細胞 を固定化し、 （ｄ）該固定化細胞と工程（ａ）のモノクローナル抗体とを接触させ、次いで、 （ｅ）結合抗体の存在または非存在について固定化細胞をモニターし、結合抗体 の存在によって液体試料中のエンテロウイルスの抗原の存在が示される ことを特徴とする液体試料中のエンテロウイルスの抗原の存在または非存在を検 出する方法。 （２９） 工程（ａ）のモノクローナル抗体を免疫測定マーカーで標識する請求項（２８） 記載の方法。 （３０） 免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカ、酵素マーカー、ハプテ ンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（２９）記載の方法。 （３１） 免疫測定マーカーがセイヨウワサピペルオキシダーゼである請求項（３０）記載 の方法。 （３２） 免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（３０）記載の方法。 （３３） （ａ）エピトープが（ｉ）エンテロウイルス群の全体にわたって保有されており 、かつ（ｉｉ）ヒト抗体が結合するものとは異なるエピトープであるＶＰｌタン パクのエピトープに対して結合能を有するパラトープを有するエンテロウイルス のＶＰ１タンパクに対するモノクローナル抗体である第１抗体を含有している液 体媒質を製造し、 （ｂ）該液体試料と、抗一１ｇＧおよび抗一１ｇＭから選択される固定化第２抗 体を接触させ、 （ｃ）接触した固定化第２抗体を洗浄し、（ｄ）洗浄した固定化第２抗体とエン テロウイルスのＶＰ１タンパクとを接触させ、 （ｅ）次いで、ＶＰｌタンパク処理した固定化第２抗体と工程（ａ）の液体媒質 とを接触させ、そして、 （ｆ）得られた抗体処理固定化第２抗体を結合第１抗体の存在または非存在につ いてモニターし、結合第１抗体の存在によって液体試料中のエンテロウイルスに 対する抗体の存在が示されることを特徴とする愚者から採取した液体試料中のエ ンテロウイルスに対する抗体の存在を検出する方法。 （３４）工程（ａ）の第ｉ抗体を免疫測定マーカーで標識する請求項（３３）記 載の方法。 （３５）免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカ、酵素マーカー 、ハプテンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（３４）記数の方 法。 （３６） 免疫測定マーカーがセイヨウワサピペルオキシダーゼである請求項（３４）記載 の方法。 （３７） 免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（３４）記数の方法。 （３８） 予め決定された量のＶＰ１タンパクを工程（ｄ）で｛実用し、予め決定された量 の第１抗体を含む量の工程（ａ）の液体媒質を工程（ｅ）で使用し、工程（ｆ） で観察された結合第１抗体の量によって液体試料中のエンテロウイルスに対する 抗体のレベルの程度が得られる請求項（３３）記載の方法。 （３９） （ａ）エピトープがＡ型肝炎ウイルスを除くエンテロウイルスとして知られてい るウイルス群の全体にわたって保有され′ているエンテロウイルスのＶＰ１タン パクのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体である第１抗体を 製造し、（ｂ）液体試料と予め決定された量の第１抗体の混合物を平百させ、（ ｃ）固定されたエンテロウイルスのＶＰ１タンパクからなる第１基質を製造し、 （ｄ）工程（ｂ）の平衡化混合物と工程（ｃ）の第１基質とを接触させ、（ｅ） 接触した第１基質を洗浄し、 （ｆ）固定されたエンテロウイルスのＶＰｌタンパクからなり、工程（ｃ）の第 １基質と実質的に同一である第２基質を製造し、（ｇ）工程（ｂ）で使用した予 め決定された量の第１抗体と工程（ｆ）の第２基質とを接触させることによって 得られる対照試料と、工程（ｅ）の洗浄された第１基質上の結合第１抗体の量と を比較し、次いで、接触した第２基質を洗浄し、第２基質上の結合基質の量と比 較して第１基質上の結合第１抗体の量の減少によって液体試料中のエンテロウイ ルス抗原レベルの程度が得られることを特徴とする液体試料中のエンテロウイル スの抗原を検出する方法。 （４０）工程（ａ）の第１抗体を免疫測定マーカーで標識する請求項（３９）記 載の方法。 （４１） 免疫測定マーカーが発蛍光団マーカー、発光測定マーカー、酵素マーカー、ハプ テンマーカーおよび放射性同位体から選択される請求項（４０）記載の方法。 （４２） 免疫測定マーカーがセイヨウワサピペルオキシダーゼである請求項（４０）記載 の方法。 （４３） 免疫測定マーカーがヨウ素の放射性同位体である請求項（４０）記載の方法。 （４４） 別々の容器に入れた、 （１）エピトープが（ｉ）エンテロウイルス群の全体にわたって保有されており 、（ｉｉ）ヒト抗体と結合するものとは異なるエピトープである、 ＶＰ１タンパクのエピトープに対して結合能を有するパラトープを有するエンテ ロウイルスのＶＰＩタンパクに対するモノクローナル抗体、 （ＩＩ）抗−ＩｇＧおよび抗−ＩｇＭから選択される固定化第２抗体、および （ＩＩＩ）エンテロウイルスのＶＰ１タンパクからなることを特徴とする免疫検 査キット。 （４５）別々の容器に入れた、 （１）エピトープがＡ型肝炎ウイルスを除くエンテロウイルスとして知られてい るウイルス群の全体にわたって保有されているエンテロウイルスのＶＰｌタンパ クのエピトープに対して結合能を有するモノクローナル抗体、および （ＩＩ）固定されたエンテロウイルスのＶＰ１タンパクからなる基質からなるこ とを特徴とする免疫検査キット。