JP2000510340A

JP2000510340A - 集合分泌抗体を発現するトランスジェニック植物

Info

Publication number: JP2000510340A
Application number: JP09540110A
Authority: JP
Inventors: マイクビーハイン; アンドリューハイアット; ケイシーマージュリアン
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2000-08-15
Also published as: EP0946717A4; EP0946717A1; AU2932397A; WO1997042313A1; CA2253454A1; AU731137B2; US5959177A; US6417429B1

Abstract

(57)【要約】本発明は植物中の異種多量体タンパク質、例えば、抗体の発現及び集合、並びにこのようなタンパク質を発現するトランスジェニック植物に関する。幾つかの好ましい実施態様の一つにおいて、植物中の機能性分泌抗体の発生及び集合が開示される。又、本発明は本発明のトランスジェニック植物により生産された組成物及びその組成物の使用方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】集合分泌抗体を発現するトランスジェニック植物関連出願の相互参照本件は1992年11月５日に出願された共同未決米国特許出願第07/971,951号の一部継続出願であり、この出願は1990年10月２日に出願された米国特許出願第07/5 91,823号の継続出願（現在の米国特許第5,202,422号）であり、これは1989年10 月27日に出願された米国特許出願第07/427,765号（放棄された）の一部継続出願であり、これらの開示が参考として本明細書に含まれる。技術分野本発明は植物中の異種多量体タンパク質--例えば、抗体--の発現及び集合、並びにこのようなタンパク質を発現するトランスジェニック植物に関する。背景ポリペプチドは多種の細胞宿主中で発現し得ることが知られている。多種の構造遺伝子が哺乳類及びウイルスから単離され、構造遺伝子以外の源からの転写及び翻訳の開始及び終止の調節シグナルに結合され、これらの調節シグナルが機能性である宿主に導入された。経済上の理由のために、遺伝子操作された単細胞微生物を利用して多種のポリペプチドを生産することが望ましいであろう。しかしながら、一方では単細胞生物、又、他方では哺乳類細胞の性質の固有の相違のために、単細胞微生物中のポリペプチドの折りたたみ及びプロセシングは哺乳類細胞中で行われる折りたたみ及びプロセシングとは全く異なることが明らかである。結果として、単細胞微生物に由来する哺乳類ポリペプチドは常に適当に折りたたまれ、又はプロセシングされて得られたポリペプチド中に生物活性又は生理活性の所望の程度を適当に与えるとは限らない。その目的のために、哺乳類ポリペプチドを植物中で発現しようとする試みが種々の成功の程度でもってなされていた。一種の特に重要なポリペプチドは分泌免疫グロブリンＡである。分泌免疫グロブリンＡ(SIgA)は粘膜分泌物中の免疫グロブリン(Ig)の最も多量の形態であり、この場合、それは感染物質に対する最初の防御系の一部を形成する。その分子は主として11S二量体形態で存在し、その中で２種の単量体IgA抗体単位が小さいポリペプチド結合(Ｊ)鎖及び第四ポリペプチド、分泌成分(SC)と会合している。モノクローナルSIgAを生じる能力は実質的に貴重であるが、その合成は複雑である。何となれば、それは二量体IgA(dIgA)を分泌するプラズマ細胞並びにポリマーIgレセプター(pIgR)を発現する上皮細胞を必要とするからである。通常、上皮基底外側表面のpIgRはdIgAを結合し、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、リン酸化、タンパク質分解、及び頂端表面にあるSIgA複合体の分泌への最終の放出のプロセスを開始する(Mostov，Ann.Rev.Immunol．12:63(19 94))。こうして、分泌抗体を集合するトランスジェニック植物の能力に集中することが重要である。分泌IgAは苛酷な環境により生じる変性に耐性である。この変性耐性は、IgA分子、Ｊ鎖及び分泌成分を含む複合体分泌IgA分子が正確かつ有効に集合されることを必要とする。本発明に至るまで、有益な量の分泌IgAの集合及び発現は、低収率のため、又、利用可能な哺乳類系が単一細胞中でSigAを発現し、集合することができないために実施不能であった。本明細書に開示されるように、以上の問題が本発明により今解決された。植物細胞中の多量体タンパク質の発現は、ポリペプチド鎖をコードする遺伝子が同植物細胞中に存在することを必要とする。本明細書に開示された操作の出現に至るまで、両方の遺伝子を同じ細胞に実際に導入する可能性は極めて少なかった。多量体タンパク質の集合及びかなりの量の多量体タンパク質の発現が本明細書に記載された方法及び構築物の使用により今や実施可能にされた。トランスジェニック植物は多くの組換えタンパク質、特に治療目的に意図される組換えタンパク質の発現に重要な系として出現している。それらの主要な魅力の一つは極めて競争力のあるコストで農業規模のタンパク質生産の可能性であるが、又、多くのその他の利点がある。殆どの植物形質転換技術が植物ゲノムへの異種ＤＮＡの安定な組込みをもたらし、こうしてトランスジェニック植物の交配による遺伝子組換えが新しい遺伝子を植物に導入し、多重遺伝子を植物に蓄積するのに簡単な方法である。更に、植物中の組換えタンパク質のプロセシング及び集合は又、哺乳類細胞中で、普通に使用される微生物発現系よりも利点であり得ることを完全にし得る。抗体産生のために組換え発現系を使用することの最も有益な局面の一つは、抗体が分子操作により調製し得る容易さである。これは抗体フラグメント及び一本鎖分子の生産並びに完全長抗体の操作を可能にする。例えば、広範囲の機能性組換え抗体フラグメント、例えば、Fab、Fv、一本鎖抗体及び単一ドメイン抗体が生成し得る。加えて、完全長抗体を産生する植物細胞の能力が変化されたFc媒介性質を有する抗体分子の産生に利用し得る。これは免疫グロブリン鎖のドメイン構造により促進され、これは個々のドメインが遺伝子レベルで“切断され、スプライシングされる”ことを可能にする。例えば、IgG抗体Ｈ鎖のＣ末端ドメインは、機能性抗体の正確な集合を植物中で維持しながら、Ｃγ２ドメイン及びＣγ ３ドメインをIgA抗体のＣα２ドメイン及びＣα３ドメインで置換することにより修飾された。これらの変化は抗原結合又は特異性に影響しないが、Fc領域により媒介される抗体の保護機能を変更し得る。又、特別に操作された植物が治療免疫グロブリンを含む種々のタンパク質の優れた源を多量かつ比較的低いコストで提供し得ることが更に明らかになってきている。植物中の抗体の産生は局所免疫療法及び予防免疫療法の領域で特に有益であり得る。例えば、局所適用された抗体は病原バクテリアによる定着を阻止できるだけでなく、定住バクテリアフローラを高度に特異的な様式で変更することができる。う食症の場合、ストレプトコッカス・ムタンスの細胞表面付着に対し産生された局所適用されたモノクローナル抗体はバクテリアが非ヒト霊長類で樹立されるようになることを阻止し、又、疾患のレベルを軽減する(Lehnerら，Infect.Immun ．50:796-799(1985))。ヒトでは、mAbが成人でストレプトコッカス・ムタンスに対する長期の保護を与えることが示された(Maら，Infect.Immun．50:3407-14(19 90))。こうして、有益な免疫グロブリン--特に抗体--を多量かつ低コストで提供する方法は現在使用中のその他の方法よりも特有の利点を与える。加えて、植物中で組換え発現系を使用して免疫グロブリン及びその他の大きいタンパク質分子を操作し得ることの比較的容易なこと、及び継続世代中のこれらの系の安定性がトランスジェニック植物を免疫療法分子の極めて魅力的な源にする。発明の要約それ故、活性生物分子を比較的容易に、かつ多量に生産する方法が今開示される。加えて、それにより生産された分子及び組成物が同様に開示される。こうして、一実施態様において、本発明は単一細胞内で分泌抗体を産生し、集合する方法を意図しており、前記方法は(a)植物種の第一員のゲノム中に分泌シグナルを形成するリーダー配列を含むポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分をコードする第一哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第一形質転換体を生産し、（b）前記植物種の第二員のゲノム中にポリペプチドリンカー又は結合鎖をコードする第二哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第二形質転換体を生産し、（c）前記植物種の第三員のゲノム中に分泌成分をコードする第三哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第三形質転換体を生産し、（d）前記形質転換体を有性交配して全ての３種の哺乳類配列を含む子孫集団を生じ、そして(e)前記子孫集団から分泌抗体を産生するトランスジェニック植物種を単離することを特徴とする。上記方法の一つの変化において、ヌクレオチド配列は別個のベクターにより導入される。別の変化において、ポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分はポリペプチドを含むαＨ鎖部分、一本鎖抗体もしくはそのフラグメント、又は一つ以上の可変領域を含むポリペプチドを含むＨ鎖部分であってもよい。こうして、一実施態様において、本発明は単一細胞内で分泌抗体を産生し、集合する方法を意図しており、前記方法は(a)植物種の第一員のゲノム中に分泌シグナルを形成するリーダー配列を含むポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分をコードする第一哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第一形質転換体を生産し、（b）前記植物種の第二員のゲノム中に分泌シグナルを形成するリーダー配列を含むポリペプチドを含む免疫グロブリンＬ鎖部分をコードする第二哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第二形質転換体を生産し、（c）前記植物種の第三員のゲノム中にポリペプチドリンカー又は結合鎖をコードする第三哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第三形質転換体を生産し、（d）前記植物種の第四員のゲノム中に分泌成分をコードする第四哺乳類ヌクレオチド配列を導入して、第四形質転換体を生産し、（e）前記形質転換体を有性交配して全ての４種の哺乳類配列を含む子孫集団を生じ、そして(f)前記子孫集団から分泌抗体を産生するトランスジェニック植物種を単離することを特徴とする。上記方法の一つの変化において、ヌクレオチド配列は別々のベクターにより導入される。別の変化において、ポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分はポリペプチドを含むαＨ鎖部分、一本鎖抗体もしくはそのフラグメント、又は一つ以上の可変領域を含むポリペプチドを含むＨ鎖部分であってもよい。更に、本発明は、相当するFabフラグメントを生産する植物種が前記子孫集団から単離される上記方法を意図している。別の変化において、相当するFvフラグメントを生産する植物種が子孫集団から単離される。又、本発明は種々のトランスジェニック植物を開示する。一実施態様において、（a）免疫グロブリンＨ鎖ポリペプチド及びＬ鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ポリペプチドリンカー又は結合鎖をコードするヌクレオチド配列、及び分泌成分をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞、及び(b)前記ヌクレオチド配列によりコードされた免疫活性分泌抗体を含むトランスジェニック植物が開示される。一つの変化において、全ての４種のヌクレオチド配列が単一細胞内に含まれる。更に別の変化において、ヌクレオチド配列の夫々が別のベクターに含まれる。その他の別の変化において、ポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分はポリペプチドを含むαＨ鎖部分、一本鎖抗体もしくはそのフラグメント、又は一つ以上の可変領域を含むポリペプチドを含むＨ鎖部分であってもよい。別の実施態様において、（a）免疫グロブリンＨ鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ポリペプチドリンカー又は結合鎖をコードするヌクレオチド配列、及び分泌成分をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞、及び(b)前記ヌクレオチド配列によりコードされた免疫活性分泌抗体を含む本発明のトランスジェニック植物が開示される。一つの変化において、全ての３種のヌクレオチド配列が単一細胞内に含まれる。更に別の変化において、ヌクレオチド配列の夫々が別のベクターに含まれる。その他の別の変化において、ポリペプチドを含む免疫グロブリンＨ鎖部分はポリペプチドを含むαＨ鎖部分、一本鎖抗体もしくはそのフラグメント、又は一つ以上の可変領域を含むポリペプチドを含むＨ鎖部分であってもよい。種々の別の実施態様において、免疫グロブリン分子はFabフラグメント又はFv フラグメントを含む。更に別の変化において、植物は双子葉植物又は単子葉植物であってもよい。一つの例示実施態様において、植物はタバコ植物である。又、本発明は前もって選択されたリガンドに対しヒト又は動物被験者を受動免疫する方法であって、前記被験者に前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性免疫グロブリン分子の予防量を投与し、前記分子が検出可能なシアル酸残基を含まないことを特徴とする方法を開示する。一つの変化において、免疫グロブリン分子は植物細胞中に封入される(encapsulated)。別の変化において、免疫グロブリン分子は組成物の一部として投与され、その組成物は栄養価を有する物質を更に含む。別の実施態様において、栄養価を有する物質は植物又は動物に由来する。更に別の変化において、免疫グロブリン分子は組成物の一部として投与され、その組成物は生理不活性な物質を更に含む。全ての前記実施態様において、免疫グロブリンは抗体又はその免疫活性誘導体もしくはフラグメントであってもよい。一つの変化において、免疫グロブリンは分泌IgA又はその免疫活性誘導体もしくはフラグメントである。全ての上記実施態様において、前もって選択されたリガンドは抗原分子である。一つの変化において、リガンドは病原体抗原である。以上の実施態様の種々の組み合わせが、完全な明細書（これはその一部であるが）に記載されたその他の局面を含む実施態様と同様に本発明により意図されている。図面の簡単な説明図1A及び1Bは6D4ハイブリドーマからのκ鎖ｃＤＮＡ（図1A）及びγ鎖ｃＤＮＡ（図1B）の主要な特徴を示す略図である。重要な制限エンドヌクレアーゼ部位の位置が又示されている。相補性決定領域、フレームワーク領域及び定常部の位置が示されている。図２中、Rogersら，Meth.In Enzymol．153:253(1987)に記載されたpMON530 ２成分(binary)35S-NOSカセットベクターの略図が示されている。CaMV35Sプロモーターセグメント;3'；及びNOS 3'非翻訳配列が示されている。又、pBR322複製起点を有する1.6-kbセグメント、ノパリンT-DNAの右ボーダー及び無傷ノパリンシンターゼ(NOS)遺伝子を有するノパリン型pTiT37プラスミドの2.4-kbセグメント、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定基を有するTn7の2.2-k bセグメント、形質転換植物細胞中で選択可能なカナマイシン耐性を与えるキメラNOS-NPTII'‐NOS遺伝子をコードする1.6-kbセグメント、及びその他のＤＮＡセグメントの挿入のための特異な制限部位を含む合成マルチリンカーが存在する。図3A-3Cはアスパラギン結合オリゴ糖（Ｎ結合型オリゴ糖）の主要な型の構造を示す。ボックス領域は全てのＮ結合型オリゴ糖に共通の五糖コア（グリコシル化コア部分）を囲む。複合体（図3A）及びハイブリッド（図3B）Ｎ結合型オリゴ糖は外部分枝を含むＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有し、高マンノース（図3C）Ｎ結合型オリゴ糖はそれを有しない。図4A-4Cは405nmにおける吸光度(Ａ₄₀₅)により測定したトランスジェニックニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)中の機能性抗体発現の実証を示す。全ての三つの図中、ガイ(Guy)の13ハイブリドーマ細胞培養上澄み(IgG)を陽性対照として使用した。夫々の抗体溶液の初期濃度は５μｇ/mlであった。希釈数は連続２回希釈を表す。示された結果は三つの別々の３回反復実験の平均±SDとして表される。全ての三つの図中、黒い四角（■）はSigA-Gを表し、黒い円（●）は dIgA-Gを表し、黒い三角（▲）はIgA-Gを表し、白い四角（□）はSCを表し、白い円（○）はＪ鎖を表し、白い三角（△）はWTを表し、かつ倒立黒三角（▼）はガイ13を表す。希釈が水平軸にプロットされ、一方、吸光度が垂直軸にプロットされる。図4A中、κＬ鎖のHRP標識抗血清で検出された、精製SA I/IIへの植物エキス結合が示される。図4B中、SCのヒツジ抗血清、続いてヒツジIgのアルカリ性ホスファターゼ標識ロバ抗血清で検出された、精製SA I/IIへの植物エキス結合が示される。図4C中、SCのヒツジ抗血清、続いてヒツジIgのアルカリ性ホスファターゼ標識ロバ抗血清で検出された、連鎖球菌細胞への植物エキス結合が示される。図５は基質(１)に触媒作用するタバコ植物中で産生された6D4抗体を実証するのに使用された基質(１)及びインヒビター(２)を示す。発明の詳細な説明Ａ．定義双子葉植物：胚が二つの種子ハーフ又は子葉を有する開花植物。双子葉植物の例はタバコ；トマト；アルファルファを含むマメ科植物；オーク；カエデ；バラ；ミント；カボチャ；デージー；クルミ；サボテン；スミレ；及びキンポウゲである。単子葉植物：胚が一つの子葉又は種子ハーフを有する開花植物。単子葉植物の例はユリ、イネ科牧草；トウモロコシ；エンバク、小麦及び大麦を含む穀物；ラン；アヤメ；タマネギ及びヤシである。下等植物：シダ、裸子植物、球果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、ゼニゴケ、マツモ、コケ、紅藻、褐藻、配偶体、シダ植物の胞子体、及び緑藻を含むあらゆる非開花植物。真核ハイブリッドベクター：ポリペプチド（インサート）をコードするＤＮＡが真核細胞に導入し得るＤＮＡ。染色体外リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）：リボソームＲＮＡをコードする一つ以上の遺伝子を有し、自律複製（染色体の複製に非依存性）する、染色体外の単細胞真核生物中に見られるＤＮＡ。パリンドロームＤＮＡ：一つ以上の対称の中心を有するＤＮＡ配列。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸Ｔ−ＤＮＡ：移入ＤＮＡのセグメントｒＤＮＡ：リボソームＤＮＡＲＮＡ：リボ核酸ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡＴｉ−プラスミド：腫瘍誘発プラスミドＴｉ−ＤＮＡ：Ｔｉ−プラスミドからのＤＮＡのセグメントインサート：構造遺伝子及び必要により付加的なＤＮＡ配列からなる、ｒＤＮＡに異種のＤＮＡ配列構造遺伝子：ポリペプチドをコードし、好適なプロモーター、終止配列及び必要によりその他の調節ＤＮＡ配列を備えており、かつ正確な読み取り枠を有する遺伝子シグナル配列：ポリペプチドを小胞体に結合し、かつタンパク質分泌に必須であるポリペプチドに結合されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列又、この配列は本明細書中で分泌シグナル又は分泌シグナル配列と称される。又、“シグナル配列”という用語はタンパク質がおおよその小胞体又は遊離リボソームで形成されることを決定するアミノ酸の配列を表すのに使用し得る。“リーダー配列” は一般に核酸ストランドの5'末端又はターゲッティング又は調節に際して機能するタンパク質のアミノ末端付近の配列を意味するが、その用語は本明細書中で“ 分泌シグナル”又は“シグナル配列”を含むように時折使用される。（選択的）遺伝子マーカー：形質転換細胞が未形質転換細胞から選択し得る表現型形質をコードするＤＮＡ配列プロモーター：発現調節要素を遺伝子に与え、かつＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列又はＤＮＡ配列のグループにある認識部位誘導プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始の速度が外部刺激により調節されるプロモーターこのような刺激として、光、熱、嫌気ストレス、栄養状態の変化、代謝産物の存在又は不在、リガンドの存在、微生物の攻撃、創傷等が挙げられる。ウイルスプロモーター：ウイルス遺伝子の5'末端に見られるプロモーターに実質的に類似するＤＮＡ配列を有するプロモーター典型的なウイルスプロモーターはHuangら，Cell 27:245(1981)(この出願に引用される全ての文献は参考として含まれる)により記載されたMMTVのp21タンパク質をコードする遺伝子の5'末端に見られる。合成プロモーター：生物学的に誘導されたのではなく、化学的に合成されたプロモーター通常、合成プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ開始の効率を最適化する配列変化を含む。構成的プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始の速度がほぼ一定であり、外部刺激に比較的非依存性であるプロモーター構成的プロモーターの例として、Poszkowskiら，EMBO J．3:2719(1989)及びOdellら，Nature 313:810(1985) により記載されたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター及び19 Sプロモーターが挙げられる。一時調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始の速度が発生中に特定の時間で調節されるプロモーター一時調節プロモーターの例がChuaら，Scienc e 244:174-181(1989)に示される。空間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始の速度が葉、茎又は根の如き生物の特定の構造中で調節されるプロモーター空間調節プロモーターの例がChuaら，Science 244:174-181(1989)に示される。空間一時調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合及び開始の速度が発生中に特定の時間で生物の特定の構造中で調節されるプロモーター典型的な空間一時調節プロモーターはChuaら，上記文献(1989)に記載されたEPSPシンターゼ-35Sプロモーターである。一本鎖抗原結合タンパク質：Ｖ_L配列のカルボキシル末端をＶ_H配列のアミノ末端に結合するペプチドにより免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸配列（Ｖ_H）につながれた免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸配列（Ｖ_L）を含むポリペプチド一本鎖抗原結合タンパク質コーディング遺伝子：一本鎖抗原結合タンパク質をコードする組換え遺伝子多量体タンパク質：単一球状タンパク質を形成するように互いに会合された一つより多い別個のポリペプチド又はタンパク質鎖を含む球状タンパク質ヘテロダイマータンパク質及びホモダイマータンパク質の両方が多量体タンパク質である。ポリペプチド及びペプチド：隣接残基のα−アミノ基及びカルボキシ基の間でペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸残基の直線状系列タンパク質：ポリペプチドのように互いに連結された約50より大きいアミノ酸残基の直線状系列キレート剤：金属を結合することができる化学化合物、ペプチド又はタンパク質キレート剤の例として、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸(E GTA)、２，３−ジメルカプトプロパン−１−スルホン酸(DMPS)、及び２，３− ジメルカプトコハク酸(DMSA)等が挙げられる。金属キレート錯体：キレート剤に結合された金属を含む錯体免疫グロブリン産物：免疫グロブリンＨ鎖の少なくとも免疫活性部分を含み、こうして抗原と特異的に化合することができるポリペプチド、タンパク質又は多量体タンパク質例示免疫グロブリン産物は免疫グロブリンＨ鎖、免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント及びFvフラグメントのように当業界で知られている部分を含む、パラトープを含む免疫グロブリンのあらゆる部分免疫グロブリン分子：一緒に共有結合された免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖の免疫活性部分を含み、かつ抗原と特異的に化合することができる多量体タンパク質 Fab フラグメント：一緒に共有結合された免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖の免疫活性部分を含み、かつ抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン分子の部分からなる多量体タンパク質Fabフラグメントは典型的には当業界で公知である方法を使用してパパインによる実質的に無傷の免疫グロブリン分子のタンパク質分解消化により調製される。しかしながら、又、Fabフラグメントは当業界で公知の方法を使用して免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖の所望の部分を好適な宿主細胞中で発現することにより調製し得る。Fv フラグメント：一緒に共有結合された免疫グロブリンＨ鎖可変領域及び免疫グロブリンＬ鎖可変領域の免疫活性部分からなり、かつ抗原と特異的に化合することができる多量体タンパク質Fvフラグメントは典型的には当業界で公知の方法を使用して免疫グロブリンＨ鎖可変領域及び免疫グロブリンＬ鎖可変領域の所望の部分を好適な宿主細胞中で発現することにより調製される。無性繁殖：葉切断物、茎切断物、根切断物、単一植物細胞（プロトプラスト）及びカルスから全植物を再生することによる子孫の生産グリコシル化コア部分：全てのアスパラギン結合オリゴ糖に共通の五糖コア五糖コアは構造Man α１−３(manα1-6)Man β１−４６LcNAc β１−４６LcNac− （ASNアミノ酸）を有する。五糖コアは典型的には五糖コアに結合された２個の外部分枝を有する。Ｎ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝：アスパラギン結合オリゴ糖の五糖コア（グリコシル化コアタンパク質）に結合される付加的なオリゴ糖哺乳類及び植物の糖ポリペプチドの両方に見られる外部分枝はマンノースのみを含む酵母外部分枝と直接対照的にＮ−アセチルグルコサミンを含む。哺乳類外部分枝は外部分枝の末端部分に直接結合されたシアル酸残基を有する。糖ポリペプチド多量体：単一球状タンパク質を形成するようにグリコシル化ポリペプチド又はタンパク質鎖と互いに結合された少なくとも一つのポリペプチド又はタンパク質鎖とを含む球状タンパク質ヘテロダイマー糖タンパク質及びホモダイマー糖タンパク質の両方が多量体タンパク質である。グリコシル化ポリペプチド及びタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミンのＣ(１)がアスパラギンのアミド基に結合されるｎ−グリカンである。免疫グロブリンスーパーファミリー分子：免疫グロブリン又は免疫グロブリン関連ドメインに実質的に類似するドメインサイズ及びアミノ酸残基配列を有する分子類似性の意味はDayhoffら，Meth Enzymol．91:524-545(1983)により記載されたアラインプログラムの如きコンピュータープログラムを使用して統計的に決定される。３未満の典型的なアラインスコアーは、試験される分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの員であることを示す。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーは表Ａに示され、Williams及びBar- clay，Immunoglobulin Genes，361頁，Academic Press，New York，NY（1989）により記載された分子を含む分子の幾つかの主要クラスを含む。表Ａ免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの既知の員^* 免疫グロブリンＨ鎖(IgM) Ｌ鎖κ Ｌ鎖λＴ細胞レセプター(Tcr)複合体 Tcrα鎖 Tcr β鎖 Tcr γ鎖 Tcr Ｘ鎖 CD3 γ鎖 CD3 δ鎖 CD3 ε鎖主要組織適合複合体(MHC)抗原クラスＩＨ鎖 β₂ミクログロブリンクラスIIα クラスIIββ₂-m関連抗原 TL H鎖 Qa-2 H鎖 CD1a H鎖Ｔリンパ球抗原 CD2 CD4 CD7 CD8鎖Ｉ CD8鎖IId CD28 CTLA4造血／内皮抗原 LFA-3 MRC OX-45脳／リンパ系抗原 Thy-1 MRC OX-2 免疫グロブリンレセプター Poly IgR Fcγ2b／γ1R FcεRI（α）神経分子神経付着分子(MCAM) ミエリン結合gp(MAG) Ｐ₀ミエリンタンパク質腫瘍抗原癌胎児性抗原(CEA)成長因子レセプター血小板由来成長因子(PDGF)レセプターコロニー刺激因子-1（CSF1）レセプター非細胞表面分子 α₁B-糖タンパク質基底膜結合タンパク質^*Williams及びBarclay，Immunoglobulin Genes，p361，Academic Press，NY(1 989);及びSequences of Proteins of Immunological Interest,第４編，U.S.Dep t．of Health and Human Serving(1987) 触媒部位：反応体を結合することができ、かつ反応の速度を改善することができる分子の部分触媒部位はポリペプチド又はタンパク質、酵素、有機物、有機金属化合物、金属等に存在し得る。触媒部位は一つ以上のポリペプチド鎖又は化合物に存在する別個の部分からつくられてもよい。これらの別個の触媒部分は一緒に会合して触媒部位の更に大きい部分を形成する。触媒部位は金属に結合されるポリペプチド又はタンパク質により形成されてもよい。酵素部位：触媒部位を含むタンパク質分子の部分殆どの酵素部位は非常に高い選択的基質特異性を示す。酵素部位は同じポリペプチド鎖の異なるセグメントに存在する二つ以上の酵素部位部分を含んでもよい。これらの酵素部位部分は一緒に会合されて酵素部位の更に大きい部分を形成する。又、酵素部位の部分は金属であってもよい。自家受粉：同じ植物の雄花部分から雌花部分への花粉の移動このプロセスは典型的には種子を生じる。他家受粉：一つの植物の雄花部分から別の植物の雌花部分への花粉の移動このプロセスは典型的には生存子孫を成長することができる種子を生じる。エピトープ：免疫グロブリン産物により特異的に認識される分子の部分又、それは決定基又は抗原決定基と称される。アブザイム：酵素又は触媒として作用することができる免疫グロブリン分子酵素：それがしばしば特異性である基質中の或る変化を触媒作用により加速又は生じることができるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドＲＮＡ分子、又は多量体タンパク質Ｂ．多量体タンパク質を含むトランスジェニック植物の生産方法本発明は第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含む多量体タンパク質を含む植物の新規な生産方法を提供する。一般に、その方法は下記の要素を組み合わせる。１．植物種の第一員のゲノムに第一ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して第一形質転換体を生じる。２．植物種の第二員のゲノムに第二ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して第二形質転換体を生じる。３．第一形質転換体及び第二形質転換体から子孫の集団を生産する。４．その集団から多量体タンパク質を有する子孫を単離する。本発明により生産された植物は生物学的に機能性のコンホメーションをとるような方法で一緒に会合された第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含む多量体タンパク質を含む。本発明の一実施態様において、多量体タンパク質は前もって選択されたリガンドに特異的に結合してリガンドと単離される複合体のリガンド形成部位の間に充分に強い結合を有する複合体を生成するリガンド結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチド（レセプター）である。別の実施態様において、多量体タンパク質は免疫グロブリンＨ鎖と免疫グロブリンＬ鎖とを含む免疫グロブリン分子である。免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖は互いに会合されて、前もって選択され、又は前もって決定された抗原に特異性の抗原結合部位（競合的に抑制されるその能力により証明されるような）を有するコンホメーションをとる。多量体タンパク質が抗原結合タンパク質である場合、そのアフィニティー又は結合活性は一般に10⁵M^-1より大きく、又は通常10⁶M^-1より大きく、好ましくは10⁸ M^-1より大きい。更に別の実施態様において、多量体タンパク質は免疫グロブリンＨ鎖の一部及び免疫グロブリンＬ鎖の一部からなるFabフラグメントである。免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖は互いに会合されて、前もって選択され、又は前もって決定された抗原に特異性の抗原結合部位を有するコンホメーションをとる。Fabフラグメントの抗原結合部位は免疫グロブリン分子の抗原結合部位と同様の結合アフィニティー又は結合活性を有する。更に別の実施態様において、本トランスジェニック植物は免疫グロブリンＨ鎖可変領域の少なくとも一部と免疫グロブリンＬ鎖可変領域の少なくとも一部とを含むFvフラグメントである多量体タンパク質を含む。免疫グロブリンＨ鎖可変領域及び免疫グロブリンＬ鎖可変領域は植物細胞内で互いに自己発生的に互いに会合して前もって選択され、又は前もって決定された抗原に特異性の結合部位を有する生物活性コンホメーションをとる。Fvフラグメントの抗原結合部位は免疫グロブリン分子に存在する抗原結合部位により示されたアフィニティーと同様のその抗原に対するアフィニティー又は結合活性を有する。更に別の実施態様において、多量体タンパク質は基質を結合し、基質からの生産物の生成を触媒作用する酵素である。触媒多量体タンパク質の基質結合部位（リガンド結合部位）のトポロジーはおそらく基質に対するアフィニティー(会合定数又はpKa)よりもその活性に重要であるが、主題多量体タンパク質は10³M^-1より大きく、更に通常10⁵M^-1又は10⁶M^-1より大きく、好ましくは10⁷M^-1より大きいその前もって選択された基質に対する会合定数を有する。本発明に従って生産された多量体タンパク質が別のポリペプチド鎖と会合した免疫グロブリンＨ鎖可変領域の少なくとも一部を含むアブザイムである場合、この別のポリペプチド鎖は免疫グロブリンＬ鎖可変領域の生物活性部分を少なくとも含む。一緒になって、これらの２種のポリペプチドはポリペプチド単独、即ち、単量体としてのいずれかのアフィニティー又は会合定数とは異なり、好ましくはそれより高い前もって選択されたリガンドに対する結合アフィニティー又は会合定数を有するコンホメーションをとる。有益な多量体タンパク質は免疫グロブリンのＬ鎖及びＨ鎖の可変領域から誘導された一つ又は両方のポリペプチド鎖を含む。典型的には、Ｌ鎖（Ｖ_L）可変領域及びＨ鎖（Ｖ_H）可変領域を含むポリペプチドが前もって選択された抗原を結合するのに一緒に使用される。１．植物種の第一員への第一ポリペプチドをコードする遺伝子の挿入所望の第一ポリペプチドをコードする遺伝子の単離方法は当業界で公知である。例えば、Guide To Molecular Cloning Techniques Methods In Enzymology，1 52巻，Berger及びKimmel編集(1987);及びCurrent Protocols in Molecular Biol ogy，Ausebelら編集，John Wiley and Sons，New York(1987)(その開示が参考として本明細書に含まれる)を参照のこと。本発明を実施するのに有益な遺伝子として、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子、Fabフラグメント、Fvフラグメント、酵素、レセプター及びアブザイム中に含まれたポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。免疫グロブリンＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードする遺伝子が特に好ましい。典型的には、前もって選択された抗原を結合することができる免疫グロブリンの免疫グロブリンＨ鎖可変領域及び免疫グロブリンＬ鎖可変領域をコードする遺伝子が使用される。これらの遺伝子は活性が探究される抗原リガンド（抗原）、即ち、前もって選択された抗原で免疫された脊椎動物、好ましくは哺乳類から得られた細胞から単離される。免疫化は通常に行われ、動物中の抗体力価が監視されて所望される免疫化の段階を測定でき、これは所望されるアフィニティー又は結合活性に相当する。部分免疫動物は典型的には唯一の免疫化を受け、応答が検出された直後に細胞がそれから回収される。充分に免疫された動物は通常２週又は３週間隔で宿主哺乳類への抗原の１回以上の反復注射で得られるピーク力価を示す。通常、最後の抗原投与の３〜５日後に、脾臓が除去され、通常の操作を使用して、免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖をコードする遺伝子が脾臓中に存在する転移Ｂ細胞から単離される、Current Protocols in Molecular Biology ，Ausubelら編集，John Wiley and Sons，New York(1987)及びAntibodies:A L- aboratory Manual，Harlowe及びLane編集，Cold Spring Harbor，New York(1988 )を参照のこと。Ｖ_Hポリペプチド及びＶ_Lポリペプチドをコードする遺伝子はIgA、IgD、IgE、I gG又はIgMを産生する細胞、最も好ましくはIgM及びIgGを産生する細胞から誘導し得る。免疫グロブリン可変領域遺伝子がクローン化し得るゲノムＤＮＡのフラグメントの調製方法は当業界で公知である。例えば、Herrmannら，Methods in E nzymol.，152:180-183(1987);Frischauf，Methods in Enzymol.，152:183-190(1 987);Frischauf，Methods in Enzymol.，152:199-212(1987)（本明細書に引用された文献の教示が参考として本明細書に含まれる）を参照のこと。免疫グロブリン産物をコードする遺伝子を単離するのに有益なプローブはＶ_H 及びＶ_Lのフレームワーク領域をコードするＶ_H配列及びＶ_L配列の定常部をコードする配列及び全転移免疫グロブリン遺伝子の定常部のプローブを含み、これらの配列は利用可能な源から得られる。例えば、Early及びHood，Genetic Enginee ring，Setlow及びHollaender編集，3巻:157-188，Plenum Publishing Corporati on，New York(1981);及びKabatら，Sequences of Immunological Interests，Na tional Institutes of Health，Bethesda，MD（1987）を参照のこと。多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子はポリペプチドを発現する遺伝子を含むゲノムＤＮＡ又はポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から単離し得る。ゲノムＤＮＡを使用することの難点は、配列がイントロンにより分離される場合にポリペプチドをコードする配列を並置することにある。適当なエクソンを含む一つ以上のＤＮＡフラグメントが単離される必要があり、イントロンが切除され、エクソンが適当な順序及び配向で一緒にスプライシングされる。たいていの場合、これは困難であり、その結果、ｍＲＮＡを使用する別の技術が特別の方法であろう。何となれば、配列が全ポリペプチドについて連続（イントロンを含まない）であるからである。ペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡの単離方法が当業界で公知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら，John Wiley and Sons ，New York(1987)，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods In Enzy - mology，152巻，Berger及びKimmel編集(1987)、及びMolecular Cloning:A Labor atory Manual，Maniatisら編集，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982)を参照のこと。先に単離されたポリペプチドコーディング遺伝子は典型的には発現ベクターに操作により結合される。宿主細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは植物細胞と適合性の発現ベクターが本発明の遺伝子を発現するのに使用される。植物中の遺伝子の発現に有益な典型的な発現ベクターが当業界で公知であり、Rogersら， Meth．in Enzymol.，153:253-277(1987)により記載されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘発(Ti)プラスミドから誘導されたベクターが挙げられる。しかしながら、幾つかのその他の発現ベクター系が植物中で機能することが知られている。例えば、Vermaら，PCT公開WO 87/00551、並びにCocking及びDave y，Science，236:1259-1262（1987）を参照のこと。上記発現ベクターはプロモーターを含む発現調節要素を含む。ポリペプチドコーディング遺伝子は発現ベクターに操作により結合されて、プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼ結合及び所望のポリペプチドコーディング遺伝子の合成を誘導することを可能にする。誘導性、ウイルス、合成、構成的、一時調節、空間調節、又空間一時調節されるプロモーターがポリペプチドコーディング遺伝子を発現するのに有益である。発現ベクターの選択そして最終的にどのプロモーターにポリペプチドコーディング遺伝子が操作により結合されるのかは、当業界で公知であるように、所望の機能性、例えば、タンパク質発現の位置及び時期、並びに形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは組換えＤＮＡ部を構築する当業界に固有の制限である。しかしながら、本発明を実施するのに有益な発現ベクターは少なくとも複製を誘導することができ、好ましくは又、それが操作により結合されるＤＮＡセグメントに含まれたポリペプチドコーディング遺伝子の発現を誘導することができる。好ましい実施態様において、ポリペプチドコーディング遺伝子を発現するのに使用される発現ベクターは植物細胞中で有効である選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい薬剤耐性選択マーカーは発現がカナマイシン耐性をもたらす遺伝子、即ち、Rogersら，Methods For Plan tMolecular Bio- logy，Weissbach及びH.Weissbach編集，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1 988)により記載されたノパリンシンターゼプロモーター、Tn5ネイマイシンホスホトランスフェラーゼII及びノパリンシンターゼ3'未翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。有益な植物発現ベクターはファーマシア(Piscataway，NJ)により市販されている。種々の方法が相補付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作により結合するのに開発されていた。例えば、相補ホモポリマートラックが挿入すべきＤＮＡセグメントひいてはベクターＤＮＡに添加し得る。次いでベクター及びＤＮＡセグメントが相補ホモポリマーテールの間で水素結合により結合されて組換えＤＮＡ分子を生成する。又、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーがＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合するのに使用し得る。合成リンカーはブラントエンドＤＮＡセグメントをブラントエンドＤＮＡ分子の結合を触媒作用することができる酵素、例えば、バクテリオファージT4 DNAリガーゼの存在下で大過剰の合成リンカー分子とともにインキュベートすることによりブラントエンドＤＮＡセグメントに結合される。こうして、その反応の生成物はそれらの末端に合成リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いでこれらのＤＮＡセグメントは適当な制限エンドヌクレアーゼで開裂され、合成リンカーの末端と適合性の末端を生じる酵素で開裂された発現ベクターにつながれる。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーがニュー・イングランド・バイオラブズ(Beverly， MA)を含む幾つかの源から市販されている。ポリペプチドコーディング遺伝子を植物に導入する方法として、アグロバクテリウム媒介植物形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子移入、生殖器官への注射及び未熟な胚への注射が挙げられる。これらの方法の夫々が固有の利点及び欠点を有する。こうして、遺伝子を特別な植物種に導入する一つの特別な方法は別の植物種に最も有効な方法であるとは必ずしも限らないかもしれない。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介移入は遺伝子を植物細胞に導入するのに広く適用可能な系である。何となれば、ＤＮＡが全植物組織に導入でき、プロトプラストからの無傷の植物の再生の必要をバイパスするからである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのアグロバクテリウム媒介発現ベクターの使用は当業界で公知である。例えば、Fraleyら，Biotechnology，3:629(1985)及びRogersら，Methods in Enzymology，153:253-277(1987)により記載された方法を参照のこと。更に、Ｔｉ−ＤＮＡの組込みは少ない転移をもたらす比較的正確な方法である。移入すべきＤＮＡの領域はボーダー配列により形成され、介在ＤＮＡが通常 Spielmanら，Mol.Gen.Genet.，205:34(1986)及びJorgensenら，Mol.Gen.Genet. ，207:471（1987）により記載されたようにして植物ゲノムに挿入される。最新のアグロバクテリウム形質転換ベクターはエシェリキア・コリだけでなく、アグロバクテリウム中で複製でき、Kleeら，Plant DNA Infectious Agents，T.Hohn 及びJ.Schell編集，Springer-Verlag，New York（1985）179-203頁に記載された便利な操作を可能にする。更に、アグロバクテリウム媒介遺伝子移入用のベクターの最近の技術進歩はベクター中の遺伝子及び制限部位の転移を改良して種々のポリペプチドコーディング遺伝子を発現することができるベクターの構築を促進した。Rogersら，Methods in Enzymology，153:253(1987)により記載されたベクターはプロモーター及び挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のためのポリアデニル化部位により隣接された便利なマルチリンカー領域を有し、本目的に適している。アグロバクテリウム媒介形質転換が有効であるこれらの植物種では、それは遺伝子移入の容易かつ特定の性質のために特別な方法である。しかしながら、少ない単子葉植物がアグロバクテリウムの天然宿主であることが明らかであるが、トランスジェニック植物がBytebierら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84:5345(198 7)により記載されたアグロバクテリウムベクターを使用してアスパラガス中で生産された。それ故、商業上重要な穀物、例えば、米、トウモロコシ、及び小麦は別法を使用して形質転換される必要がある。植物プロトプラストの形質転換はリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、及びこれらの処理の組み合わせに基く方法を使用して達成し得る。例えば、Potr ykusら，Mol.Gen.Genet.，199:183(1985);Lorzら，Mol.Gen.Genet.，199:178(19 85);Frommら，Nature，319:791(1986);Uchimiyaら，Mol.Gen.Genet.，204:204(1 986);Callisら，Genes and Development，1:1183(1987); 及びMarcotteら，Nature，335:454（1988）を参照のこと。異なる植物種へのこれらの系の適用はその特別な植物種をプロトプラストから再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀物の再生の例示方法がFujimu raら，Plant Tissue Culture Letters，2:74(1985);ToriyaMaら，Theor Appl.Ge net.，73:16(1986);Yamadaら，Plant Cell Rep.，4:85(1986);Abdullahら，Biot echnology，4:1087（1986）に記載されている。葉盤及びその他の組織のアグロバクテリウム媒介形質転換はアグロバクテリウム・ツメファシエンスが自然に感染する植物種に限定されることが明らかである。こうして、アグロバクテリウム媒介形質転換が双子葉植物に最も有効である。しかしながら、アグロバクテリウムを使用するアスパラガスの形質転換が又行い得る。例えば、Bytebierら，Proc.Natl.Acad.Sci.，84:5345(1987)を参照のこと。プロトプラストから成功裏に再生し得ない植物種を形質転換するために、ＤＮＡを無傷の細胞又は組織に導入するその他の方法が利用し得る。例えば、未熟胚又は外植体からの穀物の再生はDasil，Biotechnology，6:397（1988）により記載されたようにして行い得る。加えて、“粒子銃”又は高速マイクロプロジェクタイル(microprojectile)技術が同様に利用し得る。このような技術を使用して、Kleinら，Nature，327:70(1987);Kleinら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85:8 502(1988);及びMcCabeら，Biotechnology，6:923(1988)に記載されたようにして、ＤＮＡが細胞壁を通って、毎秒百メートル〜数百メートルの速度に加速された小さい(0.525μｍ)金属粒子の表面の細胞質に運ばれる。金属粒子は細胞の幾つかの層に侵入し、こうして組織外植体中の細胞の形質転換を可能にする。金属粒子が使用されてトウモロコシ細胞を成功裏に形質転換し、稔性の安定に形質転換されたタバコ植物及び大豆植物を生産した。組織外植体の形質転換はプロトプラスト段階中の継代の必要をなくし、こうしてトランスジェニック植物の生産を加速する。又ＤＮＡはZhouら，Methods in Enzymology，101:433(1983);D.Hess，Intern Rev.Cytol.，107:367(1987);Luoら，Plant Mol.Biol.Reporter，6:165(1988)により記載されたようにして花粉への直接ＤＮＡ移入により植物に導入し得る。ポリペプチドコーディング遺伝子の発現はPenaら，Nature，325:274 (1987)により記載されたようにして植物の生殖器官へのＤＮＡの注射により得られる。又、ＤＮＡはNeuhausら，Theor.Appl.Genet.，75:30(1987);及びBenbrook ら，Proceedings Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，MA，27-54頁(1986) により記載されたようにして未熟胚の細胞及び乾燥された胚の再水和に直接注射し得る。単一植物プロトプラスト又は種々の外植体からの植物の再生は当業界で公知である。例えば、Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach及びH.Weis sbach編集，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1988)を参照のこと。この再生及び成長プロセスは形質転換体細胞及び苗条の選択の工程、形質転換体苗条の発根の工程及び土壌中の小植物の成長の工程を含む。葉外植体からのアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより導入された異種遺伝子を含む植物の再生はHorschら，Science，227:1229-1231(1985)により記載されたようにして行い得る。この操作において、形質転換体がFraleyら，Proc.N atl.Acad.Sci.U.S.A.，80:4803（1983）により記載されたようにして形質転換されている植物中で苗条の再生を誘導する培地中で選択薬剤の存在下で成長させられる。この操作は典型的には２週〜４週以内に苗条を生産し、次いでこれらの形質転換体苗条が選択薬剤及びバクテリア増殖を阻止するための抗生物質を含む適当な根誘導培地に移される。次いで、選択薬剤の存在下で発根して小植物を形成する形質転換体苗条が土壌に移植されて根の発生を可能にする。これらの操作は使用される特別な植物種に応じて変化し、このような変化が当業界で公知である。２．植物種の第二員への第二ポリペプチドをコードする遺伝子の挿入有益な遺伝子として、生物学的機能性多量体タンパク質を生成するような方法で第一ポリペプチドと自己発生的に会合し得る第二ポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。この第二ポリペプチドをコードする遺伝子を植物種の第二員に導入するのに使用される方法は、遺伝子を同植物種の第一員に導入するのに使用され、上記された方法と同じである。３．第一形質転換体及び第二形質転換体からの子孫の集団の生産子孫の集団はMendelにより1865年に記載された他家受精として知られている方法（Mendelの最初の論文の英語翻訳が他人によるコメント及びMendelの文献目録と一緒にExperiments In Plant Hybridization，Edinburgh，Scotland，Oliver Boyd編集，1965に見られる）を含む当業界で公知の方法により植物種の第一形質転換体及び第二形質転換体から生産し得る。４．多量体タンパク質を含む子孫の単離所望の多量体タンパク質を含む子孫は、当業界で公知のアッセイ方法を使用して生物学的に多量体のタンパク質の存在について分析することにより同定し得る。このような方法として、ウェスタンブロッティング、イムノアッセイ、結合アッセイ、及び生物学的機能性多量体タンパク質を検出するように設計されたあらゆるアッセイが挙げられる。例えば、Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination，Klein，John Wiley and Sons，New York，NY（1982）に記載されたアッセイを参照のこと。好ましいスクリーニングアッセイは、多量体タンパク質の生物活性部位が検出可能なシグナルを生じるような方法で検出されるアッセイである。このシグナルは直接又は間接に生じられてもよく、このようなシグナルとして、例えば、複合体の生成、触媒反応生成物の形成、エネルギーの放出又は吸収等が挙げられる。例えば、この方法により産生された抗体分子を含む子孫はELISA又はAntibodies: A Laboratory Manual，Harlow及びLane編集，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor，NY（1988）に記載されたイムノアッセイと同様のラジオイムノアッセイの如き通常のイムノアッセイでその抗体がその抗原に結合することを可能にするような方法でプロセシングし得る。本発明の更に別の局面は第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含む多量体タンパク質の生産方法である。一般に、その方法は本発明の植物を培養する要素と、所望の多量体タンパク質を生産するように培養された植物を回収する要素とを組み合わせる。第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含む所望の多量体タンパク質を含む本発明の植物は、当業者に公知の方法を使用して培養される。本発明のトランスジェニック植物のいずれもが、それらが含む所望の多量体タンパク質を単離するために培養し得る。培養後に、トランスジェニック植物が回収されて生産された多量体タンパク質を回収する。この回収工程は全植物、又は植物の葉、もしくは根のみを回収することからなってもよい。この工程は植物を死滅させ、又はトランスジェニック植物の部分のみが回収される場合には植物の残りを成長させ続けてもよい。好ましい実施態様において、この回収工程は (i) 前記トランスジェニック植物の少なくとも一部を均一にして植物パルプを生産する工程、 (ii)前記植物パルプから前記多量体タンパク質を抽出して多量体タンパク質を含む溶液を生成する工程、及び (iii) 前記多量体タンパク質を前記溶液から単離する工程を更に含む。トランスジェニック植物の少なくとも一部は、当業者に公知の方法を使用して均一にされて植物パルプを生産する。この均一化は、トランスジェニック植物部分が小片に分解されて植物パルプを生じる限り、手動、機械、又は化学的手段により行われてもよい。この植物パルプはトランスジェニック植物粒子の種々のサイズの混合物からなる。植物粒子のサイズ及び許容し得るサイズの変化の量は植物パルプから多量体タンパク質を抽出するのに使用される正確な方法に依存し、これらのパラメーターは当業者に公知である。多量体タンパク質は先に生産された植物パルプから抽出されて多量体タンパク質を含む溶液を生成する。このような抽出方法は普通であり、当業者に公知である。例えば、抽出工程は植物パルプを好適な溶媒中で浸軟又は浸漬することからなってもよい。この好適な溶媒は植物パルプ中に存在する多量体タンパク質を溶解して多量体タンパク質を含む溶液を生成することができる。このような抽出方法に有益な溶媒が当業者に公知であり、水性溶媒、有機溶媒及び両方の組み合わせが挙げられる。多量体タンパク質は、タンパク質単離の当業者に公知である方法を使用して先に生成された溶液から単離される。これらの方法として、イムノアフィニティー精製並びに単離すべき多量体タンパク質の特定サイズ、電気泳動移動度、生物活性、及び／又は正味の電荷に基く精製操作が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ．トランスジェニック植物の利用又、本発明は流体サンプルから前もって選択されたリガンドを選択する新規な方法を提供する。その方法は下記の要素を組み合わせる。１．流体サンプルを本発明のトランスジェニック植物からの植物細胞と混合して混合物を生成する。２．この混合物をリガンドが植物細胞に入り、多量体タンパク質を結合して植物細胞内に複合体を生成するのに充分な期間にわたって維持する。３．複合体を含む植物細胞を混合物から除去し、それによりリガンドを流体サンプルから分離する。流体サンプルは多量体タンパク質を含む本発明のトランスジェニック植物からの植物細胞と混合される。この多量体タンパク質はレセプター、酵素、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子もしくはそのフラグメント、又はアブザイムであってもよい。当業者は、この多量体タンパク質が前もって選択されたリガンドを結合することができる必要があることを理解するであろう。流体サンプルは液体又はガスであってもよい。両方の場合、混合は植物細胞を液体又はガス中に入れることからなってもよい。又、植物細胞は流体サンプルと充分に混合されてもよい。この混合は流体サンプルを植物細胞と緊密に接触させて混合物を生成する必要がある。この混合物は流体サンプル中に存在するリガンドを細胞に入らせるのに充分な期間にわたって維持される。このプロセスは拡散のような受動プロセスであってもよく、又は高圧を流体サンプルに適用してそれを植物細胞に押しやるような系へのエネルギーの適用により行われてもよい。リガンドが植物細胞に入るのに必要とされる時間の量は当業者に知られており、このような期間を最適化するように前もって決定し得る。植物細胞に入った後、リガンドは多量体タンパク質を結合して複合体を生成する。多量体タンパク質がレセプターである場合、生成された複合体はレセプター−リガンド複合体である。多量体タンパク質が免疫グロブリン、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の一部、Fabフラグメント、又はFvフラグメントである場合、生成された複合体は免疫反応複合体である。多量体タンパク質が酵素であり、リガンドが基質である場合、生成された複合体は酵素−基質複合体である。多量体タンパク質がアブザイムである場合、生成された複合体は免疫反応複合体である。複合体が植物細胞中で生成された後、複合体を含む植物細胞が混合物から除去され、それによりリガンドを流体サンプルから分離する。植物細胞を混合物から除去する方法は当業者に公知であり、機械的除去、濾過、沈降及びその他の分離手段が挙げられる。この方法に利用される植物細胞が生存植物を構成する場合、この手段はリガンドを植物中で濃縮する。リガンドが重要な栄養源である場合、これはその細胞中でその特別な栄養源を濃縮するその植物をもたらし、それにより植物の栄養価を増進する。リガンドが環境汚染物質である場合、この汚染物質は植物細胞中で濃縮され、こうして環境から除去される。勿論、この方法が適用可能であるためには、そのリガンドが植物細胞に入ることができる必要がある。植物細胞に入ることができるリガンドは当業者に公知である。又、本発明は金属イオンを金属イオンを含む流体サンプルから分離する方法を意図している。この特別な方法は下記の工程を含む。１．流体サンプルにキレート剤を混合してキレート混合物を生成する。２．キレート混合物を金属イオンがキレート剤を結合し、金属イオンキレート錯体を生成するのに充分な期間にわたって維持する。３．金属イオンキレート錯体を本発明の植物細胞と混合して結合混合物を生成する。４．結合混合物を金属イオンキレート錯体が植物細胞に入り、多量体タンパク質を結合して反応複合体を生成するのに充分な期間にわたって維持する。５．反応複合体を含む植物細胞を結合混合物から除去し、それにより金属イオンを流体サンプルから分離する。この方法を実施するのに有益なキレート剤として、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)及びビス（ビス−カルボキシメチルアミノプロピル）フェニルイソチオシアネート(CITC)が挙げられる。例えば、Mearesら，Analytical Biochemistry ，142:68-78（1984）を参照のこと。流体サンプルはガス又は液体サンプルであってもよく、キレート剤と混合される時にキレート化混合物を生成する。キレート化混合物は金属がキレート剤を結合し、金属イオンキレート錯体を生成するのに充分な期間にわたって維持される。金属イオンがキレート剤を結合するのに必要とされる時間の量は使用されるキレート剤の型及び金属の濃度に少なくとも依存するであろう。金属イオンキレート錯体は、少なくとも一種の金属イオンがそのキレート剤と会合し、そのキレート剤に結合されるようになって錯体を生成する時に生成される。この金属イオンキレート錯体が本発明の植物細胞と混合される。これらの植物細胞は金属イオンキレート錯体を特異的に結合することができる多量体タンパク質を含む。例えば、植物細胞はReardonら，Nature，316:265-268（1985）及びMe aresら，Analytical Biochemistry，142:68-78(1984)により記載された免疫グロブリン分子と同様の金属キレート錯体に免疫特異性である免疫グロブリンを含んでもよい。結合混合物は、金属イオンキレート錯体が植物細胞に入り、多量体タンパク質を結合して植物細胞と反応複合体を生成するのに充分な期間にわたって維持される。結合混合物は、金属イオンキレート錯体が多量体タンパク質を結合することを可能にする条件下に維持される必要がある。このような条件は当業者に公知である。金属イオンキレート錯体が植物細胞に入るのに必要とされる時間の量は変化し、金属キレート錯体の濃度及びサイズに少なくとも依存するであろう。金属イオンキレート錯体は、例えば、拡散により受動的に植物細胞に入ってもよく、又は加圧下で植物細胞に押しやられてもよい。金属イオンキレート錯体が植物細胞中に存在する多量体タンパク質に結合する時に生成された反応複合体はキレート剤に結合された金属イオン、キレート剤及び多量体タンパク質からなる。次いで反応複合体を含む植物細胞が結合混合物から除去されて、それにより金属イオンを流体サンプルから分離する。植物細胞は、当業者に公知の方法を使用して除去されてもよく、機械的除去、濾過、沈降及びその他の分離手段が挙げられる。この方法に利用される植物細胞が生存植物を構成する場合、この方法は金属を植物中で濃縮する。本発明のトランスジェニック植物は、当業者に知られているあらゆる方法を使用して形質転換し得るあらゆる有性交配可能な植物種から生産し得る。有益な植物種はタバコ、トマト、マメ、アルファルファ、オーク、及びカエデを含む双子葉植物；イネ科牧草類、トウモロコシ、穀物、エンバク、小麦、及び大麦を含む単子葉植物；並びに裸子植物、球果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、ゼニゴケ、マツモ、コケ、藻類、配偶体、シダ植物の胞子体を含む下等植物である。本発明のトランスジェニック植物はプロモーターに操作により結合されたポリペプチドコーディング遺伝子を含む。有益なプロモーターが当業者に知られており、誘導プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、一時調節プロモーター、空間調節プロモーター、及び空間一時調節プロモーターが挙げられる。好ましい実施態様において、本発明のトランスジェニック植物は免疫グロブリン産物を含む。有益な免疫グロブリン産物が免疫グロブリン分野の当業者に公知であり、免疫グロブリンＨ鎖、Ｈ鎖とＬ鎖とを含む免疫グロブリン分子が挙げられる。免疫グロブリン分子の半分、Fabフラグメント、Fvフラグメント、及び一本鎖抗原結合タンパク質として知られているタンパク質。免疫グロブリン産物の構造が当業者に公知であり、Basic and Clinical Immunology，Stitesら著，第４編，Lange Medical Publications，Los Altos，CAに記載されている。一本鎖抗原結合タンパク質の構造がBirdら，Science，242:423-426(1988)及びLadnerの米国特許第4,704,692号に記載されていた。免疫グロブリン、又は抗体分子は分子の幾つかの型、例えば、IgD、IgG、 IgA、IgM及びIgEを含む分子の大ファミリーである。抗体分子は典型的には夫々の鎖に存在する可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）部の両方を有する二つのＨ鎖及びＬ鎖を含む。免疫グロブリンの幾つかの異なる領域は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して免疫グロブリン遺伝子を単離するのに有益な保存された配列を含む。例示の保存配列を示す広範なアミノ酸配列データ及び核酸配列データがKabatら，S equences of Proteins of Immunological Interest，国立健康協会，Bethesda， MD（1987）により免疫グロブリン分子について編集されている。Ｈ鎖又はＬ鎖のＶ領域は典型的には四つのフレームワーク(FR)領域（図１）を含み、夫々が保存配列の長さ部分を含む比較的低い可変度(degrees of variabil ity)を含む。Ｖ_HのFR1及びFR4(Ｊ領域)フレームワーク領域からの保存配列の使用が好ましい例示実施態様であり、本明細書中の実施例に記載される。フレームワーク領域は典型的には幾つか又は全部の免疫グロブリン型にわたって保存され、こうしてその中に含まれる保存配列が可変型を単離するのに特に適している。一つの特に有益な免疫グロブリン産物は免疫グロブリンＨ鎖である。免疫グロブリンＨ鎖は免疫グロブリンＨ鎖可変領域と免疫グロブリン定常部からなる。免疫グロブリンＨ鎖可変領域は抗原結合部位（及び抗体結合部位）を含むポリペプチドである。それ故、免疫グロブリンＨ鎖可変領域は特別なエピトープを特異的に結合することができる。Ｖ_Hは長さが約110から約125までのアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基配列は、特別な抗原に応じて広く変化し、Ｖ_H が結合することができる。通常、ジスルフィド結合により互いに結合される約60 -75アミノ酸残基により分離された少なくとも二つのシステインがあるであろう。免疫グロブリン定常部（Ｃ_H）はα、γ１、γ２、γ３、δ、mu、又はεヒトイソ型のものであってもよい。免疫グロブリンＨ鎖がマウスに由来する場合、Ｃ_H はα、γ１、γ2a、γ2b、γ３、δ、mu、又はεイソ型のものであってもよい。Ｃ_Hはそれが単離された動物種中に通常存在するイソ型のものであろう。又、Ｃ_Hは所定の生物学的機能を増進し、又は与えるために異なるイソ型に由来するドメインからなってもよい。幾つかの異なる定常部イソ型からのＤＮＡ配列を含む遺伝子が組み合わされてキメラＣ_Hポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を生じ得る。ＤＮＡ配列及びタンパク質配列は利用できる源から容易に得られる。例えば、Early Hood，Genetic Engineering，Setlow及びHollaender編集，３巻，Plenum Publishing Corporation，(1981)，157-188頁;及びKabatら，Sequence s of Immunological Interest，National Institutes Of Health，Bethesda，MD (1987)を参照のこと。又、これらの二つの源はＶ_H、Ｖ_L及びＣ_L遺伝子及びタンパク質に関する幾つかの配列を含む。好ましい免疫グロブリン産物は上記免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖を含む産物である。免疫グロブリンＬ鎖は免疫グロブリンＬ鎖可変領域（Ｖ_L ）及び免疫グロブリンＬ鎖定常部からなる。Ｖ_Lは長さが約95から約115までのアミノ酸残基であろう。当業者は、ヒト及びマウスの両方に存在するＣ_Lの２種のイソ型、λイソ型及びκイソ型があることを理解するであろう。その他の好ましい実施態様において、免疫グロブリン産物はＶ_H単独、又はFv フラグメントを形成するためにＶ_Lと会合されたＶ_Hからなる。意図されたトランスジェニック植物は多量体タンパク質を含む。この多量体タンパク質は上記免疫グロブリン産物、酵素、特定のリガンドを結合することができるレセプター、又はアブザイムであってもよい。本発明の酵素は、少なくとも二つのポリペプチド鎖が存在する多量体タンパク質である。これらの二つのポリペプチド鎖は本発明の方法によりトランスジェニック植物に導入された遺伝子によりコードされる。有益な酵素として、アスパルテートトランスカルバミラーゼ等が挙げられる。別の好ましい実施態様において、特定のリガンドを結合することができるレセプターがある。典型的には、このレセプターは本発明の方法によりトランスジェニック植物に導入された遺伝子によりコードされた少なくとも二つのポリペプチド鎖からつくられる。このようなレセプター及びそれらの夫々のリガンドの例として、ヘモグロビン、O₂;タンパク質キナーゼ、cAMP;等が挙げられる。本発明の別の好ましい実施態様において、存在する免疫グロブリン産物は免疫グロブリンＨ鎖及びその関連可変領域により、又は免疫グロブリン分子、Fab、F vもしくは免疫グロブリン分子の実質的な部分を形成するために一緒に会合された免疫グロブリンＨ鎖及び免疫グロブリンＬ鎖により構成されたアブザイムである。例示アブザイムとして、Tramontanoら，Science，234:1566-1570(1986);Pol lackら，Science，234:1570-1573(1986);Jandaら，Science，241:1188-1191(198 8);及びJandaら，Science，244:437-440(1989)により記載されたアブザイムが挙げられる。典型的には、本発明の多量体タンパク質は少なくとも２種のポリペプチドを含む。しかしながら、２種より多いペプチドが存在し得る。これらのポリペプチドの夫々が別々のポリペプチドコーディング遺伝子によりコードされる。ポリペプチドが互いに会合されてジスルフィドブリッジ、水素結合、又は同様のメカニズムにより多量体タンパク質を形成する。本発明から生産されるトランスジェニック植物又は本発明のトランスジェニック植物の子孫であるトランスジェニック植物が本発明の一部として含まれる。これらのトランスジェニック植物は親トランスジェニック植物中に含まれた多量体タンパク質と同じ多量体タンパク質を含む。このような植物は親植物の無性繁殖又は自家受粉により発生し得る。植物を無性繁殖し、又、自家受粉する方法が公知である。更に別の局面において、本発明は複合体を含むトランスジェニック植物を意図している。一般に、このような複合体を含むトランスジェニック植物は、キレート剤を流体サンプルに添加してキレート混合物を生成し、流体サンプル中に存在する金属がキレート剤を結合し、金属キレート錯体を生成するのに充分な期間にわたって混合物を維持し、金属キレート錯体を本発明のトランスジェニック植物細胞と混合して結合混合物を生成し、金属キレート錯体が植物細胞に入り、植物細胞中に存在する多量体タンパク質を結合して植物細胞中に複合体を生成するのに充分な時間にわたって維持することにより得られる。金属キレート錯体及び免疫グロブリン産物からなる反応複合体を含むトランスジェニック植物が又本発明により意図されている。典型的には、このトランスジェニック植物は本発明の方法により生産されるであろう。Ｄ．生物活性糖ポリペプチド多量体本発明は少なくとも２種のポリペプチドを含む生物活性糖ポリペプチド多量体を意図しており、そのポリペプチドの一種は(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その結果、多量体はシアル酸残基を含まない。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体は免疫グロブリンスーパーファミリー分子のアミノ酸残基配列、例えば、免疫グロブリンのアミノ酸残基配列、Ｔ細胞レセプター複合体の分子、主要組織適合複合体抗原等を含む。免疫グロブリンＨ鎖、免疫グロブリンＨ鎖可変領域又は免疫グロブリンＨ鎖可変領域の一部のアミノ酸残基配列を含む生物活性糖ポリペプチド多量体が特に好ましい。又、免疫グロブリンＬ鎖、及び免疫グロブリンＬ鎖可変領域並びに免疫グロブリンＬ鎖可変領域の部分のアミノ酸残基配列を有する糖ポリペプチド多量体が好ましい。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドと別のアミノ酸残基配列を含む少なくとも一種のその他のポリペプチドに結合される免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列とを含む。好ましい実施態様において、その他のポリペプチドは免疫グロブリンスーパーファミリー分子、免疫グロブリン分子、免疫グロブリンＨ鎖、免疫グロブリンＨ鎖可変領域、免疫グロブリンＨ鎖可変領域の一部、免疫グロブリンＬ鎖、免疫グロブリンＬ鎖可変領域、又は免疫グロブリンＬ鎖可変領域の一部のアミノ酸残基配列を含んでもよい。その他の好ましい実施態様において、糖ポリペプチド多量体は免疫グロブリン分子又は糖ポリペブチド多量体中に存在する免疫グロブリン分子の一部に結合された免疫グロブリンＪ鎖を更に含む。Ｊ鎖はポリマーIgA及びIgM並びにその他の免疫グロブリン、例えば、IgG、IgD、IgE、及びこれらの免疫グロブリンイソ型のその他の種々のサブクラスと会合されるポリペプチドである。ヒト及びマウスの両方のＪ鎖のアミノ酸組成がMoleら，Biochemistry，16:350 7（1977）、Max及びKorsmeyer，J.Exp.Med.，161:832(1985)，Cannら，Proc.Nat l.Acad.Sci.，USA，79:6656（1982）、及びKoshland，Annu.Rev.Immunol.，3:42 5（1985）により記載されていた。Ｊ鎖は高比率の酸性アミノ酸、少数のグリシン、スレオニン、システイン、及び唯一のメチオニンを有する137アミノ酸残基を有する。Ｊ鎖は８システイン残基を含み、そのうちの６残基は鎖内ジスルフィド結合の形成に関係し、２残基は免疫グロブリンＨ鎖、例えば、Mend ezら，Biochem.Biophys.Res.Commun.，55:1291(1973)、Mesteckeyら，Proc．Nat l.Acad.Sci.，USA，71:544（1974）、Mesteckey及びSchrohenloher，Nature，24 9:650（1974）により記載されたようなα鎖又はmuＨ鎖の如き免疫グロブリンＨ鎖の最後から２番目のシステインに連結される。好ましい実施態様において、糖ポリペプチド多量体は又糖ポリペプチド多量体中に存在する免疫グロブリンＨ鎖アミノ酸残基配列のFc領域に結合された分泌成分を含む。分泌成分は549-558アミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖及び5-7 オリゴ糖側鎖としてアスパラギン残基にＮ−グリコシド結合により結合された多量の炭水化物を含む。Mostovら，Nature，308:37(1984);Eiffertら，Hoppe Sevl er's C.Physiol.Chem.，365:1489(1984);Heremans，N The Antigens,M.Sela編集，2:365，Academic Press New York(1974);Tomanaら，Ana.Biochem.，89:110(19 78);Purkayasthaaら，J.Biol.Chem.，254:6583(1979);及びMizoguchiら，J.Biol .Chem.，257:9612(1982)を参照のこと。分泌成分は鎖内ジスルフィド結合に関係する20システイン残基を含む。好ましい実施態様において、分泌成分は糖ポリペプチド多量体中に存在する免疫グロブリンＨ鎖のFc領域中に存在するシステイン残基に結合されたジスルフイドである。本発明はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドを含む糖ポリペプチド多量体を意図しており、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。ポリペプチドはポリペプチド中に存在するアスパラギンアミノ酸残基のアミド基に直接にそのC(1)炭素を介して結合されたＮ−アセチルグルコサミンオリゴ糖を含むグリコシル化コア部分を有する。グリコシル化コア部分は図3A-3C中のボックス領域内に含まれた構造Man α1-3（ Manα1-6）Manβ1 1-4GlcNAc β1-4 GlcNAc-Asnを有する。又、ポリペプチドはＮ−アセチルグルコサミンを含む外部オリゴ糖分枝（外部分枝）を有する。複合体及びハイブリッドアスパラギン結合オリゴ糖の両方がＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含み、一方、高マンノースオリゴ糖はそれを含まない。バクテリア細胞はアスパラギンアミノ酸に結合されたグリコシル化コア部分を含まない。酵母細胞は複合体又はハイブリッド型のアスパラギン結合オリゴ糖を有しなく、それ故、酵母はＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有しない。植物細胞はアスパラギンアミノ酸に結合されたグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドを生産することができる。糖ポリペプチド多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドを含み、検出可能なシアル酸残基及び全体中で、多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。シアル酸、哺乳類糖タンパク質の優占末端炭水化物は植物タンパク質の炭水化物残基として同定されていなかった。植物中に見られる末端炭水化物残基として、Sturmら，J.Biol.Chem. ，262:13392（1987）により記載されたようなキシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース又はガラクトースが挙げられる。その他に関して、植物糖タンパク質及びこれらのタンパク質に結合された炭水化物は哺乳類糖タンパク質に非常に似ている。植物中で生産された糖ポリペプチド多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドを含むが、検出可能なシアル酸残基を含まない。アミノ酸残基配列内に、Ｎ結合型グリコシル化シグナル、アスパラギン−Ｘ− セリン／スレオニン（式中、Ｘはおそらくプロリン又はアスパラギン酸以外のあらゆるアミノ酸残基であってもよい）を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、植物細胞に導入された時に、配列（Ｎ結合型）のアスパラギン残基に結合されたオリゴ糖によりグリコシル化されるであろう。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列の一般の総説についてMarshall，Ann.Rev.Biochem.， 41:673（1972）及びMarshall，Biochem.Soc.Symp.，40:17(1974)を参照のこと。これらのシグナルは哺乳類及び植物細胞の両方中で認識される。しかしながら、植物細胞では、これらのシグナルは植物細胞中で発現された時に哺乳類細胞中で見られるような末端シアル酸残基を含むアスパラギン結合型オリゴ糖をもたらさず、Ｎ結合型グリコシル化シグナル配列を含むポリペプチドはグリコシル化されてグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むようになり、検出可能なシアル酸残基を含まないであろう。本発明の糖ポリペプチド多量体、タンパク質、又はポリペプチドはシアル酸に特異性のレクチン、例えば、小麦胚アグルチニン又はレシヌス・コムニスアグルチニンへの特異的結合の欠如により証明されるように検出可能なシアル酸残基を含まない。特別なレクチンへのグリコシル化ポリペプチド鎖の結合の測定方法は当業界で公知である。例えば、Fayeら，Ana.Biochem.，149:218（1985）及びGol dsteinら，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，35:127（1978）を参照のこと。グリコシル化ポリペプチド鎖が特別なレクチンに結合するか否かの典型的な測定方法として、レクチンカラムを使用する方法、及びグリコシル化ポリペプチドがニトロセルロースに結合され、ビオチニル化レクチンで探査される方法が挙げられる。レクチンの正確な特異性は、レクチン結合をシアル酸残基の如き特別なオリゴ糖と競合させることにより測定し得る。免疫グロブリンスーパーファミリー分子、及び免疫グロブリンはそれらに結合された種々の炭水化物基を有し得る。典型的には、炭水化物は、トリペプチドアクセプター配列アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｎ結合型シグナル）がＨ鎖可変領域内に見られる二三の場合を除いて免疫グロブリンＨ鎖定常部に見られる。アミノ酸残基配列内にトリペプチドアクセプター配列（Ｎ結合型グリコシル化配列）を含むその他の免疫グロブリンスーパーファミリー分子は又そのトリペプチドアクセプター配列のアスパラギンに結合された炭水化物基を含むであろう。７種のヒトＨ鎖に結合された典型的な炭水化物基がJeske及びCapra，Fundam ental Immunology，W.E.Paul編集，Raven Press，New York，NY(1984)により記載されている。炭水化物結合部位は種々の種と免疫グロブリンＨ鎖の匹敵するクラスの間に高度に保存される。表Ｂはヒト免疫グロブリンＨ鎖の夫々の種々のオリゴ糖を示す。表Ｂヒト免疫グロブリンＨ鎖の構造上の特徴糖ポリペプチド多量体中に存在するポリペプチドは免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列内にＮ結合型グリコシル化シグナルを含むことが好ましい。その他の好ましい実施態様において、Ｎ結合型グリコシル化は免疫グロブリン残基配列ではないポリペプチドの領域中に存在する。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体は分泌IgAを含む。分泌IgAはIgAダイマーを含む分泌IgA分子を形成するために全て一緒に結合された四つの免疫グロブリンαＨ鎖、四つの免疫グロブリンＬ鎖、Ｊ鎖及び分泌成分からつくられる。分泌IgA分子は抗原に特異的に結合するＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域を含む。分泌IgA分子はIgA₁分子又はIgA₂分子を含んでもよい。分泌I gAの一般的な説明について、Mesteckeyら，Advances in Immunology，40:153(19 87)を参照のこと。動物の最終の集合分泌IgAは二つの異なる細胞型：結合Ｊ鎖を有するIgAを産生するプラズマ細胞及び分泌IgAを産生する上皮細胞の産物である。複合体のトランスサイトーシス及び分泌は細胞の管腔表面のみにある膜の結果である。複合体の４種の成分（α、γ、Ｊ、SC）の相互作用は粘膜表面と関連する分解環境に格別に耐性である免疫グロブリン構造をもたらす。その他の好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体は全て一緒にジスルフィド結合された五つのIgM分子、三つのＪ分子及び分泌成分を含む分泌IgM分子である。両方の分泌免疫グロブリン(IgM及びIgA)はタンパク質分解及び分解に耐性であり、それ故、肺又は胃腸道の如き粘膜表面に存在する時に活性である。Tomasi， N.Basic and Clinical Immunology，198頁，Lange Medical Publications，Los Altos，CA(1982)を参照のこと。好ましい実施態様において、生物活性糖ペプチド多量体はその中に少なくとも一つの触媒部位を有する。この触媒部位は一つ以上のポリペプチドにより形成される酵素部位であってもよい。存在する触媒部位は典型的には単独又はその他のポリペプチドのアミノ酸残基配列と一緒に触媒部位を形成することが知られているアミノ酸残基配列により形成される。この触媒部位は酵素の活性部位、又は免疫グロブリンの結合部位であってもよい。例えば、Tramontanoら，Science，234 :1566（1986）を参照のこと。又、本発明はBiochemistry Worth Publishers,Inc .，New York（1975）に記載された酵素の如き触媒部位を含むその他の酵素を意図している。その他の好ましい実施態様において、本発明はグリコシル化コア部分並びにＮ -アセチルグルコサミンを含む外部分枝を有するポリペプチドを含む生物活性糖ポリペプチド多量体を意図しており、多量体が検出可能なシアル酸を含まない場合に異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドに結合された免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む。糖ポリペプチド多量体の触媒部位が第一部分及び第二部分を含む触媒糖ポリペプチド多量体が意図されている。又、触媒部位の第一部分は免疫グロブリンアミノ酸残基配列により形成される。触媒部位の第二部分は異なる免疫グロブリンアミノ酸残基配列により形成される。触媒部位の第一部分及び第二部分は一緒に会合されて触媒部位の更に大きな部分を形成する。更に好ましい実施態様において、触媒部位の第一部分は免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列により形成され、触媒部位の第二部分は触媒部位で更に大きい部分を形成するためにＨ鎖アミノ酸残基配列と会合される免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列により形成される。又、本発明は (i) グリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポリペプチド（そしてそのポリペプチドはマウス免疫グロブリン結合レクチンに結合しない）、及び (ii)異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチド（この別のポリペプチドはポリペプチドに結合される）を含む生物活性糖ポリペプチド多量体を意図している。マウス免疫グロブリン結合レクチンとして、小麦胚アグルチニン及びリシヌス・コムニスアグルチニンの如き末端シアル酸残基を特異的に結合するレクチンが挙げられる。マウス免疫グロブリン結合レクチンは末端シアル酸残基に特異性であり、こうして植物細胞中で産生された免疫グロブリンを結合しない。何となれば、植物細胞中で産生された免疫グロブリンは末端シアル酸残基を含まないからである。レクチン結合性の一般的な説明についてOsawaら，Ana.Rev.Biochem.，5 6:21-42(1987)を参照のこと。Ｅ．植物中で産生された免疫グロブリンを使用する受動免疫化前もって選択されたリガンドを結合することができる本発明の生物活性糖ポリペプチド多量体を含む組成物を動物の粘膜表面と接触させることによる前もって選択されたリガンドに対し動物を受動免疫する方法が本発明により意図されている。前もって選択された抗原を結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体、例えば、免疫グロブリン分子は植物細胞中で有効かつ経済的に産生し得る。これらの免疫グロブリン分子はシアル酸を含まず、しかもコアグリコシル化部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含む。好ましい実施態様において、免疫グロブリン分子はIgA、IgM、分泌IgM分泌IgAである。分泌免疫グロブリン、例えば、分泌IgM及び分泌IgAはタンパク質分解及び変性に耐性であり、それ故、苛酷な環境中の使用に望ましい。意図された苛酷な環境として、酸性環境、プロテアーゼを含む環境、高温環境、及びその他の苛酷な環境が挙げられる。例えば、動物の胃腸道は、プロテアーゼ及び酸の両方が存在する苛酷な環境である。Kobayishiら，Immunochemistry，10:73(1973)を参照のこと。動物の受動免疫化は、糖ポリペプチド多量体を動物の粘膜表面と接触させることにより生じられる。動物は肺、消化器官、鼻咽頭腔、尿生殖器系等を含む種々の粘膜表面を含む。典型的には、これらの粘膜表面は唾液、涙液、鼻液、気管液、腸液、胆汁、頸部液等を含む種々の分泌を生じる細胞を含む。好ましい実施態様において、免疫グロブリン分子の如き糖ポリペプチド多量体は前もって選択された抗原に免疫特異性である。典型的には、この抗原は粘膜表面と関連する疾患、例えば、壊死性全腸炎、下痢疾患、及び腸中の発癌物質吸収により生じる癌を生じる病原体に存在する。例えば、McNabb及びTomasi，Ann.Re v.Microbiol.，35:477(1981)及びLawrenceら，Science，243:1462（1989）を参照のこと。粘膜表面と関連する疾患を生じる典型的な病原体として、バクテリア病原体及びウイルス病原体の両方、例えば、E.coli、S.チフィムリウム、V.コレラ、及びS.ムタンスが挙げられる。糖ポリペプチド多量体はこれらの病原体に結合することができ、それらが粘膜関連疾患又は粘膜侵入疾患を生じることから防止することができる。好ましい実施態様において、動物粘膜表面と接触させられる組成物は植物物質と前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体とを含む。存在する植物物質は植物細胞壁、植物オルガネラ、植物細胞質、糖ポリペプチド多量体を含む無傷植物細胞、生存植物等であってもよい。この植物細胞物質は約10,000gの植物物質対約100ナノグラムの糖ポリペプチド多量体から存在する糖ポリペプチド多量体夫々10gに対し約100ナノグラムの植物物質までの比で存在する。更に好ましい実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々１mgに対し約10,000gの植物物質から存在する糖ポリペプチド多量体夫々１gに対し存在する100ナノグラムの植物物質までの比で存在する。その他の好ましい実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々１mgに対し約10,000gの植物物質から存在する糖ポリペプチド多量体夫々5 00mgに対し約１mgの存在する植物物質の比で存在する。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体を含む組成物は治療組成物である。活性成分としてポリペプチド又はタンパク質を含む治療組成物の調製は当業界で良く理解されている。治療組成物は液体溶液又は懸濁液であってもよく、又消化前に液体中の溶解もしくは懸濁に適した固体形態が調製し得る。又、治療薬は乳化されてもよい。活性治療成分は典型的には医薬上許され、かつ活性成分と適合性である無機キャリヤー及び／又は有機キャリヤーと混合される。キャリヤーは典型的には治療組成物に添加されて組成物に好適なコンシステンシー及び形態を与える多少不活性な物質を含む生理的に許される賦形剤である。好適なキャリヤーは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール等及びこれらの組み合わせである。加えて、所望により、組成物は少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤及び活性成分の有効性を増進するpH緩衝剤を含むことができる。栄養価を有するキャリヤーを含む治療組成物が又意図されている。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体を含む組成物は病原体抗原に免疫特異性である免疫グロブリン分子を含む。病原体は別の生物に疾患を生じるあらゆる生物である。粘膜病原体抗原に免疫特異性である免疫グロブリンが特に好ましい。粘膜病原体抗原は粘膜組織を通って生物に侵入し、又は粘膜関連疾患を生じる病原体に存在する。粘膜病原体として、肺病原体、鼻病原体、腸病原体、歯病原体等が挙げられる。粘膜病原体を含む病原体の一般的な説明について、Davisら，Microbiology，第３編，Harper and Row，Hagerstown，MD( 1980)を参照のこと。病原体に免疫特異性の抗体は、通常のモノクローナル抗体産生技術を使用して産生し得る。Antibodies:A Laboratory Manual，Harlowら編集，Cold Spring Ha rbor，NY（1988）を参照のこと。次いでＬ鎖可変領域及びＨ鎖可変領域をコードする遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応及び適当に選ばれたプライマーを使用して単離し得る。Orlandiら，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86:3833(1989)及びHuseら，Science 246:1275(1989)を参照のこと。次いで可変領域が植物発現ベクター、例えば、Hiattら，Nature，342:76-78（1989）により記載された発現ベクターに挿入される。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体は腸病原体抗原に免疫特異性の免疫グロブリンである。胃腸道に疾患を生じる腸病原体、例えば、バクテリア、ウイルス、及び寄生虫、例えば、E.coli、サルモネラ、ビブリオ・コレラ、サルモネラ・チフィムリウム、及びストレプトコッカス・ムタンスに免疫特異性の免疫グロブリンが特に好ましい。又、ジフテリア毒素に免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマATCC No.HB 8329により産生された抗体、シュードモナス・アエルギノーザ・エクソトキシンＡに免疫特異性の抗体、例えば、ハイブリドーマD253-15-6(ATCC No.H 8789)により産生された抗体、リシンＡ又はＢ鎖に免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマTFT A1 （ATCC No．CRL 1771）又はTFTB1（ATCC No.1759）により産生された免疫グロブリン、シストゾーマ・マンゾニ糖タンパク質に免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ130C/2B/8（ATCC No．8088）により産生された抗体、シゲラ・シガ毒素及びシゲラ様毒素に免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ13C4（ATCC No.1794）により産生された抗体、破傷風トキソイドに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ9F12(ATCC No.HB8177)及びハイブリドーマSA13(ATCC No．HB8501)により産生された免疫グロブリン、トリチネラ・スピラリス、例えば、ハイブリドーマC₂C₅C₁₂（ATCC No．HB8678）に免疫特異性の免疫グロブリン、デングウイルス又は複合体に免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、D3-2H2-9-21(ATCC No．HB114)、ハイブリドーマ15F3-1(ATCC No ．HB47)、ハイブリドーマ3H5-1(ATCC No．HB46)、ハイブリドーマ5D4-11(ATCC N o．HB49)、ハイブリドーマ1H10-6（ATCC No．HB48）により産生された免疫グロブリン、Ｂ型肝炎表面抗原、例えば、ハイブリドーマH25B10（ATCC No．CRL 801 7）、ハイブリドーマH21F8-1(ATCC No．CRL 8018)に免疫特異性の免疫グロブリン、単純ヘルペスウイルスに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ1D4(ATCC No．HB 8068)、ハイブリドーマ39-S（ATCC No．HB 8180）、ハイブリドーマ52-S（ATCC No．HB 8181）、ハイブリドーマ3N1（ATCC No．HB 8067）により産生された免疫グロブリン、インフルエンザウイルスに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、HK-PEG-1（ATCC No．CL 189）、ハイブリドーマM2- 1C6-4R3(ATCC No．HB64)により産生された免疫グロブリン、パラインフルエンザウイルスに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ9-3-4（ATCC No．8935）により産生された免疫グロブリン、並びにパルボウイルスに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、3C9-D11-H11（ATCC No．CRL 1745）により産生された免疫グロブリンである糖ポリペプチド多量体が本発明により意図されている。その他の好ましい実施態様において、組成物中に存在する糖ポリペプチド多量体は歯病原体抗原、例えば、ストレプトコッカス・ムタンス等に免疫特異性である免疫グロブリン分子である。ストレプトコッカス・ムタンスに免疫特異性の免疫グロブリン、例えば、ハイブリドーマ15B2(ATCC No．HB8510)により産生された免疫グロブリンが特に好ましい。本発明は脊椎動物の如き動物で受動免疫を生じることを意図している。好ましい実施態様において、受動免疫は魚、鳥、爬虫類、両生類、又は昆虫中で生じられる。その他の好ましい実施態様において、受動免疫は哺乳類、例えば、ヒト、家畜、例えば、反芻動物、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等中で生じられる。特に好ましい実施態様において、受動免疫は成体哺乳類中で生じられる。好ましい実施態様において、受動免疫は動物、例えば、衰弱し、それ故、その母からミルクを最早得ようと授乳しない哺乳類中で生じられる。受動免疫は、このような動物に前もって選択されたリガンドに免疫特異性の糖ポリペプチド多量体を含む組成物の充分な量を投与して動物中に予防濃度の糖ポリペプチド多量体を生じることにより動物中で生じられる。糖ポリペプチド多量体、例えば、免疫グロブリンの予防濃度は存在する病原体に結合し、その病原体が動物中で検出可能な疾患を生じることを阻止するのに充分な量である。予防濃度を生じるのに必要とされる糖ポリペプチド多量体を含む組成物の量は、当業界で公知であるように、動物のサイズ、存在する病原体の量、病原体に対する特別な糖ポリペプチド多量体のアフィニティー、特別な糖ポリペプチド多量体が動物中でその活性位置に送出される効率等により変化するであろう。又、本発明は動物にグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む多量体の予防濃度を動物中で確立するのに充分な量の病原体を結合することができる封入された生物活性糖ポリペプチド多量体（その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない）を投与することにより病原体に対する受動免疫を動物に与える方法を意図している。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体は保護被覆物中に封入される。封入材料は膜、ゲル、ポリマー等であってもよい。封入材料はそれが含む物質を保護し、封入装置から出入りする物質の流れを調節するように機能する。好ましい実施態様において、糖ポリペプチド多量体は植物細胞壁、植物細胞、ミセル、腸皮等中に封入される。好ましい実施態様において、糖ポリペプチド多量体、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、組換えヒトインスリン、組換えαインターフェロン及び成長ホルモンが種々のアプローチを使用して成功裏に投与され、頬、鼻、及び直腸の粘膜中で治療有効である。Eppsteinら，Alternative Delivery Systems for Peptides and Proteins as Drugs，CRC Critical.Rev.in Therapeutic Drug Ca rrier Systems，5:99-139（1988）。好ましい実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体が溶液中の鼻内製剤により投与される。製剤は三つの方法：カテーテルによる単一投薬、計量投薬ポンプ（又、ネブライザーと称される）による多投薬、及び計量投薬加圧エアゾールの使用による多投薬の一つにより投与される。所望により、鼻粘膜によるペプチド又はタンパク質の吸収は、ノニオン性ポリオキシエチレンエーテル、胆汁塩、例えば、グリココール酸ナトリウム(SGC)及びデオキシコール酸塩(DOC)、並びにフシジン酸の誘導体、例えば、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（STDH F）を含む吸収増進剤を添加することにより促進し得る。計量投薬噴霧ポンプを使用して噴霧として投与される容積当たり0.9重量％の塩化ナトリウム及び１％のDOC、0.5U/kgのインスリンを含む鼻インスリン製剤は血清インスリンの迅速な上昇をもたらした。Mosesら，Diabetes 32:1040(1983) 。生物活性糖ポリペプチド多量体の投薬量は鼻スプレー製剤では0.15mg/ kgから600mg/kgまでの範囲であってもよく、好ましい投薬量は0.15mg/mlから200 mg/kgまでの範囲であり、最も好ましい投薬量は1mg/kgから200mg/kgまでの範囲である。好ましい実施態様において、多量体は粘膜を横切らず、こうして吸収増進剤が必要とされない。幾つかの投薬形態が生物活性糖ポリペプチド多量体の直腸送出に利用できる。これらとして、座薬（エマルション型及び懸濁液型）、直腸ゼラチンカプセル（溶液及び懸濁液）、及び浣腸（マクロ：100ミリリットル( ml)以上、そしてミクロ：１〜20ml）が挙げられる。24〜40時間の期間にわたって２mlの容積を送出するように設計された浸透圧ポンプが又直腸送出のために開発された。鼻製剤について記載された吸収増進剤は、直腸粘膜を横切る増大された輸送が所望される場合に製剤中に含まれる。生物活性糖ポリペプチド多量体の直腸投与に好ましい製剤は許される投薬形態のいずれか一つに上記された好ましい範囲からなる。生物活性糖ポリペプチド多量体は体腔の粘膜への適用により投与し得るリポソーム（ミセル）製剤中で投与し得る。Julianoら，J.Pharmacol.Exp.Ther.，214: 381(1980)。リポソームは直径約20〜50ナノメートルの最小の単層小胞から直径数十ミクロンの多層小胞までの範囲の幾つかの異なる物理構造を生じる当業者に公知の種々の技術により調製される。Gregoriadias編集，Liposome Technology ，1:CRC Press（1984）。鼻製剤についてリストされた好ましい投薬量の生物活性糖ポリペプチド多量体は多層小胞の凍結乾燥粉末とともに水和されて糖ポリペプチドを含むリポソームを形成する。更に好ましい実施態様において、上記の好ましい投薬量の生物活性糖ポリペプチド多量体はアゾ芳香族架橋ポリマーで被覆されるゼラチンカプセル中で経口投与される。アゾポリマー被覆糖ポリペプチドは胃及び小腸中で消化から保護される。アゾポリマー被覆糖ポリペプチドが大腸に達する時、自生ミクロフローラがアゾ結合を減少し、架橋を破壊し、ポリマーフィルムを分解する。これはその後の局所作用又は吸収のために結腸の管腔への糖ポリペプチド多量体の放出をもたらす。病原体特異性糖ポリペプチド多量体は動物中の特別な位置で予防濃度の多量体を確立するのに充分な量で投与されることが好ましい。特別な予防濃度を生じるために投与される多量体の量は、当業界で公知であるように、存在する病原体の量、免疫されることが所望される動物中の正確な位置、病原体に対する多量体のアフィニティー、変性又は分解に対する多量体の耐性、病原体不活化の様式、投薬製剤等により変化するであろう。多量体は毎日１〜４回の別々の投薬で約0.1mg〜2,000mgの多量体を含む植物物質10g〜100,000g中で投与される。この量の多量体は約0.01mg/体重1kg〜約2,000 mg/体重1kgの予防濃度を生じる。好ましい実施態様において、多量体の予防濃度は約0.01mg/体重1kg〜約600mg/体重1kgである。その他の好ましい実施態様において、予防濃度は約0.01mg/体重1kg〜約200mg/体重1kgである。本発明は前もって選択されたリガンドに対する受動免疫を動物に与える方法を意図しており、その方法は動物に予防濃度の多量体を動物内で確立するのに充分な量の前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を投与することを特徴とする。投与される多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、その結果、多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。病原体に対する受動免疫を動物に与える方法が特に好ましく、その方法は動物に予防濃度の多量体を動物内で確立するのに充分な量の病原体を結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を投与することを特徴とする。投与される多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、その結果、多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。好ましい実施態様において、多量体は多量体と栄養価を有する物質により構成された組成物として投与される。栄養価を有する物質は動物がカロリーを誘導することができる物質又は化合物である。栄養価を有する典型的な物質として、タンパク質、炭水化物、脂質、脂肪、糖タンパク質、グリコーゲン等が挙げられる。植物物質又は動物物質である栄養価を有する物質が特に好ましい。その他の好ましい実施態様において、多量体は多量体と生理不活性物質により構成された組成物として投与される。生理不活性物質として、水の如き溶液及びキャリヤー化合物が挙げられる。その他の好ましい実施態様において、前もって選択されたリガンドに対し動物を受動免疫する方法は動物の胃腸道に植物細胞壁と前もって選択された抗原を結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体とを含む組成物を導入することを含み、前記糖ポリペプチド多量体は少なくとも２種のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドの一種が(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、前記多量体がシアル酸残基を含まない。その他の好ましい実施態様は (1) 動物の胃腸道に前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を含む植物細胞を含む組成物を導入し（前記多量体は少なくとも２種のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドの一種が(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その結果、前記多量体がシアル酸残基を含まない）、そして (2) 胃腸道中の植物細胞を分断し、それにより生物活性糖ポリペプチド多量体を胃腸道に放出し、動物を受動免疫することを特徴とする前もって選択された抗原に対し動物を受動免疫する方法を意図している。Ｄ．糖ポリペプチド多量体を含む組成物又、本発明は少なくとも２種のポリペプチドを含む封入された糖ポリペプチド多量体を含む生物活性組成物を意図しており、前記ポリペプチドの一種が(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その結果、多量体がシアル酸残基を含まない。好ましい実施態様において、糖ポリペプチド多量体は植物細胞、植物細胞壁、腸皮、被覆物等中に封入される。約10,000gの植物物質対夫々100ngの存在する糖ポリペプチド多量体の比〜組成物中に存在する糖ポリペプチド多量体夫々10gに対し約100ngの植物物質の比を含む組成物が特に好ましい。更に好ましい実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々１mgに対し約10,000gの植物物質の比〜存在する糖ポリペプチド多量体夫々1gに対し約100ngの存在する植物物質の比で存在する。別の好ましい実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々1mgに対し約10,000gの植物物質から組成物中に存在する糖ポリペプチド多量体夫々500mgに対し約１mgの存在する植物物質までの比で存在する。その他の実施態様において、組成物は葉緑素、相乗的化合物、薬物、医療用植物に由来する化合物、及び種々の医薬品等を更に含む。医療用植物からの化合物は、糖ポリペプチド多量体を医療用植物中で発現し、次いで植物を回収することにより組成物に添加されてもよい。又、本発明は (a) 植物種の第一員のゲノムに糖ポリペプチド多量体の構成部分であるＮ結合型グリコシル化シグナルを有する自己発生的に結合するモノマーポリペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を導入して第一形質転換体を生産し、 (b) 同植物種の第二員のゲノムに糖ポリペプチド多量体の構成部分である別の自己発生的に結合するモノマーポリペプチドをコードする別の哺乳類遺伝子を導入して第二形質転換体を生産し、 (c) 前記第一形質転換体及び第二形質転換体から子孫集団を発生し、そして (d) 前記子孫集団から糖ポリペプチド多量体を生産するトランスジェニック植物種を単離することを特徴とする方法に従って生産された糖ポリペプチド多量体を意図している。Ｇ．生物学上重要なタンパク質の発生比較的高い収率の生物活性又は生理活性多量体タンパク質、例えば、アブザイム、免疫グロブリン、酵素等の生産は、夫々が自己発生的に結合するポリペプチドをコードする核ゲノム内に組込まれた複数の哺乳類遺伝子並びに自己発生的に結合するポリペプチドそれ自体を含む植物細胞により構成されたトランスジェニック有性生殖可能植物で得られる。これらのポリペプチドは生物活性ポリペプチド多量体、例えば、ホモ多量体又はヘテロ多量体として植物細胞中に存在する。これらのトランスジェニック植物は哺乳類遺伝子の存在が実質的に全てのそれらの細胞である以外は形態学上通常である。夫々の遺伝子産物が植物細胞の実質的に全部又は一部中に存在することができ、即ち、産物が細胞型、組織又は器官に局在化し得る。前記トランスジェニック植物は植物種の第一員の核ゲノムに多量体タンパク質の構成部分である自己発生的に結合できるモノマーポリペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を導入して生存第一形質転換体を生産することにより生産される。同様に、又、多量体タンパク質の構成部分である別の自己発生的に結合できるモノマーポリペプチドをコードする別の哺乳類遺伝子が同植物種の第二員の核ゲノムに導入されて生存第二形質転換体を生産する。次いで、こうして得られた第一形質転換体及び第二形質転換体が有性交配され、培養されて子孫集団を発生し、これから多量体タンパク質を生産するトランスジェニック植物が単離される。本発明を具体化するトランスジェニック植物は所望の多量体タンパク質を経済的かつ比較的高い収率で生産するのに有益であるだけでなく、流体、即ち、ガス又は液体から前もって選択されたリガンド、例えば、金属イオンを分離し、かつ／又は濃縮するための手段として有益である。トランスジェニック植物はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む糖ポリペプチド多量体を生産し、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。前もって選択された病原体に対する受動免疫は、動物に予防濃度の多量体を動物中に確立するのに充分な量の病原体抗原を結合することができる封入された生物活性糖ポリペプチド多量体を投与することにより動物中で得られる。投与される糖ポリペプチド多量体は検出可能なシアル酸残基を含まず、グリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む。又、本発明はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む糖ポリペプチド多量体を含む生物活性組成物を意図しており、多量体は検出可能なシアル酸残基を含まず、植物細胞の如きタンパク質被覆物中に封入される。こうして、本発明の一実施態様において、生物活性糖ポリペプチド多量体が開示され、その多量体は少なくとも２種のポリペプチドを含み、そのポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、多量体がシアル酸残基を含まない。一つの変化において、アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。別の変化において、アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。更に別の実施態様において、アミノ酸残基配列は触媒部位又は酵素部位を形成する。別の局面において、上記生物活性糖ポリペプチドが意図されており、ポリペプチドに結合された別のアミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドを更に含む。一つの別の実施態様において、本発明の生物活性糖ポリペプチド多量体は少なくとも一つの触媒部位を含む。別の実施態様において、それは少なくとも一つの酵素部位を含む。又、本発明は異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドに結合された、グリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含む生物活性糖ポリペプチド多量体を意図しており、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。一つの変化において、免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。別の変化において、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。本発明の別の局面において、免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含み、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。更に別の局面において、免疫グロブリンアミノ酸残基配列は触媒部位の第一部分を形成し、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は触媒部位の第二部分を形成し、それにより第一部分及び第二部分が一緒に会合されて触媒部位の更に大きい部分を形成する。その他の変化において、免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は触媒部位の部分を形成する免疫グロブリンＨ鎖可変領域のアミノ酸残基配列を含み、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は触媒部位の部分を形成する免疫グロブリンＬ鎖可変領域のアミノ酸残基配列を含む。又、本発明は上記生物活性複合体糖ポリペプチド多量体を意図しており、免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が触媒部位の第一部分を形成する免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含み、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が触媒部位の第二部分を形成する免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含み、それにより触媒部位の第一部分及び第二部分が一緒に会合されて触媒部位の更に大きい部分を形成する。又、本発明は(i)Ｎ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝とともにグリコシル化コア部分により形成されたオリゴ糖及び免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポリペプチド（そのポリペプチドはマウス免疫グロブリン結合レクチンに結合しない）、及び(ii)異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチド（その別のポリペプチドはポリペプチドに結合される）を含む生物活性糖ポリペプチド多量体を開示する。一つの変化において、免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＨ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。別の変化において、異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は免疫グロブリンＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列を含む。又、前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を含む予防量の組成物を動物の粘膜表面と接触させることを含む前もって選択されたリガンドに対しヒト又は動物を受動免疫する方法が開示され、その多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。一つの方法において、予防濃度を被験者中に確立するのに充分な量の前もって選択されたリガンドを結合することができる封入された生物活性糖ポリペプチド多量体が被験者に投与され、その多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。更に別の変化において、予防濃度を被験者中に確立するのに充分な量の病原体抗原を結合することができる封入された生物活性糖ポリペプチド多量体が被験者に投与され、その多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。種々の別の実施態様において、多量体は植物細胞壁中に封入される。多量体が植物細胞に封入され、植物細胞を含む組成物が投与され、又は多量体が腸皮に封入される。その他の方法として、前もって選択されたリガンドに対する受動免疫を被験者（ヒト又は動物）に与える方法が挙げられ、その方法は被験者に予防濃度を被験者中に確立するのに充分な量の前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を投与することを含み、その多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。別法は被験者に予防濃度を被験者中に確立するのに充分な量の病原体を結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を投与することを含み、その多量体はグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝及び免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、その多量体は検出可能なシアル酸残基を含まない。一つの変化において、多量体は多量体と栄養価を有する物質により構成された組成物として投与される。例えば、栄養価を有する物質は動物又は植物物質である。別の変化において、多量体は多量体と生理不活性物質により構成された組成物として投与される。それは又植物物質を含んでもよい。前記方法の種々の開示された実施態様において、生物活性糖ポリペプチドはIg A分子であり、又はそれは分泌IgAを含んでもよい。一つの変化において、生物活性糖ポリペプチドはIgA定常部アミノ酸残基配列を含む。本明細書に記載された前もって選択されたリガンドは粘膜病原体抗原又は特定の腸病原体抗原を含んでもよい。例えば、病原体抗原はE.coli抗原、ビブリオ・コレラ抗原、サルモネラ抗原、又は歯病原体抗原であってもよい。一つの例示の歯病原体抗原はストレプトコッカス・ムタンス抗原である。前もって選択されたリガンドに対し被験者を受動免疫する別の開示された方法は被験者の胃腸道に植物細胞壁と前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体とを含む組成物を導入することを含み、その多量体は少なくとも２種のポリペプチドを含み、そのポリペプチドの一種が(a )免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、（b）コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その多量体はシアル酸残基を含まない。前もって選択されたリガンドに対し動物を受動免疫する別法は(a)動物の胃腸道に前もって選択されたリガンドを結合することができる生物活性糖ポリペプチド多量体を含む植物細胞を含む組成物を導入し（その多量体は少なくとも２種のポリペプチドを含み、そのポリペプチドの一種が(i)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、(ii)コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その多量体はシアル酸残基を含まない）、そして(b)植物細胞を胃腸道中で分断し、それにより生物活性糖ポリペプチド多量体を胃腸道に放出し、被験者を受動免疫することを特徴とする。又、本発明は少なくとも２種のポリペプチドを含む封入された糖ポリペプチド多量体を含む生物活性組成物を開示し、そのポリペプチドの一種は(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と、(b)コア部分及びＮ−アセチルグルコサミンを含む外部分枝を含むオリゴ糖とを有し、その多量体はシアル酸残基を含まない。別の実施態様において、被覆物は植物細胞である。別の実施態様において、被覆物は腸皮である。又、本発明は(a)植物種の第一員のゲノムに糖ポリペプチド多量体の構成部分であるＮ結合型グリコシル化シグナルを有する自己発生的に結合するモノマーポリペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を導入して第一形質転換体を生産し、（b）同植物種の第二員のゲノムに糖ポリペプチド多量体の構成部分である別の自己発生的に結合するモノマーポリペプチドをコードする別の哺乳類遺伝子を導入して第二形質転換体を生産し、（c）第一形質転換体及び第二形質転換体から子孫集団を発生し、そして(d)その子孫集団から糖ポリペプチド多量体を生産するトランスジェニック植物種を単離することを含む方法に従って生産された糖ポリペプチド多量体を開示する。一つの別の実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々１mgに対し１mgより多い植物物質の比で存在する。別の実施態様において、植物物質は存在する糖ポリペプチド多量体夫々1mgに対し１m gより少ない植物物質の比で存在する。実施例以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１免疫グロブリンＨ鎖コーディング遺伝子及び免疫グロブリンＬ鎖コーディング遺伝子のハイブリドーマ細胞系６Ｄ４からの分離 TramontanoらによってScience,234:1566-1570(1986)に記載されている６Ｄ４抗体をスクリーニングするハイブリドーマ細胞を、10％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中で対数期(log phase)に増殖した。全てのＲＮＡは、２リットルの対数期(log phase)の６Ｄ４ハイブリドーマ細胞から、UllrichらによってSc ience ,196:1313(1977)に記載されている方法で調製した。すなわち、６Ｄ４細胞を遠心分離で収集し、Polytronホモジナイザーを用いて、５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ7.0、0.1Ｍ2-メルカプトエタノール(２Ｍｅ)及び0.5％ナトリウムラウリルサルコシネートを含有する４Ｍグアニジウムチオシアネート70ml中、室温で 20秒間ホモジネートした。そのホモジネートを、５分間8,000ｘｇで遠心分離し、不溶デブリを除去した。約28mlのホモジネートを、Beckman SW70 Tiローター内で、４ｍＭエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)ｐＨ7.5中で、5.7ＭＣｓＣｌ(Bethesda Research Labo ratories,Gaithersburg,MD)の10mlパッド上に重層した。その溶液を15℃で少なくとも５時間、50,000回転／分(rpm)で遠心分離した。その上清を注意深く吸引し、管の壁を乾燥して残留ホモジネートを除去した。ＲＮＡペレットを、10ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ7.4、２ｍＭＥＤＴＡ及び0.5％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)含有溶液に溶解した。この溶液をフェノール溶液で２回抽出した。得られた水相を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(容量で25:25:1) 含有溶液で抽出した。得られた水相から、1/10容積の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２容積のエタノールを添加することによってＲＮＡを回収した。この溶液を-20℃ で12〜18時間保持し、ＲＮＡを沈殿させた。沈殿ＲＮＡを含む溶液を20分間、10 ,000ｘｇ、4℃で遠心分離してペレットを含むＲＮＡを生成した。そのＲＮＡペレットに70％エタノール5mlを添加してＲＮＡペレットから過剰の塩を除去し、溶液を10分間、10,000xｇ、４℃で遠心分離した。最後のＲＮＡペレットを、0.5ml のＤＥＰＣ-Ｈ₂Ｏに溶解し、260nmでのＲＮＡ吸光度を測定するための小アリコートを取り除いて-70℃で保存した。長いポリＡ路を含む配列用の濃厚メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)は、Molecu lar Cloning:A Laboratory Manual ,Maniatisら,eds.,Cold Spring Harbor Labor atory,New York(1982)に記載された方法を使用して全細胞ＲＮＡから調製した。すなわち、上記で調製した全ＲＮＡを１mlのＤＥＰＣ-Ｈ₂Ｏ中で再懸濁し、65℃ で５分間保持した。100ｍＭトリス-Ｃｌ、１Ｍ塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)、2.0 ｍＭＥＤＴＡｐＨ7.5、及び1.0％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)から成る２ｘ高塩充填バッファー１mlを再縣濁ＲＮＡに添加し、その混合物を室温まで冷却した。そして、その混合物を、0.1Ｍ水酸化ナトリウム及び５ｍＭＥＤＴＡ含有溶液でオリゴ-ｄＴを洗浄して予め調製したオリゴ-ｄＴ(Collaborative Researc hタイプ２又はタイプ３)カラムに注ぎ、カラムをＤＥＰＣ-Ｈ₂Ｏで平衡化した。その溶出液を無菌ポリプロピレン管に収集し、65℃で５分間加熱後同じカラムに再び注いだ。そして、オリゴｄＴカラムを50ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.5、500ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ7.5及び0.5％ＳＤＳから成る高塩充填バッファー20mlで洗浄した。そのオリゴｄＴカラムから、10ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.5、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ7.5及び0.5％ＳＤＳから成るバッファー１mlでメッセンジャーＲＮＡを溶出させた。そのメッセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿で濃縮してＤＥＰＣ-Ｈ₂Ｏ中で再縣濁した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を上記で調製したｍＲＮＡから調製した。最初の鎖合成、２番目の鎖合成、及び補充反応は、WatosonらによってDNA Cloning Volum e I ,D.M.Glover,ed.，( )に記載された方法に従って行った。すなわち、10μｇのｍＲＮＡ含有溶液を65℃で５分間保持し、速やかに氷上で冷却した。この溶液に、50ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.3、８ｍＭＭｇＣｌ₂、50ｍＭＫＣｌ、２μｇオリゴ(ｄＴ)、１ｍＭｄＡＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、10ｍＭＤＴＴ、60単位のＲＮアジン(Promega Corporation,Madison, WI)、４μｇアクチノマイシン、135単位のＡＭＶ逆転写酵素及び10μＣｉα³²Ｐ -ｄＣＴＰ含有の反応混合物100μｌを混合して最初のｃＤＮＡ鎖を合成した。この反応混合物を44℃で１時間保持した。さらに60単位のＲＮアジン及び80単位の逆転写酵素を添加し、反応混合物を44℃で30分間保持した。50ｍＭＥＤＴＡ及び10％ＳＤＳ含有溶液0.005mlを加えて最初の鎖ｃＤＮＡ合成を終了させた。核酸をフェノール抽出で精製し、エタノール沈殿で濃縮した。２番目の鎖ｃＤＮＡは、上記で生成した最初の鎖ｃＤＮＡ生成物のすべてを、 20ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.5、100ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、10ｍＭ（NH₂ ）₂SO₄、10ｍＭＤＴＴ、0.05mg/mlウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、50μＭのｄＧＴＰ、50μＭｄＡＴＰ、50μＭｄＴＴＰ、50μＭｄＣＴＰ、150μＭベータ- ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(β-ＮＡＤ⁺)(Sigma Chemical Company, St.Louis,MO)、15μCi/ul［α-³²Ｐ］ｄＣＴＰ、30単位のE.coli ＤＮＡポリメラーゼ、2.5単位のＲＮアーゼＨ、及び４単位のE.coli ＤＮＡリガーゼ含有溶液 100μｌに加えて合成した。この溶液を１時間14℃で保持し、さらに１時間25℃ で保持した。２番目の鎖ｃＤＮＡ合成反応は、５μｌの0.05ＭＥＤＴＡｐＨ8. 0、５μｌの10％ＳＤＳを加えて終了させた。この反応混合物から、フェノール抽出次いでエタノール沈殿によって、核酸を精製した。上記で生成した２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入するために、以下の補充反応で２本鎖ｃＤＮＡの末端を平滑末端に転換して調製した。上記で生成した２本鎖ｃＤＮＡの２分の１を、33.4ｍＭトリス-アセテートｐＨ7.8、66.6 ｍＭ酢酸カリウム、10ｍＭ酢酸マグネシウム、0.5ｍＭＤＴＴ、87.5μｇ/mlＢＳＡ、310μＭｄＧＴＰ、310μＭｄＡＴＰ、310μＭｄＴＴＰ、310μＭｄＣＴＰ及び８単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ含有溶液に添加した。この溶液を37 ℃で30分間保持し、５μｌの0.05ＭＥＤＴＡを添加して反応を終了させた。生成した平滑末端のｃＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈殿によって精製した。 EcoRIアダプターをアニールし、上記で生成した平滑末端のｃＤＮＡに連結した。すなわち、１μｌのポリヌクレオチド及び20単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを、70ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.6、10ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤＴＴ、10 ｍＭ２Ｍｅ及び500μｇ/mlのＢＳＡ含有溶液に加えることによって、ポリヌクレオチドＮ１(表１)をキナーゼ化した。その溶液を37℃で30分間保持し、65℃で 10分間保持して反応を終了させた。上記キナーゼ反応に、20ngのポリヌクレオチドＮ２(表２)を、20ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.4、２ｍＭＭｇＣｌ₂及び15ｍＭＮａＣｌ含有溶液1/10容量と共に添加した。この溶液を70℃に５分間加熱し、500 μｌのビーカーの水で1.5時間かけて約25℃の室温まで冷却した。この間に、溶液中の２ポリヌクレオチドがアニールして２本鎖EcoRIアダプターを形成した。表１ EcoRI アダプターポリヌクレオチドこの２本鎖EcoRIアダプターを、５μｌのアニールアダプターを50μｌトリス- ＣｌｐＨ7.5、７μｌＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ及び10単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ含有溶液に添加することによって、上記で生成した平滑末端のｃＤＮＡに共有結合させた。この溶液を37℃で30分間保持し、それから溶液を 72℃で15分間保持することでＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。得られたｃＤＮＡの５'末端を、５μｌの上記反応生成物、10ｍＭＡＴＰ含有溶液４μｌ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによってリン酸化した。この溶液を37℃で30分間保持し、それから溶液を65℃で10分間保持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。上記で調製したｃＤＮＡを、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Mania tisら,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1982)に記載された方法と同様の方法で、サイズ-分画して長いｃＤＮＡ挿入断片を得た。すなわち、上記で調製した反応混合物を、20ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0、1.2ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び0.1％sarkosylから成る同容量の２ｘＣＬ４Ｂカラムバッファーに加えた。この溶液をプレ膨潤したセファロースＣＬ-４Ｂ(Pharmacia LKB Bi otechnology Inc.,Piscataway,NJ)を使用して予め調製した５mlのＣＬ-４Ｂカラム上に充填した。その試料をカラムに入れ、そしてカラムを10ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0、600ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び0.1％sarkosylから成る１ｘカラムバッファーで満たした。そのカラムを重力で流動させ、約200μｌのフラクションを手動で収集した。各フラクションに存在する２本鎖ｃＤＮＡのサイズは、0.8％アザロースゲルを通してゲル電気泳動で決定した。アガロースゲル電気泳動によって決定した高分子量のｃＤＮＡを含むフラクションをプールし、ブタノール抽出で濃縮し、そしてエタノール沈殿してサイズ-分画ｃＤＮＡを生成した。上記で調製されたサイズ-分画ｃＤＮＡを、予め制限エンドヌクレアーゼEcoRI によって消化されたラムダZap(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)に直接連結した。その連結反応混合物を、Stratagene Cloning Systemsから入手可能なGigapackIIゴールドパッケージング抽出液を使用して製造業者の説明書に従い詰め込み、ＢＢ４細胞(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)上にプレートしてプラークを生成した。そのプラークをヒト抗体の定常部遺伝子を含む放射能標識プローブでスクリーニングした。すなわち、RabbittsらによってCold Spring Harbor Quantitative Biology 45:867-878(1980)に既に記載されているヒトＩｇＧ、及びRabbittsらによってCold Spring Harbor Quantitative Biology 45:867-878(1980)に既に記載されているヒトカッパーＬ鎖プローブを、Molecular Cloning:A Laboratory Man ual,Maniatisら,eds.,Cold Spring Harbor,New York(1982)に記載された標準的な手順によって、ニック(nick)翻訳した。この手順で調製し、１×10⁸cpm/μｇ以上の比活性を有するプローブを、当業者に周知な方法によって、上記で調製されたライブラリーからのプラークとハイブリダイズさせた。すなわち、上記で調製されたｃＤＮＡライブラリーのタイターを、100ｍＭＮａＣｌ、50ｍＭトリス -ＣｌｐＨ7.5及び10ｍＭ硫酸マグネシウム含有バッファー中に、そのライブラリーの一連の希釈溶液を作成することによって決定した。各希釈溶液の10μｌを指数関数的に増殖するE.coli細胞の200μｌに加え、37℃で15分間保持してファージを細菌細胞に吸収させた。５g/l ＮａＣｌ、２g/lの硫酸マグネシウム、５g/l の酵母抽出物、10g/lのＮＺアミン(カゼイン加水分解産物)及び0.7％溶融アガロースから成る３mlの上面寒天を調製し、使用するまで50℃のウォーターバスに入れておいた。ファージ、細菌及び上面寒天を混合し、そして、予め暖めておいた細菌寒天プレート(５g/l ＮａＣｌ、２g/l硫酸マグネシウム、５g/l酵母抽出物、1 0g/l ＮＺアミン及び15g/l Difco寒天)の表面に一様に分布させた。そのプレートを、37℃で12〜24時間保持し、その間にラムダプラークが細菌lawn上に発生した。そのラムダプラークを計数して、元のライブラリー中の１ミリリットルあたりのプラーク形成単位の総数を決定した。そして、タイターｃＤＮＡライブラリーをプレートして、ライブラリーからレプリカフィルターを作成した。そのレプリカフィルターを使用して、免疫グロブリンＨ鎖又はＬ鎖のどちらかをコードするcDNAsを含む個々のクローンを分離した。すなわち、150ミリリットルプレート毎に20,000のプラークが得られるような容量のタイターｃＤＮＡライブラリーを、600μｌの指数関数的に増殖するE.c oli細胞に加え、37℃で15分間保持してファージを細菌細胞に吸収させた。そして、7.5mlの上面寒天を、細菌細胞とファージを含む溶液に加えた。ファージが吸収された細菌細胞を上面寒天と混合し、その全混合物を予め暖められた細菌寒天プレートの表面に一様に分布させた。この全プロセスをプレート数の分繰り返し、少なくともライブラリーサイズと等しい総数のプラークを生成した。そして、これらのプレートを37℃で16時間保持し、その間に細菌lawn上にプラークが現れた。そして、プレートをニトロセルロースフィルターで覆い、その細菌プレート上の各フィルターの定位置をインクドットでマークした。フィルターを、１〜５分間細胞プレート上に保持して先が平坦なピンセットで取り出し、1.5ＭＮａＣｌ及び0.5ＭＮａＯＨから成る変性溶液に浸漬されたスポンジパッド上に、約１分間押しつけて置いた。そして、そのフィルターを、1.5ＭＮａＣｌ及び0.5 Ｍトリス-ＣｌｐＨ8.0から成る中性溶液を含むスポンジパッド上に移して押しつけた。その後、そのフィルターを、0.36ＭＮａＣｌ、20ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ7.4、及び２ｍＭＥＤＴＡ含有溶液中で洗浄し、Whatman３ＭＭ紙上に置いて乾燥させた。このプロセスを各細菌プレートについて繰り返してハイブリッド形成用の２番目のレプリカフィルターを生成した。すべてのフィルターを乾燥後、シートをWhatman３ＭＭ紙の間にはさみ、フィルターをバキュームオーブン内で２時間80℃で焼いた。これで、フィルターが特異的プローブとハイブリッド形成される準備が整った。焼成フィルターを、0.9ＭＮａＣｌ及び0.09Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ7.0含有溶液の表面に置いて、フィルターを下部から完全に湿らせた。フィルターを同じ溶液中に５分間沈めた。50ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0、１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び0.1％ＳＤＳ含有のプレ洗浄液にフィルターを移した。そして、そのプレ洗浄液を42℃で２時間保持した。そのフィルターをプレ洗浄液から取り出し、25％ホルムアミド、1.0ＭＮａＣｌ、50％デキストラン硫酸、0.05ＭＮａＰＯ₄ ｐＨ7.7、0.005ＭＥＤＴＡ、0. 1％フィコール、0.1％ＢＳＡ、0.1％ポリ(ビニルピロリドン)、0.1％ＳＤＳ及び 100μｇ/mlの変性サーモン精子ＤＮＡを含むプレ-ハイブリッド形成溶液中に入れた。フィルターを、そのプレ-ハイブリッド形成溶液中で緩やかに混ぜながら４〜６時間42℃で保持した。そして、フィルターをプレ-ハイブリッド形成溶液から取り出し、比活性が少なくとも１×10⁸cpm/μｇである³²Ｐで標識されたプローブを２×10⁶cpm/ml含むプレ-ハイブリッド形成溶液から成るハイブリッド形成溶液に入れた。フィルターを、ハイブリッド形成溶液中で穏やかに混ぜながら 12〜24時間42℃で保持した。ハイブリッド形成完了後、ハイブリッド溶液を捨て、60℃の0.9ＭＮａＣｌ、0.09Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ7.0及び0.1％ＳＤＳを含む多量の溶液中で10分間で３〜４回洗浄した。フィルターを洗浄溶液から取り出し、室温で１枚のWhatman３ＭＭ紙上で空気乾燥した。フィルターを複数枚の３ＭＭ紙に貼り付け、プラスチックラップで包み、強化スクリーンによって-70 ℃でＸ線フィルム(KodakXR又は同等のもの)に露出を与えてオートラジオグラムを生成した。そのフィルムを製造業者の説明書に従って現像した。正のハイブリッド形成シグナルは、ニトロセルロースフィルター上の不整のインクスポットによるプラークの位置に適切に配置されていた。ハイブリッド形成したプラークを分離精製し、製造業者、Stratagene Cloning Sysytems,La Jolla,CAから提供され、ShortらによってNucleic Acids Res.,16:7 583-7600(1988)に記載された基礎的なin vivo切除の手順に従って、ラムダZAPベクターから挿入断片を切除した。このin vivo切除手順は、ラムダZAPベクターからクローン化された挿入断片をファージミド(phagemid)ベクター中に移動して操作及び配列決定を容易にしている。SangerらによってProc.Natl.Acad.Aci.USA,7 4:5463-5467(1977)に記載されているSangerジデオキシ法で、シークエナーゼＤＮＡ配列決定キット(United States Biochemical Corporation,Cleaveland,OH) を用いて、ハイブリッド形成挿入断片の配列を決定した。ｐＡＢＺ100及びｐＡＢＺ101と示される２本の全長Ｌ鎖クローンを、ＤＮＡ配列決定によって同定した。さらに、ｐＡＢＺ200と示される１本の全長Ｈ鎖クローンをも同定した。これらの全長ｃＤＮＡクローンを、Morecular Cloning:A Laboratory Manual, Maniatisら,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1982)に記載された方法と同様の方法で、mp18にサブクローニングした。すなわち、全長ｃＤＮＡクローンを含むファージミド(phagemid)を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化させ、全長ｃＤＮＡ挿入断片をゲル電気泳動で分離した。その分離した全長ｃＤＮＡ挿入断片を、既にEcoRIで消化されたＭ13 mp18に連結した。その連結反応混合物を適当な細菌宿主細胞上にプレートし、全長ｃＤＮＡ挿入断片を含むファージプラークを分離した。このクローニングステップの正当性を制限地図によって確認した。鋳型ＤＮＡ含有１本鎖ウラシルは、Muta-Gene Ｍ13 in vitro変異誘発キット( Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)によって提供される手順に従って調製した。すなわち、dut及びung変異の両方を含む細胞鎖ＣＪ236の分離コロニーを、30 μｇ/mlクロラムフェニコール含有の20mlのＬＢ培地(10g/lバクトトリプトン、５g/l酵母抽出物及び５g/l ＮａＣｌ)に混合した。この溶液を37℃で12〜16時間保持して一晩培養した。この一晩培養したものの１mlを、30μｇ/mlのクロラムフェニコール含有の２ｘＹＴ培地(16g/lバクトリプトン、10g/l酵母抽出物及び５g/l ＮａＣｌ)と250mlフラスコ中で混合した。この溶液を37℃でコンスタントに振とうしながら、約４時間或いは600ナノメーター(nm)での光学密度が0.3になるまで保持した。この光学密度は、１ミリメーター当たりほぼ１×10⁷ＣＦＵ(colony forming unit)に相当する。全長ｃＤＮＡ挿入断片含有Ｍ13ファージを0.2以下の感染多重度で加えた。この溶液を37℃で４〜６時間振とうしながら保持した。得られた培養30mlを50mlの遠心分離管に移し、17,000ｘｇ(Sorvall SS-34ローターで12,000回転／分)で15分間４℃で遠心分離した。得られた上清含有ファージ粒子を新しい遠心分離管に移し、17,000ｘｇで15分間４℃で再度遠心分離した。この２回目の上清を新しいポリアロマー遠心分離管に移し、150マイクログラムのＲＮアーゼＡをその上清に添加した。この上清を室温で30分間保持して、存在するどのＲＮＡもＲＮアーゼＡに消化させた。この上清に、3.5Ｍ酢酸アンモニウム及び20％ポリエチレングリコール8000(ＰＥＧ8000)含有溶液1/4容量を添加した。この上清を30分間氷上に放置した。この間に、上清中に存在したいずれのファージ粒子もＰＥＧ8000によって沈殿した。この溶液を17,000ｘｇで15分間４ ℃で遠心分離して沈殿ファージ粒子を収集した。得られたペレットを200μｌの高塩バッファー(300ｍＭＮａＣｌ、100ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0及び１ｍＭＥＤＴＡ)にて再縣濁した。この溶液を氷上に30分間放置し、２分間マイクロフュージ内で遠心分離していかなる不溶物質をも除去した。得られた上清を新しい管に移し、ファージ株として使用するまで保存した。鋳型ＤＮＡ含有の１本鎖ウラシルは、全200μｌファージ株を２回同量の中和フェノールで抽出して調製した。その水相をフェノールクロロホルム(25:25:1フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール)で１回再抽出し、さらに数回クロロホルムイソアミルアルコール(1:1/48クロロホルム:イソアミルアルコール) で抽出した。得られた水相に、1/10容量の7.8Ｍ酢酸アンモニウム及び2.5容量のエタノールを混合した。この溶液を-70℃で少なくとも30分間保持してＤＮＡを沈殿させた。溶液を４℃で15分間遠心分離して沈殿ＤＮＡを収集した。得られたＤＮＡペレットを90％エタノールで１回洗浄し、10ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.6及び１ＭＥＤＴＡ含有溶液20μｌ中で再縣濁させた。この溶液中に存在する鋳型ＤＮＡ含有ウラシルの量は、ゲル電気泳動で決定した。この鋳型ＤＮＡ含有ウラシルを、さらに変異誘発ステップで使用して、全長ｃＤＮＡ中に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。変異原性の全長ｃＤＮＡは、Muta-Geneキット(Bio-Rad Laboratories,Richmon d,CA)で提供される方法に従って合成した。すなわち、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように設計されたポリヌクレオチドを使用して、鋳型ＤＮＡ含有１本鎖ウラシルから変異原性鎖の合成を開始した。200ピコモル(pmoles)の選択されたポリヌクレオチドを、100ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0、10ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭＤＴＴ、0.4ｍＭＡＴＰ及び4.5単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ含有溶液と混合して、ポリヌクレオチドをリン酸化してキナーゼ反応を起こさせた。この溶液を37℃で45分間保持した。その溶液を65℃で10分間保持してキナーゼ反応を終了させた。そのキナーゼ反応したポリヌクレオチドを、10ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.6及び１ｍＭＥＤＴＡ含有溶液で６モル/μｌに希釈した。キナーゼ反応したポリヌクレオチドを、上記で調製された鋳型ＤＮＡ含有１本鎖ウラシルに、200ngの鋳型ＤＮＡ含有ウラシル、３モルのキナーゼ反応したポリヌクレオチド、20ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.4、２ｍＭＭｇＣｌ₂及び50ｍＭＮａＣｌを混合することでアニールした。この溶液を70℃で５分間保持し、毎分約１℃の割合で30℃まで冷却した。この溶液を使用するまで氷上に放置した。その溶液に、４ｍＭｄＡＴＰ、４ｍＭｄＣＴＰ、４ｍＭｄＣＴＰ、４ｍＭＴＴＰ、7.5ｍＭＡＴＰ、175ｍＭトリス-ＣｌｐＨ7.4、37.5ｍＭＭｇＣｌ₂、215ｍＭＤＴＴ含有溶液１μｌを、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ及び１単位の４ＤＮＡポリメラーゼと共に加えた。この溶液を氷上に５分間放置し、鋳型含有ウラシルにポリヌクレオチドを容易に結合させる条件下でＤＮＡ合成を開始することで、ポリヌクレオチドプライマーを安定化した。そして、その溶液を25℃で５分間保持し、最終的に37℃で90分間保持した。この溶液に、90μｌの終了バッファー(1 0ｍＭトリス-ＣｌｐＨ8.0及び10ｍＭＥＤＴＡ)を加えて凍結させて合成反応を終了させた。そして、この合成反応物を使用するまで-20℃で保存した。その合成反応物をMuta-Geneキットに記載された手順で感受性ＭＶ1190細胞に形質転換した。すなわち、ＭＶ1190細胞の分離コロニーを10mlのＬＢ培地に添加し、この溶液を37℃でコンスタントに振とうしながら一晩放置することで、感受性ＭＶ1190を調製した。翌日、40mlのＬＢ培地に一晩培養したＭＶ1190の十分な量を混合して、開始吸収値(600nmでの光学密度)が約0.1になるようにした。そして、その溶液を37℃で約２時間コンスタントに振とうしながら保持した。この間に培養は、吸収値が0.8〜0.9になった。吸収がこの値に達したとき、ＭＶ1190細胞を5,000rpmで５分間０℃で遠心分離した。そのＭＶ1190細胞ペレットを1mlの氷令50ｍＭＣａＣｌ₂中で再縣濁させた。この溶液にさらに19mlの氷令50ｍＭＣａＣｌ₂を添加した。得られた溶液を氷上に30分間放置した。その細胞を5,000 rpmで５分間０℃で遠心分離した。そのＭＶ1190細胞ペレットを１mlの氷令50ｍＭＣａＣｌ₂中で再縣濁させた。その溶液にさらに３mlの氷令50ｍＭＣａＣｌ₂ を添加し、溶液を氷上に放置した。ＭＶ1190細胞は形質転換に感受可能となった。上記で調製された合成反応物の10μｌアリコートを、冷やした1.5mlの無菌ポリプロピレン管中で0.3mlの感受性ＭＶ1190細胞と静かに混ぜ合わせた。この溶液を氷上に90分間放置した。そして、その溶液を３分間42℃のウォーターバスに入れ、すぐに氷上に戻した。そして、その形質転換細胞を３つの異なった濃度でＭＶ1190細胞系上にプレートした。10μｌ、50μｌ、及び100μｌの形質転換細胞を、それぞれ0.3mlのＭＶ1190−晩培養細胞を入れた管に加えた。この溶液を穏やかにしかし完全に混合し、その溶液に、50μｌの２％5-ブロモ-4-クロロ-3- インドイル-ベータ-D-ガラクトピラノシド(Ｘ−ＧＡＬ)、20μｌの100ｍＭイソプロピル-ベータ-チオ-ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)及び予め約50℃に冷却した溶融上面寒天(ＬＢ培地中0.7g Bacto-Agar/100ml)2.5mlを混合した。得られた溶液をＬＢ培地中15g/L Bacto-Agarから成る細菌プレートの表面に速やかに注入した。その寒天を約10分間冷却し、そしてプレートを逆さにして37℃で一晩放置すると、その間にＭＶ1190細胞lawn中にプラークが発生した。上述の形質転換の結果分離したプラークを、Muta-Geneキット(Bio-Rad Labora tories,Richmond,CA)によって提供される説明書に記載された標準的な方法で集めて増殖させた。そして、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Maniatisら ,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,NY(1982)に記載されたアルカリ溶解mini-prep法で、各プラークから２本鎖ＲＦＤＮＡを生成した。そして、得られたＤＮＡを所望のポリヌクレオチドを含む変異体の同定ができる制限エンドヌクレアーゼで消化させた。そして、この方法で同定した変異体の配列を決定して、免疫グロブリンＨ鎖又は免疫グロブリンＬ鎖のどちらかをコードする変異体ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を確認した。実施例２カッパーＬ鎖遺伝子含有発現ベクターの構築カッパーリーダーを含む全カッパーＬ鎖遺伝子含有発現ベクターは、以下の方法で生成した。上記で分離された全長カッパーＬ鎖遺伝子ｃＤＮＡを、ポリヌクレオチドＰ１とＰ３(表２)及び上述の変異誘発法を使用して変異誘発した。ポリヌクレオチドＰ１は、全長カッパーｃＤＮＡの５'末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドＰ３は、全長カッパーＬ鎖ｃＤＮＡクローンの３'末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。変異体に導入されたポリヌクレオチドＰ１及びポリヌクレオチドＰ３の両方を指標する２つの追加のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異形質転換体を分離した。そして、これらの変異体の配列決定をして、これらがポリヌクレオチドＰ１及びポリヌクレオチドＰ３の両方のＤＮＡ配列を含むことを確認した。全長カッパーＬ鎖ｃＤＮＡ(図１Ａ)を、５'及び３'末端において制限エンドヌクレアーゼEcoRI部位で切除し、その制限断片をゲル電気泳動で分離した。この分離した制限断片を、予めEcoRIで消化されたｐＭＯＮ530発現ベクターに直接連結した(図２)。(ｐＭＯＮ530発現ベクターはMonsanto,St.Louis,MOから市販されている。)得られた連結反応混合物を適当な宿主細胞に形質転換させ、個々の形質転換体を分離した。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Maniatisら,Col d Spring Harbor Laboratory,New York(1982)に記載された標準的な方法と同様の方法を用いて、個々の形質転換体からＤＮＡを調製した。そして、形質転換体ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化させて、発現ベクター内にカッパーＬ鎖ｃＤＮＡ遺伝子の位置づけを行った。得られたカッパーＬ鎖発現ベクターは、カッパーリーダーを含む全カッパー鎖をコードする遺伝子を含んでいた。カッパーＬ鎖遺伝子がそのリーダー配列を含まない発現ベクターは、以下の方法で生成した。上記で分離された全長カッパーＬ鎖遺伝子ｃＤＮＡを、ポリヌクレオチドＰ２とＰ３(表２)及び上述の変異誘発法を使用して変異誘発した。ポリヌクレオチドＰ２は、成熟カッパーＬ鎖のＮ-末端アミノ酸をコードする配列のちようど５'にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入して、通常は野生型ｃＤＮＡ中で転写されるカッパーＬ鎖リーダー配列を除去する。ポリヌクレオチドＰ３は、全長カッパーＬ鎖ｃＤＮＡクローンの３'末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。変異体に導入されたポリヌクレオチドＰ２及びポリヌクレオチドＰ３の両方を指標する２つの追加のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位含む変異形質転換体を分離した。そして、これらの変異体の配列決定をして、事実、これらがポリヌクレオチドＰ２及びポリヌクレオチドＰ３の両方を含むことを確認した。この変異誘発で生成されたリーダーがないカッパーＬ鎖ｃＤＮＡを、５'及び３'末端において制限エンドヌクレアーゼEcoRI部位で切除し、その制限断片をゲル電気泳動で分離した。この分離した制限断片を、予めEcoRIで消化されたｐＭＯＮ530発現ベクターに直接連結した(図２)。得られた連結反応混合物を適当な宿主細胞に形質転換させ、個々の形質転換体を分離した。個々の形質転換体からＤＮＡを調製し、その形質転換体ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化させて、発現ベクター内にリーダーのないカッパーＬ鎖ｃＤＮＡ遺伝子の位置づけを行った。得られたリーダーのないカッパーＬ鎖発現ベクターは、通常のカッパーリーダー配列を持たないカッパー鎖をコードする遺伝子を含んでいた。表２変異原性ポリヌクレオチド実施例３：γ重鎖遺伝子を含む発現ベクターの構築ガンマリーダーを含む全ガンマ重鎖遺伝子を含有する発現ベクターを、以下のようにして製造した。上で単離した完全な長さのガンマ重鎖遺伝子cDNAを、ポリヌクレオチドP4およびP6（第２表）および上記の突然変異誘発手順を使用して、突然変異誘発させた。ポリヌクレオチドP4は、該自然の完全な長さのガンマcDNA の5'末端に、EcoRI制限エンドヌクレアーゼサイトを導入する。ポリヌクレオチドP6は、該完全な長さのガンマ重鎖cDNAクローンの3'末端に、EcoRI制限エンドヌクレアーゼサイトを導入する。これらポリヌクレオチドP4およびポリヌクレオチドP6両者が該突然変異体に導入されていることを示す、２つの付随的なEcoRI 制限エンドヌクレアーゼサイトを含む、突然変異形質転換体を単離した。次に、これらの突然変異体を配列決定して、これらが実際に該ポリヌクレオチドP4およびポリヌクレオチドP6両者のDNA配列を含むことを確認した。この完全な長さのガンマ重鎖cDNAを、5'および3'末端において該制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより切断し（第1B図）、該制限フラグメントを、ゲル電気泳動を利用して単離した。この単離した制限フラグメントを、前もってEcoRIで消化しておいた、該pMON530発現ベクターに直接連結した（第２図）。この生成した連結混合物を、適当な宿主細胞内で形質転換し、それぞれの形質転換体を単離した。DNAをこれらそれぞれの形質転換体から調製し、次いで該形質転換体DNAを、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して、該発現ベクター内で、該ガンマ重鎖cDNAの配向を設定した。得られたこのガンマ重鎖発現ベクターは、該ガンマリーダーを含む該全ガンマ重鎖をコードする遺伝子を含んでいた。リーダー配列を含まない該ガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターは、以下のようにして製造した。上で単離した該完全な長さのガンマ重鎖遺伝子cDNAを、ポリヌクレオチドP5およびP6（第２表）および上記の突然変異誘発手順を使用して、突然変異誘発させた。ポリヌクレオチドP5は、成熟タンパク質のN-末端アミノ酸をコードする該配列の直ぐ5'側に、EcoRI制限エンドヌクレアーゼサイトを導入し、かくして該正常なガンマリーダー配列を除去する。ポリヌクレオチドP6は、該完全な長さのガンマ重鎖cDNAクローンの3'末端に、EcoRI制限エンドヌクレアーゼサイトを導入する。これらポリヌクレオチドP5およびポリヌクレオチドP6両者が該突然変異体に導入されていることを示す、２つの付随的なEcoRI制限エンドヌクレアーゼサイトを含む、突然変異形質転換体を単離した。次いで、これらの突然変異体を配列決定して、これらが実際に該ポリヌクレオチドP5およびポリヌクレオチドP6両者のDNA配列を含むことを確認した。このリーダーを含まないガンマ重鎖cDNAは、5'および3'末端に位置するサイトを、該制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより切断し、得られた該制限フラグメントに対して、ゲル電気泳動を利用することにより単離した。この単離した制限フラグメントを、前もってEcoRIで消化しておいた、該pMON530発現ベクターに直接連結した（第２図）。この生成した連結混合物を、適当な宿主細胞内で形質転換し、それぞれの形質転換体を単離した。DNAをこれらそれぞれの形質転換体から調製し、次いで該形質転換体DNAを、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して、該発現ベクター内で、該ガンマ重鎖cDNAの配向を設定した。得られたこのガンマ重鎖発現ベクターは、天然のガンマリーダーをもたない該ガンマ重鎖をコードする遺伝子を含んでいた。実施例４：植物への免疫グロブリンの導入上記実施例において製造した該リーダーを含まないカッパ発現ベクター、該リーダーを含まないガンマ発現ベクター、該天然のカッパ発現ベクターおよび天然のガンマ発現ベクターを、Ditta等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1980，77 :7347-7351に記載の三親接合系を使用して、アグロバクテリウム(Agrobacterium )菌株GV311-SE内で動態化した。簡単に説明すれば、該アグロバクテリウム（アクセプタ）GV311-SEを、１ｌ当たり2.6g/lの酵母抽出液、5g/lのトリプトン、5g /lのNaCl、5g/lのマニトール、1/16g/lのグルタミン酸一ナトリウム、0.25g/lの KH₂PO₄、0.1g/lのMgSO₄-7H₂Oを含有するMGL培地および1mg/lのビオチンを含む寒天プレート上で、pH7.0にて12〜18時間、28℃にて成育させた。Better等，J．Ba cteriol.，1983，155:311により記載された、該動態化プラスミドpRK2073を含む該E.コリ（ヘルパー）菌株を、LB培地（LB培地は5g/lの酵母抽出液、10g/lのトリプトン、10g/lのNaCl、15g/lのバクト−アガー(Bacto-agar)を含むpH7.0の培地である)を含む寒天プレート上で、12〜18時間、37℃にて成育させた。上記発現ベクター各々を含むこのE.コリを、３μｇ/mlのテトラサイクリンおよび10μｇ/mlのカナマイシンを補充したLB培地を含むバクテリア培養プレート上で、12〜18時間、37℃にて成育させた。これら３種のバクテリア、即ちアクセプタアグロバクテリウム、ヘルパーE.コリおよび該発現ベクターを含むE.コリ全ての等量（約1x10⁸細胞）を一緒に混合し、100μｇ/mlのカナマイシン、200μｇ/m lのスペクチノマイシンおよび50μｇ/mlのクロラムフェニコールを含有する、AB 寒天培地(1ｌのAB培地は、1gのNH₄Cl、0.3gのMgSO₄-7H₂0、0.15gのKCl、0.01gの CaCl₂、2.5mgのFeS₄-7H₂O、3gのK₂HPO₄、1.15gのNaH₂PO₄-H₂O、5gのグルコースおよび15gのバクト−アガーを含む)を含むバクテリア培養プレート上に塗布した。このバクテリア培養プレートを28℃にて２〜４日間インキュベートした。単一の形質転換体コロニーを、100μｇ/mlのカナマイシン、200μｇ/mlのスペクチノマイシンおよび50μｇ/mlのクロラムフェニコールを補充したLB培地を含有する培養フラスコ内で混合し、28℃にて12〜18時間穏やかな振盪状態に維持した。上記実施例で調製した該発現ベクター各々は、今やアグロバクテリウムの培養液中にあり、従っていつでも植物中に導入できる状態にある。タバコの葉の円板を、Rogers等の文献「植物分子生物学の方法(Methods For Pl ant Molecular Biology)」，Academic Press，Inc.，San Diego(1988)に記載されている方法を利用して、形質転換した。健康な若いタバコの葉を、20%(w/v)の一般家庭用の漂白剤および0.1%(w/v)のSDSを含む溶液中に、８分間維持することにより、その表面を滅菌した。次いで、これら葉を、98%のエタノールを含有する溶液中に60秒間移し、無菌の２度蒸留したH₂Oで２回洗浄した。次に、該葉の円板を６mmのペーパーパンチで孔を開けた。該円板を、その基部を下にして、MS10 溶液(MS塩，Gibco Laboratories，Grand Island New York，0.01mg/mlのチアミンHCl、0.001mg/mlのピリドキシンHCl、0.001mg/mlのニコチン酸、および0.1mg/ mlのイノシトール、30gのスクロース、0.01μｇ/mlのナフタレン酸性酸(acidic acid)[NAA]、1.0μｇ/mlのベンジルアデニン[BA]および10g/lのバクト−アガー，pH6.0)中に配置した。各円板を、該発現ベクターを含有するアグロバクテリウムの培養液と、５秒間混合した。これらの円板を、次に無菌濾紙で水分を吸い取って乾燥し、基部側を下にして、該MS10培地に移し、該培地を正常な成長条件下にて48時間維持した。次いで、各葉の円板を無菌水で洗浄して、該発現ベクターを含有する該アグロバクテリウムの大部分を除去した。該葉の円板を、 No.9ファットマン(Whatman)濾紙上で水分を吸い取ることにより乾燥し、次に基部を上にして、200μｇ/mlのカナマイシン硫酸および500μｇ/mlのカルベニシリンを含有する、MS10培地を含む選択プレート上に配置した。選択プレートを、正常な成育条件下で２週間維持した。この２週間以内に、カルスが出現し、間もなく苗条が出現した。この苗条が出現した後、該葉を、MSO培地(NHAまたはBAを含まないMS10培地)および200μｇ/mlのカナマイシンと500μｇ/mlのカルベニシリンを含有する、再生プレートに移した。該再生プレートにおいて発根した該苗条を土壌に移して、小植物を生成した。これらの小植物を、成熟体に至るまで、標準的な成育条件下に維持した。小植物の集団を、上記実施例において構築した該発現ベクター各々から、ここに概説した手順を使用して製造した。該小植物の各集団から得た葉の抽出液を、 Engvall等，J．Immunol.，1972，109:129-135に記載された方法に基づいた、ELI SAアッセイにより、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の存在についてスクリーニングした。簡単に説明すれば、150mMのNaClおよび20mMのトリス(Tris)-Clを含有するpH8.0の溶液50μｌ(TBS)と、ヤギ抗−マウス重鎖またはヤギ抗-マウス軽鎖特異的IgG(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)とを、マイクロタイタープレートのウエル内で混合した。これらプレートを約16時間４℃に維持して、該ヤギ抗体を該マイクロタイターウエルの壁に付着させた。該ウエルをH₂Oで４回洗浄した後、5%の脂肪を含まない乾燥ミルクを含む200μｌのTBSを、該マイクロタイターウエルに混合した。これらのウエルを少なくとも30分間20℃に維持し、該ウエルを振盪により空にし、水分を吸い取って乾燥し、固体担体、即ち固体マトリックスを形成した。該マトリックスには、該ヤギ抗体が機能可能に付着していた。これら形質転換体各々からの葉を、中央脈の除去後、乳鉢と乳棒とでホモジネートした。このホモジネートした形質転換葉と、1/4容の5xTBS(750mMのNaClおよび100mMのトリス-Clを含有するpH8.0の溶液)とを混合した。該ホモジネートの一連の２−回の希釈を、TBS(150mMのNaClおよび20mMのトリス-Cl，pH8.0) 中で行い、50μｌの連続的な２−倍希釈による希釈液を、各マイクロタイターウエルに添加し、該ウエルを18時間４℃に維持して、固相免疫反応生成物を形成した。次に、該ウエルを室温にて上流水で洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRPO)(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)とTBS中にて複合化した、ヤギ抗−マウス重鎖またはヤギ抗−マウス軽鎖特異的抗体の1:1000希釈液50μｌをマイクロタイターウエル各々と混合した。これらのウエルを２時間37℃に維持し、次いで製造業者等の指示に従って検出を行った。コントロールマイクロタイターウエルを同様な方法で調製し、該ベクター単独により形質転換された植物由来の抽出液を含んでいたが、如何なる検出可能な免疫グロブリン生成物をも発現しなかった。各小植物の免疫グロブリン含有率は、少なくとも２回測定し、その平均値として第３表に与えた。小植物の各集団由来の少なくとも９種の小植物を、このようにしてアッセイした。免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を発現する該小植物は、かくして該免疫グロブリン遺伝子によって形質転換されたことが示され、従って形質転換体またはトランスジェニック植物と呼ぶ。第３表：タバコ¹における免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現ガンマ-NL² ガンマ-L 30±16 1412±270 (60) (2400) カッパ-NL カッパ-L 1.4±1.2 56±5 (3.5) (80) 1: 数値はng/mg全タンパク質単位（平均±S.D.）で表されている。 2: Ｌはリーダーまたはシグナル配列が存在することを示し、NLはリーダーまたはシグナル配列が存在しないことを示す。第３表に示された結果は、各免疫グロブリン鎖の蓄積のための、シグナル配列の重要性を立証している。カッパ鎖の蓄積は、該cDNA構築体が存在する場合には（平均して）40倍にも大きくなり、またガンマ鎖の蓄積は、47倍に増大した。実施例５：免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖両者を発現する子孫集団の生成各免疫グロブリン鎖を発現する、実施例４に従って生成した形質転換体を性的に交雑させて、これら両鎖を発現する子孫を生成した。簡単に説明すれば、一つの免疫グロブリンを発現する１個の形質転換体を取り出して、雌形質転換体を生成することにより、未熟な花を摘花するように、ハイブリッド子孫を生成した。次いで、この雌形質転換体を、他方の免疫グロブリン鎖を発現する他方の形質転換体（雄）と他家受粉する。他家受粉後、該雌形質転換体を、ハイブリッド種子が生成されるまで、通常の成育条件下に維持した。次に、該ハイブリッド種子を発芽させ、成育させて、該免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖両者を含む子孫を生成した。これらの葉をホモジナイズし、このホモジネートを、実施例４で記載したELIS Aアッセイを使用して、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の発現についてアッセイした（第４表を参照のこと）。免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現するハイブリッド子孫の数を第５表に示す。該カッパリーダー構築体および該ガンマリーダー構築体を発現する該形質転換体の交雑により生成されたこのハイブリッド子孫は、ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖両者を含む組み立てられた免疫グロブリン分子を含んでいた。第４表：ハイブリッド子孫¹における免疫グロブリンガンマおよびカツパ鎖の発現ガンマ-L² ガンマ-NL³ 3330±2000 32±26 (12800) (60) カッパ-L カッパ-NL 〔ガンマ-L〕〔ガンマ-NL] 3700±2300 6.5±５ (12800) (20) 1: 数値はng/mg全タンパク質（平均±S.D.）で表されている。 2: Ｌはリーダーまたはシグナル配列が存在することを示す。 3: NLはリーダーまたはシグナル配列が存在しないことを示す。第５表：ハイブリッド子孫における免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現および組み立てガンマのみカッパのみガンマ＆カッパなしカッパ-NL X ４６３５ガンマ-LX (組み立て0%) カッパ−ＬＸ３ 10 11 ４（95±16%ガンマ−Ｌの組み立て）第４および５表に示した結果は、該２種の免疫グロブリン鎖の組み立ての重要性を立証している。親形質転換体と比較すると、両免疫グロブリン鎖を一緒に発現する子孫は、各鎖をより一層蓄積する。平均して、ガンマ鎖は蓄積において2. 5-倍の増大を示し、またカッパ鎖は66−倍の増大を示した。リーダー配列なしにcDNAを発現する形質転換体と比較すると、性的交雑によりもたらされた該リーダー配列と二重の発現の結果として、蓄積の増加は著しく高い。ガンマ鎖は110-倍におよびカッパ鎖は2,600-倍に増大した。実施例６：該トランスジェニック植物中の、免疫グロブリン重鎖−コード遺伝子および免疫グロブリン軽鎖−コード遺伝子の検出該トランスジェニック植物およびハイブリッド子孫中の、免疫グロブリン重鎖 −コード遺伝子および免疫グロブリン軽鎖−コード遺伝子の存在は、Maniatis等の分子クローニング：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laborat ory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)に記載されている、サザンブロット手順を利用して、該トランスジェニック植物から抽出したDNAを分析することにより立証した。簡単に説明すれば、該葉のセグメントを液体窒素中で凍結した後、該重鎖遺伝子形質転換体、軽鎖遺伝子形質転換体または該ハイブリッド子孫から収穫した成熟した葉の組織１ｇからDNAを抽出した。該凍結した葉のセグメントを、Shure等，Cell，1986，25:225-233に記載されている手順に従って、尿素混合物(420g/lの尿素、312.5mMのNaCl、50mMのトリス-Cl(pH8.0)、20 mMのEDTAおよび1%のザルコシン)中で、乳鉢と乳棒によりホモジナイズした。この葉のホモジネートをフェノール:CHCl₃(1:1v/v)で抽出し、核酸をpH5.2にて4.4 Mの酢酸アンモニウム1/6容およびイソプロピルアルコール１容を添加し、得られた溶液を-20℃にて30分間維持することにより沈殿させた。該沈殿した核酸を含む溶液を、４℃にて15分間、7500xgにて遠心分離処理して、該沈殿した核酸を回収した。得られた核酸ペレットを、10mMのトリス-Cl(pH7.6)および１mMのEDTAを含むTE溶液に再度懸濁した。得られた溶液中のDNAの濃度を分光光度法により測定した。上記の方法を利用して、該形質転換体各々からDNAを調製し、20μｇの形質転換体DNAを、製造業者Statagene Cloning Systems，La Jolla，CAの推奨する条件下で、制限エンドヌクレアーゼHind IIIで消化した。得られた制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、アガロースゲル上でサイズ分画し、Maniatis等の分子クローニング：アラボラトリーマニユアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manu al)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)に記載の方法を利用して、ニトロセルロースに対してブロッティングした。簡単に言えば、該DNAを、アガロースゲルを介して電気泳動することによりサイズ分画した後、該DNAをエチジウムブロミドで染色し、該ゲルの写真を撮影した。該DNAを含有する該ゲルを、1.5MのNaC lおよび0.5MのNaOHを含有する溶液中に室温にて１時間維持し、一方で定常的に穏やかに攪拌した。次に、このゲルをpH8.0の1Mのトリス-Clおよび1.5MのNaClを含有する溶液中に室温にて１時間維持し、一方で定常的に穏やかに攪拌した。該ゲルのpHを、該ゲルの小片を定期的に取り出し、小体積の蒸留水中でそのpHを測定することにより検査した。該ゲルのpHが約8.0に達したら、87.65g/lのNaCl、1 3.8g/lのNaH₂PO₄-H₂Oおよび3.7g/lのEDTAを含むpH7.4の溶液(10xSSC) で湿らせた厚いガーゼの上に置いた。該ゲルと同一のサイズに予め裁断し、10xS SCを含有する溶液で湿らせたニトロセルロースフィルタの小片(Schleicher & Sc huell BA 85，Keene，NH)を、該ゲル上に置き、介在するあらゆる気泡を除去した。該ニトロセルロースフィルタと正確に同一のサイズに裁断したファットマン 3MM濾紙の２片を、2xSSC(2xSSCは、17.53g/lのNaCl、2.76g/lのNaH₂PO₄-H₂Oおよび0.74g/IEDTA(pH7.4))で湿らせ、該ニトロセルロースフィルタの上に置き、介在するあらゆる気泡を除去した。該ファットマン３MM濾紙片よりも僅かに小さなサイズに裁断した、ペーパータオルの積層体（高さ5-8cm）を、該ファットマン３MM濾紙片上に置いた。ガラスプレートを、この得られた積層体の上に置き、50 0gの重りを該プレート上に置いた。達成される毛管作用を、12〜24時間作用させ、この作用は該DNAを該ゲルから該ニトロセルロースフィルタに移動させた。該積層体を分解し、該ニトロセルロースフィルタを室温にて５分間、6xSSC(6xSSC は52.59g/lのNaCl、8.28g/lのNaH₂PO₄-H₂Oおよび2.22g/lのEDTAを含む(pH7.4)) で湿らせた。このフィルタを乾燥したファットマン３MM濾紙の一片上に置き、風乾させた。この乾燥したフィルタを３MM濾紙２枚の間に置き、真空下で２時間80 ℃にて焼成して、該DNAを該ニトロセルロースフィルタに機能可能に結合させた。該焼成したフィルタを、0.9MのNaClおよび0.09Mのクエン酸ナトリウムを含むp H7.0の溶液の表面上に、該フィルタが下から十分に湿潤するまで置いた。これらフィルタを同一の溶液に５分間沈めた。該フィルタを、50%のホルムアミド、0.9MのNaCl、0.05MのNaPO₄、pH7.7、0.00 5MのEDTA、0.1%のフィコール(Ficoll)、0.1%のBSA、0.1%のポリ（ビニルピロリドン）、0.1%のSDSおよび100μｇ/mlの変性したサケ精液DNAを含む予備ハイブリダイゼーション溶液中に入れた。該フィルタを、穏やかに攪拌しつつ、該予備ハイブリダイゼーション溶液中に、12〜18時間42℃にて維持した。次いで、該フィルタを該予備ハイブリダイゼーション溶液から取り出し、1x10⁵cpm/mlの³²P-標識したガンマ鎖プローブ（該ガンマ発現ベクター全体を標識した）および1x10⁶c pm/mlの³²P-標識したカッパ鎖プローブ（該カッパ発現ベクター全体を標識した）を含む予備ハイブリダイゼーション溶液からなるハイブリダイゼーション溶液中に入れた。該フィルタを、穏やかに攪拌しつつ、該ハイブリダイゼーション溶液中に、12〜24時間42℃にて維持した。このハイブリダイゼーションが完了した後、該ハイブリダイゼーション溶液を捨て、該フィルタを４回、大量の、 0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム(pH7.0)および0.1%のSDSを含有する溶液で、室温にて１回の洗浄当たり10分間洗浄した。次いで、該フィルタを、0.15 MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム(pH7.0)および0.1%のSDSを含有する溶液中で、1.5時間に渡り、65℃にて２回洗浄した。該フィルタを、更に0.2xSSC(0.0 3MのNaClおよび0.003Mのクエン酸ナトリウムを含む(pH7.0))および0.1%のSDSを含有する溶液にこれらを移すことにより、１時間穏やかに攪拌しつつ42℃にて洗浄した。該フィルタを洗液から取り出し、室温にてファットマン３MM濾紙上で風乾させた。次に、該フィルタを、３MM濾紙にテープで接着し、プラスチックラップで包んで使用して、造影スクリーンを使用して、X-線フィルム(Kodak XRまたは等価なもの)に-70℃にて暴露して、オートラジオグラムを得た。該フィルムを製造業者の指示に従って現像した。得られたオートラジオグラム（図示せず）は、以下のように説明できる。トランスジェニック葉DNAのサザンブロットを調製した。これは、カッパおよびガンマ遺伝子両者が該トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれていることを立証した。リーダー配列(pHi101)をもたない軽鎖cDNAを発現する形質転換体由来の DNAは、レーン１に現れた。レーン２は、リーダー配列(pHi201)をもたない重鎖c DNAを発現するcDNA形質転換体由来のDNAを含んでいた。レーン３は、リーダー配列(pHi102)をもつ、完全な長さの軽鎖cDNAを発現する形質転換体由来のDNAを含んでいた。レーン４は、リーダー配列(pHi202)をもつ、重鎖cDNAを発現する形質転換体由来のDNAを含んでいた。レーン５は、該完全な長さのガンマcDNAを発現する植物と該完全な長さのカッパcDNAを発現する植物との間の交雑により誘導されたF₁植物(pHi102xpHi201)由来のDNAを含んでいた。トランスジェニックタバコの葉のRNAのノーザンブロットは、該トランスジェニック植物の葉におけるカッパおよびガンマmRNAの発現（図示せず）を立証しており、レーン１はリーダー配列(pHi101)を含まない軽鎖cDNAを発現する形質転換体由来のRNAを含んでいた。レーン２は、リーダー(pHi201)を含まない重鎖cDNAを発現する形質転換体由来のRNAを含んでいた。レーン３は、リーダー(pHi102)を含む完全長さの軽鎖を発現する形質転換体由来のRNAを含んでおり、レーン４はリーダー(pHi202)を含む重鎖を発現する形質転換体由来のRNAを含んでいた。レーン５は、該完全な長さのガンマcDNAを発現する植物と該完全な長さのカッパcDNAを発現する植物との間の交雑により誘導されたF₁植物(pHi102xpHi201)由来のDNAを含んでいた。異なるハイブリダイゼーションからのレーンを、メチレンブルー染色により検出されるように、該ブロット上の18S(1900bp)および25S(3700bp)リボソームRNAバンドについて整列させた。実施例７：該トランスジェニック植物における免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするmRNAの検出該トランスジェニック植物における免疫グロブリン重鎖遺伝子または免疫グロブリン軽鎖遺伝子をコードするmRNAの存在は、上記の文献：分子クローニング：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)に記載されたものと類似の手順を利用して、該トランスジェニック植物から抽出したRNA を分析することにより立証された。簡単に説明すれば、RNAを、該重鎖遺伝子形質転換体、該軽鎖遺伝子形質転換体または該ハイブリッド子孫から収穫した成熟した葉組織１ｇから抽出した。該葉組織を小片に裁断し、10mlの0.1Mトリス-Cl( pH9.0)およびこのバッファーで飽和したフェノールを含有する溶液10mlと混合した。該葉組織を、高速度でポリトロン(Polytron)ホモジナイザーを使用して１分間ホモジネートし、得られたホモジネートを室温にて4,000xgで15分間遠心分離処理した。得られた水性相を取り出し、RNAを、pH5.2の3M酢酸ナトリウム１mlおよび25mlのイソプロパノールと混合することにより沈殿させた。この溶液を-20 ℃にて20分間維持して、存在する該RNAを沈降させた。該沈殿したRNAを、該溶液を4,000xgにて15分間、４℃にて遠心分離処理することにより集めた。得られたR NAのペレットを、400μｌのDEPC-H₂Oに再度懸濁させ、1.5mlのエッペンドルフ(E ppendorf)チューブに移した。この溶液をトップスピードで５分間、エッペンドルフ微量遠心管内で遠心分離処理した。得られた上澄を新たなエッペンドルフ管に移し、40μｌのpH5.2の3M酢酸ナトリウムおよび１mlの乾燥エタノールと混合した。この溶液を、-20℃にて20分間維持し、次いで５分間エッペンドルフ微量遠心管内で遠心分離処理した。得られたこのRNAペレットを、400μｌのDEPC-H₂O中に再度懸濁し、少量のアリコートを取り出して、260nmにおける吸光度により該RNAの濃度を測定した。該溶液の残部を、使用するまで-70℃にて凍結しておいた。上で調製した該RNAを、変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上でサイズ分画し、ナイロン膜上に移した。使用したこれらの手順は、Maniatis等の分子クローニング：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual) ，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)に記載の手順と同様であった。簡単に説明すれば、該変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを、73.3mlのDEPC-H₂O水中で1.4gのアガロースを溶融し、この溶液を水浴上で60℃に冷却することにより調製した。50mMのNaH₂PO₄、50mMのNa₂HPO₄、50mMの酢酸ナトリウムおよび10mMのED TAを含有するバッファー10mlを、この溶液と混合した。16.66mlの37%ホルムアルデヒドをも該溶液と混合し、該溶液をゲル型に流し込み、固化させた。かくして、該変性ホルムアルデヒドアガロースゲルはいつでも使用できる状態となった。上で調製したRNAのアリコート20μｇを、15μｌのホルムアミド、５μｌの37% ホルムアルデヒド、および50mMのNaH₂PO₄、50mMのNa₂HPO₄、50mMの酢酸ナトリウムおよび10mMのEDTAを含有するバッファー3μｌと混合した。この溶液を55℃にて15分間維持し、次いで即座に氷上に置いた。50%のグリセロール、１mMのEDTA 、0.4%のブロムフェノールブルーおよび0.4%のキシレンシアノールを含有する溶液1/10容を、この溶液と十分に混合し、得られた溶液を上で調製した変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上に堆積させた。このゲルを、５mMのNaH₂PO₄、５mM のNa₂HPO₄、５mMの酢酸ナトリウムおよび１mMのEDTAを含有するバッファー中で、室温にて２時間電気泳動させた。この電気泳動が完了した後、該ゲルを、水を数回交換して、10〜15分間湿らせた。次いで、該ゲルを、pH7.5の0.1Mのトリス- Clを含有する溶液内に45分間いれた。次に、このゲルを3MのNaClおよび0.3Mのクエン酸ナトリウムを含有するpH7.0の溶液に入れた。該ゲルを、更に1.5MのNaCl および0.15Mのクエン酸ナトリウムを含有するpH7.0の溶液で湿らせた、厚いガーゼ上に置いた。予め該ゲルと同一のサイズに裁断し、10xSSCを含有する溶液で湿らせた、ナイロン膜(ハイボンド(Hybond)-N,Amersham Corporation，Ar lington Heights，IL)のシートを、該ゲル上に置き、あらゆる介在する気泡を除去した。正確に該ナイロン膜と同一のサイズに裁断した、２片のファットマンMM 濾紙を、2xSSC(0.3MのNaClおよび0.03Mのクエン酸ナトリウムを含むpH7.0の溶液 )中で湿らせ、該ナイロン膜上に置き、あらゆる介在する気泡を除去した。該ファットマン３MM濾紙よりも僅かに大きなサイズに裁断した、ペーパータオル（高さ5-8cm）の積層体を、該ファットマン３MM濾紙上に置いた。ガラスプレートをこの得られた積層体上に置いて、500gの重りを該プレート上に置いた。発生する毛管作用を、12〜24時間維持し、この作用により該RNAは、該ゲルから該ナイロン膜に移された。この積層体を分解し、該ナイロン膜を、6xSSC(0.9MのNaClおよび0.09Mのクエン酸ナトリウムを含有するpH7.0の溶液)中に室温にて５分間浸した。次いで、このナイロン膜を紫外線照射ボックスに10分間入れて、該RNAを該ナイロン膜に機能可能に結合させた。カッパ軽鎖コード配列またはガンマ重鎖コード配列を含むRNAは、実施例６に記載のプロトコールを利用して、該ナイロン膜を予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリッド化することによって検出した（そのオートラジオグラムの結果は、米国特許第5,202,422号の第４図に示されている）。リーダー配列をもたない（レーン１）またはその天然のリーダー配列をもつ（レーン３）該カッパ軽鎖 cDNAを発現する形質転換体由来のRNA中に検出された、該ハイブリッドRNA種が示されている。リーダー配列（レーン２）またはその天然のリーダー配列（レーン４）をもたない、該ガンマ重鎖cDNAの何れかを発現する形質転換体由来のRNA中に検出された、該ハイブリッドRNA種も示してある。天然のリーダー配列をもつカッパ軽鎖および天然のリーダー配列を有するガンマ重鎖両者を含むハイブリッド子孫中に検出された該ハイブリッドRNA種（レーン５）も示してある。実施例８：トランスジェニック植物中の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の検出トランスジェニック植物およびハイブリッド子孫中の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現は、重鎖および軽鎖両者が検出される、ウエスタンブロットにより立証された。抗生物質：アラボラトリーマニュアル(Antibiotics:A Laboratory Manual)，Harlow & Lane編，Cold Spring Harbor Laboratories，New York(1988 )に記載されているウエスタンブロット手順を使用する。簡単に説明すれば、成熟した植物の葉のセグメント１ｇを、pH7.5の0.05Mトリス-Cl１mlおよび１mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)と共に、乳鉢および乳棒を使用してホモジナイズし、得られた該葉の抽出液μｌを、指示されたように、２mMのD. T.の存在下または不在下で、4Mの尿素および1%のSDSなる最終濃度をもつ溶液と混合し、この溶液を３分間沸騰させた。沸騰後、この溶液を、NH，Chua，Method s in Enzymol.，1980，69:434-446に記載されているように、SDS-含有10%ポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動(SDS-PAGE)させた。次いで、電気泳動されたタンパク質を、抗生物質：アラボラトリーマニュアル(Antibiotics:A Laborator y Manual)，Harlow & Lane編，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York(1988)に記載されているように、ニトロセルロースシートに移した（転写）。簡単に言えば、該ニトロセルロースシートを、pH8.0の、20mM トリス-Cl、150mMのNaClおよび5%のウシ血清アルブミン(BSA)および0.5%の脱脂粉乳を含む0.01%のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ツイーン(Twe en)20)(TBST)の溶液中に置いた。該ニトロセルロースシートを、この溶液中に４ ℃にて６時間維持した。次いで、該ニトロセルロースシートを、TBST中の1:500 希釈率のビオチン処理したヤギ抗−マウス全IgG抗体(Cappel，Malvery，PA)を含む溶液に入れ、該ニトロセルロースシートを含む該溶液を４℃にて24時間維持した。この期間中に、該ニトロセルロースシート上に固定化された該免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、該ビオチン処理したヤギ抗−マウス全IgG 抗体と免疫反応して、該ニトロセルロースシート上に免疫反応生成物を形成した。該ニトロセルロースシートをこの溶液から取り出し、TBST溶液で洗浄し、次いでストレプタビジン−結合アルカリンホスファターゼ(Fisher Scientific，Pitt sburgh，PA)を含有するTBST溶液中に入れた。この溶液を25℃にて１時間維持した。該ニトロセルロースシートをこの溶液から取り出し、TBSTで洗浄した。該ニトロセルロースシートを、pH9.5の100mMトリス-Cl、100mMのNaCl、５ mMのMgCl₂、0.3mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および150μｇ/mlの5- ブロミル-4-クロリル-3-ヨードリルホスフェート(BCIP)を含有する溶液中に、室温にて30分間維持することにより、該免疫反応生成物を可視化した。残留発色溶液を、pH7.5の20mMトリス-Clおよび150mMのNaClを含有する溶液で、該フィルタを洗浄した。次いで、該フィルタを、１mMのEDTA、pH8からなる停止溶液中に入れた。強力な紫色の発現は、該免疫反応生成物の位置を示した。該重鎖形質転換体における免疫グロブリン重鎖の発現、該軽鎖形質転換体における免疫グロブリン軽鎖の発現および該ハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖および軽鎖両者の発現は、ウエスタンブロット（ここには提示しないが、米国特許第5,202,422号お第５図を参照のこと）を利用して立証した。更に、該ハイブリッド子孫中に生成された該免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、非−還元条件下で観測される（提示せず）、高分子量の免疫反応性ガンマおよびカッパ鎖により立証されるように、免疫グロブリン分子に組み込まれていた。上記のウエスタンブロットの説明は以下の通りである。葉のタンパク質のウエスタンブロットは、免疫グロブリンカッパ鎖、免疫グロブリンガンマ鎖または組み合わされた免疫グロブリンIgGを発現するトランスジェニックタバコ植物からのサンプルを使用して調製した。レーン1-7において、該葉のタンパク質の抽出液は、ジチオスレイトール(DTT)を含み、またレーン８および９において、該葉のタンパク質の抽出液は、DTTを含んでいなかった。レーン１は100ngの精製した 6D4ハイブリドーマからの抗体を含んでいた。レーン２は15μｇの野性型植物の抽出タンパク質を含んでいた。レーン３は、リーダー配列を含まない接頭カッパ鎖cDNA(pHi101)により形質転換した植物由来の、15μｇのタンパク質を含んでいた。レーン４は、接頭ガンマ鎖cDNA(pHi102)により形質転換した植物由来の植物抽出液からの15μｇの植物抽出液を含んでいた。レーン５は、完全長さのカッパ cDNA形質転換体(pHi102)由来の15μｇの植物抽出液を含んでいた。レーン６は、完全長さのガンマcDNA形質転換体(pHi202)由来の15μｇの植物抽出液を含んでいた。レーン７は、カッパおよびガンマ形質転換体間の交雑に由来するF1植物からの15μｇの植物抽出液を含んでいた。レーン８は、100ngの6D4抗体（DTTを含まず）を含んでおり、レーン９はレーン７と同一であったが、サンプル中にDTT は含まれていなかった。左側のガンマおよびカッパは、6D4重鎖および軽鎖の位置を意味する。実施例９：該トランスジェニック植物内で発現された免疫グロブリン分子は抗原と結合する該トランスジェニック植物内で発現された免疫グロブリン分子による抗原との結合は、実施例４に記載したELISAアッセイと同様な、ELISAアッセイを利用して立証された。この抗原結合ELISAアッセイは、以下のように変更した。該マイクロタイターウエルの壁に対して該ヤギ抗体を付着させる代わりに、Tramontano等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1986，83:6736-6740に記載された方法に従って、BSAと結合した抗原P3を、マイクロタイターウエルの壁に付着させる。次いで、小植物集団各々由来の葉のホモジネートを、該ウエルに添加し、該ホモジネート中に存在する免疫グロブリン分子の結合を、実施例４に記載したようにHR POに結合したヤギ抗−マウス重鎖を使用して検出した。該トランスジェニック植物内で発現された該免疫グロブリン分子は、この抗原結合ELISAアッセイにおいて、直接その特異的抗原P3と結合した。この抗体−抗原相互作用の特異性を立証するために、付随的なELISAアッセイを実施した。このアッセイは、上記の抗原結合ELISAアッセイと類似するが、葉のホモジネートの一連の希釈の前に、P3の500μＭ溶液５μｌを２つのウエルに添加して、該マイクロタイターウエル壁に付着したP3-BSAに結合した抗体に対する競合体として作用させる。この競合ELISAアッセイの残りの部分は、実施例４に従って実施した。実施例10：トランスジェニック植物内で発現された免疫グロブリンの触媒活性トランスジェニック植物内で発現された免疫グロブリンの触媒活性を、機能性の免疫グロブリンを発現するタバコ植物由来の該6D4免疫グロブリン分子を精製し、該精製した免疫グロブリン分子をアッセイして、触媒活性を測定することにより立証した。簡単に説明すれば、組み込まれた免疫グロブリン分子を含む植物を、実施例１、２、３、４、５、６および８に記載した方法並びに手順を使用して製造した。該 6D4免疫グロブリン分子を、植物中での発現のために選択した。というのは、マウス内で生成された正常なグリコシル化6D4抗体が、カルボン酸エステルの加水分解を触媒するからである。これについては、Tramontano等，Science，1986，2 34:1566を参照のこと。該6D4免疫グロブリンを、該免疫グロブリンを発現するタバコ植物の葉から、セファクリル分画およびプロテインＡ−セファロース(Protein A-Sepharose)への吸着により精製した。簡単に説明すれば、10ｇの若い葉から、その中央脈を除去し、次いで手作業で、pH8.0にて、50mMのトリス-HClおよび１mMのPMSFを含有するホモジネート用のバッファー50ml内でホモジナイズした。得られたこのホモジネートを10,000xgにて遠心分離処理し、得られた上澄を、セントリコン(Centr icon)30(Amicon，Danvers，MA)を利用して最終体積10mlまで濃縮した。この濃縮したホモジネートを、次に予め調製したS-300カラムに流し込んだ。このカラムをpH5.0にて0.1Mの酢酸ナトリウムで溶出し、各１mlの溶出液を集めた。該集められた各画分中に存在する免疫グロブリンの量は、実施例４に記載のように、EL ISAアッセイを利用して測定した。溶出された該免疫グロブリンの大部分を含む画分をプールし、pH8.9の1.5Mのグリシンおよび3.0MのNaClを含有する結合バッファーに対して、徹底的に透析した。この透析後、該免疫グロブリンを、2gのプロテインA-セフロース(Pharmacia ，Piscataway，NJ)を含むカラムにゆっくりと２度通して、該免疫グロブリンを該カラムに結合させた。該プロテインA-セフロースを、結合バッファー20mlで洗浄した。結合した該免疫グロブリンを、pH6.0の0.1Mクエン酸塩を含有する溶出バッファー10mlで溶出した。得られた溶出液を、セントリコン30を使用して１ml 当たり免疫グロブリン50μｇとなるまで濃縮した。この濃縮した免疫グロブリンを、次にpH8.0にて50mMの燐酸塩バッファーに対して透析した。得られたこの溶液中に存在する免疫グロブリンの最終濃度は、実施例８に記載されたELISAアッセイを利用して測定した。得られた6D4免疫グロブリンのアミノ酸配列は、Matsudaira，P.，J．Biol．Ch em.，1987，262:10035-10038により記載された方法を利用して決定した。簡単に説明すれば、該6D4免疫グロブリンのガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)法を利用して、約１μｇの6D4免疫グロブリンを、10%ポリアクリルアミドゲルに積層することにより分離した。該免疫グロブリンを、該ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖が分離するまで、電気泳動させた。これらの分離されたガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を、次にMatsudaira，P.，J．Biol．Chem.，1987，262:10035-10038に記載されたように、ポリビニリデンジフルオライド膜上でブロッティングし、かつアミノ酸配列を決定した。マウス由来の6D4モノクローナル抗体は、植物の葉からの抗体の精製のめに使用したものと同一の手順を利用して、マウスの腹水から精製した。簡単に説明すれば、該6D4モノクローナル抗体を含む該マウス由来の腹水を、セファクリル(S- 300)カラムおよびA-セファロースカラム上で分画した。得られたこの精製マウスモノクローナル6D4抗体は、pH6.0の0.1Mクエン酸塩バッファー中で最終濃度500 μｇ/mlであった。該植物由来のおよびマウス由来の6D4抗体を、その精製状態のものを基質と共に、以前にTramontano等，Science，1986，234:1566-1569により記載されたように、特異的阻害剤の存在下または不在下でインキュベートすることにより、その活性についてアッセイした。これを簡単に説明すると、約100nMのマウス由来の6 D4抗体または植物由来の6D4抗体を、25℃にて、pH8.0の50mM燐酸塩バッファー中で予備インキュベートした。一連の反応混合物を、基質含有ジオキサン母液の変動する量と混合することにより、5%ジオキサンを含み、かつ１〜８mMの範囲の基質濃度の一連の反応混合物を生成することにより形成した。これら反応混合物を１時間に渡り25℃に維持し、該エステル基質の加水分解を、ヒューレット−パッカード(Hewlett-Packard)8452Aダイオードアレイ分光光度計により、245nmにおける吸着量変化を監視することにより測定した。最大の吸着量変化は、非−特異的なエステラーゼ(Sigma，St．Louis，MO)を、コントロール反応混合物に添加することにより測定した。速度論的パラメータを、Tramontano等，Science，1986 ，234:1566により記載されたラインウエーバー−バーク(Lineweaver-Burke)データ処理を利用して、バックグラウンド加水分解を差し引いた後に得た。阻害定数を、100nMおよび300nMホスホネート両者について得たスロープをプロットすることにより測定した（第６表）。Ｋ_M、Ｋ₁、Ｖ_max、およびＫ_catにより測定した、該精製された植物由来およびマウス由来の6D4抗体の触媒活性を第６表に示す。該植物由来およびマウス由来の6D4抗体は、一桁未満の差異を示した。第６表：6D4^bの触媒活性起源タバコ腹水Ｋ_M 1.41x10^-6M 9.8x10^-6M Ｖ_max 0.057x10^-8Msec^-1 0.31x10^-8Msec^-1 Ｋ₁ 0.47x10^-6M(競合的) 1.06x10^-6M(競合的) Ｋ_cat 0.008sec^-1 0.025sec^-1 b: このデータは線形回帰を利用して解析した。実施例11：植物中の異種リーダー配列による免疫グロブリンの製造植物中の免疫グロブリンの組み立てに及ぼす異種リーダー配列の効果を決定するために、実施例１に記載した天然のマウスリーダー配列の代わりに、サッカロマイセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のα−交配ファクタ由来のシグナルおよび予備−配列を含む免疫グロブリンcDNAを調製した。該サッカロマイセスセレビシアエのα−交配ファクタの配列は、Kurzan等，Cell，1982，30:933 -943に記載されており、また以下のように説明されている。該α−交配ファクタのリーダー配列の配列は、該ガンマ鎖またはカッパ鎖をコードするヌクレオチド配列と結合していた。該α−交配ファクタの該ヌクレオチド配列は以下の通りである：GAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAA TTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGA （SEQ ID NO.9）。この下線を施した記号は、酵母のプレプロ配列の5'未翻訳ヌクレオチドを表す。該プレプロ配列の翻訳された部分の翻訳されたアミノ酸配列および該付着したカッパ鎖の初めの部分は以下の通りである：MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQ IPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDLKR/DVVL...(SEQ ID NO . 10)。該付着したガンマ鎖の該プレプロ配列および初期部分の該翻訳された部分の、翻訳されたアミノ酸残基配列は以下の通りである：MRFPSIFTAVLFAASSALAAPV NTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDLKR/EVEL... (SEQ ID No.11)。該プレプロ配列と該カッパまたはガンマ鎖との間の結合点は、スラッシユ(“/”)により示されており、該スラッシュに続く４つのアミノ酸残基はそれぞれ該カッパおよびガンマ鎖の初期部分を表す。 Kurzan等，Cell，1982，30:933-943により記載された該サッカロマイセスセレビシアエのα−交配ファクタ由来の該プレプロ配列を、まずp69Aからのα−交配ファクタを含む、Eco RI乃至Hind III制限エンドヌクレアーゼフラグメントを単離することにより、M13mp18にサブクローニングした。次いで、この制限エンドヌクレアーゼフラグメントを含有するα−交配ファクタを、予めEco RI乃至Hind III制限エンドヌクレアーゼにより消化したM13mp18ベクターDNAと連結した。このクローニング段階の精度は、該α−交配ファクタDNAを含有するこの得られたM 13クローンの制限エンドヌクレアーゼ消化により決定した。実施例１で調製した内因性マウスリーダー配列をもたない、該6D4カッパおよびガンマ鎖ベクターを、Hind IIIで消化し、かつ得られた5'ホスフェート残基を除去した。該α−交配ファクタベクターを、Hind III制限エンドヌクレアーゼで消化して、該α−交配ファクタを含有するHind III制限エンドヌクレアーゼフラグメントを生成した。該α−交配ファクタ含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による分離後、電気溶出装置(BRL，Bethesda， MD)を使用して単離した。この単離したα−交配ファクタ含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、別々の連結反応において、該Hind IIIで消化したガンマおよびカッパベクターと連結した。オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発を利用して、該α−交配ファクタプレプロ配列の末端とGlnコドン（ガンマ鎖）またはAspコドン（カッパ鎖）との間の余分のヌクレオチドを除去して、キメラcDNAを生成した。このオリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発の正確性は、DNA配列決定によって確認した。該α−交配ファクタプレプロ配列および該ガンマまたはカッパ免疫グロブリンコード配列を含有する該キメラcDNAを、Rogers等，Meth．Enzymol.，1987，153: 253に記載されたPMON530ベクターに挿入した。これを簡単に説明すると、該キメラcDNAを、T4DNAリガーゼを使用して、該PMON530ベクターに結合した。この結合反応の生成物を、Bethesda Reseach Laboratories(Bethesda，MD)のバクテリア菌株および方法を利用して、E.コリ内に導入した。個々のプラスミド(該キメラc DNAを含有する組み換えpMON530)を、制限エンドヌクレアーゼ消化および配列決定によって解析した。得られたキメラガンマおよびカッパcDNA発現ベクターを使用して、Horsch等， Science，1985，227:1229-1231によりおよび実施例４に記載されたようにして、葉の円板を形質転換した。該ガンマ鎖を発現する個々の植物および該カッパ鎖を発現する個々の再生された植物を選別した。該再生体がガンマ鎖またはカッパ鎖を発現することを、実施例４に記載のELISAアッセイを利用して確認した後、該個々の再生体を性的に交配して、ガンマＸカッパ子孫を生成した。これらの子孫を、実施例４に記載のEL ISAアッセイを利用して、抗体産生についてスクリーニングした。該γ_mat鎖または該κ_mat鎖の何れかを発現する該個々の再生体を、内因性マウスリーダーペプチドを含有する、天然の6D4抗体を発現する植物と交配して、該天然のガンマ鎖と該κ_matとを含有する子孫、または該γ_matと天然のカッパ鎖とを含む子孫を生成した。これらの子孫をも、実施例４に記載のELISAアッセイを利用してスクリーニングした。これら子孫各々における抗体発現のレベルは、実施例４に記載のELISAアッセイを利用して測定し、また得られた結果を以下の第７表に報告する。第７表：ガンマまたはカッパ鎖の蓄積およびガンマ／カッパ複合体の抗原結合＊：数値はng/mg全タンパク質（平均±S.D.）で示され、ここではマウス腹水由来の精製6D4抗体を該ELISA標準として使用した。括弧内の数値は発現の最大レベルを示す。“NL”はリーダーをもたず／シグナルを有さない配列を示す。 c: α(K)は、ELISAにより測定した、Ｋ鎖をも発現する、植物中のα鎖の豊富さを意味し、逆（即ち、性的交配の子孫）もまた真である。これらの場合において、括弧内の数値は、BSA(Hiatt等，Nature，1989，342:76-78)と結合した、ホスホネート抗原(P3)（以前にTramontano等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，198 6，83:6736-6740に記載された）で被覆されたELISAプレートに対する抗体結合の結果である。高レベルでのＫ複合体を発現する植物のみを、該抗原結合アッセイで使用した。サッカロマイセスセレビシアエのリーダー配列を含有する個々のガンマおよびカッパ鎖は、以前にHiatt等，Nature，1989，342:76-78に報告された、天然のマウスリーダーを発現する構築体とほぼ同一レベルで蓄積された。更に、機能性抗体を、同一のシグナル（γ_matＸκ_mat）または異なるシグナル（κ_matｘγ_nativ _e ；κ_nativeＸγ_mat）を含むガンマおよびカッパ鎖の何れかとの交配によって生成した。これは、Hiatt等，Nature，1989，342:76-78に報告されているように、一方の親がリーダーなしに免疫グロブリンを発現する植物の交配が、機能性の抗体分子を製造しないことと対照的である。該植物内膜系による、該マウス免疫グロブリンN-末端のプロセッシングの忠実性は、P．Matsudaisa，J．Biol．Chem.，1987，262:10035-10038により記載されているような、自動化配列分析により測定した。哺乳動物カッパ鎖N-末端アミノ酸は、Kabat等，免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Public Health Servide，National Institutes of Health，Bethesda，Marylandによって記載されたように、典型的にはアスパラギン酸である。多くのマウスIgG1ガンマ鎖は、Johnston等，Bioch．Biophys．Res ．Commun.，1975，66:843-847により報告されたように、パイログルタミン酸により遮断されている。配列分析は、天然のマウスリーダーを発現する植物由来のガンマ鎖が遮断されたN-末端を含むことを示唆した。天然のマウスリーダーを発現するカッパ鎖の末端配列は、Asp-Val-Val-Leuであり、このことは該カッパ鎖の適当なタンパク分解プロセッシングの存在を示している。実施例12：植物由来の免疫グロブリン分子のグリコシル化植物由来の免疫グロブリンのガンマ鎖のグリコシル化パターンを決定するために、Faye等，Anal．Biochem.，1985，149:218-224に記載のように、該精製した抗体をニトロセルロース上にブロッティングし、かつビオチン処理したレクチンで精査した。これを簡単に説明すると、該ニトロセルロース膜を、室温にて１時間、１μｇ/mlのビオチン処理レクチン(Pierce，Rockford，IL)を含む、50mMのトリス-Cl、0.5mMのNaCl、0.1mMのCaCl₂、0.1mMのMgCl₂および0.1mMのMnCl₂を含有する溶液中でインキュベートした。次に、該フィルタをTIBSで洗浄し、かつ１ μｇ/mlのストレプタビジン−アルカリンホスファターゼ(Sigma，St．Louis，MO )を含有するTIBS中で室温にて１時間インキュベートした。結合したアルカリンホスファターゼを、Hiatt等，Nature，1989，342:76-78に記載のように、ブロモ −クロロ−インドリルホスフェートを使用して可視化した。幾つかの場合においては、ブロッティングして高マンノース型の糖を除去する前に、該精製抗体を40mUのエンドグリコシダーゼＨ(Signal Chemical Co.，St． Louis，MO)と共に、50μｌのpH5.8の200mM酢酸ナトリウム中で、37℃にて２時間インキュベートした。その結果（提示せず）は、マンノースおよびグルコースに対して特異的なコンカナバリンＡのみが該植物由来の抗体と結合し、一方マウス腹水由来の抗体は、コンカナバリンＡ並びに末端ガラクトース残基（N-アセチルガラクトースアミン）に対して特異的なヒマ(Ricjnus communis)由来のレシチンにより、および程度は低いが、末端シアリン酸残基を有するN-アセチルグルコースアミンダイマーに対して特異的な小麦胚芽アグルチニンによって認識された。種々のレクチンの特異性は、Kijimoto-Ochiai等，Biochem．J.，1989，257:43-49において論じられている。N-アセチルグリコースアミンオリゴマーおよびN-アセチルラクトースアミンに対して特異的な、ヨウシュチョウセンアサガオ(Datura stramonium)由来のレクチンおよびGal β１、4G1cNac β１、２マンノースに対して特異的なインゲンマメ(Phaseolus vulgaris) は、該植物由来のまたはマウス腹水由来のガンマ鎖と結合しなかった。 α−メチルグルコシドを使用した該ニトロセルロースブロットからの該レクチンの溶出液は、以前にJohnston等，Bioch．Biophys．Res Commun.，1975，66:84 3-847に記載されているように、該植物由来のおよびマウス腹水由来の抗体に対するコンカナバリンＡ結合の相対的アフィニティーと比較するのに使用した。このアッセイを利用した場合、該植物由来のおよびマウス腹水由来の抗体は、コンカナバリンＡアフィニティー並びにガンマ鎖１μｇ当たりのコンカナバリンＡの結合量については、識別不可能であった。 Trimvle等，Anal．Biochem.，1984，141:515-522により記載された条件を使用して、エンドグリコシダーゼＨによる該植物由来のまたはマウス腹水由来の抗体の消化を実施し、次いで該抗体をニトロセルロースに転写した。これらのエンドグリコシダーゼＨにより消化した抗体は、コンカナバリンＡのオボアルブミンに対する結合が減少する条件下では、コンカナバリンＡの結合における減少を示さなかった。これらの結果の総合的考察は、該植物由来の免疫グロブリンが、該マウス腹水由来の抗体と類似する細胞コンパートメントを介してプロセッシングされることを示している。このガンマ鎖コンカナバリンＡ結合およびエンドグリコシダーゼＨによる消化に対するグリカンの耐性並びに正確なカッパ鎖N-末端は、該抗体が小胞体からゴルジ(Golgi)に移動しており、またWalter等，Annu．Rev．Cell Bio l.，1986，2:499-516により記載されたように、原形質膜を介して分泌されることを示している。該レクチンの幾つかの該植物由来の抗体に対する種々の結合様式は、該植物由来のまたはマウス腹水由来の抗体の最終的なグリコシル化パターンが異なっていることを示す。該植物由来の抗体は、末端ガラクトースおよび末端シアル酸に対して特異的なレクチンには結合しなかったが、該マウス腹水由来の抗体はこれらに結合した。実施例13：植物細胞壁内での免疫グロブリン分子の保持細胞壁を含まない植物の原形質体からの免疫グロブリンの分泌の割合を、完全な細胞壁をもつ植物細胞からの免疫グロブリンの分泌の割合と比較した。植物細胞由来の原形質体の調製は、Tricoli等，Plant Cell Report.，1986，5:334-337 に記載されている。簡単に説明すると、タバコの葉の１cm²片を、セルライシン( cellulysin;Calbiochem)、マセラーゼ(macerase;Calbiochem)およびドリセラーゼ(driselase;Sigma)の混合物中で、18時間インキュベートして、細胞壁を消化し、かつ該葉から原形質体を剥離した。この原形質体を、0.4mマニトール中で遠心分離処理(100xgにて２分間)した。原形質体または完全な植物細胞により生成される免疫グロブリンを、2x10⁶個の原形質体を、10μCimCiの³⁵S-メチオニンを含有する0.5mlのマニトール培地中に再度懸濁することにより標識した。該細胞を該標識培地内に２時間維持し、細胞および培地のアリコートを取り出して、標識されたメチオニンの該6D4抗体への組み込み量を測定した。該インキュベーション培地中の標識された6D4抗体の量は、該培地中に含まれる免疫グロブリンをプロテイン-Aセファロースカラムに結合させ、該カラムに結合した全放射能カウントを測定することにより決定した。該細胞内で該6D4抗体に組み込まれた標識メチオニンの量は、該細胞を調製し、その溶解物を10%SDS-PAGEゲルに堆積し、Hiatt等，J．Biol．Chem.，1986，26 1:1293-1298により以前に記載されたように、該溶解物を２時間電気泳動させることにより測定した。該6D4抗体を含有する該SDS-PAGEゲルの領域を切取って、該標識抗体を該ゲルから溶出した。次いで、存在する標識抗体の全量を測定した。更に、同様な測定を、100mMのメチオニンの存在下で更に２時間維持した後に実施した。以前にHiatt等，J．Biol．Chem.，1986，261:1293-1298により記載されたように、適当な成長ホルモン内で葉のセグメントをインキュベートすることによって、８週間の期間に渡りカルス細胞系を発生させた。次いで、細胞系のこの懸濁液を該カルス細胞塊から発生させ、上記のように³⁵S-メチオニンの組み込みのために使用した。この分泌液の分析の結果を第８表に示す。２時間の標識期間の後、新たに合成された抗体のかなりの部分が、該原形質体から分泌された。100mMのメチオニンによる２時間のチェースの後、全標識抗体の殆どが、該原形質体から該培地に分泌され、このことは該抗体の分泌が生じたことを示している。これとは対照的に約40%の該標識抗体が、樹立されたカルス懸濁液中の、完全な細胞壁を有する細胞系内に維持された。これら細胞は薄い一次細胞壁を含み、従って該細胞壁内に該抗体を維持した。第８表：２時間における6D4内への³⁵S-メチオニンの組み込み（培地／細胞）原形質体プロテインＡ 0.33 原形質体 SDS-PAGE 0.31 カルス懸濁液細胞プロテインＡ 0.39カルス懸濁液細胞 SDS-PAGE 0.25 ２時間のチェース後の6D4内への組み込み原形質体プロテインＡ 6.60 原形質体 SDS-PAGE 6.31 カルス懸濁液細胞プロテインＡ 2.77カルス懸濁液細胞 SDS-PAGE 2.14 実施例14：植物細胞中の分泌IgAの製造 A．病原体特異的可変領域をコードするmRNAの単離予め選択された抗原に対して免疫特異性の分泌型IgAを、まず予め選択されたハイブリドーマから該可変領域をコードする遺伝子を単離することにより、植物細胞内で生成する。Chomczynski等，Anal．Biochem.，1987，162:156-159により記載された方法に従って、Stratagene(La Jolla，CA)により製造されたRNA単離キットを使用し、製造業者の指示に従って、mRNAを調製する。簡単に言えば、約 1x10⁷個の細胞を、4.0Mのグアニンイソチオシアネート、pH7.0の0.25Mのクエン酸ナトリウムおよび0.1Mの2-メルカプトエタノールを含む10mlの変性溶液中でガラスホモジナイザーを使用してホモジナイズした。2M濃度、pH4.0の酢酸ナトリウム１mlを該ホモジナイズした細胞と混合する。１mlの水で飽和したフェノールを、該ホモジナイズした細胞を含有する該変性溶液と混合する。２mlのクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1v/v)混合物を、該ホモジネートに添加する。このホモジネートを、10秒間激しく攪拌し、氷上に15分間維持する。次に、このホモジネートを、壁厚の50mlポリプロピレン遠心機２(Fisher Scientific Compa ny，Pittsburgh，PA)に移す。この溶液を10,000xgにて20分間４℃で遠心分離処理し、上部のRNA-含有水性層を、新たな50mlのポリプロピレン遠心機２に移し、等体積のイソプロピルアルコールと混合する。この溶液を、少なくとも１時間-2 0℃に維持して、該RNAを沈殿させる。該沈殿したRNAを含有するこの溶液を、４ ℃にて10,000xgで20分間遠心処理した。該ペレット化した全細胞RNAを集め、上記の変性溶液３mlに溶解する。３mlのイソプロピルアルコールを、該再度懸濁した全細胞RNAに添加し、激しく攪拌する。この溶液を少なくとも１時間-20℃に維持して、該RNAを沈殿させる。該沈殿したRNAを含有する該溶液を４℃にて10,000xgで10分間遠心分離処理する。このペレット化したRNAを、１回75%のエタノールを含有する溶液で洗浄する。該ペレット化したRNAを真空下で15分間乾燥し、次いでジメチルピロカーボネート処理した(DEPC-H₂O)H₂O中に再度懸濁させる。上で調製したmRNAにつき、分子クローニング：アラボラトリーマニュアル(Mol ecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版，Sambrook等編，Cold Spring Ha rbor，NY（1989）に記載された如く、長いポリＡトラックを含む配列を増やす。簡単に説明すれば、該ハイブリドーマ細胞から単離した全RNAの半分を、１mlのD EPC-H₂Oに再度懸濁し、65℃にて５分間維持する。100mMのトリス-HCl、1Mの塩化ナトリウム、2.0mMのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム(EDTA)を含むpH7 .5の2x高塩濃度バッファー１mlおよび0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、該再懸濁したRNAに添加し、この混合物を室温まで冷却させる。次に、この混合物を、オリゴ-dTを、0.1Mの水酸化ナトリウムおよび5mMのEDTAを含有する溶液で洗浄することにより、予め調製したオリゴ-dT(コラボラディブリサーチタイプ(C ollaborative Research Type)２または３)カラムに適用し、次いでDEPC-H₂O内で平衡化する。該カラムの溶出液を無菌ポリプロピレンチューブ集め、該溶出液を５分間65℃に加熱した後、同一のカラムに再度適用する。次いで、このオリゴ-d Tカラムを、pH7.5の50mMのトリス-HCl、500mMの塩化ナトリウム、pH7.5の1mMのE DTAおよび0.1%のSDSを含有する高塩濃度バッファー2mlで洗浄する。次にこのオリゴ-dTカラムを、pH7.5の50mMのトリス-HCl、100mMの塩化ナトリウム、１mMのE DTAおよび0.1%のSDSを含有する1x中塩濃度バッファー2mlで洗浄する。該mRNAを該オリゴ-dTカラムから、pH7.5の10mMのトリス-HCl、pH7.5の1mMのEDTAおよび0. 05%のSDSを含有するバッファー1mlで溶出する。このmRNAを、該溶液をフェノール／クロロホルム溶液で抽出し、次いで100%のクロロホルムで１回抽出することにより精製する。このmRNAを、エタノール沈殿法により濃縮し、次いでDEPC-H₂O 中で沈殿させ、-70℃にて保存する。上記工程で単離した該mRNAは、該ハイブリドーマにより生成された抗体を構成する該重鎖および軽鎖可変領域両者をコードするmRNAを含む。 B．ポリメラーゼ連鎖反応を利用する該可変領域の単離 PCR増幅の準備において、上記実施例において調製した該mRNAを、プライマー伸張反応によるcDNA合成用の鋳型として使用する。典型的な50μｌの転写反応において、水中の5-10μｇの該ハイブリドーマmRNAを、まずOrlandi等，Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A.，1989，86:3833-3937に記載のように、500ng(50.0pmol) の3'V_Hプライマーと、65℃にて５分間ハイブリッド化する。次いで、該混合物を1.5mMdATP、dCTPおよびdTTP、pH8.0の40mMのトリス-HCl、8mMのMgCl₂、50mM のNaCl、2mMのスペルミジンに調製する。モロニー−マウスロイケミアウイルス( Moloney-Murine Leukemia Virus)逆転写酵素（26単位，Stratagene）を該溶液に添加し、この溶液を37℃にて１時間保持する。 PCR増幅は、該逆転写酵素反応生成物（約５μｇのcDNA/RNAハイブリッド）、O rlandi等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1989，86:3833-3937に記載の300ng の3'V_Hプライマー、同様にOrlandi等の上記文献に記載の5'V_Hプライマー各々300 ng、200mMのdNTP混合物、50mMのKCl、pH8.0の10mMのトリス-HCl、15mMのMgCl₂、 0.1%のゼラチンおよび２単位のTaqDNAポリメラーゼを含む100μｌの反応液中で実施する。この反応混合物を、無機油上に積層し、40サイクルの増幅にかける。各増幅サイクルは92℃にて１分間の変性、52℃にて２分間のアニーリングおよび 72℃にて1.5分間のプライマー伸張（延長）によるポリヌクレオチド合成を含む。該増幅されたV_H−コードDNA同族体含有サンプルを、フェノール−クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿させ、-70℃にて10mMのトリス-HCl(pH7.5)および1mMのEDTA中で保存する。該軽鎖可変領域を同様な方法で、但し該ラムダまたはカッパ軽鎖に対して特異的な3'V_Hプライマーおよび5'V_Hプライマーを使用して、単離する。このPCR増幅条件は、該重鎖可変領域の単離について記載したものと同一であった。 C．該病原体特異的重鎖および軽鎖可変領域の、植物発現ベクターへの挿入該病原体特異的重鎖および軽鎖可変領域を上記のように単離し、IgAの定常部を含む植物発現ベクターに挿入する。このベクターは、標準的な分子生物学的技術を利用して構築され、かつ実施例１に記載したように、該6D4抗体由来の免疫グロブリンシグナル配列および完全に配列決定されており、以前にAuffay等，Ge ne，1981，13:365-374に記載されたMOPC315から単離した、該免疫グロブリンα 定常領域両者をもつ、pMON530の派生体である。このベクターは、また該免疫グロブリンシグナル配列と該IgAの定常領域遺伝子との間に位置するポリリンカー領域をも含んでいて、該病原体特異的重鎖可変領域を容易に挿入することを可能とする。該ポリリンカー中に存在する制限エンドヌクレアーゼサイトは、該重鎖可変領域を単離するのに使用した該PCRプライマー中に存在する制限エンドヌクレアーゼサイトと相容性である。該病原体特異的重鎖可変領域は、該ベクターを適当な制限酵素で切断し、また可変領域を単離するのに使用した該PCRプライマー中に存在する、該病原体特異的可変領域を適当な制限酵素サイトで切断することにより、該ベクター中に挿入される。次いで、該病原体特異的可変領域を該ベクターに連結する。次いで、このベクターを、実施例４に記載した方法で植物中に導入する。この病原体特異的IgA重鎖を含有する植物を同定し、次いで該病原体特異的軽鎖を含有する植物と交配する。適当な軽鎖と結合した該病原体特異的軽鎖可変領域を含む植物を、病原体特異的重鎖可変領域含有植物の製造と同様な技術を利用して製造する。性的交配を利用して、該病原体特異的重鎖および軽鎖を、同一の植物内に導入して、組み合わせIgAを含む植物を製造する。該分泌成分をコードする遺伝子を、植物発現ベクター、例えばpMON530ベクターに導入することにより、IgAの分泌成分を含む植物を製造する。該分泌成分の配列は、Mostov等，Nature，1984，308:37により記載されている。該分泌成分をコードする遺伝子は、標準的な分子生物学的技術を利用して、適当なシグナル配列と共に、該pMON530ベクターに挿入される。得られた分泌成分−含有ベクターを使用して、植物細胞を形質転換し、該分泌成分を含みかつ発現する植物を生成する。 IgA免疫グロブリンのＪ鎖または結合鎖を含む植物は、該Ｊ鎖をコードする該遺伝子を、該分泌成分、該軽鎖および重鎖について記載したように、植物発現ベクターに挿入することにより生成される。該Ｊ鎖コード遺伝子は、Max等，J．Ex ．Med.，1985，161:832-849により配列決定されている。更に、他のＪ鎖の配列は、免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest),第４版，U.S．Dept．of Health & Human Services,（1987）において入手できる。該ベクターを使用して、該Ｊ鎖を発現する植物を生成する。これらＪ鎖発現植物を、該分泌成分を発現する植物と交配して、該分泌成分および該Ｊ鎖両者を発現する植物を製造する。次いで、これら植物を該病原体特異的IgA抗体を発現する植物と交配して、２つのIgA分子、分泌成分およびＪ鎖で構成される、真の分泌型IgAを発現する植物を生成する。 D．分泌された病原体に対する受動免疫性の発生分泌型IgAを生成する植物を、実施例11に従って製造した。これらの植物は、シゲラ(Shigella)毒素に対して免疫特異性である分泌型IgAを生成した。この分泌性IgAは、13C2(ATCC #CRL1794)と命名されたハイブリッドから、重鎖および軽鎖可変領域を単離することにより製造した。該分泌型IgAを発現する植物は、約１mgの分泌型IgAを、それぞれ10〜100gの植物物質につき含んでいた。これらの植物を収穫し、受動免疫性の発生のために使用したが、該植物は依然として新鮮さを保っている。受動免疫性を必要とする成人を、１日当たり１〜４回、該分泌型IgAを発現する植物10〜100gを摂取させることにより免疫化し、次いで受動免疫性発現を、シゲラ毒素を含有するバクテリアのある用量で摂取させることにより分析する。該成人は、重炭酸ナトリウムを含有する１オンスの水に懸濁した該シゲラバクテリアの約1.2x10⁹コロニー−形成単位を摂取する。約15分〜1/2時間後に、該成人は更に該分泌型IgAを勧誘する植物10〜100gを摂取した。該成人を、該バクテリアの接種後１〜２日間、下痢の存在について追跡する。下痢の出現頻度は、該分泌型IgAを含有する植物を摂取した成人においては、該分泌型IgA含有植物を摂取せずに、同一のバクテリアの攻撃に付した他の成人と比較して、大幅に低下する。シゲラ毒素およびシゲラ様毒素(SLT1)を、該ハイブリドーマ13C2(ATCC #CRL17 94)から、その重鎖および軽鎖可変領域を単離することにより調製する。この植物は、10〜100gの植物物質当たり約１mgの抗−シゲラ抗体を含む。該抗−シゲラ抗体を含む植物を単離し、かつホモジナイズし、幼児用のフォーミュラに配合する。幼児には、通常の授乳に対する補給として、毎日３回以上の用量で、6-600mg に相当する、所定量の植物物質中に存在する抗体を与える。これら幼児につき、引き続き通常のシゲラバクテリアに対する暴露後、該幼児内におけるシゲラ疾患の発生率を測定する。シゲラ毒素に対して特異的な該分泌型IgAを含有する該植物物質を摂取した幼児においては、該分泌型IgAを含有する該植物物質を摂取せずに、同一の量のシゲラに暴露した幼児と比較した場合、シゲラによる疾患の発生率は大幅に減じられる。実施例15：分泌型抗体の発生および組み立て分泌型免疫グロブリンＡ(SIgA)は、粘膜分泌物中の免疫グロブリン(Ig)の最も豊富な型であり、該粘膜においてこの免疫グロブリンは、感染性薬物に対して第一の防禦ラインの一部を構成する。該分子は、主として11Sダイマー形状で存在し、そこで２つのモノマー型IgA抗体単位が小さなポリペプチド結合(Ｊ)鎖および第四のポリクローナルペプチド、即ち分泌型成分(SC)と結合している。モノクローナルSIgAを生成する能力は、実質的な価値のあるものである。しかし、哺乳動物においては、２つの異なる細胞型がSIgAを生成するのに必要とされ、その合成は、原形質細胞がダイマー型IgA(dIgA)を分泌し、かつ上皮細胞が該ポリマー状Igレセプタ(pIgR)を発現することを必要とするので、極めて複雑である。これとは対照的に、植物においては、ただ一つの細胞が、分泌型分子の組み立てに必要とされるに過ぎない。通常は、上皮バソラテラル(basolateral)表面上のpIgR がdIgAと結合して、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、ホスホリル化、タンパク分解、および該分泌における頂端表面における該SIgAの最終的な放出を開始する(Mostov，Ann．Rev．Immunol.，1994，12:63)。かくして、トランスジェニック植物の分泌型抗体を組み立てる能力に注目することは重要である。我々は、更にこの組み立て過程、特に分泌型免疫グロブリンの組み立て過程を「作動」するのは該重鎖であり、かつＣα2およびＣα3が該分子の二量化（データは提示せず）を十分に可能とすることをも見出した。以下に記載する構築体の多くが、重鎖および軽鎖部分を含むが、軽鎖配列を含むことは必ずしも必要ではないことに注意すべきである。即ち、例えば一本鎖抗体および１を越える可変重鎖領域を含む免疫グロブリンが、本明細書に記載するように有用である。 A．分泌型抗体の発現用のベクターの調製マウス抗体(Guy's13)の該重鎖および軽鎖、マウスＪ鎖およびウサギSCをコードする遺伝子を、以下に記載するように、別々のトランスジェニックタバコ植物の後の形質転換のために、二重35S-NOS発現カセットベクター、pMON530またはpM ON530Lにクローニングした。 Guy's13は、マウスIgG1モノクローナル抗体(mAb)であり、これはストレプトコッカスミュータンス(Streptococcus mutans)およびS.ソブリヌス(sobrinus)(Smi th & Lehner，Oral Microbiol．Immunol.，1989，4:153)の185kD連鎖球菌抗原(S /A)I/II細胞表面接着分子を認識する。S.ミュータンスはヒトにおける虫歯の主な原因であり、またSAI/IIはS.ミュータンスの歯に対する付着の開始を媒介する。SAI/IIは連鎖球菌アドヘジンの科に属し、Guy's13は、連鎖球菌の該ミュータンス群の一つを除き全てにおいて保存されている。Guy's13は、また他の口腔連鎖球菌に弱く結合している(Ma等，Eur．J．Immunol.，1994，24:131-138を参照のこと)。トランスジェニックな完全長さのGuy's13は、N.タバクム(tabacum)植物におて生成され、正確に組み立てられることが分かっている(Ma等の上記文献) 。以前測定されたように、該重鎖のＣγ3ドメインの、IgG-分泌ハイブリドーマ( MOPC315)由来のＣα2およびＣα3ドメインでの置換による該重鎖の変性は、トランスジェニック植物中で生成される該抗体(IgA-G)の組み立てまたは機能に影響を与えない(Ma等の上記文献)。ハイブリッドIgA/IgG重鎖遺伝子をコードするために同一の構築体を、ここに記載するような発現される分泌型免疫グロブリン分子の調製において使用した。 Guy's13重鎖および軽鎖遺伝子のクローニングは、基本的にMa等の上記文献に記載のように行った。簡単に説明すれば、mRNAを該Guy's13およびマウスIgA(MOP C351)ハイブリドーマ細胞系から、酸性グアニジウムチオシアネートーフェノールクロロホルム抽出を利用して、精製した(Chomezynski & Sacchi，Anal．Bioch em.，1987，162:156)。相補DNAを、モロニーマウスロイケミアウイルス逆転写酵素(Promega，UK)を使用して作成した。 Guy's13の重鎖および軽鎖をコードするDNAを、PCR法で増幅した。このPCR 法で使用した該縮重オリゴヌクレオチドは、該増幅されたDNAフラグメント中に5 '−末端Xholおよび3'−末端Eco RI制限サイトを組み込むように設計された。オリゴヌクレオチドの例は詳細な説明に記載されており、その設計は当業者には周知である。制限酵素消化に引き続き、該免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを構成的植物発現ベクターであるpMON530Lに連結した。該ベクターは該クローニングサイトの上流側に、マウス免疫グロブリンリーダー配列を含む。該pMON530Lの配列は、カリフラワーのモザイクウイルス35Sを含む構成的発現植物ベクターである、Rog ers，Methods Enzymol.，1987，153:253-277によって記載されたpMON530から誘導される。該文献の開示事項を本発明の参考とする。該pMON530Lベクターは、アミノ酸残基配列：MELDLSLPLSGAAGGT(SEQ ID NO.12) をコードする、マウス免疫グロブリンリーダーヌクレオチド配列を除き、親ベクターと同一であり、該ヌクレオチド配列において、最後の２個のアミノ酸をコードするヌクレオチドはKpnクローニングサイトである。該挿入されたリーダーは回内因性pMON530プロモータ配列とインフレーム(in-frame)状態にある。該挿入された軽鎖配列を含む該組み換えベクターを使用して、E.コリ(DH5-α，GibcoBR L)を形質転換した。形質転換体を、天然のPCR生成物由来の、放射性標識したDNA プローブを使用した、サザンブロッティングによりスクリーニングした。プラスミドDNAを正の形質転換体から精製し、アグロバクテリウムツメファシエンス(Ag robacterium tumefaciens)に導入した(Rogers等，Methods Enzymol.，1987，153 :253)。該pMON530ベクターは、カリフラワーのモザイクウイルスの35S転写体から誘導した、天然のリーダー配列およびプロモータ配列を含み、該ベクターは、殆どの植物器官の種々の細胞型において導入遺伝子の発現を導く(Benfey & Chua ，Science，1990，250:959;Barnes，PNAS USA，1990，87:9183)。ここにおよび以下に記載する４種の導入遺伝子全てに対して同一のプロモータを使用することは、共通の植物細胞内での一致した発現の可能性を最大にした。同様な方法を利用して、２種の型のハイブリッドGuy's13の重鎖を構築した。以下の第９表に示す該合成オリゴヌクレオチドを、PCRで使用して、以下の領域を増幅した：(a)Guy's13シグナル配列〜Ｃγ１ドメイン(J1およびJ5)の3'末端まで、（b）Guy's13シグナル配列〜Ｃγ2ドメイン(J1およびJ2)の3'末端まで、および(c)Ｃα2ドメインの5'末端からMOPC315ハイブリドーマ(J3およびJ4)由来のDNAの3'末端まで。プライマーJ2、J3およびJ5はHind IIIサイトを組み込み、一方プライマーJ1およびJ4は、それぞれBg IIIおよびXholサイトを組み込んで、連結および該発現ベクターへの方向性クローニングを容易にする。該増幅したフラグメントを精製し(ジーンクリーン(Geneclean)II，Bio 101，L a Jolla，CA)、Hind IIIで37℃にて１時間消化した。該Guy's13フラグメントを、16℃にて16時間、MOPC315フラグメントにT4 DNAリガーゼ(Gibco，BRL)により連結し、該反応混合物のアリコートを、更なるPCR用の鋳型として使用し、そこではGuy's13(J1)に対して該5'末端オリゴヌクレオチドを、またMOPC315（J4）に対しては該3'末端オリゴヌクレオチドを使用した。増幅したDNAフラグメントを精製し、上記のようにpMON530に連結した。該天然のGuy's13リーダー配列をコードする該DNAは、該重鎖キメラヌクレオチド配列のクローニングのために、該PCR 増幅に関与するので、該後者のベクターを選択して使用した。というのは、これがpMON530L中に存在する、挿入されたマウスリーダー配列を欠いているからである。第９表：合成オリゴヌクレオチド次に、該軽鎖およびキメラ重鎖遺伝子を含有する、該生成した別々の発現ベクターを、別々に使用して、以下に記載するようにタバコ植物を形質転換した。本研究で使用した該SC構築体は、それぞれウサギpIgRのCOOH-末端近傍のNH₂-M ALFLL配列およびAVQSAE配列に相当する、合成オリゴヌクレオチド5'および3'プライマーにより増幅したコード−長さのcDNAからなっていた(Mostov等，Nature ，1984，308:37)。該5'および3'プライマーは、それぞれpMON530に方向性結合を可能とするために、BgIIIおよびEco RI制限クローニングサイトを組み込むように設計された。更に該3'プライマーは、該Eco RIサイトに、直ぐ5'側で、しかも該SC構築体の任意の末端として選択されたコドンの3'側に停止コドンを組み込むように設計された。かくして、該5'および3'プライマーは、5'から3'の方向に列挙すると、SCGATCT ATGGCTCTCTTCTTGCTC(SEQ ID NO.18)およびAATTC TTATTCCGCA CTCTGCACTGC(SEQ ID NO.19)なる各ヌクレオチド配列を有していた。該制限サイトは下線を施してある。該SC構築体を増幅した、該ウサギのpIgR配列は、ゲンバンク承認番号(GenBank Accession Number)K01291を通して入手でき、SEQ ID NO.20に列挙してある。上記プライマーは、それぞれSEQ ID NO.20に示された、124〜1995の位置を含むヌクレオチド領域を増幅する。この増幅されたフラグメントは、SEQ ID NO.21にも示されているが、この場合3'停止コドンTAAを有する。そのコードされたアミノ酸配列は、SEQ ID NO.22に示してある。次に、クローニング用の制限サイトを含む、該PCR増幅されたSCフラグメントを、後のタバコ植物の形質転換のため、pMO N530に方向性連結する目的で、BgIIIおよびEco RIで消化した。コード−長さの相補DNA(cDNA)からなるマウスＪ鎖構築体を、該マウスＪ鎖の該NH₂-末端MKTHLLおよび該COOH−末端SCYPD配列に対応する、合成オリゴヌクレオチドプライマーで増幅した(Matsuuchi等，PNAS USA，1986，83:456)。マウスＪ鎖構築体は、またMatsuuchi等，PNAS USA，1986，83:456-460に記載の、該Ｊ鎖cDNAを使用しても調製できる。該SC構築体について上記したように、該Ｊ鎖遺伝子用の該5'および3'プライマーは、それぞれpMON530への方向性連結を可能とするように、BgIIIおよびEco RI 制限クローニングサイトを組み込むように設計された。更に、該3'プライマーは、該Eco RIサイトに対して、直ぐ5'側で、しかも該SC構築体の任意の末端として選択されたコドンに対して3'側に停止コドンを組み込むように設計された。かくして、該5'および3'プライマーは、5'から3'の方向に列挙すると、GATCT ATGAAG ACCCACCTGCTT(SEQ ID NO.23)およびAATTC TTAGACAGGGTAGCAAGA(SEQ ID NO.24) なる各ヌクレオチド配列を有していた。該制限サイトは下線を施してある。該Ｊ鎖構築体を増幅した、該免疫グロブリンＪ鎖配列は、ゲンバンク承認番号 (GenBank Accession Number)M12555を通して入手できる。該ゲンバンク配列のエキソン１〜エキソン４に相当する、該PCR増幅したJ鎖cDNA配列は、SEQ ID N0.25 に示され、これは停止配列をコードする3'TAAコドンを含む。そのコードされたアミノ酸配列はSEQ ID NO.26に示されている。次いで、クローニング用の該制限サイトを含む、該PCR増幅されたＪ鎖フラグメントを、後のタバコ植物の形質転換の目的で、pMON530に方向性連結するために、BgIIIおよびEco RIで消化した。 B．トランスジェニック植物の製造次いで、トランスジェニック植物を、基本的に以下のようにして再生した。タバコ葉組織を、該必要なタンパク質各々に対して上で調製した該組み換えプラスミドを含むアグロバクテリウムを使用して、別々に形質転換して、分泌型免疫グロブリンを生成した。再生された植物を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により、該Ｊ鎖をコードするRNA転写体の製造のためにおよびタンパク質イムノブロット分析によりSCを製造するためにスクリーニングした。正の形質転換体を自家受粉させて、同型接合子孫を生成した。 C．トランスジェニック植物および交配子孫において発現されたタンパク質の分析上記セクションＢにおいて生成したトランスジェニック植物中で発現されたタンパク質を分析するために、また交配した植物子孫中で発現されたタンパク質を分析するために、植物抽出物のタンパク質イムノブロット分析を、非−還元性および還元性条件下で行った。該２つの型の分析のために、葉のセグメントをロイペプチン(10μｇ/ml)(Calbiochem，San Diego，CA)を含む、トリス−緩衝塩水(T BS)(150mMのNaClおよび20mMのトリス-HCl(pH8))中でホモジナイズした。非−還元性条件に対しては、該抽出物を３分間75mMのトリス-HCl(pH6.8)および2%SDS中で沸騰させた。次いで、４または10%アクリルアミド中で、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を実施した。該ゲルをニトロセルロース上にブロッティングした。該ブロットを、２時間に渡り、0.05%のツイーン20(Merck Ltd.，Leicester，UK)および1%の脱脂粉乳を含むTBS中でインキュベートし、次いで適当な抗−血清とインキュベートし、かつ２時間37℃にてインキュベートした。抗体結合を、ニトロブルーテトラゾリウム(300mg/ml)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(150mg/ml)と共にインキュベートすることにより検出した。非−還元性条件下での検出は、該マウスκ軽鎖またはウサギSCに対する抗−血清を使用して実施した。還元条件下で調製した植物抽出液のタンパク質イムノブロットは、同様に実施した。サンプルを上記のように調製した。但し、5%のβ−メルカプトエタノールを添加した。10%アクリルアミド中でSDS-PAGEを実施し、該ゲルを前と同様にブロッティングした。検出は、該マウスγ１重鎖、マウスκ軽鎖、またはウサギSC に対する抗−血清を使用し、次いで適当な第二層としてのアルカリンホスファターゼ結合抗体を使用して実施した。非−還元条件下で、該κ軽鎖に対する抗−血清を使用した、該IgA-Gの植物抽出液のタンパク質イムノブロット分析は、約210kDのバンドを示し、これは天然のIgG1抗体と比較して、該IgA-G抗体構築体中の余分の定常領域の存在と一致している。幾つかのより小さなタンパク分解フラグメントも検出され、これは以前の発見と一致している(Maの上記文献)。以下のサンプルを、かかるアッセイにおいて、還元性条件下でテストした：(1 )ハイブリドーマ細胞培養物上澄中で調製されたGuy's13mAb、（2）形質転換されていない野性型の植物、（3）Guy's13の変性された重鎖および軽鎖遺伝子を発現するトランスジェニック植物、（4）Guy's13および該Ｊ鎖の変性された重鎖および軽鎖遺伝子を発現するトランスジェニック植物、（5）Guy's13、該Ｊ鎖および SCの変性された重鎖および軽鎖遺伝子を発現するトランスジェニック植物、（6 ）SCを発現するトランスジェニック植物、および（7）該Ｊ鎖を発現するトランスジェニック植物（データは提示せず）。該Ｊ鎖を発現する該植物を、IgA-Gを発現する植物と交配し、植物抽出液のイムノブロット分析を実施した。この子孫は、第二の大きなIgバンドを約400kDに示し、これは該IgA-G分子の相対的分子量のほぼ２倍であり、このことは二量化抗体(dIgA-G)が組み立てられたことを示唆した。dIgA-Gを発現した成熟植物を、 SCを発現した同型の植物と交配させた。この子孫植物(SIgA-G)は、非−還元条件下でのタンパク質イムノブロット分析において、約470kDの高分子量バンドを生じるものを含んでいた。このような分子サイズは、分泌型Igに対して予想されるものと一致する。SCに対する抗−血清を使用した検出は、この高分子量タンパク質がSCを含むことを確認した。この植物抽出液は、また400kDのバンド(dIgA-G) および210kDバンド(IgA-G)をも含んでいたが、これらは該κ軽鎖に対する抗−血清によってのみ検出され、SCに対する抗−血清によっては検出されなかった。SC のみを分泌するトランスジェニック植物においては、非−還元性条件下でのタンパク質イムノブロッティングにおいて、高分子量のタンパク質は全く検出されず、結果としてSCが内因性の植物タンパク質で組み立てられ、もしくはマルチマーを形成するという証拠はなかった。更に還元条件下でのタンパク質イムノブロット分析は、抗体(IgA-G、dIgA-GおよびSIgA-G)を発現するが、該Ｊ鎖またはSCを発現しない植物由来の抽出液が、同一の抗体重鎖および軽鎖を含んでいることを立証した（データは提示せず）。該SCおよびSIgA-G植物のみが、SCに対する抗−血清により認識されるタンパク質を発現した（データは提示せず）。Ig重鎖由来のSCの還元条件のみでの分解は、該SC鎖が、組み立てられたSIgA-G分子中で、少なくとも部分的に共有結合的に結合していることを示唆した。主なSCバンドの還元条件下での分子量は約50kDであり、これは予想値(66.5kD)よりも低かった。これは恐らくタンパク質分解の結果であり、該タンパク質分解は該完全な植物中でまたはサンプルの調製中に生じたものと思われる。ダイマーIgAと結合したSCは、しばしばタンパク質分解に付されて、インビボで小さいが生物学的に活性な形状にあることが分かっている(Ahn en等，J．Clin．Invest.，1986，77:1841)。しかしながら、非−還元性条件下での該タンパク質イムノブロット分析では、dIgA-GとSIgA-Gとの間の分子量の差異は、予想通り約70kDであった。該野性型のコントロール植物からの抽出液には、交叉反応するタンパク質は検出されなかった。 D．抗体組み立てのためのトランスジェニック子孫の生成哺乳動物においては、抗体によるSCの組み立ては、該Ｊ鎖の存在を必要とするが(Brandzaeg & Prydz，Nature，1984，311:71)、この局面は植物における発現の場合にも検討された。かくして、モノマー型のIgA-Gを発現する植物を、SC− 発現植物と交配した。 IgA-GのSCとの同時発現の確認するための努力において、トランスジェニック植物抽出液のタンパク質イムノブロッティングを、非−還元性および還元性条件下で実施した。サンプルをセクションB.1に記載のようにして調製した。非−還元性条件下では、タンパク質イムノブロッティングを、4%SDS-PAGEで行い、κ軽鎖に対するヤギ抗−血清を、次いでヤギIgGに対するアルカリンホスファターゼ −標識したウサギ抗−血清を使用して検出した。還元性条件下では、タンパク質イムノブロッティングを、10%SDS-PAGEで実施し、SCに対するヒツジ抗−血清、引き続きヒツジIgGに対するアルカリンホスファターゼ−標識したロバ抗−血清を使用して検出した。この子孫においては、該抗体の210kDのモノマー型のみが、該κ軽鎖に対する抗−血清により認識され、SCに対する抗−血清は遊離のSCを認識するが、Igと結合したタンパク質を認識しなかった（データは提示せず）。これらの結果は検討した10個の全ての植物において確認され、一方で該Ｊ鎖、該抗体鎖およびSCを同時に発現した10個の全ての植物は、470kDのSIgA-G分子を組み立てた。この発見は、Igと結合したSCに対する該Ｊ鎖の必要性を明らかにし、かつ植物中の遺伝子結合の特性が、哺乳動物中の性質と類似していることを示唆している。機能性抗体の研究は、酵素−結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)により、５個の植物構築体を使用して実施した（第４図）。この手順は本質的に以下のようにして実施した。マイクロタイタープレートを、TBS中の精製SAI/II(2μｇ/ml)または重炭酸バッファー(pH9.8)中の対数増殖期のS.ミュータンス(NCTC 10499)の何れかで被覆した。TBS中の5%脱脂粉乳により、室温にて２時間遮断した。植物の葉を、ロイペプチン(10μｇ/ml)を含むTBS中でホモジナイズした。得られた上澄を連続的な２倍の希釈率で、該マイクロタイタープレートに添加し、室温にて２時間インキュベートした。 0.05%のツイーン20を含むTBSで洗浄した後、結合したIg鎖を、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)(Nordic Pharmaceuticals，UK)と結合した、マウス軽鎖に対するヤギ抗体またはSCに対するヒツジ抗−血清の何れかを使用し、次いでアルカリンホスファターゼと結合したヤギIgに対するロバ抗体を使用して検出した。結合抗体を室温にて２時間適用した。HRP-結合抗体を、2,2'-アジノ−ジ- (3-エチルベンズチアゾリンスルホネート)(Boehringer Mannheim，Indianapolis ，IN)で検出し、アルカリンホスファターゼ結合抗体を、ニナトリウムp-ニトロフェニルホスフェート(Sigma，UK)で検出した。該抗体溶液の濃度は、まず既知濃度で使用したマウスIgA mAb(TEPC-21)と比較して、ELISA法により測定した(Ma 等(1994)の上記文献)。該抗原−結合ELISAにおいて、各抗体溶液の最初の濃度は５μｇ/mlであった。第4A-C図に示した結果を、以下のように説明することができる。即ち、第4A-C 図は、405nm(A₄₀₅)における吸光度により測定した、トランスジェニックN.タバカム(tabacum)における機能性抗体発現の存在を示す。これら３枚の図全てにおいては、Guy's13ハイブリドーマ細胞培養物上澄(IgG)を、正のコントロールとして使用した。各抗体溶液の初期濃度は５μｇ/mlであった。希釈数は連続的二倍希釈を表す。図示した結果は、３回に渡る別々に行った実験の平均±SDとして表した。これら３枚の図全てにおいて、中実の四角（■）はSIgA-Gを、中実の丸（ ●）はdIgA-Gを、中実の三角（▲）はIgA-Gを、白四角（□）はSCを、白丸（○ ）はＪ鎖を、白三角（△）は形質転換されていない、野性型の植物(WT)を、および中実逆三角（▼）はGuy's13を表す。希釈率を横軸に、一方吸光度を縦軸にプロットした。抗体軽鎖および重鎖を発現する全ての植物が、特異的にSAI/IIを認識する機能性抗体を組み立てた（第4A図）。結合のレベルおよび滴定曲線は、天然のマウスハイブリドーマ細胞上澄に関する結果と同様であった。野性型の植物または該Ｊ鎖またはSCを発現する植物については、SAI/IIは検出されなかった。固定化された精製SAまたは該バクテリア細胞表面上の天然の抗原への、該抗体の結合も、SC に対する抗−血清について検出された（第4Bおよび4C図）。これらのアッセイにおいては、SIgA-G植物抗体結合のみが検出され、該IgA-GまたはdIgA-G植物中の該機能性抗体については検出されなかった。これらの結果は、SCは、該SIgA-G植物中の抗体により組み立てられるが、抗原の認識または結合を妨害しないことを示している。植物中の機能性Ig分子の組み立ては、極めて効果的である(Hiatt等，Nature， 1989，342:76)。SIgA-Gを発現する植物についての初期の評価は、約50%の該SCが、該植物抽出液中のダイマー型のIgA-Gと結合することを示唆している（データは提示せず）。予備的実験結果は、完全に開いた葉片から得られる該SIgA-Gの量が、１ｇ当たりまたは材料の新鮮重当たり、200〜500μｇ/gであることを示している。この収率は、モノマー型のIgA-Gについて測定された値よりもかなり大きく、またSIgA-Gがタンパク分解に対してより高い抵抗性をもつという示唆と一致している。ここで、植物の組み立ての適合度は、該Ｊ鎖によるモノマー型抗体の二量化を含むように拡張された。昆虫細胞中のバキュロウイルスの使用による、該Ｊ鎖と組み換えIgAとの同時発現が報告されている(Carayannopoulos等，PNAS USA，199 4，91:8348)が、該発現された抗体の僅かに少量のみが二量化されるに過ぎず、その殆どはモノマー型に留まっていた。これとは対照的に、植物においては、該ダイマー抗体集団が、全抗体の主要部分(約57%)を占めている（データは提示せず）。これは、親mAbと同様に対応する抗原にも結合し、しかも該全組み立て抗体の大部分を構成する（約45%;データは提示せず）、組み換えられた分泌型抗体 (SIgA-G)に関する最初の報告でもある。タンパク質イムノブロット分析は、潜在的にSIgA-Gの組み立ての程度を過少評価する。というのは、この分析はSCに共有結合的に結合した抗体を検出するに過ぎないが、SIgAはインビボにおいて、共有結合または非−共有結合により結合した分子の混合物として存在できるからである(Schneiderman等，PNAS USA，1975，86:7561)。 SIgA-Gに対する４つの導入遺伝子を、同一のpMON530発現カセット、天然のリーダー配列、およびカリフラワーモザイクウイルスの35S転写体由来のプロモータ配列（これは、多くの植物生物の種々の細胞型において、導入遺伝子の発現に導く）を使用して植物中に導入した(Benfey & Chua，Science，1990，250:959; Barnes，PNAS USA，1990，87:9183)。４種全体の導入遺伝子に対してこの同一のプロモータを使用することにより、共通の植物細胞中での同時発生的な発現の可能性を最大にした。 E．顕微鏡観察植物検体を、本質的に以下のようにして、顕微鏡観察のために調製した。葉身をセグメント(2X10mm)に細断し、100mM燐酸ナトリウム(pH7.4)中の3%(w/v)パラホルムアルデヒド、0.5%(w/v)グルタルアルデヒドおよび5%(w/v)スクロース中で固定した。一連のエタノール勾配により脱水した後、葉のセグメントをキシレンで浸潤し、パラフィン中に埋設し、断面5-mmの片に細断し、免疫化学的染色のためにスライドガラス上に載せた。該葉の切片を一次抗体（A-Gハイブリッド重鎖と反応する、マウスα鎖に対する、アフィニティー−精製したウサギ抗体またはウサギSCに対するヒツジ抗体）と共にインキュベートし、次に二次抗体（何れも 10nmの金で標識した、ウサギIgに対するヤギ抗体またはヒツジIgに対するウサギ抗体）と共にインキュベートした。免疫性金シグナルを、銀増感により高めた。 SIgA-Gの顕微鏡観察は、該葉の多くの細胞型がSIgA-G成分を含むことを明らかにした。これらタンパク質は主として、葉肉の高度に液胞をもつ細胞、特に維管束鞘細胞に蓄積され、大きな中央の液胞を取り巻く細胞質バンドは強力に染色された。光学顕微鏡レベルでは、細胞質性の抗原と、該細胞壁と原形質膜との間のルミナルアポプラスト空間に含まれるものとの識別は不可能であるが、該組み換え抗体成分が該細胞壁に侵入しないことは明らかである。 F．議論最大のSIgA-G成分、即ちSCおよび個々の細胞の原形質体またはアポプラストコンパートメントの境界内の重鎖の制限は、シグ(sig)乃至単一細胞の組み立てを制限するであろう。逆に、２つの細胞型は哺乳動物中でのSIgAの製造に必要とされる。該植物系において、膜の組み込み、トランスサイトーシス、またはその後のタンパク質分解のためのシグナルを欠いている成熟SCは、従って該細胞の分泌経路内のαドメインを含むハイブリッドIgと結合できる。モノマー状の抗体の集合が、軽鎖および重鎖両者の小胞体(ER)の攻撃を必要とすることは公知である(H ein等，Biotechnol．Prog.，1991，7:455)。従って、SIgA-Gの組み立ては、２つのサイト即ち該選択された抗体が蓄積されている、該Ｊ鎖とのダイマー化後の該 ER内で、または細胞外アポプラスト内で起こり得る。 IgG-構築体領域の固有の機能、即ちプロテインＡ結合、相補的固定、および特異的細胞表面レセプタ（Fcレセプタ）に結合する能力は、SCと結合できるダイマー状Ig内に維持できる。SIgA-Gのこれらの付随的な特徴は受動免疫療法における該複合体の機能を増強できるが、幾つかの状況の下では、これらの生物学的特性は望ましくない可能性がある。原理的には、これらの場合にはＣγ2ドメインを欠いている、SIgA-G抗体を製造することは困難ではないはずである。機能的なSIgAを生成することのできる植物の開発は、受動免疫療法に関して重要な関連性をもつ可能性がある。以前は、SCとダイマー状のIgAとのインビトロでの結合による(Mach，Nature，1970，228:1278)、またはモノクローナルIgAを分泌するハイブリドーマ細胞の皮下「バックパック(backpack)」腫瘍の挿入(Win ner等，Infect．Immun.，1991，59:977)による、SIgAの製造は困難であった。該植物はSIgAを大量に発現し、その生産は農業的に利用可能な規模にまで高めることができる。この方法は、mAbを大量に生産する経済的手段を与え、mAbを粘膜表面に適用して、連鎖球菌に対する受動免疫療法において立証されているように、感染症を予防することができた(Lehner等，Infect．Immun.，1985，50:796;Bess en & Fischetti，J．Exp．Med.，1988，167:1945;Ma等，Infect．Immun.，1990 ，58:3407)。多価抗体は、粘膜表面上のIgG(Kilian等，Microbiol．Rev.，1988 ，52:296)よりも防禦性が高く、またSCもタンパク質分解に対して、該ポリマー状の抗体を安定化上で、後分泌機能をもつことも可能である(Underdown & Dorri ngton，J．Immunol.，1974，112:949;Mestecky & McGhee，Adv．Immunol.，1987 ，40:153)。組み換えサブユニットの蓄積のための、トランスジェニック植物の性的交配の原理は、種々のIgの集合並びに他のタンパク質分子の複合体に、容易に適用できる。以上の記載は、本発明を例示するものであり、本発明を何等限定するものではない。本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更並びに改良を行うことが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハイアットアンドリューアメリカ合衆国カリフォルニア州 92103 サンディエゴトーランスストリート 660 (72)発明者ジュリアンケイシーマーイギリスロンドンエスイー11 ５ピーエヌオーセットストリートトレヴォーズハウス 13

Claims

【特許請求の範囲】 1. 単一の細胞内で、分泌型の抗体を製造し、かつ組み立てる方法であって、 a. 植物種の第一の構成員のゲノムに、分泌シグナルを生成するリーダー配列を含む、免疫グロブリンアルファ重鎖部分−含有ポリペプチドをコードする、第一の哺乳動物のヌクレオチド配列を導入して、第一の形質転換体を生成し、 b. 該植物種の第二の構成員のゲノムに、ポリペプチドリンカーまたは結合鎖をコードする第二の哺乳動物ヌクレオチド配列を導入して、第二の形質転換体を生成し、 c. 該植物種の第三の構成員のゲノムに、分泌型成分をコードする第三の哺乳動物ヌクレオチド配列を導入して、第三の形質転換体を生成し、 d. 該形質転換体を性的に交雑させて、該３種全ての哺乳動物の配列を含む子孫集団を生成し、および e. 該子孫集団から、分泌型抗体を生産するトランスジェニック植物種を単離する、諸工程を含むことを特徴とする上記方法。 2. 該方法が、更に該植物種の第四の構成員のゲノムに、分泌シグナルを生成するリーダー配列を含む、免疫グロブリン軽鎖部分−含有ポリペプチドをコードする、第四の哺乳動物のヌクレオチド配列を導入して、第四の形質転換体を生成する工程と、該第四の形質転換体と、該他の形質転換体とを性的に交雑させて、該４種全ての哺乳動物配列を含む子孫集団を生成する工程と、該子孫集団から、分泌型抗体を生産するトランスジェニック植物種を単離する工程とを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 3. 該第一の哺乳動物のヌクレオチド配列が、一本鎖抗体をコードする、請求の範囲第１項に記載の方法。 4. 該第一の哺乳動物のヌクレオチド配列が、１を越える可変領域を含む、免疫グロブリンアルファ重鎖部分−含有ポリペプチドをコードする、請求の範囲第１項に記載の方法。 5. ヌクレオチド配列を、別々のベクターを介して導入する、請求の範囲第１項に記載の方法。 6. a. １以上の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ポリペプチドリンカーまたは結合鎖をコードするヌクレオチド配列、および分泌成分をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞と、 b. 該ヌクレオチド配列によってコードされる免疫学的に活性な分泌型抗体、を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。 7. 更に、１以上の軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第６項に記載の植物。 8. ３種全てのヌクレオチド配列が、単一の細胞内に含まれている、請求の範囲第６項に記載の植物。 9. ４種全てのヌクレオチド配列が単一の細胞内に含まれている、請求の範囲第７項に記載の植物。 10. 双子葉植物である、請求の範囲第６項に記載の植物。 11. 単子葉植物である、請求の範囲第６項に記載の植物。 12. 該ヌクレオチド配列各々が、別々のベクターに含まれている、請求の範囲第６項に記載の植物。 13. 予め選択されたリガンドに対して、ヒトまたは動物対象を受動免疫化する方法であって、該対象に予防的量の、予め選択されたリガンドを結合することができる、生物学的に活性な免疫グロブリン分子を投与する工程を含み、該分子が検出可能なシアリン酸残基を含まないことを特徴とする、上記方法。 14. 該免疫グロブリン分子が、植物細胞内で包埋状態にある、請求の範囲第13項に記載の方法。 15. 該免疫グロブリン分子が、組成物の一部として投与され、かつ該組成物が、更に栄養的価値をもつ物質を含む、請求の範囲第13項に記載の方法。 16. 該栄養的価値をもつ物質が、植物または動物由来のものである、請求の範囲第15項に記載の方法。 17. 該免疫グロブリン分子が、組成物の一部として投与され、かつ該組成物が更に生理的に不活性な物質を含む、請求の範囲第13項に記載の方法。 18. 該免疫グロブリンが、抗体または免疫学的に活性なその誘導体またはフラグメントである、請求の範囲第13項に記載の方法。 19. 該免疫グロブリンが、分泌型IgAまたは免疫学的に活性なその誘導体またはフラグメントである、請求の範囲第13項に記載の方法。 20. 該予め選択されたリガンドが、病原性抗原である、請求の範囲第13項に記載の方法。