KR20070085291A - 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 높은 수준의 발현 효율을 가진 고기능성 항체를 생산하는, 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 풀 사이즈의 집합 면역글로불린의 대량 생산을 위한 숙주 세포, 벡터 및 방법을 포함한다.

Description

식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCTION OF ANTIBODIES IN PLANT CELL CULTURE}

본 발명은 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법, 및 또한 그의 생성된 항체에 관한 것이다.

항체는 현재 개발중인 대부분의 치료 약물에 해당한다. 항체는 중대한 특이성을 가진 표적 항원을 인지하고 이에 결합하는 복합 당단백질이다. 이러한 특이적 결합 활성이 질병의 진단, 예방 및 치료를 비롯한 여러 가지 적용예에 항체를 사용가능케 한다(20). 전형적인 풀 사이즈 항체는 두 개의 동일한 중쇄와 두 개의 동일한 경쇄의 테트라머이다. 풀 사이즈의 면역글로불린 외에, Fab 단편(fragment), scFvs, 이중특이성 Fvs, 디아바디(diabodies), 미니바디(mini-bodies), 단일 가변 도메인, 항체 융합 단백질 등을 비롯한 치료적 가치가 있는 다른 항체 유도체는 식물에서 발현되었다(4).

IgG 항체 분자의 글리코실화는 이펙터 리간드 FcR과 보체의 인지에 중요한 번역 후 수식(post translational modification)이다. 복합 바이안테너리 (biantennary) 올리고사카라이드 부위는 각 중쇄의 CH2 도메인에서 Asn-297에 부착된다. 당 잔기의 부착에서의 이질성은 기능적 조절과 관련이 있다(21-26). 또한, CH2가 변형된 구조를 가진 탄수화물의 존재에 의해 IgG1 항체의 생체 내 운명이 철저하게 영향을 받는다는 것이 연구를 통해 제시되었다(27).

약제학적 용도의 단백질은 전통적으로 포유동물 또는 박테리아 발현 시스템에서 생산되었다. 대부분의 경우, 단백질을 정확히 폴딩하고(folding) 집합하여(assemble) 유사한 글리코실화 패턴을 발생시키는 것을 보여주기 때문에, 이들 약제학적 용도의 단백질은 포유동물 세포주, 주로 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 또는 유전자이식 동물에서 유전자이식에 의해 생산된다. 그러나, 이러한 발현 시스템은 비용이 많이 들고, 생산량을 고 수준으로 높이기 어렵다. 또한, 병원체 또는 발암성 DNA 서열에 의한 오염가능성으로 인해 안전상의 문제가 있다. 또한, 생산성이 매우 비효율적인 것과 같이 포유동물 시스템에서 특정 서브클래스, 예를 들어 IgG4의 생산률 및 안정성은 극히 낮다.

정확한 이유는 알려지지 않았지만, 재조합 IgG4의 안정성이 낮아 수율을 낮춤으로써 비효율적인 대규모의 생산을 유도한다.

따라서, 확실히 항체 및 다른 치료용 단백질을 생산하기 위한 비-포유동물 시스템이 유리할 것이다. 이러한 시스템은 비면역원성 단백질에 작용하는 것으로 나타났지만, 항체는 더욱 민감하고 비-포유동물 세포 배양 시스템에서 생산하기 더욱 어렵다. 예를 들어, 항체가 바쿨로바이러스 발현 시스템 및 안정하게 형질감염된 곤충 세포주에서 발현될 수 있더라도, 생성된 물질은 필요한 특성을 가질 수 없다. 곤충 세포 발현 시스템은 항체를 생산하지만, 다음과 같은 몇 가지 결점이 있다: 폴딩 및 분비 용량의 저하 및 비효율적인 프로세싱, 높은 (부분 바쿨로바이러 스-코딩된) 프로테아제 활성, 불충분한 강도 및 번역 후 수식 패턴의 편향(면역을 생기게 작용할 수 있음)(예를 들어 다음의 참고문헌을 참조하기 바람; Guttieri MC, Liang M. 2004, Human antibody production using insect-cell expression systems. Methods Mol Biol., 248:269-99, Guttieri MC, Sinha T, Bookwalter C, Liang M, Schmaljohn CS. 2003, Cassette vectors for conversion of Fab fragment into full-length human IgG1 monoclonal antibodies by expression in stably transformed insect cells. Hybrid Hybridomics. 22(3): 135-45, Potter KN, Li Y, Capra JD. 1993, Antibody production in the baculovirus expression system. Int Rev Immunol. 10(2-3): 103-12). 적합한 번역 후 수식이 아니므로, 항체는 대장균(E. coli)에서 생성될 수 없다.

지난 10 년간 새로운 발현 시스템이 식물에서 개발되었다. 이 방법은 식물 게놈 내로 단일가닥(single stranded) DNA 분자(T-DNA)를 삽입할 수 있는 박테리아인 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용한다(1). 펩티드 및 단백질의 대량 생산을 위한 유전자의 도입이 비교적 간단하기 때문에, 이 방법은 식물에서의 대안적인 단백질 발현 시스템으로서 점점 대중화되고 있다(2-4)(5).

식물 기재 시스템은 재조합 항체를 생산하기 위한 값싸고 효율적이며 안전한 대안법을 대표한다. 식물 세포에서 풀 사이즈 항체의 생산은 단일 감마 또는 카파 면역글로불린 사슬을 발현하는 식물의 성교배(sexual crossing)에 의해 전체 토바고(tobacco) 식물에서 최초로 입증되었다(6). 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 다른 식물에서 IgG (주로 IgG1) 및 IgA 항체의 집합이 설명되 었다(3,7-10).

지난 10 년에 걸친 연구는 식물 세포(전체 식물에 포함됨)가 다양한 기능적 항체를 생산할 수 있음을 보여주었고, 현재는 상업적 수준으로 생산량을 높히는데 강한 관심이 있다(11-13), (14,15), (5,16-18).

그러나, 유전자이식 농작물을 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 경우, 잔류하는 살충제, 제초제 및 독성 식물 대사 산물에 의한 오염을 비롯한 잠재적인 안정성 문제에 대한 관심이 증가하고 있다(19). 유전자 조작된 식물에 반대하는 그룹들은, 일반적으로 도입유전자(transgene) 및 그의 코딩 단백질이 환경 또는 먹이 사슬에 퍼지게 될 위험 가능성을 두려워하여, 규제 기관의 엄격한 제한을 통해 단백질 발현을 위해 유전자이식 식물 기술을 사용하는 회사를 규제한다. 따라서, 분명히 모든, 완전한 식물의 사용이 불리하다.

식물-현탁 세포는 주의 깊게 조절된 보증(certified) 조건하에 재조합 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 시험관내 시스템이다. 식물 세포 현탁액은 재조합 단백질을 생산하기 위해 진탕 플라스크(shaken flask) 또는 생물반응기에서 성장될 수 있다. 본 발명자들은 오픈-필드(open-field) 식물 성장의 잠재적인 위험성 없이 식물 세포 발현의 이점을 이용하여, 재조합 단백질(예컨대 항체)을 안전하게 생산가능케 하는 생물반응기 시스템에 상응하는 적용예를 적용하였다(본 명세서에 충분히 설명된 바와 같이 모두 참고로 포함되는 미국 특허 제 6,391,638 호 및 2004년 2월 24일 출원된 미국 특허출원 제 10/784,295 호를 참고하기 바람).

예를 들어, 니코티아나 타바쿰 시브이(Nicotiana tabacum cv) Petite Havana SR1 현탁 배양(P9s)에서 TMV-특이 풀 사이즈 뮤린 IgG-2b/K 항체의 발현이 개시되어 있다(18). N-말단 뮤린 리더 펩티드(leader peptide)의 삽입(integration)은 분비를 위해 집합 면역글로불린을 지배한다. 그러나, 현탁 배양에서, 풀 사이즈 재조합 항체는 식물 세포벽에 의해 보유되었다. 재조합 항체의 특이성 및 친화성이 그의 뮤린 카운터파트로부터 구별할 수 없었음이 ELISA 방법에 의해 입증되었는데, 이는 재조합 항체의 생산을 위한 생물반응기로서의 식물 세포 현탁 배양의 가능성을 나타낸다(18).

식물에서 항체를 생산하는 것은, 분자가 그의 동족(cognate) 항원을 인지하기 위해 폴딩하고 정확히 집합해야 하기 때문에 특별한 도전이다. 다른 한편으로, 식물 유래 발현 시스템은 예를 들어 박테리아 발현 시스템과는 달리 단백질 발현 및 활성에 결정적인 것으로 알려진 번역 후 수식을 촉진한다. 그러나, 포유동물과 식물 세포 배양 시스템 사이에는 번역 후 수식에 있어서 상당한 차이가 있으며, 이는 발현 단백질의 작용성이 감소 또는 심지어 제거될 가능성을 피하기 위해 고려될 필요가 있다.

포유동물과 식물 단백질 발현 시스템 사이의 주요 차이점의 하나는 생합성 경로(biosynthetic pathway)의 차이에 의해 야기된 단백질 당 측쇄의 변이(variation)이다. 글리코실화는 활성, 폴딩, 안정성, 용해도, 프로테아제에 대한 감수성, 혈액 청소율(blood clearance rate) 및 단백질의 항원 전위에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 식물에서 특정 단백질의 생산은 식물 글리코실화의 잠재적 가지형성을 고려해야 한다.

단백질 글리코실화는 두 개의 카테고리, 즉 N-결합 및 O-결합 변형으로 나누어진다(28,29)(30). 이 두 형태는 글리칸 부위가 부착되는 아미노산이 다르다; 즉 O-결합은 Ser 또는 Thr 잔기에 부착되는 반면, N-결합은 Asn 잔기에 부착된다. 또한, 각각의 형태의 글리칸 서열은 특유의 구별되는 특징을 가진다. 두 가지 형태중 N-결합 글리코실화가 더 풍부하여 단백질 기능에 대한 그의 영향이 넓게 연구되고 있다. 한편, O-결합 글리칸은 상대적으로 부족하여 단백질에 대한 그의 영향에 관한 정보를 입수할 수 없다.

몇몇 접근법에서는 식물에서 단백질 글리코실화를 제어 및 조정(tailor)하는 것에 대해 논의되었다(31)(32). 펩티트 사슬로부터 글리코실화 부위의 제거 또는 글리코실화 완전 억제와 같은 엄청난 변형이 하나의 방법으로서 실행될 수 있다. 그러나, 이 접근법은 구조적 결함을 일으킬 수 있다. 추가의 접근법은 특정 탄수화물 처리 효소의 넉아웃(knock-out) 및 도입을 포함한다. 이들 효소는 번역 후 수식동안 잠재적 면역원성 당이 추가되는 것을 막기 위해 "넉아웃"된다. 예를 들어, 크실로실 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 넉아웃에 의해 글리칸 구조에 크실로스가 부재하게 된다. 크실로스는 식물에서만 발견되는 당 잔기이고, 잠재적 면역원성을 가지는 것으로 생각된다. 식물에 시알릴 트랜스퍼라제와 같은 인간 탄수화물 처리 효소 유전자를 도입하면 식물에 존재하지 않는 시알산이 부가된다(참조예, Ragon C, Lerouge P, Faye L., 1998 The protein N-glycosylation in plants, J. Exp. Botany Vol 49(326)1463-1472).

세 번째 접근법은 세포의 특정 컴파트먼트(comparment)에 발현을 국소화시키 는 것을 시도한 것이다. 예를 들어, ER에 단백질이 보유되면 골지(Golgi)에서 식물 특이적 변형이 수행되는 것을 방지한다(33)(34,35). 각 세포 내 컴파트먼트는 상이한 탄수화물 처리 효소를 갖는다. 분비 경로에 들어가거나 표적화되는 단백질은 ER로부터 골지로, 이어 액포 또는 아포플라스트(apoplast)로 수송된다. 아포플라스트는 식물 세포막과 식물 세포벽 사이의 공간이다. 분비에 표적화되는, 또는 보다 구체적으로 특정 세포 컴파트먼트에 표적화되지 않고, 따라서 분비되는 단백질은 아포플라스트에 도달한다. 일부 단백질은 거기에 남아 있지만, 일부는 세포벽을 통과하여 성장 배지로 분비된다. 상이한 탄수화물 처리는 각 컴파트먼트에서 일어나므로, 하나의 컴파트먼트에 단백질을 보유시킴으로써 글리칸 구조의 추가적인 처리를 억제할 수 있거나, 특정 컴파트먼트에 단백질을 배치함으로써 단백질이 원하는 처리 경로로 들어가는 것을 확보하는 것이 가능하다.

배경기술에는 고기능성 IgG4 항체를 생산하는 시스템 또는 방법이 교시되거나 제시되어 있지 않다.

본 발명은 높은 수준의 발현 효율을 가진 고기능성 항체가 생성되는 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법을 제공함으로써 배경기술의 이러한 결점들을 극복한다. 본 발명은 또한 풀 사이즈의 집합 면역글로불린의 대량 생산을 위한 숙주 세포, 벡터 및 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일례에 따라, 현탁액에서 성장된 유전자 조작(예, 유전자이식) 식물 세포에 기초한 식물 발현 시스템이 제공된다. 본 발현 시스템은 특히 무손상 항체 (집합) 또는 항체 단편의 생산을 위해 설계된다.

이들 항체는 바람직하게는 기능성 항체(즉, 표적 항원을 특이적으로 결합하거나 이펙터 기능을 가질 수 있음[예, IgG4와 같은 보체 기능의 활성])이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 실질적인 무손상 항체 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 어구 "항체 단편"은 항원과 결합할 수 있는 항체의 기능성 단편을 의미한다.

본 발명을 실행하기에 적합한 항체 단편으로는 특히 면역글로불린 경쇄(본 명세서에서 "경쇄"라 함)의 상보성-결정 영역(CDR), 면역글로불린 중쇄(본 명세서에서 "중쇄"라 함)의 CDR, 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역, 경쇄, 중쇄, Fd 단편, 및 본질적으로 경쇄와 중쇄 둘 다의 모든 가변 영역을 포함하는 항체 단편, 예컨대 Fv, 단일 사슬 Fv, Fab, Fab', 및 F(ab')2가 포함된다.

경쇄와 중쇄 둘 다의 모든 또는 본질적으로 모든 가변 영역을 포함하는 기능성 항체 단편은 다음과 같이 정의된다:

(i) 두 개의 사슬로 발현되는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 유전자조작 단편으로서 정의되는 Fv;

(ii) 적합한 폴리펩티드 링커(linker)에 의해 결합된 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 포함하는 유전자조작 단일 사슬 분자인 단일 사슬 Fv ("scFv");

(iii) 항체 분자의 일가 항원-결합 부분을 가진 항체 분자의 단편으로서, 그의 가변 및 CH1 도메인으로 이루어진 중쇄의 Fd 단편 및 무손상 경쇄를 수득하기 위해 모든 항체를 효소 파파인으로 처리하여 수득되는 Fab;

(iv) 항체 분자의 일가 항원-결합 부분을 가진 항체 분자의 단편으로서, 모든 항체를 효소 펩신으로 처리한 다음 환원시킴으로써 수득되는 Fab'(항체 분자당 두 개의 Fab' 단편이 수득된다); 및

(v) 항체 분자의 일가 항원-결합 부분을 가진 항체 분자의 단편으로서, 모든 항체를 효소 펩신으로 처리하여 수득되는 F(ab')2(즉, Fab' 단편의 다이머는 두 개의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된다).

모노클로날 및 폴리클로날 항체를 생성하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 항체는 항체 분자의 생체 내 생산의 유도를 사용할 수 있는 몇몇 공지된 방법 중 어느 하나[screening of immunoglobulin libraries(Orlandi, R. et al. (1989)), Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction (Proc Natl Acad Sci USA 86, 3833-3837; 및 Winter, G. and Milstein, C. (1991). Man-made antibodies. Nature 349, 293-299)], 또는 배양에서 연속 세포주에 의한 모노클로날 항체의 생성을 통해 생성될 수 있다. 이들로는 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 및 Epstein-Barr 바이러스(EBV)-하이브리도마 기술이 포함되나 이들에 한정되지 않는다[Kohler, G. and Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity (Nature 256, 495-497; Kozbor, D. et al. (1985)), Specific immunoglobulin production and enhanced tumorigenicity following ascites growth of human hybridomas (J Immunol Methods 81, 31-42; Cote RJ. et al. (1983)). Generation of human monoclonal antibodies reactive with cellular antigens (Proc Natl Acad Sci USA 80, 2026-2030; 및 Cole, S. P. et al. (1984)). Human monoclonal antibodies (MoI Cell Biol 62, 109-120)].

생체 내에서　항체를　생성시，표적　항원이　너무　작아서　적절한　면역원　반응을　도출할　수　없는　경우，이러한　항원("합텐(haptens)"이라 함)은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH) 또는 혈청 알부민(예, 소 혈청 알부민, BSA) 담체와 같이 항원성을 가진 중성 담체에 커플링될 수 있다(참조예, 미국 특허 제 5,189,178 호 및 제 5,239,078 호). 담체에의 합텐의 커플링은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 그룹에의 직접 커플링을 수행한 다음, 형성된 이미노 결합을 임의로 환원시킬 수 있다. 다르게는, 디사이클로헥실 카보디이미드 또는 다른 카보디이미드 탈수제와 같은 축합제를 사용하여 담체를 커플링시킬 수 있다. 링커(Linker) 화합물이 또한 커플링을 수행하는데 사용될 수 있고; 동종 이작용성(homobifunctional) 및 이종 이작용성(heterobifunctional) 링커가 피어스 케미컬 컴파니(Pierce Chemical Company, 미국 일리노이 록포드 소재)로부터 입수가능하다. 이어, 생성된 면역원성 복합체는 마우스, 토끼 등과 같은 적합한 포유동물 대상 내로 주입될 수 있다. 적합한 프로토콜은, 혈청에서의 항체 생산을 증대시키도록 설계된 스케줄에 따라 애주번트(adjuvant)의 존재하에 면역원의 반복 주입을 포함한다. 면역 혈청의 역가는 당업계에 공지된 면역분석법을 사용하여 용이하게 측정될 수 있다.

수득된 항혈청이 직접 사용될 수 있거나, 상술한 바와 같이 모노클로날 항체가 수득될 수 있다.

항체 단편은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다(참조예, Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 가수분해에 의하거나 단편을 코딩하는 DNA의 포유동물 세포(예, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 배양액 또는 다른 단백질 발현 시스템) 또는 대장균(E. coli)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다.

다르게는, 항체 단편은 종래 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 수득될 수 있다. 상술된 바와 같이, (Fab')2 항체 단편은, 펩신을 사용하여 항체를 효소적으로 절단하여 5S 단편을 제공하는 것에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은, 티올 환원제, 및 임의로 디설파이드 결합의 절단으로 생성되는 설프하이드릴에 대한 차단 그룹을 사용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab' 일가 단편을 생성할 수 있다. 다르게는, 펩신을 사용하는 효소적 절단은 두 개의 일가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 생산한다. 이러한 방법을 실행하기 위한 풍부한 가이던스가 당업계의 문헌에 제공되어 있다[참조예: 미국 특허 제 4,036,945 호 및 제 4,331,647 호; 및 Porter, R. R. (1959). The hydrolysis of rabbit γ-globulin and antibodies with crystalline papain. Biochem J 73, 119-126]. 단편이 무손상 항체에 의해 인지되는 항원에 대한 결합능을 유지하는 한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예컨대 일가의 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위해 중쇄의 분리, 단편의 추가의 절단, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전자조합 기술이 또한 사용될 수 있다.

상술된 바와 같이, Fv는 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인의 쌍으로 구성된다. 이 결합은 비공유적일 수 있다(참조예, Inbar, D. et al. (1972). Localization of antibody-combining sites within the variable portions of heavy and light chains. Proc Natl Acad Sci USA 69, 2659-2662). 다르게는, 상술한 바와 같이, 가변 도메인은 분자간 디설파이드 결합에 의해 단일 사슬 Fv를 생성하도록 결합될 수 있거나, 다르게는 이러한 사슬은 글루타르알데하이드와 같은 화학물질에 의해 가교-결합될 수 있다.

바람직하게도, Fv는 단일 사슬 Fv이다. 단일 사슬 Fv는 펩티드 링커를 코딩하는 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 작제함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터 내로 삽입된 다음, 대장균(E. coli)과 같은 숙주 세포 내에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 가변 도메인을 가교하는 링커 펩티드와 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. 단일 사슬 Fv를 생성하기 위한 풍부한 가이던스가가 당업계의 문헌에 제공되어 있다(참조예: Whitlow, M. and Filpula, D. (1991). single-chain Fv proteins and their fusion proteins. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2(2), 97-105; Bird, R. E. et al. (1988). Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426; Pack, P. et al. (1993). Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density fermentation of Escherichia coli. Biotechnology (N. Y.) 11(11), 1271-1277; 및 미국 특허 제 4,946,778 호).

단리된(isolated) 상보성-결정 영역 펩티드는 관심의 대상이 되는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 작제함으로써 수득될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 항체-생산 세포의 mRNA의 RT-PCR에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법을 실행하기 위한 풍부한 가이던스가 당업계의 문헌에 제공되어 있다(예, Larrick, J. W. and Fry, K. E. (1991). PCR Amplification of Antibody Genes. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2(2), 106-110).

사람을 치료하거나 진단하는데 인간화 항체가 바람직하게 사용되는 것이 인지될 것이다. 비-인간(예, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 부분(바람직하게는 최소)을 가진 유전자 조작 키메라 항체 또는 항체 단편이다. 인간화 항체는 인간 항체(수용자 항체)의 CDR이, 목적하는 기능성을 가진 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 항체를 포함한다. 경우에 따라서, 인간 항체의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체나 유입(imported) CDR 또는 골격 서열에 모두 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 골격 영역은 적합한 인간 공통 서열의 것에 상응한다. 최적으로, 인간화 항체는 또한 전형적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 정상 영역(예컨대 Fc 영역)의 적어도 일부분을 포함한다[참조예: Jones, P. T. et al. (1986). Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525; Riechmann, L. et al. (1988). Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332, 323-327; Presta, L. G. (1992b). Curr Opin Struct Biol 2, 593-596; 및 Presta, L. G. (1992a). Antibody engineering. Curr Opin Biotechnol 3(4), 394-398)].

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 소스(source)으로부터의 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 유입 잔기라 불리는데, 전형적으로는 유입 가변 도메인으로부터 취하게 된다. 인간화는 본질적으로 문헌(참조예: Jones et al. (1986); Riechmann et al. (1988); Verhoeyen, M. et al. (1988). Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity. Science 239, 1534-1536; 및 미국 특허 제 4,816,567 호)에 기술된 바와 같이 인간 CDR을 상응하는 설치류의 CDR로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 인간화 항체는, 무손상 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 적게 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 어쩌면 일부 골격 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체일 수 있다.

인간 항체는 또한 파지-표면발현 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 각종 추가적인 기술을 사용하여 생산될 수 있다[Hoogenboom, H. R. and Winter, G. (1991). By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro. J Mol Biol 227, 381-388; Marks, J. D. et al. (1991). By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 222, 581-597; Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96; and Boerner, P. et al. (1991). Production of antigene-specific human monoclonal antibodies from in vitro-primed human splenocytes. J Immunol 147, 86-95)]. 인간화 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자자리를 코딩하는 서열을 유전자이식 동물(예, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 비활성화된 마우스)내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 항원 투여시, 인간 항체 생산은 유전자 재구성, 사슬 집합, 및 항체 레퍼토리(repertoire)를 비롯한 모든 측면에서 인간에서 보여지는 것과 밀접하게 유사한 동물에서 관찰된다. 이러한 접근법을 실행하기 위한 풍부한 가이던스가 당업계의 문헌에 제공되어 있다(참고예: 미국 특허 제 5,545,807 호; 제 5,545,806 호; 제 5,569,825 호; 제 5,625,126 호; 제 5,633,425 호; 및 제 5,661,016 호; Marks, J. D. et al. (1992). By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology (N.Y.) 10(7), 779-783; Lonberg et al., 1994. Nature 368:856-859; Morrison, S. L. (1994). News and View: Success in Specification. Nature 368, 812-813; Fishwild, D. M. et al. (1996). High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nat Biotechnol 14, 845-851; Neuberger, M. (1996). Generating high-avidity human Mabs in mice. Nat Biotechnol 14, 826; and Lonberg, N. and Huszar, D. (1995). Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol 13, 65-93).

항체를 수득한 후, 이들을 예를 들어 효소면역측정법(ELISA)를 통해 활성에 대해 시험할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일례에 따라, 임의로 및 더욱 바람직하게는 현탁액에서 성장된 식물 세포 배양, 바람직하게는 뿌리 식물 세포에서 기능적 IgG4 항체를 생산하는 시스템 및 방법이 제공된다. 임의로 및 가장 바람직하게도, 식물 세포 배양은 당근 뿌리 세포를 포함한다.

본 발명의 또다른 바람직한 일례에 따라, 임의로 및 더욱 바람직하게는 현탁액에서 성장된 식물 세포 배양, 바람직하게는 뿌리 식물 세포 배양에서, 포유동물 세포 배양에서 성장된 상응하는 항체 보다 표적 항원에 대한 결합 친화력이 더 큰 항체를 생산하는 시스템 및 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 바람직한 일례에 따라, 각각 서열번호: 1 및 5에 상당하는(homologous) 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 중쇄 및 경쇄 서열을 가진 항체가 제공된다. 임의로, 서열번호: 1 및 5에 따른 서열로 본질적으로 이루어진 서열을 가진 항체가 제공된다. 여기서 항체는 IgG1 아형이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일례에 따라, 각각 유전자 1-4(중쇄; 서열번호: 1-4)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 서열 및 유전자 9-12(경쇄; 서열번호: 5-8)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 서열에 상당하는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 중쇄 및 경쇄 서열을 가진 항체가 제공된다. 임의로, 유전자 1-4(중쇄; 서열번호: 1-4)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 중쇄 서열 및 유전자 9-12(경쇄; 서열번호: 5-8)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 경쇄 서열을 가진 항체가 제공된다. 이 항체는 IgG1 아형이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 일례에 따라, 각각 유전자 5-8(중쇄; 서열번호: 9-12)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 서열 및 유전자 9-12(경쇄; 서열번호: 5-8)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 서열에 상당하는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 중쇄 및 경쇄 서열을 가진 항체가 제공된다. 임의로, 유전자 5-8(중쇄; 서열번호: 9-12)로 구성되는 그룹 중에서 선택된 중쇄 서열 및 유전자 9-12(경쇄; 서열번호: 5-8)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 경쇄 서열을 가진 항체가 제공된다. 이 항체는 IgG4 아형이다.

본 발명의 또 다른 일례에 따라, 식물 시그널 펩티드를 포함하는 항체가 제공된다. 바람직하게도, 항체는 IgG4 아형이다. 임의로 및 바람직하게도, 식물 시그널 펩티드는 Apo(아포플라스트), ER(소포체) 및 액포로 구성되는 그룹 중에서 선택된 세포기관에 항체를 표적화시킨다. 더욱 바람직하게도, 식물 시그널 펩티드는 항체가 임의로 및 가장 바람직하게는 ER에 의해 보유되고 골지체(Golgi body)로 이동하지 않도록 항체를 ER에 표적화시킨다. 임의로, ER 보유 시그널과의 융합을 촉진하기 위해 스톱 코돈(stop codon)은 항체에 존재하지 않는다. 또한, 임의로 액포에의 표적화는 스톱 코돈 앞에 액포 선별 시그널 GLLVDTM(서열번호: 13)을 코딩하는 서열을 삽입하는 것에 의해 달성된다.

본 명세서에 사용된 용어 "식물"은 유전자 조작이 가능한 단자엽 또는 쌍자엽과 같은 임의의 식물 뿐만아니라 구과 식물, 이끼 또는 조류(algae)와 같은 기타 식물을 말한다. 현재 공지된 일례에 따라, 식물은 당근 식물이다. 다른 일례에 따라, 식물은 니코티아나 알라타(Nicotiana alata), 니코티아나 글라우카(Nicotiana glauca)(Wild Tobacco), 니코티아나 랑스도르피(Nicotiana langsdorffii), 니코티아나 롱기플로라(Nicotiana longiflora), 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)(Tobacco)을 포함하나 이에 한정되지 않는 니코티아나(Nicotiana) 속이다.

"세포", "숙주세포" 또는 "재조합 숙주세포"는 본 명세서에서 혼용적으로 사용되는 용어이다. 이 용어는 특정 대상의 세포만이 아니라 이러한 세포의 후손 또는 잠재 후손을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 후세에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손은 사실상 모 세포(parent cell)와 동일하지 않을 수 있지만 본 명세서에 사용된 용어의 범위에 여전히 포함된다. 본 명세서에 사용된 "숙주세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 발현 벡터 또는 나(naked) DNA에 의해 재조합적으로 형질전환될 수 있는 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질감염(transfection)"은 핵산-매개 유전자 전달에 의해 핵산, 예를 들어 나 DNA 또는 발현 벡터를 수용자 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수의 결과로서 세포의 유전자형이 변화되는 과정을 의미하는 것으로, 예를 들어 형질전환 세포는 목적하는 단백질의 재조합 형태를 발현한다.

약물 내성 또는 다른 선택가능 마커가 형질전환주의 선택(selection)을 촉진하고자 의도된 것임을 인지해야 한다. 추가로, 약물 내성 마커와 같은 선택가능 마커의 존재는 오염 미생물이 배양 배지에서 증식하지 않도록 하는데 유용할 수 있다. 이와 같은 형질전환 숙주세포의 순수 배양액은 유발(induced) 표현형의 생존에 필요한 조건하에서 세포를 배양함으로써 수득되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 숙주세포는 핵산 분자에 의해 형질감염되거나 형질전환될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적합하다면 리보핵산과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 또한 등가물로서, 뉴클레오티드 유사체로 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체 및 기술되는 일례에 적용된 바와 같이 단일-가닥 (예컨대 센스(sense) 또는 안티센스 (antisense)) 및 이중-가닥의 폴리뉴클레이티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 일례로, 본 발명의 숙주세포는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질감염되거나 형질전환된다. 본 명세서에 사용된 "발현 벡터"는 DNA 단편을 숙주의 게놈 내로 삽입(integration)시킬 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 삽입가능한(integratable) DNA 단편, 및 다른 비히클(vehicle)과 같은 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 목적하는 유전자 또는 그의 단편, 및 적합한 숙주세포에서 식별되는 작동가능하게 연결된 유전자 제어 요소를 포함하는 자기-복제 DNA 또는 RNA 작제물로서, 목적하는 유전자를 발현시킨다. 이들 제어 요소는 적합한 숙주 내에서 발현될 수 있다. 일반적으로, 유전자 제어 요소는 원핵 프로모터 시스템 또는 진핵 프로모터 발현 제어 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 전형적으로 전사 프로모터(transcription promoter), 전사의 개시(onset)를 제어하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator), RNA 발현의 수준을 높이는 전사 인핸서(transcription enhancer), 적합한 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, RNA 스플라이스 이음부(splice junction), 전사 및 번역을 종결하는 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 통상 벡터가 숙주세포와 독립적으로 복제하도록 하는 복제 기점을 포함한다.

동등한 기능을 제공하며 당업계에 공지된 다른 형태의 벡터도 본 발명에 사용하기에 적합하지만, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이다. 예를 들어 문헌[Pouwels et al. Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 and supplements), Elsevier, N. Y.; and Rodriquez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988)]을 참조하기 바라며, 이 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다.

일반적으로, 이러한 벡터는 형질전환 세포에서 표현형 선택(phenotypic selection)을 제공할 수 있는 특정 유전자를 추가로 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현하기 위한 원핵 및 진핵 바이러스 발현 벡터의 용도가 또한 예상된다.

임의로, 벡터는 전반적인 식물 벡터(이하의 실시예와 관련하여 기술된 바와 같은 것)일 수 있다. 다르게는, 벡터는 임의로 뿌리 세포에 대해 특이적일 수 있다.

하나의 바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.

특정 일례로, 본 발명의 숙주세포는 원핵 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 가장 바람직하게는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포이다. 이들 세포는 이후 기술된 바람직한 식물 숙주세포를 감염시키는데 사용된다.

다른 바람직한 일례로, 본 발명의 숙주세포는 진핵세포, 바람직하게는 식물 세포(예, 뿌리세포, 잎 세포, 줄기 세포, 잎꼭지 세포, 분열조직 세포 및 열매 세포(예, 포도))이다. 바람직한 일례에 따라, 식물 뿌리 세포는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 식물 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

바람직한 일례로, 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다. 본 발명의 형질전환 당근 세포는 현탁액중에서 성장되는 것을 유념해야 한다. 상기 언급되거나 실시예에 기술된 바와 같이, 이들 세포는 본 발명의 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens ) 세포에 의해 형질전환되었다.

언급된 바와 같이, 본 발명의 핵산 작제물(상술한 플라스미드)은 안정하거나 일과적으로 식물 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 안정한 형질전환에서, 본 발명의 핵산 분자는 식물 게놈 내로 삽입되며, 그 자체로 안정한 유전 형질을 나타낸다. 일과성 형질전환에서, 핵산은 형질전환된 세포에 의해 발현되지만 게놈 내로 삽입되지 않으며, 그 자체로 일시적 형질을 나타낸다. 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에 외래 유전자를 도입하는 여러 방법이 존재한다[Potrykus, I. (1991). Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. (1989). Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature (1989) 338, 274-276)].

식물 게놈 DNA내로 외인성 DNA를 안정하게 삽입하는 주된 방법은 다음의 2 가지 주요 접근법을 포함한다:

(i) 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 유전자 전달.[참조예: Klee, H. J. et al. (1987). Annu Rev Plant Physiol 38, 467-486; Klee, H. J. and Rogers, S. G. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pp. 2-25, J. Schell and L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal.; and Gatenby, A. A. (1989). Regulation and Expression of Plant Genes in Microorganisms, pp. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung and C. J. Arntzen, eds., Butterworth Publishers, Boston, Mass].

(ii) 직접 DNA 흡수[참조예: Paszkowski, J. et al. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pp. 52-68, J. Schell and L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal; and Toriyama, K. et al. (1988). Bio/Technol 6, 1072-1074 (methods for direct uptake of DNA into protoplasts)]. [참조예: Zhang et al. (1988). Plant Cell Rep 7, 379-384; and Fromm, M. E. et al. (1986). Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319, 791-793 (DNA uptake induced by brief electric shock of plant cells]. [참조예: Klein et al. (1988). Bio/Technology 6, 559-563; McCabe, D. E. et al. (1988). Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology 6, 923-926; and Sanford, J. C. (1990). Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209 (DNA injection into plant cells or tissues by particle bombardment). [참조예: Neuhaus, J. M. et al. (1987). Theor Appl Genet 75, 30-36; and Neuhaus, J. M. and Spangenberg, G. C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (use of micropipette systems)]. [참조예: 미국 특허 제 5,464,765 호(glass fibers or silicon carbide whisker transformation of cell cultures, embryos or callus tissue)]. [참조예: DeWet, J. M. J. et al. (1985). "Exogenous gene transfer in maize (Zea mays) using DNA-treated pollen," Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. P. Chapman et al., eds., Longman, New York-London, pp. 197-209; 및 Ohta, Y. (1986). High-Efficiency Genetic Transformation of Maize by a Mixture of Pollen and exogenous DNA. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (direct incubation of DNA with germinating pollen)].

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 시스템은 식물 게놈 DNA내로 삽입된 한정(defined) DNA 세그먼트를 가진 플라스미드 벡터의 사용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 전달 시스템에 따라 달라진다. 널리 사용되는 접근법은 전체-식물 분화의 개시에 대한 우수한 소스(source)를 제공하는 임의의 조직 외식편으로 수행될 수 있는 리프-디스크(leaf-dic) 방법이다[Horsch, R. B. et al. (1988). "Leaf disc transformation." Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht)]. 추가적인 접근법은 진공 침투와 함께 아그로박테리움 (Agrobacterium) 전달 시스템을 사용한다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 시스템은 유전자이식 쌍자엽 식물의 발생에 특히 유용하다.

식물 세포내로 직접 DNA를 전달하는 여러 방법이 존재한다. 일렉트로포레이션(electroporation)의 경우, 원형질체는 강한 전기장에 쉽게 노출되어 DNA가 들어가도록 미소-세공(mini-pore)을 개방한다. 마이크로인젝션(microinjection)의 경우, DNA는 마이크로피펫을 사용하여 기계적으로 세포내로 직접 주입된다. 마이크로입자 타격법(microparticle bombardment)에서, DNA는 마그네슘 설페이트 크리스탈 또는 텅스텐 입자와 같은 마이크로프로젝틸(microprojectile)상에 흡착되며, 이 마이크로프로젝틸은 세포 또는 식물 조직내로 물리적으로 가속시킨다.

안정한 형질전환후, 이어 식물을 번식시킨다. 식물 번식의 가장 통상적인 방법은 종자에 의한 것이다. 그러나, 종자는 멘델 규칙에 의해 지배되는 유전 분산(genetic variance)에 따라 식물에 의해 생성되므로, 종자 번식에 의한 재생의 단점은 이형접합성에 기인한 작물의 균일성 결핍이다. 다른 말로, 각각의 종자는 유전학적으로 상이하며, 자신의 특별한 특성을 가지고 성장할 것이다. 따라서, 재생 식물의 특성과 특징이 모 유전자이식 식물과 동일하도록 재생하는 것이 바람직하다. 형질전환 식물을 재생하는 바람직한 방법은 형질전환 식물을 신속하고 일관되게 재생산하는 미세증식(micropropagation)에 의한 것이다.

미세증식은 선택된 모 식물 또는 재배종으로부터 잘라낸 단일 조직 샘플로부터 제 2 세대 식물을 성장시키는 방법이다. 이 방법에 의해 바람직한 조직을 가지며 융합 단백질을 발현하는 식물의 대량 재생산이 가능하다. 새로 생성된 식물은 최초 식물과 유전학적으로 동일하고 최초 식물의 특징 모두를 가진다. 미세증식은 단기간에 우수 식물 재료의 대량 생산을 가능케 하고, 최초 유전자이식 또는 형질전환 식물의 특징을 보존하면서 선택된 작물을 신속하게 증식가능케 한다. 식물 클로닝 방법의 이점으로는 식물 증식의 신속성 및 생성된 식물의 우수성 및 균일성이 포함된다.

미세증식은 단계간 배양 배지 또는 성장 조건의 변화가 필요한 다단계 과정이다. 미세증식법은 기본적으로 4 단계를 포함한다: 단계 1 - 초기 조직 배양; 단계 2 - 조직 배양 증식; 단계 3 - 분화 및 식물 형성(plant formation); 및 단계 4 - 온실 배양 및 경화. 단계 1 동안, 조직 배양은 확립 및 보증된 오염물질을 함유하지 않는다. 단계 2 동안, 초기 조직 배양은 충분한 수의 조직 샘플이 생산 목표를 충족하도록 생성될 때까지 증식된다. 단계 3 동안, 새로 성장된 조직 샘플은 개개의 소식물체(plantlet)로 분할 및 성장된다. 단계 4에서, 형질전환 소식물체는 자연환경에서 성장을 계속할 수 있도록 빛에 대한 식물 내성이 점차 증가되는 경화용 온실로 옮겨진다.

본 발명의 현재 공지된 바람직한 일례에 따르면, 재조합 단백질은 본원에 충분히 설명된 바와 같이 참고문헌으로서 본원에 포함되고, 2002년 5월 21일자로 등록된 미국특허 제 6,391,638호와 관련하여 기술된 장치에서 배양함으로써 본 발명에 따른 식물 세포에 의해 생성될 수 있다. 이 장치를 사용하여 현탁액 중에서 식물 세포를 배양하는 조건은, 본원에 충분히 설명된 바와 같이 참고로서 본 명세서에 포함되며, 본 발명자들중 한 명에 의한 미국 특허출원(발명의 명칭: "세포/조직을 배양하는 장치 및 방법(CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD")과 관련하여 기술되어 있다.

안정한 형질전환이 현재 바람직하지만, 예를 들어 잎 세포, 분열조직 세포 또는 모든 식물의 일과성 형질전환이 또한 본 발명에 의해 관찰된다.

일과성 형질전환은 상술한 임의의 직접 DNA 전사 방법에 의하거나 변형된 식물 바이러스를 사용하는 바이러스 감염에 의해 수행될 수 있다.

식물 숙주의 형질전환에 유용한 것으로 제시된 바이러스로는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV), 토바코 모자이크 바이러스(TWV) 및 바쿨로바이러스(BV)가 포함된다. 식물 바이러스를 사용하는 식물의 형질전환에 대하여 예를 들어 미국 특허 제 4,855,237 호(빈 골든 모자이크 바이러스, BGMV); EPA 67,553 (TMV); 일본 특허공개 제 63-14693 호(TMV); EPA 194,809 (BV); EPA 278,667 (BV); 및 문헌[Gluzman, Y. et al. (1988). Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189]에 기술되어 있다. 식물을 비롯한 많은 숙주에서 외래 DNA를 발현함에 있어서 가성바이러스(pseudovirus) 입자의 용도가 WO 87/06261에 개시되어 있다.

식물에서의 비-바이러스성 외인 핵산 서열의 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 작제는 상기한 문헌 및 문헌[Dawson, W. O. et al. (1989). A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986) Science 231, 1294-1297; and Takamatsu, N. et al. (1990). Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett 269, 73-76]에 의해 입증된다.

형질전환되는 바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 당업자라면　바이러스　자체를　적합하게　변형시킬　수　있다．　또한，외래 DNA와의 목적하는 바이러스 벡터의 작제를 용이하게 하기 위해, 바이러스는 먼저 박테리아 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이어, 바이러스는 플라스미드로부터 잘라 내어질 수 있다. 바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 박테리아 복제기점이 바이러스 DNA에 부착된 다음 박테리아에 의해 복제될 수 있다. DNA의 전사 및 번역은 외피 단백질을 생산하게 되며, 이 외피 단백질은 바이러스 DNA를 둘러싸게 될 것이다. 바이러스가 RNA 바이러스인 경우, 이 바이러스는 일반적으로 cDNA로서 클로닝되고 플라스미드 내로 삽입된다. 이어, 이 플라스미드를 사용하여 대부분의 식물 유전 작제물을 제조한다. 그후, RNA 바이러스가 플라스미드의 바이러스 서열로부터 전사된 다음, 바이러스 유전자의 번역에 의해 바이러스 RNA를 둘러싸게 될 외피 단백질을 생산한다.

식물에서의 비-바이러스성 외인 핵산 서열의 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 작제는 본 발명의 작제물에 포함되는 것들과 같이, 상기 문헌 및 미국 특허 제 5,316,931 호에 입증되어 있다.

제 1 일례로, 식물 숙주에서의 발현이 가능한, 바이러스성 핵산으로부터의 천연(native) 외피 단백질 코딩 서열, 비-천연(non-native)(외래) 식물 바이러스 외피 단백질 코딩 서열, 및 비-천연 프로모터, 바람직하게는 비-천연 외피 단백질 코딩 서열의 서브게놈(subgenomic) 프로모터를 결손(deletion)시키고, 재조합 식물 바이러스성 핵산을 팩킹하고, 재조합 식물 바이러스성 핵산으로 숙주를 전신적으로 감염시키는 것을 포함하여, 식물 바이러스성 핵산을 삽입하는 방법이 제공된다. 또한, 비-천연 단백질이 생산되도록, 천연 외피 단백질 코딩 서열은 그 안에서 비-천연 핵산 서열의 삽입에 의해 비전사될 수 있다(non-transcribable). 재조합 식물 바이러스 핵산 작제물은 하나 이상의 추가적인 비-천연 서브게놈 프로모터를 가질 수 있다. 각각의 비-천연 서브게놈 프로모터는 식물 숙주에서 인접 유전자(adjacent gene) 또는 핵산 서열을 전사하거나 발현할 수 있고, 서로 함께 및 천연 서브게놈 프로모터와 함께 재조합될 수 없다. 또한, 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물은, 트랜스-작용 조절자와 결합하여 그 아래 위치한 코딩 서열의 전사를 조절하는 인핸서(enhancer)와 같은 하나 이상의 시스-작용 조절요소를 가질 수 있다. 하나 보다 많은 핵산 서열이 포함될 경우, 비-천연 핵산 서열은 천연 식물 바이러스성 서브게놈 프로모터 또는 천연 및 비-천연 식물 바이러스성 서브게놈 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다. 비-천연 핵산 서열은 서브게놈 프로모터(들)의 제어하에 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 목적하는 생산물을 생산한다.

제 2 일례로, 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물은, 천연 외피 단백질 코딩 서열이 비-천연 외피 단백질 코딩 서열에 인접하는 대신 비-천연 외피 단백질 서브게놈 프로모터 중 하나에 인접하게 배치되는 것을 제외하고는 제 1 일례에서와 같이 제공된다.

제 3 일례로, 그의 서브게놈 프로모터에 인접하게 배치된 천연 외피 단백질 유전자 및 바이러스성 핵산 작제물에 삽입된 하나 이상의 비-천연 서브게놈 프로모터를 포함하는 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물이 제공된다. 삽입된 비-천연 서브게놈 프로모터는 식물 숙주에서 인접 유전자를 전사 또는 발현할 수 있고, 서로 함께 및 천연 서브게놈 프로모터와 함께 재조합될 수 없다. 비-천연 핵산 서열은, 서브게놈 프로모터의 제어하에 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 목적하는 산물을 생산할 수 있도록 비-천연 서브게놈 식물 바이러스성 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다.

제 4 일례로, 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물은 천연 외피 단백질 코딩 서열이 비-천연 외피 단백질 코딩 서열에 의해 대체되는 것을 제외하고는 제 3 일례에서와 같이 제공된다.

바이러스 벡터는 상술한 바와 같은 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물에 의해 코딩된 발현 외피 단백질에 의해 감싸져 재조합 식물 바이러스를 생산한다. 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물 또는 재조합 식물 바이러스는 적합한 숙주 식물을 감염시키는데 사용된다. 재조합 식물 바이러스성 핵산 작제물은 숙주 안에서 전신적으로 분포하도록 숙주 내에서 복제될 수 있고, 숙주 내에서 하나 이상의 외래 유전자(단리된 핵산)를 전사 또는 발현하여 목적하는 단백질을 생산할 수 있다.

그 외에, 본 발명의 핵산 분자는 또한 엽록체 게놈 내로 도입되어 엽록체를 발현할 수 있다.

엽록체 게놈에 외인성 핵산 서열을 도입하는 기술은 공지되어 있다. 이 기술은 다음의 과정을 포함한다. 첫째, 세포당 엽록체의 수가 대략 하나로 줄도록 식물 세포를 화학적으로 처리한다. 이어, 적어도 하나의 외인성 핵산 분자를 엽록체내 도입하기 위해, 외인성 핵산을 바람직하게는 입자 충격(particle bombardment)을 통해 세포 내로 도입한다. 그 후, 외인성 핵산은 엽록체에 대한 고유의 효소에 의해 쉽게 수행될 수 있는 상동 조합(homologous recombination)을 통해 엽록체 게놈 내로 삽입가능하도록 당업자들에 의해 선택된다. 그 때문에, 외인성 핵산은 관심의 대상이 되는 유전자 이외에 엽록체 게놈으로부터 유래 된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 외인성 핵산은, 순차적인 선택 방법에 의해 선택후 모든 또는 실질적으로 모든 엽록체 게놈의 복사(copy)가 외인성 핵산을 포함한다는 것을 숙련자가 확인할 수 있게 하는 선택가능 마커를 포함한다. 이러한 기술에 관한 더욱 상세한 설명은 참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제 4,945,050 호 및 제 5,693,507 호에 있다. 따라서, 폴리펩티드는 엽록체의 단백질 발현 시스템에 의해 생산되어, 엽록체의 내막에 삽입될 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 예로서 본 명세서에 기술된다:

도　1은　본　발명에　따른　식물　세포　배양　시스템에서　생산된 예시적인 항체의 아미노산 서열을 나타내며, 수퍼 벡터 서열에서 경쇄 및 중쇄 모두의 엑손 서열은 적색으로 강조되어 있다. 서열은 다음과 같다: pG1KD210.BAT-RHcRKd - IgG1 중쇄 및 경쇄; 및 pG4KD110-BARHcRKd - IgG4 중쇄 및 경쇄.

도 2a-p는 항체에 대한 합성 유전자의 서열을 나타내며; 추정(deduced) 아미노산 서열이 뉴클레오티드 서열 위에 표시되어 있다. 주요 제한 부위가 뉴클레오티드 아래에 표시되어 있다. 서브클로닝에 사용된 제한 부위는 진한 글자로 표시되어 있다. 서열은 다음과 같다(이름 다음에 제한 부위가 표시된다; 클로닝에 사용된 것들은 진한 글자로 표시되어 있다):

GENE 1 Heavy chain 1 NATIVE Sal-EcoRI

GENE 2 Heavy chain 1 Apo EcoRI-Sa1I

GENE 3 Heavy chain 1 ER EcoRI SalI

Gene 4 Heavy chain 1 vac EcoRI SalI

Gene 5 Heavy chain 4 Native SalI EcoRI

Gene 6 Heavy chain 4 Apo EcoRI SalI

Gene 7 Heavy chain 4 ER EcoRI SalI

Gene 8 Heavy chain 4 Vac EcoRI SalI

Gene 9 Light chain Native SalI EcoRI

Gene 10 Light chain Apo EcoRI SalI

Gene 11 Light chain ER EcoRI XhoI

Gene 12 Light chain vac EcoRI SalI

도 3a 및 3b는 발현 카세트 및 바이너리 벡터로의 합성 유전자의 클로닝을 나타낸다; 도 3a는 식물 표적화 시그널과 합성 유전자의 작제를 나타내는데: 합성 유전자는 아포플라스트에 표적화되도록 제한 부위 앞에 스톱 코돈(작제물 2,6,10); 스톱 코돈 앞에 액포 표적화 펩티드를 코딩하는 서열(액포에 표적화됨; 작제물 4, 8, 12); 또는 시그널이 없는 서열 중 하나를 가지며, ER 보유 시그널에 융합되고(ER에 표적화됨; 작제물 3, 7, 11): 도 3b는 인간 시그널 펩티드 서열과 합성 유전자의 작제를 나타낸다. 이 합성 유전자는 인간 자연 항체로 개시되고 스톱 코돈으로 종결된다.

도 4a 및 4b는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 검출된 IgG1(도 4a) 및 IgG4(도 4b) 중쇄 및 경쇄의 발현을 나타낸다. 형질전환 당근 칼루스를 중쇄 및 경쇄 항체 사슬의 생성을 위해 스크리닝하였다. 1 g의 칼루스를 추출 버퍼로 균질화시키고, 그의 15 mg을 SDS-PAGE상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 중쇄 및 경쇄는 특이적 항 FC 및 항 Kappa 항체로 검출되었다. 도 4a는 형질전환 칼루스 발현 IgG1(1+9)을 나타낸다. 표준(St.) IgG1 중쇄 및 경쇄를 표시하였다. 이 레인은 스크리닝된 상이한 칼루스를 나타낸다. 도 4b는 형질전환 칼루스 발현 IgG4(5+9)를 나타낸다. 표준(St.) IgG4 중쇄 및 경쇄를 표시하였다. 이 레인은 스크리닝된 상이한 칼루스를 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따라 생식 세포주, 집합 IgG1 (A) 및 IgG4 (B)에 의해 생산된 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 선택된 칼루스의 세포 현탁액을 집합 IgG1 또는 IgG4 생산 및 분비에 대해 분석하였다. 1 g의 세포를 추출 버퍼로 균질화시키고, 그의 가용성 추출물 15 mg 및 배지 20㎖를 비환원성 SDS-PAGE상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 집합 IgG1 및 IgG4 사슬 은 항 FC 항체를 사용하여 검출하였다. 숫자는 단리된 상이한 칼루스를 나타내며, 표준 IgG4가 표시되어 있다.

도 6a-b는 Macro Prep High S 양이온 교환 컬럼상에서 IgG1 발현 세포 추출액의 분리를 나타낸다. IgG1 정제에서 제 1 단계는 다음과 같은 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행되었다: 25 mM 소듐 시트레이트 버퍼(pH 5.5)에서 평형화시킨 강한 양이온 교환 컬럼(Macro-Prep high-S support, Bio-Rad)상에 정화된 추출액을 부하하였다. 1M NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 IgG1을 용리하였다. 작업중 수집한 분획을 비환원성 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다. 도 6a는 양이온 교환 컬럼에서의 세포 추출의 표준 작업(run)을 나타낸다. 청색은 280㎚에서의 흡광도를 나타내고, 녹색은 전도도를 나타낸다. 분획 번호를 표시하였다. 도 6b는 작업중 수집된 분획을 나타내며, 비환원 SDS-PAGE 상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 집합 IgG1 사슬을 항 FC 항체를 가지고 검출하였다. 총 단백질 부하 및 FT(flow threw)를 표시하였고, 여기서 숫자는 용리 분획을 나타내며, 표준 IgG1이 표시되어 있다.

도 7a-b는 Macro Prep High S 양이온 교환 컬럼상에서 IgG4 발현 세포 추출액의 분리를 나타낸다. IgG4 정제에서 제 1 단계는 다음과 같은 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행되었다: 25 mM 소듐 시트레이트 버퍼(pH 5.5)에서 평형화시킨 강한 양이온 교환 컬럼(Macro-Prep high-S support, Bio-Rad)상에 정화된 추출액을 부하하였다. 1M NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 IgG4를 용리하였다. 작업중 수집한 분획을 비환원성 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석 하였다. 도 7a는 양이온 교환 컬럼에서의 세포 추출의 표준 작업(run)을 나타낸다. 청색은 280㎚에서의 흡광도를 나타내고, 적색은 염 구배를 나타낸다. 분획 번호가 표시되어 있다. 도 7b. 작업중 수집된 분획을 비환원 SDS-PAGE 상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 집합 IgG4 사슬을 항 FC 항체를 가지고 검출하였다. 총 단백질 부하 및 FT(FT1, FT2)를 표시하였다. 숫자는 용리 분획을 나타내며, 표준 IgG4가 표시되어 있다.

도 8a-b 및 도 9a-b는 선택된 분획(도 8b 및 도 9b)의 웨스턴 블롯 분석과 함께 IgG1(도 8a) 및 IgG4(도 9a)의 단백질 A에서의 전형적인 작업을 나타낸다.

도 8a-b는 단백질 A 세파로스(sepharose)에서 분리된 양이온 교환 용리액으로부터의 IgG1 함유 분획을 나타낸다. IgG1 정제에서 제 2 단계는 다음과 같은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행하였다: 양이온 교환 컬럼으로부터의 IgG1 함유 분획을 풀링하고 단백질-A 세파로스 컬럼(Sigma)에서 분리하였다. 시트르산 버퍼 pH 4.4를 가지고 IgG1을 용리하였다. 작업중 수집한 분획을 비환원 SDS-PAGE에 적용하고 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다. 도 8a는 단백질 A 세파로스 컬럼에서의 표준 작업을 나타낸다. 도 8b. 작업중 수집한 분획을 비환원성 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 집합 IgG1 사슬을 항 FC 항체를 가지고 검출하였다. 총 단백질 부하를 표시하였다. 숫자는 용리 분획을 나타내며, 표준 IgG1이 표시되어 있다.

도 9a-b는 단백질 A 세파로스(sepharose)에서 분리된 양이온 교환 용리액으로부터의 IgG4 함유 분획을 나타낸다. IgG4 정제에서 제 2 단계는 다음과 같은 단 백질 A 크로마토그래피 컬럼에 의해 수행하였다: 양이온 교환 컬럼으로부터의 IgG4 함유 분획을 풀링하고 단백질-A 세파로스 컬럼(Sigma)에서 분리하였다. 시트르산 버퍼 pH 4.4를 가지고 IgG4을 용리하였다. 작업중 수집한 분획을 비환원 SDS-PAGE에 적용하고 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다. 도 9a는 단백질 A 세파로스 컬럼에서의 표준 작업을 나타낸다. 도 9b. 작업중 수집한 분획을 비환원성 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 집합 IgG4 사슬을 항 FC 항체를 가지고 검출하였다. 총 단백질 부하를 표시하였다. 숫자는 용리 분획을 나타내며, 표준 IgG4가 표시되어 있다.

도 10a-b 및 도 11a-b는 각각 정제된 IgG1 및 IgG4 단백질의 웨스턴 블롯 및 쿠마시 염색을 나타낸다.

도 10은 정제된 IgG1의 웨스턴 블롯 및 쿠마시 염색을 나타낸다. 정제 Protalix-IgG1 및 상업적인(표준) IgG1을 비환원성 SDS-PAGE상에 적용하고, 항 FC 항체를 사용한 웨스턴 블롯(A) 및 쿠마시 염색(B)에 의해 분석하였다. 도 1Oa는 IgG1 표준 50ng (1), 1:5 희석된 Protalix IgG1 (2)을 나타낸다. 도 10b는 IgG1 표준: 1mg (1), 0.5mg (2), MW 마커 (3), Protalix IGg1 (4-7)를 나타낸다. MW 마커의 크기가 표시되어 있다.

도 11은 정제된 IgG4의 웨스턴 블롯 및 쿠마시 염색을 나타낸다. 정제 Protalix-IgG4 및 상업적인(표준) IgG4를 비환원성 SDS-PAGE상에 적용하고, 항 FC 항체를 사용한 웨스턴 블롯(A) 및 쿠마시 염색(B)에 의해 분석하였다. 도 11a는 IgG4 표준 100ng (1), 50ng (2), 25ng (3), 1:5 희석된 Protalix IgG4 (4)을 나타 낸다. 도 11b는 IgG4 표준: 1mg (1), 0.5mg (2), 0.25mg (3), 0.125mg (4), Protalix IGg4 (5)를 나타낸다. MW 마커의 크기가 표시되어 있다.

도 12a 및 12b는 FACS 분석법에 의해 결정된, Protalix IgG1, IgG4 및 CureTech IgG1과 인큐베이션시킨 세포의 형광 강도의 시프트를 나타낸다. 특이적 표면 항원을 발현하는 Jurkat 세포를 50 ㎎/㎖에서 0.1 ㎖의 정제 항체와 인큐베이션하였다. 바이오틴화 항 인간 IgG 항체, 이어 PE-컨쥬게이트 스트렙타비딘을 사용하여 결합 항체를 검출하였다. 비표지된 세포를 대조군으로서 사용하였다. A: 상이한 항체를 사용하여 염색된 세포의 FACS 분석(설명 참조), B: 분석된 샘플의 평균 형광.

바람직한　일례의　상세한　설명

본 발명은 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법이다. 본 발명은 또한 그 시스템 및 방법에 따라 생산된 항체[본 명세서에서 예시적인 항체이며, 본 발명의 설명(및 최적의 실시)을 목적으로 제공된 Curetech 항체는 제외하며, 어떠한 방식으로 제안하고자 의도되지 않음], 및 그의 숙주세포 및 벡터를 포함한다.

놀랍게도, 그리고 배경기술의 교시와는 반대로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체의 결합 효능이 포유동물 세포 배양에서 생산된 항체 보다 높다는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 이전에 식물 세포 배양에서 입증된 바 없는 안정한 고기능성 IgG4형 항체를 생산할 수 있었다. 실제로, IgG4의 발현은 식물 세포 배양(또는 임의 형태의 식물 세포)에서 입증되지 못했다.

단일 가설에 의해 제한되는 것은 아니지만, 포유동물 세포 배양에서 생산된 항체와는 대조적으로, 본 발명에 따라 생산된 항체의 더 큰 결합 친화력은 상이한 글리코실화와 관련될 수 있다. 항체는 항체 자체의 글리코실화 패턴에 의해 다르게 영향을 받는 적어도 두 개의 중요한 생물학적 기능을 가진다. 항체는 항원에 결합될 수 있어야 하고, 다른 한편으로는 면역 시스템을 활성화하기 위해 이펙터 리간드를 활성화시킬 수 있어야 한다.

유효한 항체는 면역 시스템을 다음과 같이 활성화시킨다. 항체가 그의 항원에 결합하면, 이 항체는 면역 시스템을 리쿠르팅하여(recruit) 항원(예를들어 약성 세포)을 특집하는(featuring) 표적을 파괴한다. 항체의 FC 영역은 면역 시스템을 활성화하고 대식 세포 B 및 T 세포를 리쿠르팅하게 하는 인자(factor)와 상호작용할 수 있다. 항체는 또한 면역 시스템의 세포와 함께 혈액에서 발견되는 단백질을 포함하는 보체 시스템(complement system)을 활성화시킨다. 활성화되면, 보체 시스템은 여러가지 반응을 일으킨다. 이러한 보체 시스템은 세 개의 분리된 활성화 티거(tigger)로 이루어진다: (1) 세포 표면에 결합하는 항체, (2) 면역 복합체의 형성, 및 (3) 외래 세포막의 탄수화물 성분. 이펙터 리간드를 활성화시키는 능력은 전술한 바와 같이 글리코실화의 특정 형태 및 양에 의해 영향을 받는다.

그러나, 항원에 대한 항체의 결합은 글리코실화에 의해 영향받지 않는다(참조예, 참고문헌 27 및 32). 본 발명에 따른 식물 세포 배양 시스템에서 생산된 예시적인 항체는 포유동물 CHO 세포에서 생산된 IgG1 항체 보다 항원에 대한 친화력 이 더욱 크고 더욱 강하게 항원에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, 식물 세포 배양 시스템에서 입증되지 못한 IgG4 아형의 기능적인 예로서 이러한 예시적인 항체가 안정하게 생산되었다.

식물 세포는 현존하는 '우수의약품 안정성 실험실시 기준'(cGLP) 및 '우수의약품 제조관리 기준'(cGMP)을 사용하여, 고형 배지상에서 탈분화 세포의 덩어리(칼루수)로서 또는 세포 현탁액으로서 시험관내에서 배양될 수 있다(44). 포유동물 세포 배양에 비해, 식물 세포의 배양은 비교적 값이 싸고, 세포는 일반적으로 동물 세포 배양보다 더 건강하다. 중요하게도, 식물 세포는 면역글로불린의 정확한 집합, 폴딩 및 적절한 분비에 필요한 보조 단백질 기구 및 내인성 막 시스템을 지닌다. 재조합 단백질의 말단 당 잔기내에서 차이점이 관찰되었지만, 초기 단백질 글리코실화는 포유동물 시스템에서 관찰된 패턴에 꼭 일치한다(45)(18).

고-만노스 및 복합 N-결합 글리칸의 기본적인 생합성 경로는 식물을 비롯한 모든 진핵세포 중에 크게 보존된다. 상이한 시그널 펩티드의 사용 및 상이한 세포 내 수송은 글리코실화 패턴을 변경시킬 수 있고, 다른 발현 시스템에 비해 단백질 활성 및 안정성을 향상시킬 수 있다(참조예, WO2004/096978).

유전자이식 토바코 식물에서 생산된 모노클로날 항체 Guy 13(식물 항체 Guy 13)의 중쇄에 부착된 N-결합 글리칸의 구조는 뮤린 기원의 상응하는 IgG1에서 발견되는 것들과 상이하였다(29). 식물 항체 Guy 13의 중쇄에 위치한 N-글리코실화 부위는 모두 마우스에서와 같이 N-글리코실화된다. 그러나, Guy 13 글리코형태(glycoform)의 수는 포유동물 발현 시스템에서보다 식물에서 더 많다. 식물 항 체 N-글리칸의 높은 구조 다양성에도 불구하고, 글리코실화는 식물 시스템에서 생물학적으로 활성인 가용성 IgG를 생산하기에 충분한 듯하다. 식물 당단백질은 포유동물 당단백질에 나타나는 패턴과는 상이한 글리코실화 패턴을 나타내기 때문에, 이들 식물 재조합 항체가 동물에서의 바람직하지 못한 면역 반응을 유도할 가능성을 조사하였다. 분석을 통해 식물 재조합 항체의 글리칸 부분 및 단백질 모두에 대한 항체가 검출불가능한 수준인 것으로 나타났다. 이런 결과는 인간의 치료제 및 백신으로서 식물 재조합 단백질의 적용에 대한 직접적인 의의를 가진다(47).

언급된 바와 같이, 식물이 정확한 위치에서 인간 단백질을 글리코실화시키지만, 완전 처리된 복합 식물 글리칸의 조성은 포유동물 N-결합 글리칸과 상이하다. 식물 글리칸은 동물 글리칸에서 통상적인 말단 시알산 잔기 또는 갈락토스 잔기를 가지지 않으며, 일반적으로 포유동물에서 발견되지 않는 결합을 가진 크실로스 또는 푸코스를 종종 함유한다(Jenkins et al., 14 Nature Biotech 975-981 (1996); Chrispeels and Faye in transgenic plants pp. 99-114 (Owen, M. and Pen, J. eds. Wiley & Sons, N. Y. 1996; Russell 240 Curr. Top. Microbio. Immunol. (1999)). 특히, 식물은 포유동물에서 발견되지 않는 추가적인 베타 1-2 결합 크실로실- 및 알파 1-3 결합 푸코실-잔기를 포함한다. 반대로, 이들은 포유동물에 존재하는 푸코실-1-6-잔기는 포함하지 않는다. 즉, 본 발명은 항체, 바람직하게는 식물 글리코실화 패턴을 가진 IgG4 동형을 교시한다.

본　명세서에　사용된　식물　글리코실화　패턴은　적어도　하나의　베타 1-2 결합 크실로실 또는 적어도 하나의 알파 1-3 결합 푸코실-잔기를 포함한다. 글 리코실화 패턴은 또한 인간 글리코실화 패턴(예, 갈락토스 또는 시알산 잔기)을 부분적으로 포함할 수 있다.

시알산 잔기는 인간 수용체에서의 연관 폴리펩티드의 생체 내 반감기를 확장하는 약물동태학적 이유로 요구됨이 인지될 것이다. 즉, 예를 들어 항체 산물이 바람직하게는 일부 식물 글리코실화 패턴 및 일부 인간 글리코실화 패턴을 포함하도록(위에 길게 설명됨), 식물에서 합성된 항체 산물의 글리칸의 "인간화" 문제를 처리하기 위한 다양한 방법의 용도가 본 발명에 의해 예기된다.

유전자이식 염소의 우유 및 마우스 골수종 세포주 NSO에서의 IgG4 항체의 발현이 개시되어 있다(48,49). NSO 세포에서 발현된 항 TGFbeta2 IgG4는 TGFbeta2에 대한 친화력이 높고, TGFbeta2에 대한 항증식효과를 중화하여, TGFbeta2에 의해 매개된 섬유증의 치료에 제안되어있다. 그러나, NSO 세포에서 생산된 단백질의 글리코실화 패턴은 인간에서의 것과 다르다. 예를 들어, 글리코시드 구조는 면역원성 에피도프를 나타내는 추가적인 갈락토스 알파(1-3) 구조를 포함한다. 1%의 순환 IgG는 이 에피도프에 대한 특이적 항체인 것으로 추정된다. 따라서, 이 에피도프를 생성하는 재조합 항체의 주입에 의해, 면역 복합체의　형성이 유도되고, 전신성　면역　반응이 일어나게 된다(49)(50).

처리단계 및 재료가 다소 변할 수 있는 것과 같이, 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 실시예, 처리 단계 및 재료로 한정되지 않는다는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그의 등가물에 의해서만 제한되기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 일례만을 기술하기 위해 사용되는 것 이지 제한하고자 하는 의도된 것이 아니라는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 걸쳐 사용된 용어를 이하에 비한정적으로 설명한다.

본 명세서 및 이후의 청구범위에 걸쳐, 달리 지적되지 않는 한 단어 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 임의의 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라 정해진 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 그룹의 포괄을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 달리 지적되지 않는 한 단수형은 복수형의 지시대상을 포괄한다.

이후의 실시예는 본 발명의 일면들을 수행함에 있어서 발명자들에 의해 사용된 대표적인 기술이다. 이러한 기술은 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 일례의 예시이나, 본 설명에 비추어 당업자들은 본 발명의 정신 및 의도한 범위를 벗어나지 않고 다수의 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.

실시예 1

본 발명의 시스템에서 항체의 생산

본 실시예는 본 발명에 따른 시스템에서의 예시적인 항체의 생산을 설명한다.

재료 및 방법:

합성 유전자

재조합 인간 IgG 서열을 CureTech로부터 받았고 도 1a-f에 도시하였다. pG1KD210과 pG4KD110으로 명명된 벡터는 중쇄 및 경쇄 서열 둘 다를 포함한다. pG1KD210은 중쇄 γ¹을 코딩하고, pG4KD110은 중쇄 γ⁴를 코딩한다(도 1a-f 참조). 유전자 모두 인트론을 함유하였다. 공공연하게 입수가능한 데이터베이스 및 분자 생물학 프로그램을 사용하여, 중쇄 및 경쇄의 코딩 영역과 항체 유전자의 스플라이스 자리를 지도화하였다.

스플라이스 자리는 www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/에서 찾아볼 수 있는 NetGene2 프로그램을 사용하여 실행하였다(문헌[S.M. Hebsgaard, P.G. Korning, N. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, S. Brunak: Splice site prediction in Arabidopsis thaliana DNA by combining local and global sequence information, 1996, Nuc. Acids Res., 24:3439-3452; Brunak, S., Engelbrecht, J., and Knudsen, S.: Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA Sequence, 1991 J Mol. Biol, 220:49-65)]도 참고하기 바람).

이는 인간 인트론이 식물에서 부정확하게 인지될 수 있기 때문에, 최초 인간 항체 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 인트론을 갖지 않는 합성 유전자를 제조하기 위해 필요하였다.

단백질 서열을 Curetech(인간 항체의 시조)로 검증한 후, 서열을 당근의 최적 코돈 선호도를 사용하여 역번역하였다. DNA 서열은, 단백질 서열을 변형시키지 않으면서 높은 수준의 발현을 방해할 수 있는 제한 부위와 서열을 회피하도록 변형시켰다.

유기체에 대한 코돈 선호도는 Codon Usage Database (www.kazusa.or.ip/codon/)에서 찾아볼 수 있다. 대개, 코돈 선호도의 빈도는 그의 동족 tRNA의 과다(abundance)를 반영한다. 따라서, 표적 단백질의 코돈 선호도가 발현 숙주의 평균 코돈 선호도와 크게 다른 경우, 이는 발현중에 문제를 야기할 수 있다. 하기 문제점을 종종 마주치게 된다:

* mRNA 안정도의 감소(번역 속도를 낮추는 것에 의해)

* 전사 및/또는 번역의 조기 종결에 의한 다양한 단축(truncated) 단백질 산물의 생산

* 프레임시프트(frameshift), 결손 및 오차삽입(misincorporation)(예, 아르기닌에 대한 리신)

* 단백질 합성 및 세포 성장의 저해

결과로서, 관찰된 발현 수준은 종종 낮거나, 특히 코돈이 mRNA의 5'-말단 또는 클러스터(cluster)에 드물게 존재하는 경우에는 전혀 발현되지 않을 것이다. 이로서 발현 수준이 저하되고 단축 단백질 산물이 발견된다.

발현 수준은 고도로 발현한 당근 유전자에서 드물게 발견되는 코돈을 모든 유전자에 걸쳐 더욱 유리한(당근 세포에서 자주 사용되는) 코돈으로 대체함으로서 개선될 수 있다.

제한 부위는 도 2a-p에 도시된 바와 같이 용이한 클로닝을 촉진하도록 세 개의 항체 사슬(γ¹, γ⁴ 및 κ)을 코딩하는 서열 전후에 도입된다. 최대 발현 수준 과 대안적인 글리코실화 패턴이 달성될 수 있는 곳을 조사하기 위해, 서열의 다른 변형을 실행하여 식물 세포에서 재조합 항체를 다른 세포기관에 표적화시켰다(33-36). 이러한 목적을 위해, 시그널 펩티드를 식물 시그널 펩티드에 대한 서열로 대체하기 위해, 최초의 천연 인간 시그널 펩티드를 코딩하는 서열 대신에 제한 부위가 도입된 추가적인 작제물을 제조하였다. 항체를 ER에 표적시키기 위해, 스톱 코돈을 제거하여 ER 보유(retention) 시그널과의 융합을 촉진시켰다. 액포에의 표적화는 스톱 코돈 앞에 액포 선별(sorting) 시그널을 코딩하는 서열 GLLVDTM(서열번호: 13)을 편입시킴으로써 달성되었다. 작제물은 Thermo Hybaid GmbH (Ulm, 독일)에 의해 합성되었다.

플라스미드 벡터

CE-K - 갈릴리(Galili) 교수로부터 얻은 플라스미드 CE로부터 작제하였다[미국 특허 제 5,367,110 호, 1994년 11월 22일]. 플라스미드 CE를 SalI로 분해시켰다.

SalI 부착단은 DNA 폴리메라제 I의 큰 단편을 사용하여 무디게(blunt-ended) 만들었다. 이어, 플라스미드를 PstI로 분해시키고, 기본 엔도키티나제 유전자 [Arabidopsis thalianna] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC(서열번호: 14)로부터 ER 표적화 시그널을 코딩하는 DNA 단편에 결찰시키며(ligated), ER 보유 시그널 KDEL(37)을 SmaI와 PstI로 분해시켰다.

pGREENII - 피. 물리니욱스(P. Mullineaux) 박사로부터 수득하였다(38). pGREEN II 벡터로부터의 발현은 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)로부터의 35S 프로모터, TWV(토바코 모자이크 바이러스, Tobacco Mosaic Virus) 오메가 번역 인핸서 요소 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 옥토파인 신타제 터미네이터 서열에 의해 제어된다.

발현 플라스미드의 작제

EcoRI와 Xho I로 분해시킨 유전자 11 경쇄 ER 외에, 합성 유전자를 엔도뉴클라아제 EcoRI와 SalI로 분해하였다(합성 유전자에서 밑줄친 인식 서열 참조). 중쇄를 코딩하는 유전자는, EcoRI와 SalI로 분해시킨 발현 카세트를 운반하는 바이너리 벡터(binary vector) 내로 결찰시켰다. 경쇄를 코딩하는 유전자는 발현 카세트를 운반하는 중간 벡터(CEK) 내로 결찰시키고 EcoRI와 SalI로 분해시켰다. 합성 경쇄 유전자를 가진 발현 카세트를 중간 벡터로부터 잘라 용리시키고, 상응하는 중쇄를 운반하는 바이너리 벡터 내로 결찰시켜 최종의 발현 벡터를 형성하였다(도 3). 카나마이신(kanamycine) 내성은 pGREEN 벡터와 함께 수득된 노스 프로모터(nos promoter)에 의해 구동되는 NPTII 유전자에 의해 얻어진다(도 3). 생성된 발현 카세트를 도 3에 나타낸다.

서로 다른 작제물 및 그의 명칭을 표 1에 요약한다.

표 1: 작제물의 요약

명칭	IgG 형태	표적 시그널
1+9	Hγ1+L	그의 천연 형태(최초 시그널 서열)
2+10	Hγ1+L	아포플라스트에의 표적화
3+11	Hγ1+L	소포체에의 표적화
4+12	Hγ1+L	액포에의 표적화
5+9	Hγ4+L	그의 천연 형태(최초 시그널 서열)
6+10	Hγ4+L	아포플라스트에의 표적화
7+11	Hγ4+L	소포체에의 표적화
8+12	Hγ4+L	액포에의 표적화

당근 칼루스 및 세포 현탁 배양의 확립

당근 칼루스 및 세포 현탁 배양의 확립은 토레스 케이.시.(Torres K.C.)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Tissue culture techniques for horticular crops, p.p.111, 169).

당근 세포의 형질전환 및 형질질환 세포의 분리

당근 세포의 형질전환은 앞서 기술된 방법의 적응에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 형질전환을 사용하여 수행하였다(39)(40). 칼루스 대신 공정 내내 액체 매질 중에서 성장하는 세포를 사용하였다. 배양 및 성장 시간은 액체 배양액에서의 세포의 형질전환을 위해 개작하였다. 간단히 말하면, 아그로박테리아(Agrobacteria)를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 pGREEN II 벡터 시스템으로 형질전환시킨 다음, 30 ㎎/㎖ 파로모마이신 (paromomycine) 항생제를 사용하여 선별하였다. 당근 세포는 액체 매질 중에서 아그로박테리아(Agrobacteria)로 형질전환시킨 다음 60 ㎎/㎖ 파로모마이신 항생제를 사용하여 선별하였다.

고수준의 IgG1 및 IgG4를 발현하는 칼루스를 분리하기 위한 형질전환 당근 세포의 스크리닝

형질전환하고 14일후에, 배양액으로부터의 세포를, 개개의 세포 클러스터(cluser)로부터 칼루스의 형성을 위해 3% 팩킹 세포 부피의 희석액으로 고체 매질상에 플레이팅하였다(plating). 개개의 칼루스의 직경이 1-2 ㎝에 도달하였을 때, 세포를 추출 버퍼중에서 균질화시키고, 생성된 단백질 추출물을 SDS-PAGE상에서 분리한 다음, 니트로셀룰로스막[hybond C 니트로셀룰로스, 0.45 미크론: 애머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science)]으로 옮겼다. 중쇄 및 경쇄의 검출을 위해 항 FC(Sigma A-0170) 및 항 Kappa(Sigma A-7164) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 상업적인 hIgG1(Sigma I5154) 및 hIgG4(Sigma I4639) 항체를 표준으로서 사용하였다. 상당한 수준의 IgG1 또는 IgG4를 발현하는 칼루스를 확장시키고, 스케일 업(scale up), 단백질 정제 및 분석을 위해 액체 매질에 옮겨 성장시켰다.

Protalix 생물 반응기에서의 업스케일(upscale) 배양 증식

IgG4 또는 IgG1을 발현하는 유전자 조작 당근 세포의 직경 1-2 cm 칼루스 각각을, 4.4 gr/ℓMSD 배지(Duchefa), 9.9 ㎎/ℓ티아민 HCl(Duchefa), 0.5 ㎎ 엽산(Sigma), 0.5 ㎎/ℓ바이오틴(Duchefa), 당 30 g/ℓ 및 0.2 ㎎/ℓ2-4 D(Sigma)를 함유하는 직경 9㎝의 MS(Murashige and Skoog) 한천 배지 플레이트상에 플레이팅하 였다. 이 칼루스를 2-3 주마다 계대배양하고 25℃에서 성장시켰다.

MSD 액체 배지 중에서 형질전환 칼루스를 계대배양(sub-culturing)하여 현탁 세포 배양액을 조제하였다. 현탁 세포를 250 ㎖ 삼각플라스크(작업 부피는 25 ㎖로 출발하여 7 일후 50 ㎖가 되도록 새로운 배지를 첨가하였음)에서 120 rpm의 속도로 진탕하면서 25 ℃로 배양하였다. 이어, 세포를 7일마다 새로운 배지에서 계대배양하였다. 7일간의 세포 배양액으로부터 유도된 현탁 세포 400㎖를 첨가하여 4ℓ MSD 배지를 함유하는 작은 생물 반응기(10ℓ)의 접종물(inoculum)을 수득하였다. 1 Lpm 기류(airflow)로 25℃에서의 배양 1주후, MDS 배지를 10L까지 첨가하고, 동일한 조건에서 계속 배양하였다. 추가로 7일 배양한 후, 100 메쉬 네트로 세포 배지(cell media)를 통과시켜 세포를 채취 및 수집하였다. 여분의 배지는 짜내고 팩킹 세포 케이크를 -70℃에서 저장하였다.

SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석 및 쿠마시 블루 염색

단백질 샘플을 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(41)에 의해 분리하였다. 이 겔을 쿠마시(Coomassie) 블루 염색 용액(Bio Safe Coomassie Cat. 161-0786, Bio-Rad)으로 염색시키거나, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스 막(Schleicher and Schuell, Dassel)으로 옮겼다.

니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 니트로셀룰로스상의 비-결합부위(free biding site)를, 인산 버퍼(Riedel deHaen, catalog number 30435)로 희석시킨 0.1% Tween 20(Sigma Cat P1379) 및 1% 분유(Dairy America)를 함유하는 차 단(blocking) 버퍼로 4℃에서 밤새 포화시켰다. 블롯을 pH 7.5, 25℃에서 1.5 시간 동안 HRP-컨쥬게이트 항체[항 FC(Sigma A-0170)] 및/또는 항 Kappa(Sigma A-7164)[상기와 같이 1% 분유 및 0.1% Tween 20을 함유하는 인산 버퍼의 1:6500 희석액]와 함께 인큐베이션하였다.

항체와 인큐베이션한 후, 블롯을 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 매회 10분간 3회 및 PBS로 3회 세척하였다. 블롯 스트립을 ECL 현상제(developer reagents)(Amersham RPN 2209)로 염색하였다. ECL 시약에 블롯을 침지한 후, 블롯을 X-선 필름 FUJI Super RX 18x24에 노광시키고, FUJI-ANATOMIX 현상액 및 정착액(FUJI-X fix cat# FIXRTU 1 out of 2)으로 현상하였다. 이 처리후, 항체에 의해 결합된 단백질을 나타내는 밴드가 가시화되었다.

단백질 정제

IgG1 및 IgG4 모두에 대한 정제 방법은 동일하였다. IgG 정제를 위해, 웨트(wet) 중량 약 1㎏의 세포를 함유하는 동결 세포 케이크를 해동시키고, 1ℓ의 추출 버퍼(20 mM 소듐 포스페이트 pH 7.4, 20 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 20 mM 아스코르브산, 0.1 mM DTT)에서 세포의 균질화에 의해 IgG를 추출하였다. 균질액을 4℃에서 20분간 17000g에서 원심분리에 의해 정화시켰다. 펠렛을 버리고, 30K MWCO 막에 의한 한외여과에 의해 상등액을 농축하였다. 30K 리텐테이트(retentate)의 pH를 진한 시트르산을 첨가하여 pH 5.5로 조정하였다. pH 조정후 생성된 혼탁물(turbidity)을 상술한 동일한 조건하에 원심분리에 의해 정화시켰다.

다음과 같은 크로마토그래피 컬럼 방법에 의해 추가의 정제를 실시하였다: XK 컬럼(2.6×20㎝)에 팩킹된, 25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5에서 평형화시킨 135 ㎖의 강한 양이온 교환 수지(Macro-Prep high-S support, Bio-Rad)상에 1250 ㎖의 정화 추출물를 부하하였다. 이 컬럼은 전도도, pH 및 280nm에서의 흡광도를 모니터링하는 AKTA 프라임 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 구비하였다. 샘플을 45 ㎖/분으로 부하한 다음, UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 컬럼을 유속 45 ㎖/분의 평형 버퍼(25 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 5.5)로 세척하였다. 1M NaCl을 함유하는 평형 버퍼를 사용하여 IgG4를 용리하였다. 작업중에 수집한 분획을 비환원 SDS-PAGE상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다. IgG를 함유하는 분획을 풀링하였다. 풀링한 샘플의 pH를 NaOH를 사용하여 7.5로 조정하였다.

IgG를 함유하는 샘플을 10 ㎖ 단백질 A 세파로스 컬럼에 도포하였다. 샘플을 10 ㎖/분으로 부하한 다음, UV 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 평형 버퍼(10 mM 시트레이트 포스페이트 버퍼 pH=7.5)로 세척하였다. 정제된 집합 IgG를 0.1 M 시트레이트 버퍼 pH=3.4로 용리시키고 IgG를 함유하는 분획을 풀링하였다. 용리 풀의 pH를 1M Tris (Sigma T-6066) pH 8을 사용하여 pH=7.5로 조정하고 -20℃에서 저장하였다.

총 단백질 농도의 결정

세포 추출물과 분획중의 단백질 농도는 소혈청 알부민 표준(BSA 분획 V Sigma A-2153)을 사용하여 Lowry/Bradford(Bio Rad protein assay Cat. 500-0006)의 방법에 의해 에세이하였다(42). 또한, 균질 단백질 샘플의 농도는 280 ㎚에서의 흡광도, 1 ㎎/㎖=1.4 O.D₂₈₀에 의해 결정하였다. 순도는 280/260 ㎚ 비율에 의해 결정하였다.

포유동물 세포의 배양

10% FCS(Biological industries 04-121-1A), 2 mM L-글루타민(Biological industries 03-020-1B), 1 mM Na-피루베이트(Biological industries 03-042-1B), 1OmM Hepes(Biological industries 03-025-1C), Pen-Strep-Nys(Biological industries 03-032-1B)로 보충시킨 RPMI 배지(Biological industries 01-104-1A)에서 Jurkat 세포 클론 E6-1(ATCC Catalog No. TIB-152)를 성장시켰다. 세포를 5% CO₂가 든 37℃의 인큐베이터에서 성장시켰다. 세포 표면상에서 이들 항체의 항원을 명백하게 발현하므로 이들 세포를 선택하였다.

형광염색 및 FACS 분석에 의해 Jurkat 세포에 결합하는 IgG1와 IgG4 의 결정

(앞서 기술된 항체에 의해 인식되는) 특이적 표면 항원을 발현하는 5×10⁵-1×10⁶ 개의 Jurkat 세포를 1500 rpm으로 7 분동안 원심분리하고, 배지를 제거한 다음 세포를 0.5 ㎖ 세척 버퍼(5% FCS 및 0.05% 소듐 아지드를 함유하는 PBS(Sigma S-2002))로 3 회 세척하고, 50㎍/㎖의 정제 항체 0.1 ㎖와 인큐베이션하였다. 얼음위에서 45분간 배양한 후, 세포를 세척 버퍼로 2 회 세척하였다. 세척 버퍼로 1:100으로 희석시킨 바이오틴화 항 인간 IgG 항체(SBA Cat. 2040-08) 100㎕/샘플을 사용하여 얼음상에서 45 분동안 결합 항체를 검출하였다. 이어, 세포를 세척 버퍼로 2 회 세척한 다음 1:100으로 희석된 PE-컨쥬게이트 스트렙타비딘(R-피코에니트린 컨쥬게이트 스트렙타비딘, Jackson Cat. 016-110-084) lOO ㎕/샘플과 암실에서 얼음상에서 30 분간 인큐베이션하였다. 비표지된 세포 및 PE-컨쥬게이트 스트렙타비딘으로만 염색된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 이어, 이 세포들을 세척 버퍼로 2 회 세척하고, 1 ㎖ 세척 버퍼에 현탁시켰다. Cellquest 소프트웨어를 가지고 Beckenton-Dickinson FACS-Caliber 기기에서 FACS 분석을 수행하였다.

결과:

상이한 세포기관 표적화에 의해 형질전환 당근 세포에서 IgG1과 IgG4의 중쇄 및 경쇄의 발현

최대 발현 수준 및 대안적인 글리코실화 패턴을 달성하기 위해 재조합 항체를 서로 다른 세포기관 내로 표적화시켰다. 이러한 목적을 위해, 최초 천연 인간 시그널 펩티드를 식물 시그널 펩티드로 대체하여 추가적인 작제물을 제조하였다. ER 보유 시그널, 액포 선별 시그널 및 분비(아포플라스트)에 대해 재조합 단백질을 표적시키는 C 말단 표적화 서열이 결여된 작제물을 가진 항체를 모두 제조하였다.

아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환에 의해 당근 세포를 형질전환시킨 후, 중쇄 및 경쇄의 발현을 조사하였다. 흥미롭게도, 상이한 작제물에 의해 형질전환된 세포의 스크리닝을 통해, IgG1 및 IgG4 모두의 인간 천연 항체 시그널 서열을 가진 작제물(작제물 유전자 1과 9 및 유전자 5와 9[각각의 서열번호: 3과 7 및 11과 7]에 상응함)이 가장 강력한 작제물인 반면, 나머지는 검출불가능한 수준의 IgG를 나타내었음이 입증되었다(데이터 나타내지 않음; 단일 가설에 의해 제한되길 원지 않지만, 발현 수준은 매우 낮을 수도 있고/있거나 생성된 단백질은 불안정하여 분해될 수 있다).

칼루스의 랜덤 스크리닝(각 작제물에 대해 약 100 개의 칼루스가 스크리닝됨)을 특징으로 하는 웨스턴 블롯 분석에 의한 IgG1(도 4a) 및 IgG4(도 4b) 중쇄 및 경쇄의 발현을 도 4에 나타내었다.

또한, 중쇄와 경쇄의 발현 수준이 서로 다름이 도 4로부터 명백하다. 집합 IgG의 발현량 및 배지로의 분비 수준을 평가하기 위해 추가의 스크리닝을 수행하였다. 시험한 여러 칼루스 중에서, 각 라인으로부터 하나는 스케일업 성장 및 단백질 정제를 위해 선택되었다.

도 5는 본 발명에 따라 생식 세포주에 의해 생성된 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 초기 스크리닝으로부터 선택된 칼루스(도 4)를 성장 및 확장을 위해 액체 배지로 옮겼다. 선택된 칼루스의 세포 현탁액을 집합 IgG1 또는 IgG4의 생산 및 성장 배지로의 분비에 대하여 분석하였다. 도 5a(IgG1)는 일부 단백질이 배지 중에 존재하였지만 더 많은 단백질이 추출 분획에 존재하였음을 나타낸다. 도 5b(IgG4)는 배지 중에 어떤 단백질도 존재하지 않았고, 추출 분획에 일부 단백질이 존재하였음을 나타낸다.

형질전환 당근 세포로부터 IgG1와 IgG4의 정제

정제 방법은 IgG1 및 IgG4 둘 다에 대해 동일하였다. 균질화시킨 후, 재료 및 방법의 항에 기술된 바와 같이, 양이온 교환 및 단백질 A 친화 컬럼을 포함하는 크로마토그래피 기술을 사용하여 가용성 IgG를 정제하였다.

도 6a 및 7a는 양이온 교환 컬럼상에서의 IgG1 및 IgG4의 정화 단백질 추출액의 전형적인 작업(run)의 결과를 나타낸다. 작업 동안 수집된 분획을 도 6b 및 도 7b에 나타낸 바와 같이 비환원 SDS-PAGE상에 적용하고 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다.

양이온 교환 컬럼으로부터의 IgG 용리 풀을 단백질 A 친화 컬럼상에서 정제하였다. 도 8 및 9는 선택된 분획의 웨스턴 블롯 분석과 함께(도 8b 및 도 9b), 단백질 A 친화 컬럼상에서의 IgG1(도 8a) 및 IgG4(도 9a)의 전형적인 작업을 나타낸다.

도 10 및 11에 도시된 정제 IgG1 및 IgG4 단백질의 웨스턴 블롯 및 쿠마시 염색은 식물 세포에서 생산된 IgG가 일부 주요 단백질 밴드를 보인다는 것을 입증한다. 상업적인 표준 인간 IgG1 및 IgG4에 의해 입증된 바 SDS-PAGE상에서 비환원 조건하에 적용된 IgG의 예측 크기는 >175kDa인 반면, 식물 세포 발현 IgG1은 150kDa에서 또다른 주요 밴드를 보여주었고, IgG4는 15OkDa 및 5OkDa에서 두 개의 추가적인 밴드를 보여주었다. 단일 가설에 의해 제한시키는 것을 원치 않지만, 이 들 추가적인 밴드는 분해 뿐만 아니라 탈집합(disassembly) 또는 오집합(misassembly)의 결과일 수 있다.

집합 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어지며, 이들은 디설파이드 가교 및 다른 단백질-단백질 상호작용에 의해 함께 결합한다. 그러나, 일부의 경우, 결합은 깨지고 다시 형성되어 상이한 크기를 가지며 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에서 상이한 밴드를 나타내게 되는 중쇄-중쇄, 중쇄-경쇄 또는 경쇄-경쇄의 상이한 조합을 생성할 수 있다.

이들 밴드는 집합 IgG에 특이적인 단백질 A 컬럼으로부터 직접 용리되는 표본에서도 나타나기 때문에 분해의 가능성은 적다. IgG4 가운데 IgG 반-분자(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄)의 생체 내 교환의 증거는 사슬간(interchain) 및 사슬내(intrachain) 디설파이드 가교의 교환에 기인한다(43). 중쇄 및 경쇄는 디설파이드 결합에 의해 함께 결합되나(사슬간), 중쇄 및 경쇄 자체 내에서의 결합이 또한 존재한다(사슬내).

형광 염색 및 FACS 분석에 의해 Jurkat 세포에 결합하는 IgG1 및 IgG4의 결정

B 세포 백혈병 Daudi 세포로부터의 막에 대해 CureTech의 IgG1을 재배하였고, 그의 보고된 표적 및 활성은 T 세포상에 존재한다. 최초 IgG1 항체가 결합된 Jurkat 세포(급성 T 세포 백혈병)에 존재하는 특이 항원에 대한 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 생산된 항체 IgG1 및 IgG4의 결합능을 결정하였다. 도 12에 표시된 FACS 분석의 결과는 Protalix의 IgG1, IgG4 및 CureTech IgG1과 인큐베이션한 세포의 형광 강도의 시프트(shift)를 나타낸다. 도 12b에 표시된 CureTech IgG1에 비해 Protalix IgG들의 평균 형광의 증가는, 표적에 대한 식물 세포 발현 IgG1 및 IgG4의 결합이 포유동물 CHO 세포 발현 IgG1 보다 더 친화적임을 나타내는 것이다.

토론:

최대 발현 수준 및 대안적인 글리코실화 패턴을 달성하기 위해 재조합 항체를 본 발명에 따라 서로 다른 세포기관 내로 표적화시켰다. 흥미롭게도, 상이한 작제물에 의해 형질전환된 세포의 스크리닝을 통해, IgG1 및 IgG4 모두의 천연 ER 시그널을 가진 작제물이 양적인 측면에서 가장 강력한 작제물임이 입증되었다.　이는 식물　세포가 인간　항체　중쇄　및　경쇄　유전자의　일부인 "고유(built in)" 표적화 신호를 이용할 수 있음을 의미한다.

세포내수송의 조작(및 생성된 글리코실화)에 의해 동일한 단백질상에서 상이한 글리코실화 패턴을 수득할 가능성은, 단백질 기능에 있어서 탄수화물의 역할에 대한 정보를 제공하게 되는 상이한 글리코실화 구조를 가진 단백질을 생산하는 도구 및 탄수화물 구조의 변화가 단백질 형태에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 식견으로서 역할을 할 수 있다.

본 발명은 천연 인간 리더 펩티드를 사용하여 항체가 세포내에 축적되고 배지로 분비됨을 입증한다(데이터를 도시하지 않음). 식물 세포 재료로부터 항체의 정제는, 이들 방법에서 식물 세포 숙주 단백질의 독특한 거동을 유리하게 사용하는 추출 및 크로마토그래피 기술의 형태를 사용하였다. 예를 들어, 특정 조건하에서 대부분의 당근 숙주 세포 단백질은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않은 반면, IgG는 컬럼에 결합하였다. 이는 집합 항체를 단백질 A 상에서 추가로 정제한 후, 식물 세포 단밸질로부터 항체의 신속한 분리를 가능케하였다. 식물 세포에 발현된 이들 항체의 글리코실화 패턴이 천연 단백질의 것과 유사하다면, 이는 아마도 항체의 기능적 거동 및 안정성 때문일 것임이 결정되는 것이다.

포유동물 세포 발현 항체에 상당한 수준으로 그의 항원에 대한 식물 세포 발현 항체의 결합능이 입증되었다(18,46). 평형상태에서 해리정수(dissociation constant)를 측정하여, 그의 항원에 대한 정제 식물 세포 발현 항체 C5-1의 친화도를 하이브리도마 발현 항체 C5-1의 것과 비교하였고, 결과는 각각 4.7×10^-10M 및 4.6×10^-10M 이었다. 또한, 식물 세포와 포유동물 세포 발현 항체 둘 다에 대하여 안정성 및 혈액 청소율을 또한 비교하였고 유사함을 확인하였다(46).

반대로, 본 발명에 따른 시스템 및 방법에 의한 결과는, 그의 항원에 대한 식물 세포 발현 IgG1 및 IgG4 항체의 결합이 CHO 세포에서 발현된 IgG1 보다 더 높은 친화력을 가지고 일어났음을 보여준다. 항원에 대한 IgG4의 결합은 IgG1 보다 더욱 강하였고, 이는 이러한 항체 부류의 높은 친화도를 나타내는 것이다. 식물 기재 시스템에서의 IgG4 발현 수준은 포유동물 세포 발현 시스템에서 보여지는 것보다 매우 높다(데이터 미표시). 이는 식물 세포 시스템의 독특한 능력을 더욱 강 화시킨다.

적절히 집합되고 그의 에피도프를 인식할 수 있는 재조합 인간 IgG1 및 IgG4 분자의 식물 세포 현탁액에서의 생산은 상업적 스케일 상에서 상이한 동위원소의 재조합 인간 항체의 생산을 가능케 하는 Protalix 소유 생물 반응기와 결합된 새로운 기술을 소개한다.

따라서, 본 발명은 현탁액에서 유전자이식 식물 세포, 이를테면 유전자이식 당근 세포에서 생산된 재조합 인간 항체를 위한 신규하고 확장가능하며 비용효율이 높은 생산 및 정제 방법을 제공한다.

실시예 2

본 발명에 의한 치료

본 발명에 따라 생산된 재조합 단백질은 바람직하게는 식물 세포 배양에 의해 생산된 항체를 포함하고, 바람직하게는 IgG4이나 임의로 IgG1일 수 있다.

본 명세서에서 바람직한 일례에 따라, 본 발명에 따라 생산된 항체는 항체에 의한 치료에 민감한 질병의 치료에 적합하다.

치료 방법은 임의로 및 바람직하게는 (a) 형질전환 식물 뿌리 세포로부터 정제되고 항원을 효율적으로 표적화할 수 있는 생물학적으로 활성인 재조합 항체를 제공하는 것을 포함한다. 바람직한 일례로, 본 발명의 방법에 의해 사용된 재조합 항체는 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게도, 숙주 세포는 당근 세포이다.

"포유동물 대상" 또는 "포유동물 환자"란 치료가 필요한 임의의 포유동물을 의미하는 것으로, 인간, 소, 말, 개 및 고양이 대상, 바람직하게는 인간 대상을 포함한다.

용어 "치료"는 또한 병적상태를 치료하거나 이러한 상태의 발생을 예방하여 병적상태 및/또는 하나 이상의 그의 증상을 개선 또는 경감하는 것을 포함한다.

다른 바람직한 일례로, 항체는 포유동물 세포 배양에서 생산된 등등한 IgG4 보다 항원에 대한 강한 결합능을 가진 IgG4이다. 따라서, 각각의 투여량은 치료 효과를 달성하기 위해 유사한 방식으로 달리 투여되는 항체의 투여량보다 임의로 적을 수 있다. 또한, 항체는 더 큰 치료 효과를 달성하기 위해 유사한 투여량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 단백질(항체)은 약학 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 일면에 따라, 그의 활성성분으로서 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 명세서에 사용된 "약학 조성물"은 전형적인 약물, 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 본 명세서에 기술된 하나 이상의 활성성분(예컨대 재조합 단백질)의 제제를 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 단백질 또는 세포의 투여를 촉진하는 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 널리 알려진 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 혼합(mixing), 용해(dissloving), 과립화(granulating), 당의정-제조(dragee-making), 분말화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포착화(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 방법에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 일례로, 용어 "약제학적으로 허용되는"이란 동물, 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 또는 주정부의 관리 기관에 의해 허가되었거나 미국약전 또는 다른 일반적으로 용인된 약전에 기술되어 있는 것을 의미한다. 이후에서, 어구 "생리학적으로 적합한 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 서로 혼용가능하게 사용되며, 유기체에 유의적인 자극을 일으키지 않으며 생물학적 활성 및 투여되는 컨쥬게이트의 특성을 파괴하지 않는 허용된 담체 또는 희석제를 의미한다.

용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 말한다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯한 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학조성물이 정맥 내로 투여되는 경우, 바람직한 담체는 물이다. 특히 주사액의 경우, 식염수 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실라카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 필요에 따라, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수도 있다. 이들 조성물은 용액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 글리세리드와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제제는 만니놀, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로 스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 보통의 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예가 이. 더블유. 마틴(E. W. Martin)에 의해 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적합한 투여형을 제공할 수 있도록 적합한 양의 담체와 함께 치료학적 유효량의 단백질(바람직하게는 정제 형태로)을 포함할 것이다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.

본 명세서에서 용어 "부형제"는 활성성분의 프로세스(process) 및 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 및 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 야채유 및 폴리에틸렌 글리콜의 형태가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

활성성분의 제형화 및 투여에 대한 추가적 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에서 찾아 볼 수 있고, 이 문헌은 본 명세서에 충분히 설명된 바와 같이 본 명세서에 참고로서 포함된다.

본 명세서에 기술된 약학조성물은 또한 적합한 고체 또는 겔상의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

적합한 투여 경로로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포함하여 경구, 직장, 경점막, 경피, 장관내 또는 비경구 전달이 포함될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학조성물은 약제학적으로 사용가능한 제제 내로 활성성분의 진행(processing)을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여경로에 따라 달라진다.

주사용의 경우, 본 발명의 활성성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투제가 제형화에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 활성성분은 본 발명에 따라 항체를 생성하는 모든 세포의 투여를 통해 임의로 제형화될 수 있다. 활성성분 및/또는 세포를 당업계에 널리 공지되어 있는 약제학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 활성성분을 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 용액제, 겔, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고, 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당과 같은 충진제; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트(gum tragacanth), 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카보메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 폴리머이 다. 필요에 따라, 붕괴제(disintegrating agent), 이를테면 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.

적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔(carbopol gel), 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 진한 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 나타내거나 식별하기 위해, 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 밀봉형 연성 캡슐제 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 함유할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지( lozenge)의 형태를 취할 수 있다.

흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 통상적 으로 적합한 추진제(propellant), 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩(pressurized pack) 또는 분무기(nebulizer)로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위(dosage unit)는 정량(metered amount)을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기(inhaler) 또는 취입기(insufflator)로 사용하기 위해, 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재(powder base)와 활성성분의 분말 믹스(powder mix)를 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.

본 명세서에 기술된 활성성분은 비경구 투여를 위해 예를 들어 급속정주(bolus injection) 또는 지속정주(continuous infusion)에 의해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰플(ampoule) 또는 다중투여 용기(multidose container)로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 유제일 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학조성물은 활성 제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 유성의 주사 현탁제으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제, 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능케 하는 제제를 함유할 수 있다.

바람직한 일례로, 조성물은 통상법에 따라 인간에게 정맥내 투여하기 위해 만든 약학조성물로서 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여하기 위한 약학조성물은 멸균 등장성 수성 완충액(sterile isotonic aqueous buffer)이다. 일반적으로, 제제는 단위 투여형, 예를 들어 활성제의 양을 표시한 앰플 또는 사체트(sachette)와 같은 밀폐 용기 중의 건식 동결건조 분말(drylyophilized powder) 또는 무수 농축물(water free concentrate)로서 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 조성물이 주입(infusion)에 의해 투여될 경우, 약제등급(pharmaceutical grade)의 멸균수 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀(bottle)을 사용하여 분배할 수 있다. 조성물이 주사(injection)에 의해 투여될 경우, 제제가 투여하기 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같이 음이온에 의해 형성된 염들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같이 양이온에 의해 형성된 염들이 포함된다.

본 발명의 활성성분은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제를 사용하여 좌제 또는 정체관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다.

본 명세서에 기술된 약학조성물은 또한 겔상(gel phase) 담체 또는 부형제의 적합한 고체를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

국소 경로가 임의로 수행될 수 있고, 국소용 담체에 의해 지원된다. 국소 담체는 일반적으로 활성성분의 국소 투여에 적합한 것으로, 당업계에 공지된 임의의 이러한 물질을 포함한다. 국소 담체는 목적하는 형태, 예를 들어 액체 또는 비액체 담체, 로션, 크림, 페이스트, 겔, 파우더, 연고, 용매, 액체 희석제, 드롭(drop) 등으로 조성물을 제공하도록 선택되며, 자연발생 또는 합성 기원의 물질로 구성될 수 있다. 선택된 담체는 반드시 국소 제형의 활성제 및 다른 성분에 악영향을 미치지 않으며, 국소 제형의 모든 성분에 대해 안정해야한다. 본 명세서에 사용하기에 적합한 국소 담체의 예로는 물, 알코올 및 다른 비독성 유기 용매, 글리세린, 광유, 실리콘, 바셀린, 라놀린, 지방산, 야채유, 파라벤, 왁스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 바람직한 제형은 무색 무취의 연고, 액체, 로션, 크림 및 겔이다.

연고는 반고형 제제로서, 전형적으로 바셀린 또는 다른 석유 파생물(petroleum derivative)을 기본으로 한다. 당업자들에 의해 인지될 수 있는, 사용가능한 구체적인 연고 기재는 최적의 활성성분 전달을 제공하며, 바람직하게는 다른 목적하는 성질, 예를 들어 완화성 등을 제공하는 것들이다. 다른 담체 또는 비히클과 같이, 연고 기재는 불활성이고 안정해야하고, 염증을 일으키지 않고 감작 시키지 않아야 한다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), 1399-1404]에 설명된 바와 같이, 연고 기재는 네 가지 부류로 분류될 수 있다: 유성 기재(oleaginous base); 유화가능 기재(emulsifiable bases); 에멀젼 기재(emulsion bases); 및 수-가용성 기재(water-soluble bases). 유성 연고 기재로는 예를 들어 야채유, 동물에서 수득한 지방, 및 석유에서 수득한 반고형 탄화수소가 포함된다. 흡수 연고 기재(absorbent ointment base)로도 알려진 유화가능 연고 기재는 물을 거의 또는 전혀 함유하지 않으며, 그의 예로 하이드록시스테아린 설페이트, 무수 라놀린 및 친수성 바셀린이 포함된다. 에멀젼 연고 기재는 유중수(W/O) 에멀젼 또는 수중유(O/W) 에멀젼이고, 그의 예로 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 및 스테아르산이 포함된다. 바람직한 수-가용성 연고 기재는 가변 분자량의 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조되며; 또한 기준(reference)이 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy for further information]에 따라 제조될 수 있다.

로션은 마찰없이 피부 표면에 적용될 수 있는 제제로서, 전형적으로 액상 또는 반액상 제제이며, 활성성분을 비롯한 고체 미립자가 물 또는 알코올 기재에 존재한다. 로션은 통상 고체의 현탁액이며, 수중유형의 액상 유성 에멀젼을 포함할 수 있다. 로션은 더 많은 유체 조성물을 용이하게 적용할 수 있기 때문에 넓은 체 표면적(body area)의 치료에 바람직한 제형이다. 일반적으로 로션 중의 불용성 물질은 미세하게 분쇄될 필요가 있다. 로션은 전형적으로 피부와 접촉하는 활성제, 예를 들어 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 등을 국재(localizing) 및 보유(holding)하는데 유용한 활성성분뿐만 아니라 더 잘 분산될 수 있게 하는 현탁화제를 함유할 것이다.

선택된 활성성분을 함유하는 크림은 당업계에 공지된 바와 같이 수중유 또는 유중수의 점성 액체 또는 반고형 에멀젼이다. 크림 기재는 수세가능하며(water-washable), 오일 상, 유화제 및 수성 상을 함유한다. 때때로 "내(internal)" 상으로도 불리는 오일 상은 일반적으로 바셀린 및 바셀린 또는 스테아릴 알코올과 같은 지방 알코올로 구성되며; 반드시 그럴 필요는 없지만, 수성 상은 통상 오일 상의 부피보다 크며, 일반적으로 습윤제(humectant)를 함유한다. 크림 제형에서 유화제는 앞의 문헌[Remington]에 설명된 바와 같이, 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양성 계면활성제이다.

겔 제형은 두피에 적용하기에 바람직하다. 국소 활성성분 제형 분야의 종사자들에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 겔은 반고형의 현탁형(suspension-type) 시스템이다. 단상 겔은 담체 액체를 통해 실질적으로 균일하게 분배되는 유기 고분자를 함유하며, 전형적으로는 수성이고, 바람직하게는 알코올 및 임의로 오일을 함유한다.

당업자들에게 공지된 각종 첨가제가 본 발명의 국소 제형에 포함될 수 있다. 예를 들어, 용매는 특정 활성성분 물질을 용해시키는데 사용될 수 있다. 다른 임의의 첨가제로는 피부 침투 촉진제, 유백제, 항산화제, 겔화제, 증점제, 안정화제 등이 포함된다.

본 발명의 국소 조성물은 또한 통상의 피부형 패치(patch) 또는 제품을 사용하여 피부에 전달될 수 있고, 여기서 활성성분의 조성물은 피부에 부착되어 약물 전달 장치로서의 역할을 하는 적층 구조 내에 함유된다. 이러한 구조에서, 활성성분의 조성물은 상부 백킹 층(backing layer) 아래에 있는 층 또는 "저장기(reservoir)"에 함유된다. 적층 구조는 단일 저장기를 가질 수 있거나, 복수의 저장기를 가질 수 있다. 하나의 일례로, 저장기는 활성성분의 전달동안 피부에 시스템을 부착할 수 있도록 하는 약제학적으로 허용되는 접촉성 접착제 물질의 중합 매트릭스를 포함한다. 적합한 피부 접촉성 접착제 물질의 예로는 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리이소부틸렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 선택되는 특정의 중합 접착제는 특정 활성성분, 비히클 등에 따라 달라질 것이며, 즉 접착제는 활성성분-함유 조성물의 모든 성분에 적합(compatibe)해야 한다. 다르게는, 활성성분-함유 저장기 및 피부 접촉성 접착제는 별도 및 별개의 층으로서 존재하며, 이 경우 상술된 바와 같은 중합 매트릭스일 수 있거나 액체 또는 하이드로겔 저장기일 수 있거나 일부 다른 형태를 취할 수 있는 저장기 아래에 접착제가 위치한다.

장치의 상부 표면이 되는 이들 적층물의 백킹층은 적층 구조의 일차적인 구조성분으로서 작용하며, 유연성이 풍부한 장치를 제공한다. 백킹 물질로 선택되는 물질은 활성성분 및 활성성분-함유 조성물의 다른 임의의 성분에 대해 실질적으로 불침투성이어서 장치의 상부 표면을 통해 어느 성분도 손실되지 않도록 선택되어야 한다. 백킹층은 활성성분의 전달동안 피부에 수분을 보충하는 것이 바람직한 지에 따라 차단성(occulsive) 또는 비차단성(non-occulsive)일 수 있다. 바람직하게도, 백킹은 바람직하게는 가요성 엘라스토머 물질의 시트 또는 필름으로 만들어진다. 백킹층에 적합한 폴리머의 예로는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리에스테르가 포함된다.

저장중 및 사용 전에는, 적층 구조물은 릴리스 라이너(release liner)를 포함한다. 사용하기 직전에, 이 층은 시스템을 피부에 부착시킬 수 있도록 장치로부터 제거하여 그의 기저면(활성성분 저장기 또는 별도의 접촉성 접착제 층)을 노출시킨다. 릴리스 라이너는 활성성분/비히클 불침투성 물질로 제조되어야 한다.

이러한 장치는 당업계에 알려진 통상의 기술을 사용하여, 예를 들어 접착제, 활성성분 및 비히클의 유체 혼합물을 백킹층에 캐스팅(casting)한 다음 릴리스 라이너를 적층함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 접착제 혼합물을 릴리스 라이너위에 캐스팅한 다음 백킹층을 적층할 수도 있다. 다르게는, 활성성분 저장기를 활성성분 또는 부형재의 부재하에 제조한 다음 활성성분/비히클 혼합물 중에 "침지(soaking)"하여 부하(load)시킬 수 있다.

본 발명의 국소 제형과 같이, 이들 적층 시스템의 활성성분 저장기내에 담긴 활성성분 조성물은 다수의 성분을 함유할 수 있다. 일부의 경우, 활성성분은 "니트(neat)하게", 즉 추가의 액체의 부재하에 전달될 수 있다. 그러나, 대부분의 경우, 활성성분은 적합한 약제학적으로 허용되는 비히클, 전형적으로 용매 또는 겔에 용해, 분산 또는 현탁될 것이다. 존재할 수 있는 다른 성분으로는 방부제, 안정화제, 계면활성제 등이 포함된다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 이를 필요로 환자에게 유효량으로 투여되는 것을 유념해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "유효량"는 선택된 결과를 달성하는데 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 리소좀 저장 질환의 치료에 유용하게 선택될 수 있다.

본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 약학조성물은 의도하는 목적을 달성하는데 유효한 양으로 활성성분이 함유된 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료학적 유효량은 치료할 대상의 생명을 연장하거나 질병의 증상을 예방, 경감 또는 약화시키는데 효과적인 활성성분의 양을 의미한다.

치료학적 유효량은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제제의 경우, 치료학적 유효량 또는 용량은 동물에서 활성 에세이로부터 먼저 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 활성 에세이에 의해 결정되는 IC₅₀을 포함하는 순환(circulating) 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 결정될 수 있다.

본원에 기술된 활성성분의 치료 효능 및 독성은 실험 동물에서 표준 약제학적 방법에 의해, 예를 들어 해당 활성 성분에 대한 IC₅₀ 및 LD₅₀(시험동물의 50%를 치사시키는 치사량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이들 활성 에세이 및 동물 연구에 의해 수득된 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량 범위를 정하는데 사용될 수 있다.

투여량은 사용되는 투여 경로 및 사용하는 투여형태에 따라 변할 수 있다. 적합한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 고려하여 의사 개인에 의해 선택될 수 있다.(참조예. Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

투여의 양 및 간격은 조절작용을 유지하기에 충분한 플라즈마 수준[최소유효농도(minimal effective concentration, MEC)라 불림]을 활성 부위에 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 이 MEC는 각각의 제제에 따라 달라질 것이나, 전체 동물 데이터로부터 임의로 산출될 수 있다.

투여 간격은 또한 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 제제는 시간의 10-90%동안, 바람직하게는 30-90%, 가장 바람직하게는 50-90%동안 MEC 이상의 플라즈마 수준을 유지하는 처방을 사용하여 임의로 투여될 수 있다.

치료할 상태의 중증도 및 반응도에 따라, 투여는 수일 내지 수주 내내 또는 병을 고치거나 증상이 감퇴될 때까지 치료하는 과정으로서 상기한 저속 방출(slow release) 조성물의 단일 투여일 수 있다.

본 발명의 조성물은 필요에 따라 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 담을 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 이를테면 FDA에 의해 승인된 키트(kit)로 제시될 수 있다. 발포(blister) 팩과 같은 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 포일(foil)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투약 설명서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 행정기관에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으 며, 이 통지서는 조성물의 형태 또는 인간 또는 가축 투여에 대한 기관의 승인을 반영한다. 이러한 통지서는 예를 들어 처방약에 대한 미국 식품의약청의 승인 라벨이거나 승인된 제품 전단일 수 있다. 적합한 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조하여 적절한 용기에 넣고 처방된 상태를 써넣은 라벨을 붙일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절하다"는 병의 진행을 실질적으로 억제, 감소 또는 반전시키는 것, 상태 또는 질환의 임상적 증상을 실질적으로 개선시키는 것, 또는 상태 또는 질환의 임상적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함된다. 따라서, "조절자(modulator)"는 질환 또는 상태를 조절할 수 있는 제제를 포함한다.

참고 문헌

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actgctgccc ttggatgcct tgtcaaggac tacttccctg agccagttac agtttcatgg 480 aacagtggag ccttgacctc tggtgtgcac acttttcctg ctgtcctgca atcaagtggt 540 ctctactctt tgtcttctgt tgttactgtg ccatcatcat ctctcggaac caaaacatat 600 acttgtaatg tcgatcataa gccttcaaat accaaggttg acaagagggt ggagtcaaag 660 tatggtccac cttgcccaag ttgtcctgct ccagagttcc ttggaggtcc ttctgtgttt 720 ctcttcccac ctaagccaaa agatacactg atgatcagta gaacacctga agttacctgc 780 gttgtggtcg atgtttctca ggaggaccca gaagtgcagt tcaactggta cgtcgatgga 840 gttgaggtgc ataacgcaaa gacaaagcct agagaggaac agtttaattc aacctacaga 900 gttgtgtctg tcttgaccgt tcttcaccaa gattggctta acggtaagga gtataagtgt 960 aaggtttcta acaagggatt gccatcatct atcgagaaaa ctatctcaaa ggcaaaggga 1020 cagcctaggg aaccacaggt gtacaccttg ccaccttctc aagaggaaat gaccaagaac 1080 caagtctcac tcacttgcct tgttaaaggt ttctaccctt cagacattgc tgttgagtgg 1140 gaatccaacg gtcaaccaga gaataactac aagactacac cacctgtgct ggactcagat 1200 ggatctttct ttttgtattc taggctgaca gtcgataaga gtagatggca ggaaggtaat 1260 gtgttttcat gttctgtcat gcatgaggct ctccacaatc attacactca gaaatctctc 1320 tcattgtctc ttggaaagtc gaccaag 1347 <210> 12 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic gene coding for an Ab heavy chain fused to Vac signal <400> 12 gaattccagg ttcaacttgt gcagtcaggt tctgagttga agaagccagg agcctcagtc 60 aaaatttctt gtaaggctag tggttacact ttcaccaact acggaatgaa ctgggttagg 120 caagcacctg gacagggtct tcagtggatg ggatggatca acactgattc tggtgagtca 180 acatacgctg aggagttcaa gggaaggttc gtgttctctc tcgacacctc agtcaacacc 240 gcataccttc agatcacctc tttgactgct gaggacaccg gtatgtactt ctgcgtgagg 300 gtcggctatg atgccctcga ctactggggt cagggaactc tggtgacagt gagttctgct 360 tcaactaagg gtccatcagt gttccctctc gctccatgta gtaggtctac atcagagtct 420 actgctgccc ttggatgcct tgtcaaggac tacttccctg agccagttac agtttcatgg 480 aacagtggag ccttgacctc tggtgtgcac acttttcctg ctgtcctgca atcaagtggt 540 ctctactctt tgtcttctgt tgttactgtg ccatcatcat ctctcggaac caaaacatat 600 acttgtaatg tcgatcataa gccttcaaat accaaggttg acaagagggt ggagtcaaag 660 tatggtccac cttgcccaag ttgtcctgct ccagagttcc ttggaggtcc ttctgtgttt 720 ctcttcccac ctaagccaaa agatacactg atgatcagta gaacacctga agttacctgc 780 gttgtggtcg atgtttctca ggaggaccca gaagtgcagt tcaactggta cgtcgatgga 840 gttgaggtgc ataacgcaaa gacaaagcct agagaggaac agtttaattc aacctacaga 900 gttgtgtctg tcttgaccgt tcttcaccaa gattggctta acggtaagga gtataagtgt 960 aaggtttcta acaagggatt gccatcatct atcgagaaaa ctatctcaaa ggcaaaggga 1020 cagcctaggg aaccacaggt gtacaccttg ccaccttctc aagaggaaat gaccaagaac 1080 caagtctcac tcacttgcct tgttaaaggt ttctaccctt cagacattgc tgttgagtgg 1140 gaatccaacg gtcaaccaga gaataactac aagactacac cacctgtgct ggactcagat 1200 ggatctttct ttttgtattc taggctgaca gtcgataaga gtagatggca ggaaggtaat 1260 gtgttttcat gttctgtcat gcatgaggct ctccacaatc attacactca gaaatctctc 1320 tcattgtctc ttggaaaagg ccttttagtc gatactatgt aagtcgac 1368 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Vacuolar soting signal pepide <400> 13 Gly Leu Leu Val Asp Thr Met 1 5 <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleic acid sequence coding for the ER targeting sequence from endochitinase and an ER retention signal <400> 14 atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60 gaattc 66

Claims (35)

1. 현탁액에서 성장되고 유전자 조작에 의해 항체를 생산하는 식물 세포를 포함하는, 식물 세포 배양에서 항체를 생산하기 위한 시스템.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 조작 식물 세포가 안정적으로 변형된 식물 세포를 포함하는 시스템.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 조작 식물 세포가 일과적으로 변형된 식물 세포를 포함하는 시스템.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 기능성 항체를 포함하는 시스템.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 집합(assembled) 항체를 포함하는 시스템.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편을 포함하는 시스템.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 항체 단편이 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하는 시스템.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 IgG4 항체를 포함하는 시스템.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 식물 세포가 뿌리 세포, 잎 세포, 줄기 세포, 잎꼭지 세포, 분열조직 세포 및 열매 세포로 구성된 그룹 중에서 선택된 세포를 포함하는 시스템.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 포유동물 세포 배양에서 생산된 상응하는 항체보다 높은 수준의 항원에 대한 결합 친화력을 가진 항체를 포함하는 시스템.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체의 천연 시그널 펩티드 서열을 포함하는 시스템.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가, 상기 항체를 식물 세포 세포기관에 보내기 위한 식물 시그널 펩티드를 포함하는 시스템.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 세포기관이 ER, 아포플라스트(apoplast), 엽록체, 시토졸(cytosol) 및 액포로 구성된 그룹 중에서 선택되는 시스템.
14. 제 9 항에 있어서, 상기 식물 뿌리 세포가 당근 세포를 포함하는 시스템.
15. 제 9 항에 있어서, 상기 식물 세포가 니코티아나(Nicotiana) 잎 세포를 포함하는 시스템.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 시스템에서 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 형질감염된 재조합 식물 숙주 세포의 현탁 배양액을 제조하고; 상기 숙주 세포 배양액을 항체를 발현시키는 조건하에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 배양 단계 후 상기 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 시스템에 의하거나 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 항체.
20. IgG4 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, IgG4 항체를 생산하는 숙주 세포.
21. 제 20 항에 있어서, IgG4 항체를 생산하게 하는 시그널을 추가로 포함하는 세포.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 시그널이 인간 항체 천연 시그널 서열을 포함하는 세포.
23. 제 20 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가, 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 상기 항체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 포함하는 세포.
24. 제 20 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 시그널 펩티드를 코딩하기 위한 핵산 세그먼트(segment)를 포함하는 세포.
25. 제 20 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 원핵 세포가 박테리아 세포, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포인 숙주 세포.
27. 제 20 항에 있어서, 상기 식물 세포가 아그로박테륨 리조게네 스(Agrobacterium rihzogenes) 형질전환 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 양고추냉이 세포 및 당근 세포, 토바코(tobacco) 세포 및 포도 세포로 구성된 그룹 중에서 선택된 식물 세포인 숙주 세포.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 식물 세포가 당근 뿌리 세포인 숙주 세포.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가, 식물 세포에서 작용하고 상기 재조합 분자에 작동가능하게 결합된 프로모터(promoter)를 추가로 포함하는 숙주 세포.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가, 식물 세포에서 작용하고 상기 재조합 분자에 작동가능하게 결합된 터미네이터(terminator)를 추가로 포함하는 숙주 세포.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 임의로, 부가적인 제어, 촉진 및 조절 요소 및/또는 선택가능한 마커(marker)를 추가로 포함하고, 상기 조절 요소가 상기 재조합 분자에 작동가능하게 결합되어 있는 숙주 세포.
32. 제 20 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포에서 생산되는 항체.
33. 항체 및 말단 만노스를 포함하는 분자.
34. IgG4 항체, 및 상기 IgG4 항체에 부착되고 크실로스 및 푸코스 1-3으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 탄수화물 부위를 포함하는 분자.
35. (a) 유전자 조작되어 재조합 항체를 발현시키는 식물 세포를 포함하는 현탁 배양액을 생성하고; 임의로

    (b) 상기 현탁 배양액으로부터 재조합 항체를 회수하여 재조합 항체를 생산하는 단계를 포함하여 재조합 항체를 생산하는 방법.

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