JP2015527318A - 抗cd22を含む免疫複合体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ピロロベンゾジアゼピンに共有結合する抗CD22抗体を含む免疫複合体及びその使用方法を提供する。【選択図】 図1A

Description

本発明は抗CD22を含む免疫複合体及びその使用方法に関する。
たとえば、CD19、CD22及びCD52のようなB細胞抗原はリンパ腫の治療のための治療可能性の標的を代表するものである(Grillo−Lopez A.J. et al., Curr Pharm Biotechnol, 2:301−11, (2001))。CD22は、分化の成熟段階でのみB細胞表面に発現される135kDaのB細胞限定のシアロ糖タンパク質である(Dorken, B. et al., J. Immunol. 136:4470−4479 (1986))。ヒトにおけるCD22の優勢な形態は細胞外ドメインにて7つの免疫グロブリンスーパーファミリーのドメインを含有するCD22βである(Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173:137−146 (1991))。変異体CD22αは免疫グロブリンスーパーファミリーのドメイン3と4を欠く(Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345:74−77 (1990))。ヒトのCD22へのリガンドの結合は免疫グロブリンスーパーファミリーの1と2(エピトープ1と2とも呼ばれる)に関連することが示されている(Engel, P. et al., J. Exp. Med. 181:1581−1586, 1995)。
B細胞関連の疾病には、悪性リンパ腫(非ホジキンリンパ腫、NHL)、多発性骨髄腫及び慢性リンパ性白血病(CLL、B細胞白血病(CD5+Bリンパ球)が挙げられるが、これらに限定されない。原則としてBリンパ球から生じる癌の不均質な群である非ホジキンリンパ腫(NHL)は新しく診断された癌すべてのおよそ4%に相当する(Jemal, A. et al., CA−Cancer J Clin, 52: 23−47, (2002))。侵攻性のNHLは成人NHLのおよそ30〜40%を構成し(Harris, N.L. et al., Hematol. J. 1:53−66 (2001))、それには、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、末梢T細胞リンパ腫、及び未分化大細胞型リンパ腫が含まれる。最前線の併用化学療法では侵攻性NHL患者の半数未満しか治癒せず、ほとんどの患者は結局彼らの疾患に屈する(Fisher, R.I. Semin. Oncol. 27(suppl 12): 2−8 (2000))。
B細胞NHLでは、CD22の発現は侵攻性の集団及び緩慢型の集団でそれぞれ91%〜99%に及ぶ(Cesano, A. et al., Blood 100:350a (2002))。CD22は、B細胞活性化複合体の構成成分(Sato, S. et al., Semin. Immunol. 10:287−296 (1998))として及び接着分子(Engel, Pl t al., J. Immunol. 150:4719−4732 (1993))としての双方で機能し得る。CD22を欠損するマウスのB細胞は寿命が短く、アポトーシスが多いということは、B細胞の生き残りにおけるこの抗原の役割を示唆している(Otipoby, K.L. et al., Nature (Lond) 384:634−637 (1996))。天然のリガンド(単数又は複数)又は抗体と結合した後、CD22は速やかに内部移行し、一次B細胞にて共刺激シグナルを、及び腫瘍性B細胞にてアポトーシス促進性シグナルを提供する(Sato, S. et al., Immunity 5:551−562 (1996))。
たとえば、癌のようなCD22に関連する状態の診断及び治療のためにCD22を標的とする剤に対する当該技術におけるニーズがある。本発明はそのニーズを満たし、他の利益を提供する。
本発明は抗CD22抗体及び免疫複合体及びその使用方法を提供する。
一部の実施形態では、細胞傷害剤に共有結合するCD22を結合する抗体を含む免疫複合体が提供され、その際、抗体は配列番号28のアミノ酸20〜240の範囲内のエピトープを結合する。一部の実施形態では、細胞傷害剤はピロロベンゾジアゼピンである。
一部の実施形態では、抗体は、(i)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3及び(iii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2を含む。一部の実施形態では、抗体は、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む。一部の実施形態では、抗体は、(a)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(vi)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(vi)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。一部の実施形態では、抗体は、(a)(i)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は(b)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。一部の実施形態では、抗体は、(a)配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、又は(b)配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列、又は(c)(a)にあるようなVH配列と(b)にあるようなVL配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号7のアミノ酸配列を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を有するVL配列、又は配列番号8のアミノ酸配列を有するVL配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、IgG1抗体、IgG2a抗体又はIgG2b抗体である。
一部の実施形態では、細胞傷害剤に共有結合するCD22を結合する抗体を含む免疫複合体が提供され、その際、抗体は(a)配列番号7のアミノ酸配列を有するVH配列及び配列番号8のアミノ酸配列を有するVL配列を含み、細胞傷害剤はピロロベンゾジアゼピンである。
一部の実施形態では、免疫複合体は式Ab−(L−D)pを有し、式中、(a)Abは抗体であり、(b)Lはリンカーであり、(c)Dは細胞傷害剤であり、(d)pは1〜8の範囲である。そのような一部の実施形態では、Dは式Aのピロロベンゾジアゼピンであり、
Figure 2015527318
式中、点線はC1とC2の間又はC2とC3の間での二重結合の任意の存在を示し、
はH、OH、=O、=CH、CN、R、OR、=CH−R、=C(R、O-SO-R、COR及びCORから独立して選択され、任意でさらにハロ又はジハロから選択され、その際、Rは、R、COR、COR、CHO、COH、及びハロから独立して選択され;
及びRは、H、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから独立して選択され;
は、H、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから独立して選択され;
Qは、O、S及びNHから独立して選択され;
11はH、又はRのいずれかであり、又はQがOである場合、SOMであり、Mが金属カチオンであり;
R及びR’はそれぞれ独立して、任意で置換されたC1−8アルキル基、C3−8ヘテロシクリル基及びC5−20アリール基から選択され、任意でNRR’基に関連して、R及びR’はそれらが結合する窒素原子と一緒に任意で置換された4、5、6又は7員環の複素環を形成し;
12、R16、R19及びR17はそれぞれR、R、R及びRについて定義されたとおりであり;
R”は、C3−12アルキレン基であり、1以上のヘテロ原子及び/又は任意で置換される芳香族環によって鎖が中断されてもよく;
X及びX’は独立してO、S及びN(H)から選択される。
一部の実施形態では、Dは、構造:
Figure 2015527318
を有し、その際、nは0又は1である。
一部の実施形態では、Dは、
Figure 2015527318
から選択される構造を有し、式中、R及びRE”はそれぞれ独立してH又はRから選択され、その際、RはR、COR、COR、CHO、COH及びハロから独立して選択され、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールから選択され、nは0又は1である。
一部の実施形態では、Dは式Bのピロロベンゾジアゼピンであり、
Figure 2015527318
式中、横波線はリンカーに対する共有結合部位を示し、RV1及びRV2は独立してH、メチル、エチル、フェニル、フルオロ置換されたフェニル及びC5−6ヘテロシクリルから選択され、nは0又は1である。
一部の実施形態では、免疫複合体はプロテアーゼによって切断可能であるリンカーを含む。一部のそのような実施形態では、リンカーはval−citジペプチド又はPhe−ホモLysジペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫複合体は式:
Figure 2015527318
を有する。一部の実施形態では、pは1〜3の範囲である。
一部の実施形態では、免疫複合体は構造
Figure 2015527318
を含み、式中、CBAは抗体(Ab)を表す。一部の実施形態では、RL1及びRL2はそれぞれ独立してH及びメチルから選択され、又はそれらが結合する炭素と一緒にシクロプロピレン基を形成する。一部の実施形態では、Yは単結合、(a1)及び(a2):
Figure 2015527318
から選択され、式中、Nは基がPBD部分のN10に結合する場所を示す。
一部の実施形態では、免疫複合体は、
Figure 2015527318
から選択される構造を含む。
一部の実施形態では、免疫複合体は構造
Figure 2015527318
を含み、式中、R及びR”はそれぞれ独立してH及びRから選択される。
一部の実施形態では、免疫複合体は構造
Figure 2015527318
を含み、式中、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールである。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから選択される。
一部の実施形態では、免疫複合体は構造
Figure 2015527318
を含み、式中、RV1及びRV2はそれぞれ独立してH、メチル、エチル、任意で置換されたフェニル及びC5−6ヘテロシクリルから選択される。一部の実施形態では、RV1及びRV2はそれぞれ独立してH、フェニル及び4−フルオロフェニルから選択される。
一部の実施形態では、
Figure 2015527318
から選択される式を有する免疫複合体が提供され、式中、Abは、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(vi)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体であり、pは1〜3の範囲である。
一部の実施形態では、免疫複合体が提供され、該免疫複合体は式
Figure 2015527318
を有し、式中、Abは、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体であり、pは1〜3の範囲である。一部の実施形態では、抗体は配列番号7のVH配列と配列番号8のVL配列を含む。一部の実施形態では、抗体は配列番号26の重鎖と配列番号23の軽鎖を含む。
本明細書で考察される実施形態のいずれかでは、抗体はモノクローナル抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体はCD22を結合する抗体断片である。一部の実施形態では、抗体はヒトCD22を結合する。一部のそのような実施形態では、ヒトCD22は配列番号28又は配列番号29の配列を有する。
一部の実施形態では、医薬製剤が提供され、該製剤は本明細書で記載される免疫複合体及び薬学上許容可能なキャリアを含む。一部の実施形態では、医薬製剤は追加の治療剤を含む。
一部の実施形態では、CD22陽性の癌を伴う個体を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は有効量の本明細書で記載される免疫複合体を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫から選択される。一部の実施形態では、方法はさらに追加の治療剤を個体に投与することを含む。一部のそのような実施形態では、追加の治療剤はCD79bを結合する抗体を含む。一部の実施形態では、追加の治療剤は細胞傷害剤に共有結合したCD79bを結合する抗体を含む免疫複合体である。
一部の実施形態では、CD22陽性細胞の増殖を阻害する方法が提供される。一部のそのような実施形態では、方法は、細胞の表面上のCD22への免疫複合体の結合を許容する条件下で本明細書で記載される免疫複合体に細胞を曝露し、それによって細胞の増殖を阻害することを含む。一部の実施形態では、細胞は腫瘍性B細胞である。一部の実施形態では、細胞はリンパ腫細胞である。
ヒト化10F4バージョン1(hu10F4v1)重鎖可変領域及びヒト化10F4バージョン3(hu10F4v3)重鎖可変領域と並べた、並びにヒト亜群III配列と並べたマウス10F4抗CD22抗体(m10F4)の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。HVRを四角で囲う(HVR−H1、HVR−H2、HVR−H3)。HVRを一括りにする配列はフレームワーク配列(FR−H1〜FR−H4)である。Kabatの番号付けに従って配列の番号を付ける。四角で囲ったHVRについてKabat、Chothia及びコンタクトのCDRを示す。 ヒト化10F4バージョン1(hu10F4v1)軽鎖可変領域及びヒト化10F4バージョン3(hu10F4v3)軽鎖可変領域と並べた、並びにヒトκI配列と並べたマウス10F4抗CD22抗体(m10F4)の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。抗体hu10F4v3はHVR−L1のアミノ酸28(N28V)でhu10F4v1と異なる。HVRを四角で囲う。FR−L1、FR−L2、FR−L3及びFR−L4はHVR(HVR−H1、HVR−H2、HVR−H3)を一括りにする。Kabatの番号付けに従って配列の番号を付ける。四角で囲ったHVRについてKabat、Chothia及びコンタクトのCDRを示す。 ヒト化抗CD22抗体10F4v3アイソタイプIgG1の軽鎖及び重鎖の完全長のアミノ酸配列(可変領域及び定常領域)を示す図である。下線部は定常ドメインである。 選択したアミノ酸位置にてアミノ酸をシステインで置き換えるように軽鎖又は重鎖又はFc領域を変化させる抗CD22のシステイン操作した抗体のアミノ酸配列を示す図である。示されるシステイン操作した抗体には、Kabatの205位でのバリン(順序位置ではバリン210)がシステインに変えられる抗CD22の10F4変異体軽鎖(「抗CD22 V205C h10Fv3システイン操作した軽鎖」)、EUの118位のアラニン(順序位置ではアラニン121)がシステインに変えられる抗CD22の10F4変異体重鎖(「抗CD22 A118C h10Fv3システイン操作した重鎖」)及びEUの400位のセリン(順序位置ではセリン403)がシステインに変えられる抗CD22の10F4変異体Fc領域(「抗CD22 S400C h10Fv3システイン操作したFc領域」)が挙げられる。各図では、変化したアミノ酸を二重下線と共に太字で示す。単一下線は定常領域を示す。可変領域には下線がない。 実施例Aにて記載される(A)10F4v3−PBD、(B)10F4v3−SS−PBD及び(C)10F4v3−SSMe−PBDのリンカー及び薬剤構造を示す図である。 実施例Bにて記載されるようなWSU−DLCL2マウス異種移植モデルにおける種々の抗体/薬剤の複合体の有効性を示す図である。 実施例Cにて記載されるようなGranta−519マウス異種移植モデルにおける種々の抗体/薬剤の複合体の有効性を示す図である。 実施例Dにて記載されるようなSuDHL4−lucマウス異種移植モデルにおける種々の抗体/薬剤の複合体の有効性を示す図である。 実施例Eにて記載されるようなSuDHL4−lucマウス異種移植モデルにおける10F4v3−PBDによる腫瘍増殖の用量依存性の阻害を示す図である。 実施例Fにて記載されるようなBjab−lucマウス異種移植モデルにおける10F4v3−PBDによる腫瘍増殖の用量依存性の阻害を示す図である。 実施例Gにて記載されるようなWSU−DLCL2マウス異種移植モデルにおける種々の抗体/薬剤の複合体の有効性を示す図である。
I.定義
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下で定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)のフレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)のフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一アミノ酸配列を含んでもよいし、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。一部の実施形態では、アミノ酸の変化の数は10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下又は2以下である。一部の実施形態では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子(たとえば、抗体)の単一結合部位とその結合相手(たとえば、抗原)との間の非共有結合相互作用の合計の強さを指す。別段指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は結合対のメンバー(たとえば、抗体と抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xのその相手Yに対する親和性は一般に解離定数(Kd)によって表される。親和性は、本明細書で記載されるものを含めて当該技術で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための、例となる具体的な実施形態が以下で記載される。
「親和性成熟した」抗体は、そのような変化を持たない親抗体に比べて1以上の超可変領域(HVR)にて1以上の変化を持つ抗体を指し、そのような変化は抗原に対する抗体の親和性で改善を生じる。
用語「抗CD22抗体」及び「CD22に結合する抗体」は、抗体がCD22を標的とすることにおいて診断剤及び/又は治療剤として有用であるように十分な親和性でCD22を結合することが可能である抗体を指す。一実施形態では、無関係な非CD22タンパク質に抗CD22抗体が結合する程度は、たとえば放射性免疫アッセイ(RIA)で測定したとき、CD22への抗CD22抗体の結合の約10%未満である。ある特定の実施形態では、CD22に結合する抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦5NmnM、≦4nM、≦3nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(たえば、10−8M以下、たとえば、10−8M〜10−13M、たとえば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。ある特定の実施形態では、抗CD22抗体は、異なる種由来のCD22の間で保存されているCD22のエピトープに結合する。
用語「抗体」は、広義で本明細書で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(たとえば、二重特異性抗体)及び所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むが、これらに限定されない種々の抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’);二重特異性抗体;線形抗体、単鎖抗体分子(たとえば、scFv)及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにてその抗原への参照抗体の結合を50%以上阻止する抗体を指し、逆に参照抗体は競合アッセイにてその抗原への抗体の結合を50%以上阻止する。例となる競合アッセイは本明細書で提供される。
用語「癌」及び「癌性」は、調節されない細胞の成長/増殖を通常特徴とする哺乳類における生理的な状態を指す又は説明する。癌の例には、黒色腫、癌腫、リンパ腫(たとえば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌のさらに特定の例には、高、中及び低悪性度のリンパ腫(たとえば、粘膜関連のリンパ組織B細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫(NHL)、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、びまん性大細胞型細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びホジキンリンパ腫を含むB細胞リンパ腫、及びT細胞リンパ腫)を含むB細胞に関連する癌、及び白血病(二次性白血病、慢性リンパ性白血病(CLL)、たとえば、B細胞白血病(CD5+Bリンパ球)、たとえば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病のような骨髄性白血病、たとえば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)のようなリンパ性白血病及び骨髄異形成症を含む)及び他の血液系の癌、及び/又はB細胞又はT細胞に関連する癌が挙げられる。含まれるのはまた、多形核白血球、たとえば、好塩基球、好酸球、好中球及び単球、樹状細胞、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞を含む追加の造血系細胞の癌である。含まれるのはまた、以下:リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)及びマントル細胞リンパ腫から選択される癌性のB細胞増殖性疾病である。B細胞癌の起源には、以下のように:辺縁帯における記憶B細胞での辺縁帯B細胞リンパ腫起源が挙げられ、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫は胚中心の明帯における中心細胞を起源とし、慢性リンパ性白血病及び小リンパ性リンパ腫はB1細胞(CD5+)を起源とし、マントル細胞リンパ腫はマントル帯のネイティブB細胞を起源とし、バーキットリンパ腫は胚中心の暗帯における胚中心細胞を起源とする。本明細書では「造血細胞組織」と呼ばれる造血細胞を含む組織には、胸腺及び骨髄及び、たとえば、脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ組織、たとえば、消化管関連のリンパ組織、扁桃腺、パイエル板及び盲腸及び粘膜関連のリンパ組織、たとえば、気管支内層のような末梢リンパ組織が挙げられる。そのような癌のさらなる特定の例には、有棘細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮の癌、唾液腺癌腫、腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、白血病、及び他のリンパ増殖性疾病、及び種々の型の頭頸部の癌が挙げられる。
本明細書での「B細胞悪性腫瘍」には、低悪性度の/濾胞性NHL、小リンパ性(SL)NHL、中悪性度の/濾胞性NHL、中悪性度のびまん性NHL、高悪性度の免疫芽球性NHL、高悪性度のリンパ芽球性NHL、高悪性度の小型非開裂性細胞NHL、巨大病変NHLを含む非ホジキンリンパ腫(NHL)、マントル細胞リンパ腫、AIDS関連のリンパ腫、及びワルデンシュトレームのマクログロブリン血症、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優勢ホジキン病(LPHD)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、再発した緩慢型NHL及びリツキシマブ抵抗性緩慢型NHLを含む緩慢型NHL、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む白血病;バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、及び他の血液の悪性腫瘍が挙げられる。そのような悪性腫瘍は、CD22のようなB細胞表面マーカーに対して向けられた抗体によって治療され得る。そのような疾患は、CD22のようなB細胞表面マーカーに対して向けられた抗体の投与によって治療されるように本明細書で企図され、本明細書で開示されるような非結合(「ネイキッド」)抗体又は細胞傷害剤に結合された抗体の投与が含まれる。そのような疾患はまた、抗CD22抗体を含む併用療法によって、又は別の抗体若しくは抗体薬剤複合体、別の細胞傷害剤、放射線若しくは同時に若しくは連続して投与される他の治療と併用した本発明の抗CD22抗体薬剤複合体によって治療されるように本明細書で企図される。例となる治療方法では、抗CD79b抗体、免疫グロブリン又はそのCD79b結合断片を一緒に又は連続して併用して抗CD22免疫複合体が投与される。抗CD79b抗体はネイキッド抗体であってもよいし、又は抗体薬剤複合体であってもよい。別の例となる治療方法では、抗CD20抗体、免疫グロブリン又はそのCD20結合断片を一緒に又は連続して併用して抗CD22免疫複合体が投与される。抗CD20抗体はネイキッド抗体であってもよいし、又は抗体薬剤複合体であってもよい。併用療法の一部の実施形態では、抗CD22免疫複合体はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)と共に投与される。
用語「非ホジキンリンパ腫」又は「NHL」は本明細書で使用されるとき、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を指す。ホジキンリンパ腫は一般に、ホジキンリンパ腫におけるリードスタンバーグ細胞の存在及び非ホジキンリンパ腫における該細胞の非存在によって非ホジキンリンパ腫から区別することができる。その用語によって包含される非ホジキンリンパ腫の例には本明細書で使用されるとき、Color Atlas of Clinical Hematology(第3版),A.Victor Hoffbrand及びJohn E.Pettit(編)(Harcourt Publishers Ltd.,2000)に記載されたような改訂欧米リンパ腫(REAL)スキームのような当該技術で既知の分類スキームに従って、たとえば、当業者(たとえば、腫瘍学者又は病理学者)によってそのように特定されるものが挙げられる。特に図11.57、11.58及び11.59におけるリストを参照のこと。さらに具体的な例には、再発した又は難治性のNHL、フロントライン低悪性度NHL、ステージIII/IVのNHL、化学療法耐性のNHL、前駆Bリンパ芽球性白血病及び/又はリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、B細胞慢性リンパ性白血病及び/又は前リンパ球性白血病及び/又は小リンパ性リンパ腫、B細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫及び/又はリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、節外辺縁帯−MALTリンパ腫、節辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、形質細胞腫及び/又は形質細胞骨髄腫、低悪性度の/濾胞性リンパ腫、中悪性度の/濾胞性NHL、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度のびまん性NHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、侵攻性NHL(侵攻性フロントラインNHL及び侵攻性再発NHL)、自己幹細胞移植の後再発した又はそれに抵抗性のNHL、原発性縦隔大型B細胞リンパ腫、原発性浸出液リンパ腫、高悪性度の免疫芽球性NHL、高悪性度のリンパ芽球性NHL、高悪性度の小型非開裂性細胞NHL、巨大病変NHL、バーキットリンパ腫、前駆(末梢)大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び/又はセザリー症候群、皮膚(皮膚の)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来する一方で、重鎖及び/又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」はその重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらの幾つかはさらにサブクラス(アイソタイプ)、たとえば、IgG、IgG、IgG、IgG、IgA、及びIgAに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
用語「細胞傷害剤」は本明細書で使用されるとき、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞死又は細胞に破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤には、放射性同位元素(たとえば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素)、化学療法剤又は化学療法薬剤(たとえば、メソトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤);増殖阻害剤;たとえば、核酸分解酵素のような酵素及びその断片;抗生物質;たとえば、その断片及び/又は変異体を含む細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性のある毒素のような毒素;並びに以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「化学療法剤」は癌の治療にて有用な化合物である。化学療法剤の例には、たとえば、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤;たとえば、ブスルファン、イムプロスファン及びピポスファンのようなアルキルスルホネート;たとえば、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ及びウレドパのようなアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン;アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);デルタ−9−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標));β−ラパコン;ラパコール;コルヒチン;ベツリン酸;カンプトテシン(合成類似体トポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、CPT−11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び9−アミノカンプトテシンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(アドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む);ポロフィロトキシン;ポドフィリン酸;テニポシド;クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW−2189及びCB1−TM1を含む);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンギスタチン;たとえば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード;たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチンのようなニトロソ尿素;たとえば、エネジン抗生剤(たとえば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγII及びカリケアマイシンωII(たとえば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183−186 (1994)を参照)のような抗生剤;ダイネマイシンAを含むダイネマイシン;エスペラミシン;同様に、ネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジン抗生剤発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン(モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ソルビシン;たとえば、メソトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU)のような代謝拮抗剤;たとえば、デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類似体;たとえば、フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンのようなピリミジン類似体;たとえば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン;たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤;たとえば、フォリン酸のような葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デフォファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルフォルニチン;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;たとえば、メイタンシン及びアンサミトシンのようなメイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products,Eugene,OR);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T−2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標));ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);チオテパ;タキソイド、たとえば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標);Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE(商標)パクリタキセルのクレモフォールを含まないアルブミン操作したナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及びドセタキセル(TAXOTERE(登録商標);Rhone−Poulenc Rorer,Antony,France);クロランブシル;ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標));6−チオグアニン;メルカプトプリン;メソトレキセート;たとえば、シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標));白金;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標));オキサリプラチン;ロイコボビン;ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));ノバントロン;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロネート;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);たとえば、レチノイン酸のようなレチノイド;カペシタビン(XELODA(登録商標));上記のいずれかの薬学上許容可能な塩、酸又は誘導体、並びに、たとえば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるCHOP、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるCVP及び5−FUとロイコボリンとの併用であるオキサリプラチン(ELOXATIN(商標))による治療計画の略語であるFOLFOXのような上記の2以上の併用が挙げられる。
「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプで変化する抗体のFc領域に起因する生物活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、C1q結合と補体依存性の細胞傷害性(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性の細胞介在性の細胞傷害性(ADCC);貪食作用;細胞表面受容体(たとえば、B細胞受容体)の下方調節及びB細胞の活性化が挙げられる。
剤、たとえば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療成績又は予防成績を達成するのに必要な投与量及び期間にて有効な量を指す。
用語「エピトープ」は抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
用語「Fc領域」は本明細書では、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するのに使用される。その用語にはネイティブな配列のFc領域及び変異体のFc領域が含まれる。一実施形態では、ヒトIgG重鎖のFc領域はCys226又はPro230から重鎖のカルボキシル末端に伸びる。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在してもよいし、存在しなくてもよい。本明細書で別段特定されない限り、Fc領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991にて記載されたようなEU指標とも呼ばれるEU番号付け方式に従う。
「フレームワーク」又は「FR」は超可変領域(HVR)の残基以外の可変ドメインの残基を指す。可変ドメインのFRは一般に4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3及びFR4から成る。従って、HVR及びFRの配列は一般にVH(又はVL)にて以下の配列:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4で現れる。
用語「完全長の抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、ネイティブの抗体構造に実質的に類似する構造を有する、又は本明細書で定義されるようなFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すのに本明細書で相互交換可能に使用される。
用語「CD22のグリコシル化された形態」は糖質残基の添加によって翻訳後修飾されるCD22の天然に存在する形態を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は相互交換可能に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外来性の核酸が導入されている細胞を指す。宿主細胞には「形質転換体」及び「形質転換された細胞」が挙げられ、それには、一次形質転換細胞及び継代数を問わずにそれに由来する子孫が含まれる。子孫は核酸含量にて親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有してもよい。元々の形質転換細胞についてスクリーニングされる又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫は本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生される、又はヒト抗体のレパートリー若しくはヒト抗体をコードする他の配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のそれに相当するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
「ヒトのコンセンサスフレームワーク」は、ヒトの免疫グロブリンVL又はVHのフレームワーク配列の選択にて最も共通して存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般に、ヒトの免疫グロブリンVL又はVH配列の選択は可変ドメイン配列の亜群からである。一般に、配列の亜群は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91−3242,Bethesda、MD(1991),vols.1−3におけるような亜群である。一実施形態では、VLについては亜群はKabatらの上記におけるような亜群κIである。一実施形態では、VHについては亜群はKabatらの上記におけるような亜群IIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基及びヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、HVR(たとえば、CDR)のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のそれに相当し、FRのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のそれに相当する、少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体は任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、たとえば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」はヒト化を受けた抗体を指す。
用語「超可変領域」又は「HVR」は本明細書で使用されるとき、配列にて超可変である及び/又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ)を形成する抗体の可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、ネイティブの4つの鎖を持つ抗体は、6つのHVR:VHにおける3つ(H1、H2、H3)及びVLにおける3つ(L1、L2、L3)を含む。HVRは一般に超可変ループに由来する及び/又は「相補性決定領域」(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最高の配列変異性があり、及び/又は抗原認識に関与する。例となる超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)に存在する(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987)。)。例となるCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2、及びCDR−H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、及びH3の95〜102に存在する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。)。VHにおけるCDR1を除いて、CDRは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「SDR]も含む。SDRは、短縮CDR又はa−CDRと呼ばれる領域内に含有される。例となるa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2、及びa−CDR−H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58及びH3の95〜102に存在する(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619−1633 (2008)を参照)。別段指示されない限り、HVR残基及び可変ドメインにおける他の残基(たとえば、FR残基)はKabatら、上記に従って本明細書では番号付けされる。
「免疫複合体」は細胞傷害剤を含むが、これに限定されない1以上の非相同性の分子に結合される抗体である。
「個体」又は「対象」は哺乳類である。哺乳類には、家畜(たとえば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類(たとえば、ヒト及びサルのような非ヒト霊長類)、ウサギ、及び齧歯類(たとえば、マウス及びラット)が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象はヒトである。
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から分離されているものである。一部の実施形態では、抗体は、たとえば、電気泳動法(たとえば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリ電気泳動)又はクロマトグラフィ法(たとえば、イオン交換又は逆相HPLC)によって決定されるとき、95%又は99%を超える純度に精製される。抗体の純度の評価のための方法の概説については、たとえば、Flatmanら、J.Chromatogr.B、848:79−87(2007)を参照のこと。
「単離された核酸」は、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸には、普通核酸分子を含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は染色体外に存在する、又は天然の染色体の位置とは異なる染色体の位置に存在する。
「抗CD22抗体をコードする単離された核酸」は、単一ベクター又は別々のベクターにおけるそのような核酸分子(単数又は複数)を含む、抗体の重鎖及び軽鎖(又はその断片)をコードする1以上の核酸分子を指し、そのような核酸分子(単数又は複数)は宿主細胞にて1以上の位置に存在する。
用語「CD22」は本明細書で使用されるとき、別段指示されない限り、たとえば、霊長類(たとえば、ヒト、カニクイザル(cyno))及び齧歯類(たとえば、マウス及びラット)のような哺乳類を含む脊椎動物供給源に由来するネイティブのCD22を指す。用語は「完全長の」プロセシングを受けないCD22、ならびに細胞におけるプロセシングの結果生じるCD22の任意の形態を包含する。用語はまたCD22の天然に存在する変異体、たとえば、スプライス変異体、対立遺伝子変異体及びアイソフォームも包含する。CD22の主要なアイソフォーム(CD22β)は、847のアミノ酸及び細胞外ドメインにおける7つの免疫グロブリン様の領域を含む(Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173:137−146 (1991)を参照)。主要でないアイソフォームであるCD22αは647のアミノ酸を含み、細胞外ドメインにおける免疫グロブリン様ドメイン3及び4を欠く(Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345:74−77 (1990)) and Wilson et al. (1991)、上記を参照)。例となるヒトCD22β前駆体(シグナル配列を伴う)のアミノ酸配列は配列番号28に示す。例となるヒト成熟CD22β(シグナル配列を伴わない)のアミノ酸配列は配列番号29に示す。例となるヒトCD22α前駆体(シグナル配列を伴う)のアミノ酸配列は配列番号30に示す。例となるヒト成熟CD22α(シグナル配列を伴わない)のアミノ酸配列は配列番号31に示す。
用語「CD22陽性の癌」はその表面にCD22を発現する細胞を含む癌を指す。
用語「CD22陽性の細胞」はその表面にCD22を発現する細胞を指す。
用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、たとえば、天然に存在する変異を含有する又はモノクローナル抗体の調製物の製造中に生じる考えられる変異体抗体を除いて、同一であり及び/又は同一のエピトープに結合し、そのような変異体は一般に軽微な量で存在する。通常、異なる決定基(エピトープ)に向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。従って、修飾語句「モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒトの免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する遺伝子導入動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない種々の技法によって作製されてもよく、そのような方法及びモノクローナル抗体を作製する他の例となる方法は本明細書で記載される。
「ネイキッド抗体」は非相同性部分(たとえば、細胞傷害性部分)又は放射性標識に結合されていない抗体を指す。ネイキッド抗体は医薬製剤に存在し得る。
「ネイティブ抗体」は、様々な構造を伴った天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。たとえば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合する2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)、後に続く3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)を有する。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)、後に続く定常軽鎖(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2種類の一方に割り当てられる。
用語「添付文書」は、適応、用途、投与量、投与、併用療法、禁忌及び/又はそのような治療薬に関する警告について情報を含有する、治療薬の商業包装に通例包含される指示書を指す。
参照ポリペプチド配列に関して「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、必要に応じて配列を並べ、ギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しないで、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での配列比較は、たとえば、BLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)のソフトウエアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウエアを用いて、当該技術の範囲内である種々の方法にて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大の配列比較を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を並べるための適当なパラメータを決定することができる。本明細書の目的では、しかしながら、配列比較のコンピュータプログラムALIGN−2を用いて%アミノ酸配列同一性の値を生成する。ALIGN−2配列比較のコンピュータプログラムは、Genentech社によって生み出され、ソースコードはワシントンD.C.,20559の米国著作権局にてユーザー文書と共に保管されており、米国著作権登録番号TXU510087のもとで登録されている。ALIGN−2プログラムは、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのGenentech社から公開で利用可能であり、又はソースコードからコンパイルされてもよい。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。配列比較のパラメータはすべてALIGN−2プログラムによって設定され、変化しない。
アミノ酸配列の比較にALIGN−2が採用される状況では、所与のアミノ酸配列Bへの、との又はに対する所与のアミノ酸配列Aの%アミノ酸配列同一性(所与のアミノ酸配列Bへの、との又はに対するある特定の%アミノ酸配列同一性を有する又は含むアミノ酸配列Aとして代わりに表現することができる)は以下のように算出される:
割合X/Yの100倍
その際、Xは配列比較プログラムALIGN−2によってA及びBのそのプログラムの配列比較にて同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、YはBにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同等ではない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と同等ではないことが十分に理解されるであろう。別段具体的に言及されない限り、本明細書で使用される%アミノ酸配列同一性の値のすべてはALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前の段落で記載されたように得られる。
用語「医薬製剤」は、その中に含有される有効成分の生物活性を有効にできるような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容不能に毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学上許容可能なキャリア」は、対象に対して毒性ではない、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学上許容可能なキャリアには、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「治療」(及び「治療する」又は「治療すること」のようなその文法的変形)は、治療される個体の自然経過を変える試みにおける臨床的な介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理的結末の低減、転移を防止すること、疾患の進行の速度を低下させること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の免疫複合体を使用して疾患の発生を遅らせる又は疾患の進行を遅くする。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体を抗原に結合させることに関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は一般に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)を含む(たとえば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一のVH又はVLドメインは抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、抗原を結合する抗体に由来するVH又はVLドメインを用いて特定の抗原を結合する抗体を単離し、それぞれ相補性のVL又はVHドメインのライブラリをスクリーニングし得る。たとえば、Portolanoら、J.Immunol.150:880−887(1993);Clarksonら、Nature、352:624−628(1991)を参照のこと。
用語「ベクター」は本明細書で使用されるとき、それが連結される別の核酸を伝搬することが可能である核酸分子を指す。用語には、自己複製する核酸構造としてのベクター、ならびにベクターが導入される宿主細胞のゲノムに組み入れられるベクターが含まれる。ある特定のベクターはそれが操作可能に連結される核酸の発現を指示することが可能である。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
語句「任意で置換される」は本明細書で使用されるとき、非置換であってもよい又は置換されてもよい親基に関連する。
特定されない限り、用語「置換される」は本明細書で使用されるとき、1以上の置換基を持つ親基に関連する。用語「置換基」は本明細書では従来の意味で使用され、親基に共有結合する、又は適宜親基に縮合する化学部分を指す。多種多様な置換基が既知であり、その形成及び種々の親基へのその導入の方法も既知である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される置換基(任意の置換基を含む)は抗体に対して反応性ではない基に限定される。一部の実施形態では、リンカー(L)を介してPBD化合物のN10位から抗体への連結が形成される。場合によっては、PBD構造の他の部分に位置する反応性の官能基が抗体に対するさらなる結合を形成することが可能であり得る(これを架橋と呼んでもよい)。そのような追加の結合は、場合によっては、複合体の輸送及び生物活性を変え得る。従って、一部の実施形態では、追加の置換基は反応性の官能基を欠くものに限定される。
一部の実施形態では、置換基は、R、OR、SR、NRR’、NO、ハロ、COR、COR、CONH、CONHR、及びCONRR’から選択される。一部の実施形態では、置換基は、R、OR、SR、NRR’、NO、COR、COR、CONH、CONHR、及びCONRR’から選択される。一部の実施形態では、置換基は、R、OR、SR、NRR’、NO、及びハロから選択される。一部の実施形態では、置換基は、R、OR、SR、NRR’、及びNOから成る群から選択される。
上記で考察した実施形態のいずれかが以下で記載される置換基のいずれかに適用され得る。或いは、置換基は以下で考察される基の1以上から選択され得る。
用語「C1−12アルキル」は本明細書で使用されるとき、脂肪族であり、環状であっても又は非環状であってもよく、飽和されてもよく又は不飽和であってもよい(たとえば、部分不飽和、完全不飽和)、1〜12の炭素原子を有する炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分に関連する。従って、用語「アルキル」には以下で考察されるサブクラス、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル等が含まれる。
飽和アルキルの例には、メチル(C)、エチル(C)、プロピル(C)、ブチル(C)、ペンチル(C)、ヘキシル(C)及びヘプチル(C)が挙げられるが、これらに限定されない。
飽和直鎖アルキル基の例には、メチル(C)、エチル(C)、n−プロピル(C)、n−ブチル(C)、n−ペンチル(アミル)(C)、n−ヘキシル(C)及びn−ヘプチル(C)が挙げられるが、これらに限定されない。
飽和分枝鎖アルキル基の例には、イソ−プロピル(C)、イソ−ブチル(C)、sec−ブチル(C)、tert−ブチル(C)、イソ−ペンチル(C)、及びネオ−ペンチル(C)が挙げられるが、これらに限定されない。
アルキル基には任意でO、N(H)及びSから選択される1以上のヘテロ原子が割り込み得る。そのような基は「ヘテロアルキル」と呼ばれ得る。
用語「C2−12ヘテロアルキル」は本明細書で使用されるとき、2〜12の炭素原子及びO、N(H)及びS、好ましくはO及びSから選択される1以上のヘテロ原子を有する炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分に関連する。
ヘテロアルキル基の例には、型−(OCHCH)−の1以上のエチレングリコール単位を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキル基の末端はヘテロ原子の基本的形態、たとえば、−OH、−SH又は−NHであり得る。好ましい実施形態では、末端は−CHである。
用語「C2−12アルケニル」は本明細書で使用されるとき、1以上の炭素−炭素二重結合を有するアルキル基に関連する。
不飽和のアルケニル基の例には、エテニル(ビニル、−CH=CH)、1−プロペニル(−CH=CH−CH)、2−プロペニル(アリル、−CH−CH=CH)、イソプロペニル(1−メチルビニル、−C(CH)=CH)、ブテニル(C)、ペンテニル(C)、及びヘキセニル(C)が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「C2−12アルキニル」は本明細書で使用されるとき、1以上の炭素−炭素三重結合を有するアルキル基に関連する。
不飽和のアルキニル基の例には、エチニル(−C≡CH)及び2−プロピニル(プロパルギル、−CH-C≡CH)が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「C3−12シクロアルキル」は本明細書で使用されるとき、環状基でもあるアルキル基に関連し、すなわち、一価の部分であって、部分が3〜7の環原子を含めて3〜7の炭素原子を有する、環状炭化水素(炭素環)化合物の脂肪族環原子から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分である。
シクロアルキル基の例には、
(i) 飽和単環式炭化水素化合物:
シクロプロパン(C)、シクロブタン(C)、シクロペンタン(C)、シクロヘキサン(C)、シクロヘプタン(C)、メチルシクロプロパン(C)、ジメチルシクロプロパン(C)、メチルシクロブタン(C)、ジメチルシクロブタン(C)、メチルシクロペンタン(C)、ジメチルシクロペンタン(C)及びメチルシクロヘキサン(C);
(ii)不飽和単環式炭化水素化合物:
シクロプロペン(C)、シクロブテン(C)、シクロペンテン(C)、シクロヘキセン(C)、メチルシクロプロペン(C)、ジメチルシクロプロペン(C)、メチルシクロブテン(C)、ジメチルシクロブテン(C)、メチルシクロペンテン(C)、ジメチルシクロペンテン(C)及びメチルシクロヘキセン(C);並びに
(iii)飽和多環式炭化水素化合物:
ノルカラン(C)、ノルピナン(C)、ノルボルナン(C
に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「C3−20ヘテロシクリル」は本明細書で使用されるとき、部分が3〜20の環原子を有し、そのうち1〜10が環ヘテロ原子である、複素環化合物の環原子から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分に関連する。一部の実施形態では、各環は3〜7の環原子を有し、そのうち1〜4が環ヘテロ原子である。
本明細書で使用されるとき、接頭辞(たとえば、C3−20、C3−7、C5−6等)は、炭素原子であろうがヘテロ原子であろうが環原子の数又は環原子の数の範囲を示す。たとえば、用語「C5−6ヘテロシクリル」は本明細書で使用されるとき、5又は6の環原子を有するヘテロシクリル基に関連する。
単環式ヘテロシクリル基の例には、
(i)N:アジリジン(C)、アゼチジン(C)、ピロリジン(テトラヒドロピロール)(C)、ピロリン(たとえば、3−ピロリン、2,5-ジヒドロピロール)(C)、2H−ピロール又は3H−ピロール(イソピロール、イソアゾール)(C)、ピペリジン(C)、ジヒドロピリジン(C)、テトラヒドロピリジン(C)、アゼピン(C);
(ii)O:オキシラン(C)、オキセタン(C)、オキソラン(テトラヒドロフラン)(C)、オキソール(ジヒドロフラン)(C)、オキサン(テトラヒドロピラン)(C)、ジヒドロピラン(C)、ピラン(C)、オキセピン(C);
(iii)S:チイラン(C)、チエタン(C)、チオラン(テトラヒドロチオフェン)(C)、チアン(テトラヒドロチオピラン)(C)、チエパン(C);
(iv)O:ジオキソラン(C)、ジオキサン(C)、及びジオキセパン(C);
(v)O:トリオキサン(C);
(vi)N:イミダゾリジン(C)、ピラゾリジン(ジアゾリジン)(C)、イミダゾリン(C)、ピラゾリン(ジヒドロピラゾール)(C)、ピペラジン(C);
(vii)N:テトラヒドロオキサゾール(C)、ジヒドロオキサゾール(C)、テトラヒドロイソオキサゾール(C)、ジヒドロイソオキサゾール(C)、モルフォリン(C)、テトラヒドロオキサジン(C)、ジヒドロオキサジン(C)、オキサジン(C);
(viii)N:チアゾリン(C)、チアゾリジン(C)、チオモルフォリン(C);
(ix)N:オキサジアジン(C);
(x)O:オキサチオール(C)及びオキサチアン(チオキサン)(C);並びに、
(xi)N:オキサチアジン(C
に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
置換された単環式ヘテロシクリル基の例には、環状形態の糖類に由来するもの、たとえば、アラビノフラノース、リキソフラノース、リボフラノース及びキシロフラノースのようなフラノース類(C)、並びに、たとえば、アロピラノース、アルトロピラノース、グルコピラノース、マンノピラノース、グロピラノース、イドピラノース、ガラクトピラノース、及びタロピラノースのようなにピラノース類(C)が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「C5−20アリール」は本明細書で使用されるとき、部分が3〜20の環原子を有する、芳香族化合物の芳香環原子から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分に関連する。一部の実施形態では、各環は5〜7の環原子を有する。
一部の実施形態では、環原子は、「カルボアリール基」のようにすべて炭素原子である。カルボアリール基の例には、ベンゼン(すなわち、フェニル)(C)、ナフタレン(C10)、アズレン(C10)、アントラセン(C14)、フェナントレン(C14)、ナフタセン(C18)、及びピレン(C16)に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
その少なくとも1つが芳香環である縮合環を含むアリール基の例には、インダン(たとえば、2,3−ジヒドロ−1H−インデン)(C)、インデン(C)、イソインデン(C)、テトラリン(1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン(C10)、アセナフテン(C12)、フルオレン(C13)、フェナレン(C13)、アセフェナントレン(C15)、及びアセアントレン(C16)に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、環原子には、「ヘテロアリール基」におけるように1以上のヘテロ原子が含まれ得る。単環式ヘテロアリール基の例には
(i)N:ピロール(アゾール)(C)、ピリジン(アジン)(C);
(ii)O:フラン(オキソール)(C);
(iii)S:チオフェン(チオール)(C);
(iv)N:オキサゾール(C)、イソオキサゾール(C)、イソオキサジン(C);
(v)N:オキサジアゾール(フラザン)(C);
(vi)N:オキサトリアゾール(C);
(vii)N:チアゾール(C)、イソチアゾール(C);
(viii)N:イミダゾール(1,3−ジアゾール)(C)、ピラゾール(1,2−ジアゾール)(C)、ピリダジン(1,2−ジアジン)(C)、ピリミジン(1,3−ジアジン)(C)(たとえば、シトシン、チミン、ウラシル)、ピラジン(1,4−ジアジン)(C);
(ix)N:トリアゾール(C)、トリアジン(C);並びに
(x)N:テトラゾール(C
に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
縮合環を含むヘテロアリールの例には、
(i)ベンゾフラン(O)、イソベンゾフラン(O)、インドール(N)、イソインドール(N)、インドリジン(N)、インドリン(N)、イソインドリン(N)、プリン(N)(たとえば、アデニン、グアニン)、ベンズイミダゾール(N)、インダゾール(N)、ベンズオキサゾール(N)、ベンズイソオキサゾール(N)、ベンゾジオキソール(O)、ベンゾフラザン(N)、ベンゾトリアゾール(N)、ベンゾチオフラン(S)、ベンゾチアゾール(N)、ベンゾチアジアゾール(NS)に由来するC(縮合環を2つ伴う);
(ii)クロメン(O)、イソクロメン(O)、クロマン(O)、イソクロマン(O)、ベンゾジオキサン(O)、キノリン(N)、イソキノリン(N)、キノリジン(N)、ベンゾキサジン(N)、ベンゾジアジン(N)、ピリドピリジン(N)、キノキサリン(N)、キナゾリン(N)、シンノリン(N)、フタラジン(N)、ナフチリジン(N)、プテリジン(N)に由来するC10(縮合環を2つ伴う);
(iii)ベンゾジアゼピン(N)に由来するC11(縮合環を2つ伴う);
(iv)カルバゾール(N)、ジベンゾフラン(O)、ジベンゾチオフェン(S)、カルボリン(N)、ペリミジン(N)、ピリドインドール(N)に由来するC13(縮合環を3つ伴う);及び、
(v)アクリジン(N)、キサンテン(O)、チオキサンテン(S)、オキサントレン(O)、フェノキサチイン(O)、フェナジン(N)、フェノキサジン(N)、フェノチアジン(N)、チアントレン(S)、フェナントリジン(N)、フェナントロリン(N)、フェナジン(N)に由来するC14(縮合環を3つ伴う)
が挙げられるが、これらに限定されない。
上記の基は、単独であれ、又は別の置換基の一部であれ、それ自体及び以下に列記される追加の置換基から選択される1以上の基によって任意でそれ自体置換され得る。
ハロ:−F、−Cl、−Br及び−I。
ヒドロキシ:−OH
エーテル:−OR、その際、Rは、エーテル置換基、たとえば、C1−7アルキル基(C1−7アルコキシ基とも呼ばれ、以下で考察される)、C3−20ヘテロシクリル基(C3−20ヘテロシクリルオキシ基とも呼ばれる)、又はC5−20アリール基(C5−20アリールオキシ基とも呼ばれる)である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。
アルコキシ:−OR、その際、Rはアルキル基、たとえば、C1−7アルキル基である。C1−7アルコキシ基の例には−OMe(メトキシ)、−OEt(エトキシ)、−O(nPr)(n−プロポキシ)、−O(iPr)(イソプロポキシ)、−O(nBu)(n−ブトキシ)、−O(sBu)(sec−ブトキシ)、−O(iBu)(イソブトキシ)、及び−O(tBu)(tert−ブトキシ)が挙げられるが、これらに限定されない。
アセタール:−CH(OR)(OR)、その際、R及びRは独立して、アセタール置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、R及び/又はRは独立してC1−7アルキル基である。一部の実施形態では、「環状」アセタール基の場合、R及びRはそれらが結合する2つの酸素原子及びそれらが結合する炭素原子と一緒に4〜8の環原子を有する複素環の環を形成する。アセタール基の例には−CH(OMe)、−CH(OEt)及び−CH(OMe)(OEt)が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘミアセタール:−CH(OH)(OR)、その際、Rはヘミアセタール置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。ヘミアセタール基の例には−CH(OH)(OMe)及び−CH(OH)(OEt)が挙げられるが、これらに限定されない。
ケタール:−CR(OR)(OR)、その際、R及びRはアセタールについて定義したとおりであり、Rは水素以外のケタール置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。ケタールの例には、−C(Me)(OMe)、−C(Me)(OEt)、−C(Me)(OMe)(OEt)、−C(Et)(OMe)、−C(Et)(OEt)、及び−C(Et)(OMe)(OEt)が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘミケタール:−CR(OH)(OR)、その際、Rはヘミアセタールについて定義されたとおりであり、Rは水素以外のヘミケタール置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。ヘミケタールの例には、−C(Me)(OH)(OMe)、−C(Et)(OH)(OMe)、−C(Me)(OH)(OEt)、及び−C(Et)(OH)(OEt)が挙げられるが、これらに限定されない。
オキソ(ケト、−オン):=O。
チオン(チオケトン):=S。
イミノ(イミン):=NR、その際、Rはイミノ置換基、たとえば、水素、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは水素又はC1−7アルキル基である。イミノ基の例には、=NH、=NMe、=NEt及び=NPhが挙げられるが、これらに限定されない。
ホルミル(カルバルデヒド、カルボキシアルデヒド):−C(=O)H。
アシル(ケト):−C(=O)R、その際、Rはアシル置換基、たとえば、C1−7アルキル基(C1−7アルキルアシル、C1−7アルカノイルとも呼ばれる)、C3−20ヘテロシクリル基(C3−20ヘテロシクリルアシルとも呼ばれる)又はC5−20アリール基(C5−20アリールアシルとも呼ばれる)である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。アシル基の例には、-C(=O)CHアセチル)、−C(=O)CHCH(プロピオニル)、−C(=O)C(CH(t−ブチリル)、及び−C(=O)Ph(ベンゾイル、フェノン)が挙げられるが、これらに限定されない。
カルボキシ(カルボン酸):−C(=O)OH。
チオカルボキシ(チオカルボン酸):−C(=S)SH。
チオロカルボキシ(チオロカルボン酸):−C(=SO)SH。
チオノカルボキシ(チオノカルボン酸):−C(=S)OH。
イミド酸:−C(=NH)OH。
ヒドロキサム酸:−C(=NOH)OH。
エステル(カルボキシレート、カルボン酸エステル、オキシカルボニル):−C(=O)OR、その際、Rはエステル置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。エステル基の例には、-C(=O)OCH、-C(=O)OCHCH、-C(=O)OC(CH、及び-C(=O)OPhが挙げられるが、これらに限定されない。
アシルオキシ(逆エステル):OC(=O)R、その際、Rはアシルオキシ置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。アシルオキシ基の例には、−OC(=O)CH(アセトキシ)、−OC(=O)CHCH、−OC(=O)C(CH、−OC(=O)Ph、及び−OC(=O)CHPhが挙げられるが、これらに限定されない。
オキシカルボニルオキシ:−OC(=O)OR、その際、Rはエステル置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。オキシカルボニルオキシ基の例には、−OC(=O)OCH、−OC(=O)OCHCH、−OC(=O)OC(CH、及び−OC(=O)OPhが挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ:−NR、その際、R及びRは独立してアミノ置換基、たとえば、水素、C1−7アルキル基(C1-7アルキルアミノ又はジ−C1−7アルキルアミノとも呼ばれる)、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、R及びRは独立してH又はC1−7アルキル基である。一部の実施形態では、「環状」アミノ基の場合、R及びRはそれらが結合する窒素原子と一緒に4〜8の環原子を有する複素環の環を形成する。アミノ基は1級(−NH)、2級(−NHR)、又は3級(−NHR)であってもよく、カチオン形態では、4級(−NR)であってもよい。アミノ基の例には、−NH、−NHCH、−NHC(CH、−N(CH、−N(CHCH、及び−NHPhが挙げられるが、これらに限定されない。環状アミノ基の例には、アジリジノ、アゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ、モルフォリノ、及びチオモルフォリノが挙げられるが、これらに限定されない。
アミド(カルバモイル、カルバミル、アミノカルボニル、カルボキサミド):-C(=O)NR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。アミド基の例には、−C(=O)NH、−C(=O)NHCH、−C(=O)N(CH、−C(=O)NHCHCH、及び−C(=O)N(CHCH、ならびに、アミド基であって、R及びRはそれらが結合する窒素原子と一緒に、たとえば、ピペリジノカルボニル、モルフォリノカルボニル、チオモルフォリノカルボニル、及びピペラジノカルボニルのような複素環構造を形成する、アミド基が挙げられるが、これらに限定されない。
チオアミド(チオカルバミル):-C(=S)NR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。チオアミド基の例には、−C(=S)NH、−C(=S)NHCH、−C(=S)N(CH、及び−C(=S)NHCHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
アシルアミド(アシルアミノ):−NRC(=O)R、その際、Rはアミド置換基、たとえば、水素、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基であり、Rはアシル置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、R及び/又はRは水素又はC1−7アルキル基である。アシルアミド基の例には、−NHC(=O)CH、−NHC(=O)CHCH、及び−NHC(=O)Phが挙げられるが、これらに限定されない。R及びRは一緒に、たとえば、スクシンイミジル、マレイミジル、及びフタルイミジル
Figure 2015527318
のような環状構造を形成し得る。
アミノカルボニルオキシ:−OC(=O)NR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。アミノカルボニルオキシ基の例には−OC(=O)NH、−OC(=O)NHMe、−OC(=O)NMe、及び−OC(=O)NEtが挙げられるが、これらに限定されない。
ウレイド:−N(R)CONR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基であり、Rは、ウレイド置換基、たとえば、水素、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは水素又はC1−7アルキル基である。ウレイド基の例には、−NHCONH、−NHCONHMe、−NHCONHEt、−NHCONMe、−NHCONEt、−NMeCONH、−NMeCONHMe、−NMeCONHEt、−NMeCONMe、及び−NMeCONEtが挙げられるが、これらに限定されない。
グアニジノ:−NH−C(=NH)NH
テトラゾリル:4つの窒素原子と1つの炭素原子を有する5員環の芳香族環
Figure 2015527318
アミジン(アミジノ):−C(=NR)NR、その際、各Rはアミジン置換基、たとえば、水素、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、各Rは水素又はC1−7アルキル基である。アミジン基の例には、−C(=NH)NH、−C(=NH)NMe、及びC(=NMe)NMeが挙げられるが、これらに限定されない。
ニトロ:−NO
ニトロソ:−NO。
アジド:−N
シアノ(ニトリル、カルボニトリル):−CN。
イソシアノ:−NC。
シアナト:−OCN。
イソシアナト:−NCO。
チオシアノ(チオシアナト):−SCN。
イソチオシアノ(イソチオシアナト):−NCS。
スルフヒドリル(チオール、メルカプト):−SH。
チオエーテル(スルフィド):−SR、その際、Rはチオエーテル置換基、たとえば、C1−7アルキル基(C1−7アルキルチオ基とも呼ばれる)、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。チオエーテル基の例には−SCH及び−SCHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
ジスルフィド:−SS−R、その際、Rはジスルフィド置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基(C1−7アルキルジスルフィドとも呼ばれる)である。ジスルフィドの例には−SSCH及び−SSCHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
スルフィン(スルフィニル、スルホキシド):−S(=O)R、その際、Rはスルフィン置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルフィン基の例には、−S(=O)CH及び−S(=O)CHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
スルホン(スルホニル):−S(=O)R、その際、Rはスルホン置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは、たとえば、フッ素化された又は過フッ素化されたC1−7アルキル基を含むC1−7アルキル基である。スルホン基の例には、−S(=O)CH(メタンスルホニル、メシル)、−S(=O)CF(トリフリル)、−S(=O)CHCH(エシル)、−S(=O)(ノナフリル)、−S(=O)CHCF(トレシル)、−S(=O)CHCHNH(タウリル)、−S(=O)Ph(フェニルスルホニル、ベシル)、4−メチルフェニルスルホニル(トシル)、4−クロロフェニルスルホニル(クロシル)、4−ブロモフェニルスルホニル(ブロシル)、4−ニトロフェニル(ノシル)、2−ナフタレンスルホネート(ナプシル)、及び5−メチルアミノ−ナフタレン−1−イルスルホネート(ダンシル)が挙げられるが、これらに限定されない。
スルフィン酸(スルフィノ):−S(=O)OH、−SOH。
スルホン酸(スルホ):−S(=O)OH、−SOH。
スルフィネート(スルフィン酸エステル):−S(=O)OR、その際、Rはスルフィネート置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルフィネート基の例には、−S(=O)OCH(メトキシスルフィニル;スルフィン酸メチル)及び−S(=O)OCHCH(エトキシスルフィニル;スルフィン酸エチル)が挙げられるが、これらに限定されない。
スルホネート(スルホン酸エステル):−S(=O)OR、その際、Rはスルホネート置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルホネート基の例には、−S(=O)OCH(メトキシスルホニル;スルホン酸メチル)及び−S(=O)OCHCH(エトキシスルホニル;スルホン酸エチル)が挙げられるが、これらに限定されない。
スルフィニルオキシ:−OS(=O)R、その際、Rはスルフィニルオキシ置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルフィニルオキシ基の例には、−OS(=O)CH及び−OS(=O)CHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
スルホニルオキシ:−OS(=O)R、その際、Rはスルホニルオキシ置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルホニルオキシ基の例には、−OS(=O)CH(メシレート)及び−OS(=O)CHCH(エシレート)が挙げられるが、これらに限定されない。
サルフェート:−OS(=O)R、その際、Rはサルフェート置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。サルフェート基の例には、−OS(=O)OCH及び−SO(=O)OCHCHが挙げられるが、これらに限定されない。
スルファミル(スルファモイル、スルフィン酸アミド、スルフィンアミド):−S(=O)NR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。スルファミル基の例には、−S(=O)NH、−S(=O)NH(CH)、−S(=O)N(CH、−S(=O)NH(CHCH)、−S(=O)N(CHCH、及び−S(=O)NHPhが挙げられるが、これらに限定されない。
スルホンアミド(スルフィナモイル、スルホン酸アミド、スルホンアミド):−S(=O)NR、その際、R及びRは独立して、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。スルホンアミド基の例には、−S(=O)NH、−S(=O)NH(CH)、−S(=O)N(CH、−S(=O)NH(CHCH)、−S(=O)N(CHCH、及び−S(=O)NHPhが挙げられるが、これらに限定されない。
スルファミノ:−NRS(=O)OH、その際、Rはアミノ基について定義したようなアミノ置換基である。スルファミノ基の例には、−NHS(=O)OH及び−N(CH)S(=O)OHが挙げられるが、これらに限定されない。
スルホンアミノ:−NRS(=O)R、その際、Rはアミノ基について定義したようなアミノ置換基であり、Rはスルホンアミノ置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルホンアミノ基の例には、−NHS(=O)CH及び−N(CH)S(=O)が挙げられるが、これらに限定されない。
スルフィンアミノ:−NRS(=O)R、その際、Rはアミノ基について定義したようなアミノ置換基であり、Rはスルフィンアミノ置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、RはC1−7アルキル基である。スルフィンアミノの例には−NHS(=O)CH及び−N(CH)S(=O)Cが挙げられるが、これらに限定されない。
ホスフィノ(ホスフィン):−PR、その際、Rはホスフィノ置換基、たとえば、−H、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスフィノ基の例には−PH、−P(CH、−P(CHCH、−P(t−Bu)、及び−P(Ph)が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホ:−P(=O)
ホスフィニル(酸化ホスフィン):−P(=O)R、その際、Rはホスフィニル置換基、たとえば、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスフィニル基の例には−P(=O)(CH、−P(=O)(CHCH、−P(=O)(t-Bu)、及び−P(=O)(Ph)が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホン酸(ホスホノ);−P(=O)(OH)
ホスホネート(ホスホノエステル):−P(=O)(OR)、その際、Rはホスホネート置換基、たとえば、−H、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスホネート基の例には、−P(=O)(OCH、−P(=O)(OCHCH、−P(=O)(O−t−Bu)、及び−P(=O)(OPh)が挙げられるが、これらに限定されない。
リン酸(ホスホノオキシ):−OP(=O)(OH)
ホスフェート(ホスホノオキシエステル):−OP(=O)(OR)、その際、Rはホスフェート置換基、たとえば、−H、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスフェート基の例には、−OP(=O)(OCH、−OP(=O)(OCHCH、−OP(=O)(O−t−Bu)、及び−OP(=O)(OPh)が挙げられるが、これらに限定されない。
亜リン酸:−OP(OH)
ホスファイト:−OP(OR)、その際、Rはホスファイト置換基、たとえば、−H、C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスファイト基の例には、−OP(OCH、−OP(OCHCH、−OP(O−t−Bu)、及び−OP(OPh)が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホルアミダイト:−OP(OR)−NR 、その際、R及びRはホスホルアミダイト置換基、たとえば、−H、(任意で置換された)C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、Rは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスホルアミダイト基の例には、−OP(OCHCH)−N(CH、−OP(OCHCH)−N(i−Pr)、及び−OP(OCHCHCN)−N(i−Pr)が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホルアミデート:−OP(=O)(OR)−NR 、その際、R及びRはホスホルアミデート置換基、たとえば、−H、(任意で置換された)C1−7アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基又はC5−20アリール基である。一部の実施形態では、R及びRは−H、C1−7アルキル基又はC5−20アリール基である。ホスホルアミデート基の例には、−OP(=O)(OCHCH)−N(CH、−OP(=O)(OCHCH)−N(i−Pr)、及び−OP(=O)(OCHCHCN)−N(i−Pr)が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「C3−12アルキレン」は本明細書で使用されるとき、脂肪族であり、環状であってもよく又は非環状であってもよい、飽和、部分不飽和又は完全不飽和であってもよい3〜12の炭素原子(別段特定されない限り)を有する炭化水素化合物の、双方とも同一炭素原子に由来する又は2つの異なる炭素原子に由来する2つの水素原子を取り外すことによって得られる二座部分に関連する。従って、用語「アルキレン」には、たとえば、以下で考察するサブクラス、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン等が含まれる。
直鎖飽和C3−12アルキレン基の例には、nが3〜12の整数である、−(CH)n−、たとえば、−CHCHCH−(プロピレン)、−CHCHCHCH−(ブチレン)、−CHCHCHCHCH−(ペンチレン)及び−CHCHCHCHCHCHCH−(ヘプチレン)が挙げられるが、これらに限定されない。
分枝鎖飽和C3−12アルキレン基の例には、−CH(CH)CH−、−CH(CH)CHCH−、−CH(CH)CHCHCH−、−CHCH(CH)CH−、−CHCH(CH)CHCH−、−CH(CHCH)−、−CH(CHCH)CH−、及び−CHCH(CHCH)CH−が挙げられるが、これらに限定されない。
直鎖部分不飽和のC3−12アルキレン基(C3−12アルケニレン基及びアルキニレン基)の例には、−CH=CH-CH−、−CH−CH=CH−、−CH=CH-CH-CH−、−CH=CH-CH-CH-CH−、−CH=CH-CH=CH−、−CH=CH-CH=CH−CH−、−CH=CH−CH=CH−CH−CH−、−CH=CH−CH-CH=CH−、−CH=CH-CH−CH−CH=CH−、及び−CH−C≡C−CH−が挙げられるが、これらに限定されない。
分枝鎖部分不飽和のC3−12アルキレン基(C3−12アルケニレン基及びアルキニレン基)の例には、−C(CH)=CH−、−C(CH)=CH-CH−、−CH=CH-CH(CH)−及び−C≡C−CH(CH)−が挙げられるが、これらに限定されない。
脂環式飽和C3−12アルキレン基(C3−12シクロアルキレン)の例には、シクロペンチレン(たとえば、シクロペント−1,3−イレン)、及びシクロヘキシレン(たとえば、シクロヘクス-1,4-イレン)が挙げられるが、これらに限定されない。
脂環式部分不飽和C3−12アルキレン基(C3−12シクロアルキレン)の例には、シクロペンテニレン(たとえば、4−シクロペンテン−1,3−イレン)、シクロヘキセニレン(たとえば、2−シクロヘキセン−1,4−イレン;3-シクロヘキセン−1,2−イレン;2,5−シクロヘキサジエン−1,4−イレン)が挙げられるが、これらに限定されない。
「リンカー」は、抗体を薬剤部分に共有結合させる原子の共有結合又は鎖を含む化学部分を指す。非限定の例となるリンカーが本明細書で記載される。
用語「キラル」は鏡像相手の重ね合わせできない特性を有する分子を指す一方で、用語「アキラル」は鏡像相手に重ね合わせできる分子を指す。
用語「立体異性体」は、同一の化学構成を有するが、空間における原子又は基の配置に関して異なる化合物を指す。
「ジアステレオマー」は、2以上のキラル中心を持ち、その分子が互いに鏡像ではない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物性、たとえば、融点、沸点、スペクトル特性及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィのような高分解能分析法のもとで分離し得る。
「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせできない鏡像である化合物の2つの立体異性体を指す。
本明細書で使用される立体化学の定義及び慣例は一般に、S.P.Parker編、McGraw−Hill Dictionary of Chemical Terms(1984) McGraw−Hill Book Company,New York;並びにEliel,E.及びWilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994) John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkに従う。多数の有機化合物が光学的に活性のある形態で存在し、すなわち、それらは、平面偏光面を回転させる能力を有する。光学的に活性のある化合物を記載することにおいて、接頭辞、D及びL又はR及びSはそのキラル中心(単数又は複数)についての分子の絶対的な立体配置を示すのに使用される。接頭辞、d及びl又は(+)及び(−)は化合物による平面偏光の回転の記号を指定するのに採用され、(−)又はlは化合物が左旋性であることを意味する。(+)又はdを伴う化合物は右旋性である。所与の化学構造については、これらの立体異性体はそれらが互いに鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体がエナンチオマーと呼ばれることがあり、そのような異性体の混合物はエナンチオマー混合物と呼ばれることが多い。エナンチオマーの50:50混合物はラセミ混合物又はラセミ体と呼ばれ、それは、化学反応又は化学工程にて立体選択又は立体特異性がない場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」は光学活性を欠いている2つのエナンチオマー種の等モル混合物を指す。
「脱離基」は、別の官能基で置換することができる官能基を指す。ある特定の脱離基は当該技術で周知であり、例には、ハロゲン化合物(たとえば、塩化物、臭化物、ヨウ化物)、メタンスルホニル(メシル)、p−トルエンスルホニル(トシル)、トリフルオロメチルスルホニル(トリフレート)、及びトリフルオロメチルスルホネートが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「保護基」は、化合物上の他の官能基を反応させながら、特定の官能性を遮断する又は保護するのに一般に採用される置換基を指す。たとえば、「アミノ保護基」は化合物におけるアミノ官能性を遮断する又は保護するアミノ基に連結された置換基である。好適なアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、t−ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(CBZ)及び9−フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Fmoc)が挙げられるが、これらに限定されない。保護基の一般的な説明及びその使用については、T.W.Greene、Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991、又はさらに最近の版を参照のこと。
II.組成物及び方法
一態様では、本発明は部分的に、CD22に結合する抗体及びそのような抗体を含む免疫複合体に基づく。本発明の抗体及び免疫複合体は、たとえば、CD22陽性の癌の診断又は治療に有用である。
A.例となる抗CD22抗体
一部の実施形態では、CD22に結合する単離された抗体が提供される。CD22は、分化の成熟段階でB細胞表面に発現される135kDaのB細胞に限定されたシアロ糖タンパク質である。CD22は、たとえば、非ホジキンリンパ腫のような種々のリンパ腫を含むB細胞に関連する種々の疾病及び癌にて発現される。
例となる天然に存在するヒトのCD22前駆体配列は、シグナル配列(アミノ酸1〜19)を伴って配列番号28で提供され、相当する成熟CD22の配列は配列番号29(配列番号28のアミノ酸20〜847に相当する)に示される。さらなる例となる天然に存在するヒトのCD22前駆体配列は、シグナル配列(アミノ酸1〜19)を伴って配列番号30で提供され、相当する成熟CD22の配列は配列番号31(配列番号30のアミノ酸20〜670に相当する)に示される。
ある特定の実施形態では、抗CD22抗体は配列番号28のアミノ酸20〜240の範囲内でのエピトープを結合する。非限定の例となるそのような抗体には10F4及びそのヒト化バージョンが挙げられる。一部の実施形態では、抗CD22抗体はヒトCD22を結合する。一部の実施形態では、抗CD22抗体はヒトCD22及びカニクイザルCD22を結合する。
一部の実施形態では、抗CD22抗体は、≦10nM、又は≦5nM、又は≦4nM、又は≦3nM、又は≦2nM、及び任意で≧0.0001nM、又は≧0.001nM又は≧0.01nMの親和性でヒトCD22を結合する。非限定の例となるそのような抗体にはmu10F4、hu10F4v1、及びhu10F4v3が挙げられ、それらはそれぞれ、2.4nM、1.1〜1.7nM及び1.6nMの親和性でヒトCD22に結合する。たとえば、US2008/0050310を参照のこと。
アッセイ
抗CD22抗体が「配列番号28のアミノ酸20〜240の範囲内でエピトープに結合する」かどうかを判定するには、N末端及びC末端の欠失を伴うCD22ポリペプチドをCHO細胞で発現させ、切り詰めたポリペプチドに対する抗体の結合を以前記載されたようなFACSによって調べる。たとえば、US2008/0050310を参照のこと。CHO細胞にて発現された完全長のCD22への結合に比べた切り詰めたポリペプチドに対する抗体の結合の実質的な低下(≧70%の低下)又は消失は抗体がその切り詰めたポリペプチドに結合しないことを示している。
抗CD22抗体が、≦10nM、又は≦5nM、又は≦4nM、又は≦3nM、又は≦2nM「の親和性で結合する」かどうかは、連続希釈した非標識の抗CD22抗体を用いた競合アッセイにて表面にCD22を発現するCHO細胞を用いて判定される。たとえば、US2008/0050310を参照のこと。抗体の結合親和性、Kは、非線形曲線当てはめプログラムを利用して実施される標準のScatchard解析に従って決定され得る(たとえば、Munsonら、Anal.Biochem,107:220−239,1980を参照のこと)。
抗体10F4及び他の実施形態
一部の実施形態では、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、2、3、4、5又は6のHVRを含む抗CD22抗体又は免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、2、3、4、5又は6のHVRを含む抗CD22抗体又は免疫複合体を提供する。
一態様では、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのHVR配列を含む抗体又は免疫複合体を提供する。一実施形態では、抗体は配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む。別の実施形態では、抗体は配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3及び配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。さらなる実施形態では、抗体は、抗体は配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3及び配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2を含む。さらなる実施形態では、抗体は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む。
別の態様では、本発明は、(a)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVLのHVR配列を含む抗体又は免疫複合体を提供する。別の態様では、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVLのHVR配列を含む抗体又は免疫複合体を提供する。一実施形態では、抗体は、(a)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。一実施形態では、抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
別の態様では、本発明の抗体又は免疫複合体は、(a)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVHのHVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVLのHVR配列を含むVLドメインとを含む。別の態様では、本発明の抗体又は免疫複合体は、(a)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVHのHVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてのVLのHVR配列を含むVLドメインとを含む。
別の態様では、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体又は免疫複合体を提供する。別の態様では、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体又は免疫複合体を提供する。
上記実施形態のいずれかでは、抗CD22抗体はヒト化される。一実施形態では、抗CD22抗体は、上記実施形態のいずれかのようなHVRを含み、さらにヒトのアクセプターフレームワーク、たとえば、ヒトの免疫グロブリンフレームワーク又はヒトのコンセンサスフレームワークを含む。ある特定の実施形態では、ヒトのアクセプターフレームワークはヒトのVLカッパ1(VLκ)フレームワーク及び/又はVHフレームワークVHIIIである。一部の実施形態では、ヒト化された抗CD22抗体は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。一部の実施形態では、ヒト化された抗CD22抗体は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
別の態様では、抗CD22抗体は、配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(VH)配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVH配列は、参照配列に比べて置換(たとえば、保存的置換)、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗CD22抗体はCD22に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号7にて合計1〜10のアミノ酸が置換、挿入及び/又は欠失されている。ある特定の実施形態では、配列番号7にて合計1〜5のアミノ酸が置換、挿入及び/又は欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失はHVRの外側の領域(たとえば、FRにて)生じる。
任意で、抗CD22抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号5又は配列番号7のVH配列を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される1、2又は3のHVRを含む。
一部の実施形態では、抗CD22抗体が提供され、該抗体は、配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。ある特定の実施形態では、配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に比べて置換(たとえば、保存的置換)、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗CD22抗体はCD22に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号8にて合計1〜10のアミノ酸が置換、挿入及び/又は欠失されている。ある特定の実施形態では、配列番号8にて合計1〜5のアミノ酸が置換、挿入及び/又は欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失はHVRの外側の領域(たとえば、FRにて)生じる。任意で、抗CD22抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号6又は配列番号8のVL配列を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される1、2又は3のHVRを含む。一部の実施形態では、VLは、(a)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される1、2又は3のHVRを含む。
別の態様では、抗CD22抗体が提供され、該抗体は、上記で提供された実施形態のいずれかのようなVHと、上記で提供された実施形態のいずれかのようなVLとを含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号7及び配列番号8におけるVH及びVLの配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号5及び配列番号6におけるVH及びVLの配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号24及び配列番号23における重鎖及び軽鎖の配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号26及び配列番号23における重鎖及び軽鎖の配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号25及び配列番号23における重鎖及び軽鎖の配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号27及び配列番号23における重鎖及び軽鎖の配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗CD22抗体と同じエピトープに結合する抗体又は免疫複合体を提供する。たとえば、ある特定の実施形態では、配列番号7のVH配列と配列番号8のVL配列を含む抗CD22抗体と同じエピトープに結合する抗体又は免疫複合体が提供される。ある特定の実施形態では、アミノ酸20〜240に由来する、その範囲内である又はそれと重なる配列番号28のエピトープに結合する抗体が提供される。
本発明のさらなる態様では、上記実施形態のいずれかに係る抗CD22抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗CD22抗体は、抗体断片、たとえば、Fv、Fab、Fab’、scFv又はF(ab’)の断片である。別の実施形態では、抗体は実質的に完全長の抗体、たとえば、IgG1抗体又は本明細書で定義されるような他の抗体のクラス若しくはアイソタイプである。
上述の免疫複合体のいずれかでは、抗体は薬剤部分に結合され得る。一部の実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合される。一部のそのような実施形態では、細胞傷害剤は、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、たとえば、PBD二量体である。種々の非限定の例となるPBD二量体が本明細書で考察される。
さらなる態様では、上記の実施形態のいずれかに係る抗CD22抗体又は免疫複合体は、以下の1〜7の節で記載されるような特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み入れ得る。
1.抗体の親和性
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM、及び任意で≧10−13M(たとえば、10−8M以下、たとえば、10−8M〜10−13M、たとえば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。
一実施形態では、Kdは、以下のアッセイによって説明されるような対象抗体のFab型とその抗原で実施される放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)によって測定される。抗原に対するFabの溶液結合親和性は、非標識抗原の連続滴定の存在下にて最少濃度の125I標識抗原でFabを平衡化し、次いで抗Fab抗体をコーティングしたプレートによって結合した抗原を捕捉することによって測定される(たとえば、Chenら、J.Mol.Biol.293:865−881(1999)を参照のこと)。アッセイのための条件を確立するために、50mMの炭酸ナトリウム(pH9.6)における5μg/mlの捕捉用の抗Fab抗体(Cappel Labs)によってMICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を一晩コーティングし、その後、室温(約23℃)にて2〜5時間、PBS中の2%(w/v)ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着性のプレート(Nunc番号269620)では、100pM又は26pMの[125I]抗原を連続希釈した対象Fab(Prestaら、Cancer Res.57:4593−4599(1997)における抗VEGF抗体Fab−12の評価に一致する)と混合する。次いで対象Fabを一晩インキュベートするが、インキュベートをさらに長く(たとえば、約65時間)継続して確実に平衡に到達させてもよい。その後、室温でインキュベートするために(たとえば、1時間)、混合物を捕捉プレートに移す。次いで溶液を取り除き、PBS中0.1%のポリソルベート20(TWEEN20(登録商標))でプレートを8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント(MICROSCINT−20(商標);Packard)を加え、TOPCOUNT(商標)ガンマカウンタ(Packard)で10分間プレートをカウントする。最大結合の20%以下を提供する各Fabの濃度を競合結合アッセイでの使用のために選択する。
別の実施形態によれば、約10応答単位(RU)での固定化した抗原CM5チップと共に25℃にてBIACORE(登録商標)−2000又はBIACORE(登録商標)−3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いてKdを測定する。手短には、供給者の指示書に従って、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)によってカルボキシメチル化したデキストランのバイオセンサーチップ(CM5,BIACORE社)を活性化する。10mMの酢酸ナトリウムpH4.8によって抗原を5μg/ml(約0.2μM)に希釈し、その後、5μl/分の流速で注入して約10応答単位(RU)の結合タンパク質を達成する。抗原の注入に続いて、1Mのエタノールアミンを注入して未反応の基をブロックする。動態測定については、約25μl/分の流速で25℃にて0.05%のポリソルベート20(TWEEN20(商標))界面活性剤を伴ったPBS(PBST)にて2倍連続希釈のFab(0.78nM〜500nM)を注入する。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、会合及び解離のセンサーグラムを同時に当てはめることによって単純な1対1のLangmuir結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウエア、バージョン3.2)を用いて算出する。解離定数(Kd)の平衡はkoff/konの比として算出される。たとえば、Chenら、J.Mol.Biol.293:865−881(1999)を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が10−1−1を超えるのであれば、そのときは、たとえば、ストップフロー装備の分光光度計(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを伴った8000シリーズのSLM−AMINCO(商標)分光光度計(ThermoSpectronic)のような分光光度計にて測定されるような抗原の上昇濃度の存在下でpH7.2のPBSにおける20nMの抗抗原抗体(Fab形態)の25℃での蛍光放射強度(励起=295nm;放射=340nm、16nmのバンドパス)の増減を測定する蛍光クエンチング法を用いてオン速度を測定することができる。
2.抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片には、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)、Fv、及びscFvの断片、及び以下で記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudsonら、Nat.Med.9:129−134(2003)を参照のこと。scFv断片の概説については、たとえば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg及びMoore編、(Springer−Verlag,New York),pp.269−315(1994)を参照のこと;また、WO93/16185;並びに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、生体内での長い半減期を有するFab及びF(ab’)断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
二重特異性抗体は、二価又は二重特異性であり得る2つの抗原結合部位を持つ抗体断片である。たとえば、EP404,097;WO1993/01161;Hudsonら、Nat.Med.9:129−134(2003);及びHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)を参照のこと。三重特異性抗体及び四重特異性抗体もHudsonら、Nat.Med.9:129−134(2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA;たとえば、米国特許第6,248,516 B1号を参照のこと)。
抗体断片は、本明細書で記載されるような、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞(たとえば、大腸菌又はファージ)による産生を含むが、これらに限定されない種々の技法によって作製することができる。
3.キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、たとえば、米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒトの可変領域(たとえば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルのような非ヒト霊長類に由来する可変領域)及びヒトの定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体をヒト化して、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させる。一般に、ヒト化抗体は、HVR、たとえば、CDR(又はその一部)が非ヒト抗体に由来する1以上の可変ドメインを含み、FR(又はその一部)はヒトの抗体配列に由来する。ヒト化抗体は任意でヒトの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。一部の実施形態では、ヒト化抗体における一部のFR残基が非ヒト抗体(たとえば、HVR残基が由来する抗体)に由来する相当する残基で置換されて、たとえば、抗体の特異性又は親和性を復元する又は改善する。
ヒト化抗体及びそれを作製する方法は、たとえば、Almagro及びFransson,Front.Biosci.13:1619−1633(2008)にて概説されており、さらにたとえば、Riechmannら、Nature 332:323−329(1988);Queenら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029−10033(1989);米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、及び同第7,087,409号;Kashmiriら、Methods 36:25−34(2005)(SDR(a−CDR)移植を記載している);Padlan,Mol.Immunol.28:489−498(1991)(「再表面化」を記載している);Dall’Acquaら、Methods 36:43−60(2005)(「FRシャッフリング」を記載している);及びOsbournら、Methods 36:61−68(2005)及びKlimkaら、Br.J.Cancer,83:252−260(2000)(FRシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載している)に記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトのフレームワーク領域には、「最良適合」法によって選択されるフレームワーク領域(たとえば、Simsら、J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照)、重鎖又は軽鎖の可変領域の特定の亜群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(たとえば、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPrestaら、J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照)、ヒトの成熟(体細胞変異した)フレームワーク領域又はヒトの生殖系列のフレームワーク領域(たとえば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619−1633 (2008)を参照)、及びFRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域(たとえば、Bacaら、J. Biol. Chem. 272:10678−10684 (1997)及びRosokら、J. Biol. Chem. 271:22611−22618 (1996)を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。
4.ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当該技術で既知の種々の技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、van Dijk及びvan de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368−74(2001)並びにLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450−459(2008)にて一般に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製され得る。そのような動物は通常、内在性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、又は染色体外で存在する又は動物の染色体に無作為に統合されるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Lonberg,Nat.Biotech.23:1117−1125(2005)を参照のこと。また、XENOMOUSE(商標)技法を記載している米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号;HUMAB(登録商標)技法を記載している米国特許第5,770,429号;K−M MOUSE(登録商標)技法を記載している米国特許第7,041,870号及びVELOCIMOUSE(登録商標)技法を記載している米国特許出願公開第2007/0061900号も参照のこと。そのような動物によって生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域を、たとえば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変し得る。
ヒト抗体はハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトのモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス/ヒトのヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている(たとえば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51−63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoernerら、J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照のこと)。ヒトのB細胞ハイブリドーマ法を介して生成されたヒト抗体は、Liら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557−3562(2006)にも記載されている。追加の方法には、たとえば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルなヒトIgM抗体の産生を記載している)及びNi,Xiandai Mianyixue,26(4):265−268(2006)(ヒト/ヒトハイブリドーマを記載している)にて記載されたものが挙げられる。ヒトのハイブリドーマ法(トリオーマ法)もVollmers及びBrandlein,Histology and Histopathology,20(3):927−937(2005)並びにVollmers及びBrandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185−91(2005)に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるFvクローンの可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。そのような可変ドメイン配列を次いで所望のヒトの定常ドメインと組み合わせ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する技法は以下に記載される。
5.ライブラリに由来する抗体
抗体のコンビナトリアルライブラリを所望の活性(単数)又は活性(複数)でスクリーニングすることによって抗体が単離され得る。たとえば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を持つ抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングする種々の方法が当該技術で既知である。そのような方法は、たとえば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology、178:1−37(O’Brienら編、Human Press,Totowa,NJ,2001)にて概説されており、さらに、たとえば、McCaffertyら、Nature 348:552−554;Clacksonら、Nature 352:624−628(1991);Marksら、J.Mol.Biol.222:581−597(1992);Marks及びBradbury,in Methods in Molecular Biology、248:161−175(Lo編、Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhuら、J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004);Leeら、J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、101(34):12467−12472(2004);並びにLeeら、J.Immunol.Methods、284(1−2):119−132(2004)にて記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってVH及びVL遺伝子のレパートリーを別々にクローニングし、ファージライブラリで無作為に組換え、次いでそれをWinterら、Ann.Rev.Immunol.,12:433−455(1994)で記載されたように抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、単鎖Fv(scFv)断片又はFab断片として抗体断片を提示する。免疫された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく免疫源に対する高い親和性の抗体を提供する。或いは、ナイーブレパートリーを(たとえば、ヒトから)クローニングして、Griffithsら、EMBO J,12:725−734(1993)によって記載されたような免疫することなく非自己抗原及び自己抗原の広い範囲に抗体の単一供給源を提供することができる。最終的に、幹細胞から再構成されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、超可変CDR3領域をコードし、Hoogenboom及びWinter,J.Mol.Biol.,227:381−388(1992)によって記載されたように試験管内での再構成を達成するために無作為な配列を含有するPCRプライマーを用いることによってナイーブライブラリを合成で作製することもできる。ヒト抗体のファージライブラリを記載している特許公報には、たとえば、米国特許第5,750,373号及び米国特許公開第2005/0079574号、同第2005/0119455号、同第2005/0266000号、同第2007/0117126号、同第2007/0160598号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号及び同第2009/0002360号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリから単離される抗体又は抗体断片は、本明細書のヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。
6.多重特異性抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は多重特異性抗体、たとえば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位について結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方がCD22のためのものであり、他方は任意の他の抗原のためのものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体はCD22の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を用いてCD22を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させ得る。二重特異性抗体を完全長の抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製する技法には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖の対の組換え同時発現(Milstein及びCuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 及びTrauneckerら、EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び「ノブ・イン・ホール」操作(たとえば、米国特許第5,731,168号を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のFcヘテロ二量体分子を作製するための静電操縦効果を操作すること(WO2009/089004A1);2以上の抗体又は断片を架橋すること(たとえば、米国特許第4,676,980号及びBrennanら、Science, 229: 81 (1985)を参照);ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を産生すること(たとえば、Kostelnyら、J. Immunol., 148(5):1547−1553 (1992)を参照);二重特異性抗体断片を作製するための「二重特異性抗体」技術を用いること(たとえば、Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444−6448 (1993)を参照);及び単鎖Fv(scFv)二量体を用いること(たとえば、Gruberら、J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及びたとえば、Tuttら、J.Immunol.147:60(1991)にて記載されたような三重特異性抗体を調製することによっても多重特異性抗体を作製し得る。
「オクトパス抗体」を含む、3以上の機能的な抗原結合部位を持つ操作された抗体も本明細書に含まれる(たとえば、US2006/0025576A1を参照)。
本明細書の抗体又は断片には、CD22、ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用FAb」又は「DAF」も含まれる(たとえば、US2008/0069820を参照)。
7.抗体変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。たとえば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物特性を改善することが望ましい可能性がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、たとえば、抗体のアミノ酸配列の範囲内での残基からの欠失、及び/又は挿入及び/又は置換が挙げられる。最終産物が所望の特性、たとえば、抗原結合を持つという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に達することができる。
(a)置換、挿入及び欠失の変異体
ある特定の実施形態では、1以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発のための対象部位にはHVR及びFRが含まれる。保存的置換は「好ましい置換」の見出しのもとで表1に示す。さらに大きな変化は、「例となる置換」の見出しのもとで表1に提供され、より下の方には、アミノ酸側鎖のクラスに関して記載される。アミノ酸置換が対象抗体に導入され、所望の活性、たとえば、保持された/改善された抗原結合、低下した免疫原性、又は改善されたADCC若しくはCDCについて生成物がスクリーニングされ得る。
[表1]
Figure 2015527318
側鎖の一般的な特性に従ってアミノ酸をグループ分けしてもよい。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的な置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
置換変異体の型の1つには、親抗体(たとえば、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1以上の超可変領域の残基を置換することが関与する。一般に、さらなる試験のために選択される得られた変異体(単数又は複数)は、親抗体に比べてある特定の生物特性(たとえば、高い親和性、低下した免疫原性)にて改変(たとえば、改善)を有するであろうし、及び/又は親抗体のある特定の生物特性を実質的に保持しているであろう。例となる置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、それは従来、たとえば、本明細書で記載されるもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟法を用いて簡便に生成され得る。手短には、1以上のHVR残基を変異させ、変異体抗体をファージ上に表示させ、特定の生物活性(たとえば、結合親和性)についてスクリーニングする。
変更(たとえば、置換)をHVRにて行って、たとえば、抗体の親和性を改善し得る。そのような変更は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程の間、高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基(たとえば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179−196 (2008)を参照)、及び/又はSDR(a−CDR)で行われてもよく、得られた変異体VH又はVLを結合親和性について調べる。二次ライブラリから構築し、再選択することによる親和性成熟は、たとえば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brienら編、Human Press,Totowa,NJ,(2001)。)にて記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、種々の方法(たとえば、変異性PCR、鎖のシャッフリング又はオリゴヌクレオチドに向けられた変異誘発)のいずれかによる成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで二次ライブラリを作成する。次いでライブラリをスクリーニングして所望の親和性をもつ任意の抗体変異体を特定する。多様性を導入する別の方法にはHVRに向けられたアプローチが関与し、幾つかのHVR残基(たとえば、一度に4〜6残基)が無作為化される。たとえば、アラニン走査変異誘発又はモデリングを用いて抗原結合に関与するHVR残基が具体的に特定される。CDR−H3及びCDR−L3は特に標的とされることが多い。
ある特定の実施形態では、そのような変更が抗体の抗原を結合する能力を実質的に低下させない限り、1以上のHVRの範囲内で置換、挿入又は欠失が生じ得る。たとえば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更(たとえば、本明細書で提供されるような保存的置換)がHVRにて為され得る。そのような変更はHVRの「ホットスポット」又はSDRの外側であり得る。上記で提供されるような変異体VH及びVLの配列のある特定の実施形態では、各HVRは変更されない又はわずか1、2又は3のアミノ酸の置換を含有する。
変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基又は領域を特定する有用な方法はCunningham及びWells(1989)、Science,244:1081−1085によって記載されたように「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の1残基又は群(たとえば、arg、asp、his、lys及びgluのような荷電した残基)が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸(たとえば、アラニン又はポリアラニン)によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けているかどうかを決定する。最初の置換に対して機能的な感受性を示すアミノ酸の位置でさらなる置換が導入され得る。代わりに又はさらに、抗原/抗体複合体の結晶構造を用いて抗体と抗原の間での接触点を特定する。そのような接触残基及び近傍の残基は置換の候補として標的化され得る又は排除され得る。変異体が所望の特性を含有するかどうかを決定するために変異体がスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列の挿入には、1残基から100以上の残基を含有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の融合、ならびに、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例にはN末端メチオニル残基を持つ抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のN又はC末端の酵素(たとえば、ADEPTのための)又は抗体の血清半減期を増やすポリペプチドへの融合が挙げられる。
(b)グリコシル化変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増やす又は減らすように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1以上のグリコシル化部位が作られる又は取り外されるようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、それに連結された糖質が変更され得る。哺乳類細胞によって産生されるネイティブな抗体は通常、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって一般に連結される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。たとえば、Wrightら、TIBTECH、15:26−32(1997)を参照のこと。オリゴ糖は、種々の糖質、たとえば、マンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」におけるGlcNAcに連結されるフコースを含み得る。一部の実施形態では、ある特定の改善された特性を持つ抗体変異体を作成するために、抗体におけるオリゴ糖の修飾が行われ得る。
一実施形態では、Fc領域に(直接的に又は間接的に)連結されたフコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。たとえば、そのような抗体におけるフコースの量は、1%〜80%、1%〜65%、5%〜65%又は20%〜40%であり得る。フコースの量は、たとえば、WO2008/077546にて記載されたようなMALDI−TOF質量分析法によって測定されるように、Asn297に連結された糖構造(たとえば、複合、混成、高マンノース構造)すべての合計に比べたAsn297における糖鎖の範囲内でのフコースの平均量を算出することによって決定される。Asn297は、Fc領域における297位(Fc領域残基のEu番号付け)付近に位置するアスパラギン残基を指すが、Asn297は、抗体における軽微な配列変異のために、297位の±3アミノ酸の上流又は下流、すなわち、294位〜300位の間に位置してもよい。そのようなフコシル化変異体は改善されたADCC機能を有し得る。たとえば、米国特許公開第2003/0157108号(Presta,L.);同第2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」の抗体変異体に関連する出版物の例には、US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazakiら、J.Mol.Biol.336:1239−1249(2004);Yamane−Ohnukiら、Biotech.Bioeng.87:614(2004)が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能である細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損するLec13CHO細胞(Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys. 249:533−545 (1986);米国特許出願第2003/0157108 A1号、Presta, L;及びWO 2004/056312 A1, Adamsら、特に実施例11)、及び、たとえば、α−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8のノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株(たとえば、Yamane−Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y.ら、Biotechnol. Bioeng., 94(4):680−688 (2006);及びWO2003/085107を参照)が挙げられる。
二等分されたオリゴ糖を伴った、たとえば、抗体のFc領域に連結された二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二等分される抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、低下したフコシル化及び/又は改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、たとえば、WO2003/011878(Jean−Mairetら);米国特許第6,602,684号(Umanaら);及びUS2005/0123546(Umanaら)に記載されている。Fc領域に連結されるオリゴ糖にて少なくとも1つのガラクトース残基を伴う抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、たとえば、WO1997/30087(Patelら);WO1998/58964(Raju,S.);及びWO1999/22764(Raju,S.)にて記載されている。
(c)Fc領域の変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のFc領域に1以上のアミノ酸修飾が導入されてもよく、それによってFc領域の変異体を生成する。Fc領域の変異体は、1以上のアミノ酸の位置にてアミノ酸修飾(たとえば、置換)を含むヒトFc領域配列(たとえば、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、生体内での抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能(たとえば、補体及びADCC)は必要ではない又は有害である適用に対してそれを望ましい候補にする、エフェクター機能の全部ではないが一部を持つ抗体変異体を企図する。生体内及び/又は試験管内の細胞傷害性アッセイを行ってCDC及び/又はADCCの活性の低下/枯渇を確認することができる。たとえば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを行って、抗体がFcγR結合を欠く(従ってADCC活性を欠きそうである)が、FcRn結合能力を保持することを保証する。ADCCに介在する主要な細胞、NK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIIを発現する。造血系細胞におけるFcRの発現は、Ravetch及びKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991)の464ページの表3にて要約されている。対象分子のADCC活性を評価するための試験管内アッセイの非限定例は、米国特許第5,500,362号(たとえば、Hellstrom,I.ら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、83:7059−7063(1986))及びHellstrom,Iら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、82:1499−1502(1985)を参照);同第5,821,337号(Bruggemann,M.ら、J.Exp.Med.166:1351−1361(1987)を参照)にて記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を採用し得る(たとえば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);及びCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega,Madison,WI)を参照)。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。代わりに又はさらに、対象分子のADCC活性は、たとえば、Clynesら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、95:652−656(1998)にて開示されたもののような動物モデルにて生体内で評価され得る。C1q結合アッセイを行って抗体がC1qに結合できないのでCDC活性を欠くことを確認し得る、たとえば、WO2006/029879及びWO2005/100402におけるC1q及びC3c結合のELISAを参照のこと。補体活性化を評価するには、CDCアッセイを行えばよい(たとえば、Gazzano−Santoroら、J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S.ら、Blood 101:1045−1052 (2003);及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103:2738−2743 (2004)を参照)。FcRn結合及び生体内のクリアランス/半減期の決定は、当該技術で既知の方法を用いて行うこともできる(たとえば、Petkova, S.B.ら、Int’l. Immunol. 18(12):1759−1769 (2006)を参照)。
エフェクター機能を低下させた抗体には、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327及び329の1以上の置換を伴ったものが挙げられる(米国特許第6,737,056号)。そのようなFc突然変異体には、残基265及び297のアラニンへの置換を伴ったいわゆる「DANA」Fc突然変異体(米国特許第7,332,581号)を含む、265、269、270、297及び327位でのアミノ酸の2以上の置換を伴ったFc突然変異体が挙げられる。
FcRへの改善された又は低下した結合を伴ったある特定の抗体変異体が記載されている(たとえば、米国特許第6,737,056号;WO2004/056312,及びShieldsら、J. Biol. Chem. 9(2): 6591−6604 (2001)を参照。)。
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、ADCCを改善する1以上のアミノ酸置換、たとえば、Fc領域の298、333及び/又は334位(残基のEU番号付け)での置換を伴ったFc領域を含む。
一部の実施形態では、たとえば、米国特許第6,194,551号、WO99/51642、及びIdusogieら、J.Immunol.164:4178−4184(2000)に記載されたように、C1q結合及び/又は補体依存性の細胞傷害性(CDC)の変化(すなわち、改善又は低下のいずれか)を生じる変更がFc領域にて行われる。
増えた半減期と、母性IgGの胎児への移行に関与する新生児Fc受容体(FcRn)(Guyerら、J. Immunol. 117:587 (1976)及びKimら、J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合を伴った抗体は、US2005/0014934A1(Hintonら)にて記載されている。それら抗体は、Fc領域のFcRnへの結合を改善する1以上の置換をその中に伴うFc領域を含む。そのようなFc変異体には、Fc領域の残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434の1以上での置換、たとえば、Fc領域の残基434の置換を伴うものが挙げられる(米国特許第7,371,826号)。
また、Fc領域の変異体の他の例に関してDuncan及びWinter,Nature、322:738−40(1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;並びにWO94/29351も参照のこと。
(d)システイン操作した抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の1以上の残基がシステイン残基で置換されるシステイン操作した抗体、たとえば、「チオMAb」を作ることが望ましい可能性がある。特定の実施形態では、置換された残基は抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれによって抗体のアクセス可能な部位に位置づけされ、それを用いて、たとえば、薬剤部分又はリンカー/薬剤部分のような他の部分に抗体を結合させ、さらに本明細書で記載されるような免疫複合体を作り得る。ある特定の実施形態では、以下の残基:軽鎖のV205(Kabat番号付け)、重鎖のA118(EU番号付け)及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)の任意の1以上がシステインによって置換され得る。抗CD22抗体の非限定の例となるシステイン操作した重鎖及び軽鎖を図3(配列番号25〜27)に示す。システイン操作した抗体は、たとえば、米国特許第7,521,541号に記載されたように生成され得る。
(e)抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はさらに、当該技術で既知であり、容易に利用可能である追加の非タンパク質様部分を含有するように修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、酸化プロリプロピレン/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(たとえば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水におけるその溶解性のために製造において利点を有し得る。ポリマーはどの分子量であってもよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってもよい。抗体に連結されるポリマーの数は変化してもよく、1を超えるポリマーが連結されるのであれば、それらは同一分子又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下等で治療に使用されるかどうかを含むが、これらに限定されない検討に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質様部分の複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kamら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600−11605 (2005))。放射線は任意の波長であってもよく、それには、普通の細胞を害することはないが、抗体/非タンパク質様部分に近傍の細胞が殺傷される温度に非タンパク質様部分を加熱する波長が挙げられるが、これらに限定されない。
B.組換え法及び組成物
たとえば、米国特許第4,816,567号に記載されたような組換え法及び組成物を用いて抗体を作製し得る。一実施形態では、本明細書で記載される抗CD22抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(たとえば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む1以上のベクター(たとえば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(たとえば、それらで形質転換されている)。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(たとえば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施形態では、抗CD22抗体を作製する方法が提供され、該方法は、抗体の発現に好適な条件下で上記で提供されたような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意で宿主細胞(又は宿主細胞の培養培地)から抗体を回収することとを含む。
抗CD22抗体の組換え作製については、たとえば、上述のような抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び/又は発現のために1以上のベクターに挿入する。そのような核酸を容易に単離し、従来の手順を用いて(たとえば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)配列決定し得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞には、本明細書で記載される原核細胞又は真核細胞が挙げられる。たとえば、抗体は、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能が必要とされない場合、細菌にて産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、たとえば、米国特許第5,648,237号、同第5,789,199号、及び同第5,840,523号を参照のこと(また、大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp. 245−254も参照)。発現後、可溶性分画にて菌体ペーストから抗体を単離してもよく、さらに精製することができる。
原核細胞に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを持つ抗体の産生を生じる真菌株及び酵母株を含めて、糸状菌又は酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニング又は発現の宿主である。Gerngross,Nat.Biotech.22:1409−1414(2004)、及びLiら、Nat.Biotech.24:210−215(2006)を参照。
グリコシル化された抗体の発現に好適な宿主は多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質移入に使用され得る多数のバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞の培養物も宿主として利用することができる。たとえば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、及び同第6,417,429号(トランスジェニック植物にて抗体を作製するためのPLANTIBODIES(商標)技法を記載している)を参照のこと。
脊椎動物の細胞も宿主細胞として使用され得る。たとえば、浮遊状態で増殖するように適合している哺乳類細胞株が有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されるサルの腎臓CV1株(COS−7);ヒト胚性腎臓細胞株(たとえば、Grahamら、J.Gen.Virol.36:59(1977)にて記載された293又は293細胞);幼若ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスのセルトリ細胞(たとえば、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980)にて記載されたようなTM4細胞);サルの腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザルの腎臓細胞(VERO−76);ヒトの子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラットの肝臓細胞(BRL3A);ヒトの肺細胞(W138);ヒトの肝臓細胞(HepG2);マウスの乳腺腫瘍(MMT060562);Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982)に記載されたようなTRI細胞;MRC5細胞及びFS4細胞である。他の有用な哺乳類の宿主細胞株には、DHFRCHO細胞(Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びY0、NS0及びSp2/0のような骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類の宿主細胞株の概説については、たとえば、Yazaki及びWu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255−268(2003)を参照のこと。
C.アッセイ
当該技術で既知の種々のアッセイによってその物理的な/化学的な特性及び/又は生物活性について、本明細書で提供される抗CD22抗体が特定され、スクリーニングされ、特性評価され得る。
一態様では、たとえば、ELISA、BIACore(登録商標)、FACS又はウエスタンブロットのような既知の方法によってその抗原結合活性について抗体が調べられる。
別の態様では、競合アッセイを用いて、CD22への結合について本明細書で記載される抗体のいずれかと競合する抗体を特定し得る。ある特定の実施形態では、そのような競合する抗体は本明細書で記載される抗体が結合する同一のエピトープ(たとえば、線形エピトープ又は立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープのマッピングのための詳細な例となる方法は、Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biology、vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)にて提供されている。
例となる競合アッセイでは、固定化したCD22を、CD22に結合する第1の標識した抗体(たとえば、本明細書で記載される抗体のいずれか)及びCD22への結合について第1の抗体と競合するその能力について調べられる第2の標識されていない抗体を含む溶液にてインキュベートする。第2の抗体はハイブリドーマの上清に存在してもよい。対照として、固定化したCD22を、第1の標識抗体を含むが、第2の標識していない抗体を含まない溶液にてインキュベートする。第1の抗体のCD22への結合を可能にする条件下でのインキュベートの後、過剰の未結合の抗体を取り除き、固定化CD22に会合した標識の量を測定する。固定化CD22に会合した標識の量が対照試料に比べて試験試料で実質的に低下しているのであれば、それが第2の抗体がCD22への結合について第1の抗体と競合していることを示す。Harlow及びLane(1988)、Antibodies:A Laboratory Manual、ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY)を参照のこと。
D.免疫複合体
本発明はまた、たとえば、化学療法剤若しくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素(たとえば、細菌、真菌、植物又は動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性複合体)のような1以上の細胞傷害剤に結合された本明細書の抗CD22抗体を含む免疫複合体も提供する。
免疫複合体は、薬剤部分の腫瘍への標的化送達を可能にし、一部の実施形態では、その中で細胞内蓄積を可能にし、その際、結合されない薬剤の全身性投与は正常な細胞に対して許容できないレベルの毒性を生じ得る(Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382−387)。
抗体/薬剤の複合体(ADC)は、強力な細胞傷害剤を抗原発現腫瘍細胞に向けることによって抗体と細胞傷害剤双方の特性を組み合わせる標的化された化学療法分子であり(Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982−1004)、それによって有効性を最大化し、標的を外れた毒性を最少化することによって治療指数を高める(Carter, P.J.及びSenter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154−169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98−107)。
本発明のADC化合物には抗癌活性を持つものが含まれる。一部の実施形態では、ADC化合物には薬剤部分に結合された、すなわち、共有結合された抗体が含まれる。一部の実施形態では、抗体はリンカーを介して薬剤部分に共有結合される。本発明の抗体/薬剤の複合体(ADC)は、有効量の薬剤を腫瘍組織に選択的に送達し、それによってさらに大きな選択性、すなわち、さらに少ない有効用量が達成され得る一方で、治療指数(「治療ウインドウ」)を大きくし得る。
抗体/薬剤の複合体(ADC)の薬剤部分(D)は、細胞傷害効果又は細胞静止効果を有する任意の化合物、部分又は基を含み得る。例となる薬剤部分には、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)及び細胞傷害活性を有するその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。そのような免疫複合体の非限定例は以下でさらに詳細に考察される。
1.例となる抗体/薬剤の複合体
抗体/薬剤の複合体(ADC)化合物の例となる実施形態は、腫瘍細胞を標的とする抗体(Ab)と、薬剤部分(D)とAbをDに連結するリンカー部分(L)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、たとえば、リジン及び/又はシステインのような1以上のアミノ酸残基を介してリンカー部分(L)に連結される。
例となるADCは式I:
Ab−(L−D)p (I)
を有し、式中、pは1〜約20である。一部の実施形態では、抗体に結合され得る薬剤部分の数は遊離のシステイン残基の数によって限定される。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法によって、遊離のシステイン残基が抗体のアミノ酸配列に導入される。式Iの例となるADCには、1、2、3又は4の操作されたシステインアミノ酸を有する抗体が挙げられるが、これらに限定されない(Lyon, R.ら、(2012) Methods in Enzym. 502:123−138)。一部の実施形態では、1以上の遊離のシステイン残基が操作を使用することなく抗体にすでに存在しており、その場合、既存の遊離のシステイン残基を用いて薬剤に抗体を結合し得る。一部の実施形態では、1以上の遊離のシステイン残基を生成するために、抗体の結合に先立って、抗体を還元状態に曝露する。
(a)例となるリンカー
「リンカー」(L)は、式Iの抗体/薬剤の複合体(ADC)を形成するために1以上の薬剤部分(D)を抗体(Ab)に連結するのに使用することができる二官能性又は多官能性の部分である。一部の実施形態では、抗体/薬剤の複合体(ADC)は、薬剤及び抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて調製することができる。たとえば、一部の実施形態では、抗体(Ab)のシステインチオールがリンカー又は薬剤/リンカーの中間体の反応性官能基と結合を形成してADCを作製することができる。
一態様では、リンカーは、抗体上に存在する遊離のシステインと反応して共有結合を形成することが可能である官能基を有する。非限定の例となるそのような反応性官能基には、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、スクシンイミドエステル、4−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステルのような活性化エステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、及びイソチオシアネートが挙げられる。たとえば、Klussmanら(2004),Bioconjugate Chemistry,15(4):765−773の766ページの結合法及び本明細書の実施例を参照のこと。
一部の実施形態では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応することが可能である官能基を有する。例となるそのような求電子基には、アルデヒド基及びケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は抗体上の求電子基と反応し、抗体単位への共有結合を形成することができる。非限定の例となるそのような反応性官能基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
リンカーは1以上のリンカー成分を含み得る。例となるリンカー成分には、6−マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン−シトルリン(「val−cit」又は 「vc」)、アラニン−フェニルアラニン(「ala−phe」)、p−アミノベンジルオキシカルボニル(a 「PAB」)、N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、及び4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1カルボキシレート(「MCC」)が挙げられる。種々のリンカー成分が当該技術で既知であり、その一部を以下に記載する。
リンカーは、薬剤の放出を円滑にする「切断可能なリンカー」であり得る。非限定の例となる切断可能なリンカーには、酸−不安定性リンカー(たとえば、ヒドラゾンを含む)、プロテアーゼ感受性(たとえば、ペプチダーゼ感受性)リンカー、光不安定性リンカー、又はジスルフィド含有リンカーが挙げられる (Chariら、Cancer Research 52:127−131 (1992); US 5208020)。
ある特定の実施形態では、リンカーは以下の式II:
−Aa−Ww−Yy− (II)
を有し、式中、Aは「ストレッチャー単位」であり、aは0〜1の整数であり、Wは「アミノ酸単位」であり、wは0〜12の整数であり、Yは「スペーサー単位」であり、yは0、1又は2である。式IIのリンカーを含むADCは、式I(A):Ab−(A−W−Y−D)pを有し、式中、Ab、D及びpは式Iについて上記で定義したとおりである。そのようなリンカーの例となる実施形態は、参照によって明らかに本明細書に組み入れられる米国特許第7,498,298号に記載されている。
一部の実施形態では、リンカー成分は抗体を別のリンカー成分又は薬剤部分に連結する「ストレッチャー単位」(A)を含む。非限定の例となるストレッチャー単位を以下に示す(波線は、抗体、薬剤又は追加のリンカー成分への共有結合の部位を示す)。
Figure 2015527318
一部の実施形態では、リンカー成分は「アミノ酸単位」(W)を含む。そのような一部の実施形態では、アミノ酸単位はプロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、たとえば、リソソーム酵素のような細胞内プロテアーゼへの曝露の際、免疫複合体からの薬剤の放出を円滑にする(Doroninaら、(2003) Nat. Biotechnol. 21:778−784)。例となるアミノ酸単位には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。例となるジペプチドには、バリン−シトルリン(vc又はval−cit)、アラニン−フェニルアラニン(af又はala−phe);フェニルアラニン−リジン(fk又はphe−lys);フェニルアラニン−ホモリジン(phe−homolys);及びN−メチル−バリン−シトルリン(Me−val−cit)が挙げられるが、これらに限定されない。例となるトリペプチドには、グリシン−バリン−シトルリン(gly−val−cit)及びグリシン−グリシン−グリシン(gly−gly−gly)が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸単位は、天然に存在するアミノ酸残基及び/又は些末なアミノ酸及び/又はシトルリンのような天然に存在しないアミノ酸類似体を含み得る。アミノ酸単位は、特定の酵素、たとえば、腫瘍関連のプロテアーゼ、カテプシンB、C及びD、又はプラスミンプロテアーゼによる酵素切断のために設計し、最適化することができる。
通常、ペプチド型のリンカーは、2以上のアミノ酸及び/又はペプチド断片の間でペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、たとえば、液相合成法に従って調製することができる(たとえば、E. Schroder及びK. Lubke (1965) “The Peptides”, volume 1, pp 76−136, Academic Press)。
一部の実施形態では、リンカー成分は、直接、又はストレッチャー単位及び/又はアミノ酸単位を介して、抗体を薬剤部分に連結する「スペーサー」単位を含む。スペーサー単位は「自壊的」であってもよいし、又は「非自壊的」であってもよい。「非自壊的」なスペーサー単位は、スペーサー配列の一部又は全部が、ADCの切断の際、薬剤部分に結合したままであるものである。非自壊的なスペーサー単位の例には、グリシンスペーサー単位及びグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、グリシン−グリシンスペーサー単位を含有するADCの腫瘍細胞に関連するプロテアーゼによる酵素切断は、ADCの残りからのグリシン−グリシン−薬剤部分の放出を生じる。そのような一部の実施形態では、グリシン−グリシン−薬剤部分は腫瘍細胞内で加水分解工程に供されるので、薬剤部分からグリシン−グリシンスペーサー単位を切断する。
「自壊的」なスペーサー単位は薬剤部分の放出を可能にする。ある特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位はp−アミノベンジル単位を含む。そのような一部の実施形態では、p−アミノベンジルアルコールがアミド結合を介してアミノ酸単位に連結され、ベンジルアルコールと薬剤の間でカルバメート、メチルカルバメート又はカルボネートが作られる(Hamannら、(2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087−1103)。一部の実施形態では、スペーサー単位はp−アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)を含む。一部の実施形態では、自壊的なリンカーを含むADCは構造:
Figure 2015527318
を有し、式中、Qは−C−Cアルキル、−O−(C−Cアルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、mは0〜4の整数であり、Xは1以上の追加のスペーサー単位であってもよく又は存在しなくてもよく、pは1〜約20の範囲である。一部の実施形態では、pは1〜10、1〜7、1〜5又は1〜4の範囲である。非限定の例となるXスペーサー単位には
Figure 2015527318
が挙げられ、式中、R及びRは独立してH及びC−Cアルキルから選択される。一部の実施形態では、R1及びR2はそれぞれ−CHである。
自壊的なスペーサーの他の例には、たとえば、2−アミノイミダゾール−5−メタノール誘導体(米国特許第7,375,078号; Hayら、(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、及びオルソ−又はパラ−アミノベンジルアセタールのような電子的にはPAB基に類似する芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、たとえば、置換された及び非置換の4−アミノ酪酸アミド(Rodriguesら、(1995) Chemistry Biology 2:223)、適当に置換されたビシクロ[2.2.1]及びビシクロ[2.2.2]環系(Stormら、(1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)、及び2−アミノフェニルプロピオン酸アミド(Amsberryら、(1990) J. Org. Chem. 55:5867)のようなアミド結合の加水分解の際に環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシン残基のα炭素への薬剤の結合は、ADCにて有用であり得る自壊的なスペーサーの別の例である(Kingsburyら、(1984) J. Med. Chem. 27:1447)。
一部の実施形態では、リンカーLは、分枝鎖の多官能性リンカー部分を介した抗体への1を超える薬剤部分の共有結合のための樹状型リンカーであり得る(Sunら、(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213−2215; Sunら、(2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761−1768)。樹状リンカーは薬剤と抗体のモル比、すなわち、ADCの効力に関係する負荷を高めることができる。従って、抗体がたった1つの反応性システインチオール基しか持たない場合、多数の薬剤部分は樹状リンカーを介して連結され得る。
式IのADCの文脈で非限定の例となるリンカーを以下に示す。
Figure 2015527318
式中、R及びRは独立してH及びC−Cアルキルから選択される。一部の実施形態では、R1及びR2はそれぞれ−CHである。
Figure 2015527318
式中、nは0〜12である。一部の実施形態では、nは2〜10である。一部の実施形態では、nは4〜8である。
さらなる非限定の例となるADCは構造:
Figure 2015527318
を有し、式中、Xは、
Figure 2015527318
であり、
Yは、
Figure 2015527318
であり、各Rは独立してH又はC−Cアルキルであり、nは1〜12である。
一部の実施形態では、リンカーは溶解性及び/又は反応性を調節する基によって置換される。非限定例として、たとえば、スルホネート(−SO )又はアンモニウムのような荷電置換基は、ADCを調製するのに採用される合成経路によっては、リンカー試薬の水溶解性を高めてもよく、抗体及び/又は薬剤部分とのリンカー試薬のカップリング反応を促進してもよく、又はAb−L(抗体−リンカー中間体)のDとの、若しくはD−L(薬剤−リンカー中間体)のAbとのカップリング反応を促進してもよい。一部の実施形態では、リンカーの一部が抗体にカップリングし、リンカーの一部が薬剤にカップリングし、次いでAb−(リンカー部分)が薬剤−(リンカー部分)にカップリングして式IのADCを形成する。
本発明の化合物は、以下のリンカー試薬:ビス−マレイミド−トリオキシエチレングリコール(BMPEO)、N−(β−マレイミドプロピルオキシ)−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BMPS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)、N−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)、1,6−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン(HBVS)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート)(LC−SMCC)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、4−(4−N−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)、スクシンイミジル3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)、スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、N−スクシンイミジル−4−(2−ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、スクシンイミジル6−[(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート](SMPH)、イミノチオエート(IT)、スルホ−EMCS、スルホ−GMBS、スルホ−KMUS、スルホ−MBS、スルホ−SIAB、スルホ−SMCC、及びスルホ−SMPB、及びスクシンイミジル−(4−ビニルスルホン)ベンゾエート(SVSB)、及びビス−マレイミド試薬:ジチオビスマレイミドエタン(DTME)、1,4−ビスマレイミドブタン(BMB)、1,4ビスマレイミジル−2,3−ジヒドロキシブタン(BMDB)、ビスマレイミドヘキサン(BMH)、ビスマレイミドエタン(BMOE)、BM(PEG)(以下に示す)、及びBM(PEG)(以下に示す)を含めて;イミドエステル(たとえば、ジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(たとえば、ジスクシンイミジルスベレート)、アルデヒド(たとえば、グルタールアルデヒド)、ビス−アジド化合物(たとえば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(たとえば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(たとえば、トルエン2,6−ジイソシアネート)、及びビス活性フッ素化合物(たとえば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)の二官能性誘導体と共に調製されるADCを明らかに企図するが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ビス−マレイミド試薬は、抗体におけるシステインのチオール基のチオール含有の薬剤部分、リンカー、又はリンカー−薬剤中間体への結合を可能にする。チオール基と反応性である他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート及びイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2015527318
ある特定の有用なリンカー試薬は、たとえば、Pierce Biotechnology社(Rockford,IL)、Molecular Biosciences社(Boulder,CO)のような種々の商業的供給源から入手することができ、又は当該技術、たとえば、Tokiら(2002) J.Org.Chem.67:1866−1872;Dubowchikら、(1997) Tetrahedron Letters,38:5257−60;Walker,M.A.(1995) J.Org.Chem.60:5352−5355;Frischら、(1996) Bioconjugate Chem.7:180−186;US6214345;WO02/088172;US2003130189;US2003096743;WO03/026577;WO03/043583;及びWO04/032828に記載された手順に従って合成することができる。
炭素14を標識した1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX−DTPA)は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合するための例となるキレート剤である。たとえば、WO94/11026を参照のこと。
(b)例となる薬剤部分
一部の実施形態では、ADCはピロロベンゾジアゼピン(PBD)を含む。一部の実施形態では、PBD二量体は特定のDNA配列を認識し、それに結合する。天然の産物アントラマイシン、PBDは1965年に初めて報告された(Leimgruberら、(1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793−5795; Leimgruberら、(1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791−5793)。それ以来、天然に存在する及び類似体である多数のPBDが報告されている(Thurstonら、(1994) Chem. Rev. 1994, 433−465 including dimers of the tricyclic PBD scaffold (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099)。特定の理論によって束縛されることを意図するものではないが、二量体構造がB形態のDNAの小溝との等らせん性に適する三次元形状を付与し、結合部位でのぴったりした嵌合を導くと考えられる。(Kohn, In Antibiotics III. Springer−Verlag, New York, pp. 3−11 (1975); Hurley及びNeedham−VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230−237)。C2アリール置換基を持つ二量体PBD化合物は、細胞傷害剤として有用であることが示されている(Hartleyら、(2010) Cancer Res. 70(17):6849−6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927−2941; Howardら、(2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463−6466)。
PBDが抗体に結合されており、得られたADCは抗癌特性を有することが示されている。PBD二量体における非限定の例となる結合部位には、5員環のピロール環、PBD単位間のテザー、及びN10−C11のイミン基が挙げられる(WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598)。
ADCの非限定の例となるPBD二量体成分は、式A:
Figure 2015527318
のもの及びその塩及び溶媒和物であり;
式中、波線はリンカーへの共有結合部位を示し;
点線は、C1とC2又はC2とC3の間での二重結合の任意の存在を示し;
は独立してH、OH、=O、=CH、CN、R、OR、=CH−R、=C(R、O-SO-R、COR及びCORから選択され、任意でさらにハロ又はジハロから選択され、Rは独立してR、COR、COR、CHO、COH、及びハロから選択され;
及びRは独立してH、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから選択され;
は独立してH、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから選択され;
Qは独立してO、S及びNHから選択され;
11はH若しくはRのいずれかであり、又は、QがOである場合、SOMであり、Mは金属カチオンであり;
R及びR’はそれぞれ、任意で置換されたC1−12アルキル基、C3-20ヘテロシクリル基及びC5−20アリール基から独立して選択され、任意でNRR’の基と関連して、R及びR’はそれらが連結される窒素原子と一緒に任意で置換された4、5、6又は7員環の複素環の環を形成し;
12、R16、R19及びR17はそれぞれR、R、R及びRについて定義されたとおりであり;
R”はC3−12アルキレン基であり、その鎖は、1以上のヘテロ原子、たとえば、O、S、N(H)、NMe及び/又は芳香族環、たとえば、ベンゼン又はピリジンによって中断されてもよく、その環は任意で置換され;
X及びX’は独立してO、S及びN(H)から選択される。
一部の実施形態では、R及びR19はHである。
一部の実施形態では、R及びR16はHである。
一部の実施形態では、R及びR17は双方ともOR7Aであり、その際、R7Aは任意で置換されたC1−4アルキルである。一部の実施形態では、R7AはMeである。一部の実施形態では、R7AはCHPhであり、Phはフェニル基である。
一部の実施形態では、XはOである。
一部の実施形態では、R11はHである。
一部の実施形態では、各単量体単位におけるC2とC3の間には二重結合がある。
一部の実施形態では、R及びR12は独立してH及びRから選択される。一部の実施形態では、R及びR12は独立してRである。一部の実施形態では、R及びR12は独立して、任意で置換されたC5−20アリール又はC5−7アリール又はC8−10アリールである。一部の実施形態では、R及びR12は独立して、任意で置換されたフェニル、チエニル、ナフチル、ピリジル、キノリニル、又はイソキノリニルである。一部の実施形態では、R及びR12は独立して=O、=CH、=CH−R、及び=C(Rから選択される。一部の実施形態では、R及びR12はそれぞれ=CHである。一部の実施形態では、R及びR12はそれぞれHである。一部の実施形態では、R及びR12はそれぞれ=Oである。一部の実施形態では、R及びR12はそれぞれ=CFである。一部の実施形態では、R及び/又はR12は独立して=C(Rである。一部の実施形態では、R及び/又はR12は独立して=CH−Rである。
一部の実施形態では、R及び/又はR12は=CH−Rであり、各基は独立して以下に示すいずれかの構造を有し得る:
Figure 2015527318
一部の実施形態では、=CH−Rは構造(I)である。
一部の実施形態では、R”はCアルキレン基又はCアルキレン基である。
一部の実施形態では、ADCの例となるPBD二量体成分は式A(I)の構造を有し;
Figure 2015527318
式中、nは0又は1である。
一部の実施形態では、ADCの例となるPBD二量体成分は式A(II)の構造を有し;
Figure 2015527318
式中、nは0又は1である。
一部の実施形態では、ADCの例となるPBD二量体成分は式A(III)の構造を有し;
Figure 2015527318
式中、R及びRE”はそれぞれ独立してH又はRから選択され、Rは上記のとおりに定義され、
式中、nは0又は1である。
一部の実施形態では、nは0である。一部の実施形態では、nは1である。一部の実施形態では、R及び/又はRE”はHである。一部の実施形態では、R及びRE”はHである。一部の実施形態では、R及び/又はRE”はRであり、その際、Rは任意で置換されたC1−12アルキルである。一部の実施形態では、R及び/又はRE”はRであり、その際、Rはメチルである。
一部の実施形態では、ADCの例となるPBD二量体成分は式A(IV)の構造を有し;
Figure 2015527318
式中、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールであり、その際、Ar及びArは同一であってもよいし、異なっていてもよく、
式中、nは0又は1である。
一部の実施形態では、ADCの例となるPBD二量体成分は式A(V)の構造を有し;
Figure 2015527318
式中、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールであり、その際、Ar及びArは同一であってもよいし、異なっていてもよく、
式中、nは0又は1である。
一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから選択される。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニルである。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたチエン−2−イル又はチエン−3−イルである。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたキノリニル又はイソキノリニルである。キノリニル基又はイソキノリニル基は、任意の利用可能な環の位置を介してPBDのコアに結合し得る。たとえば、キノリニルは、キノリン−2−イル、キノリン−3−イル、キノリン−4−イル、キノリン−5−イル、キノリン−6−イル、キノリン−7−イル及びキノリン−8−イルであってもよい。一部の実施形態では、キノリニルは、キノリン−3−イル及びキノリン−6−イルから選択される。イソキノリニルは、イソキノリン−1−イル、イソキノリン−3−イル、イソキノリン−4イル、イソキノリン−5−イル、イソキノリン−6−イル、イソキノリン−7−イル及びイソキノリン−8−イルであってもよい。一部の実施形態では、イソキノリニルは、イソキノリン−3−イル及びイソキノリン−6−イルから選択される。
ADCのさらなる非限定の例となるPBD二量体成分は式B:
Figure 2015527318
のもの及びその塩及び溶媒和物であり、式中、
波線はリンカーへの共有結合を示し;
OHに接続される波線はS又はRの配置を示し;
V1及びRV2は独立してH、メチル、エチル、及びフェニル(フェニルは特に4位にてフルオロによって任意で置換されてもよい)及びC5−6ヘテロシクリルから選択され、その際、RV1及びRV2は同一であってもよいし、異なっていてもよく、
nは0又は1である。
一部の実施形態では、RV1及びRV2は独立してH、フェニル及び4−フルオロフェニルから選択される。
一部の実施形態では、リンカーは、B環のN10イミン、C環のC−2エンド/エクソ位置、又はA環を連結するテザー単位(以下の構造C(I)及びC(II)を参照)を含むPBD二量体薬剤部分の種々の部位の1つにて連結され得る。
ADCの非限定の例となるPBD二量体成分は式C(I)及びC(II)を含む:
Figure 2015527318
式C(I)及びC(II)はそのN10−C11イミンの形態で示される。例となるPBD薬剤部分はまた、以下の表で示すように、同様にカルビノールアミン及び保護されたカルビノールアミンの形態も含み、
Figure 2015527318
式中、
Xは、CH(n=1〜5)、N、又はOであり;
Z及びZ’は独立してOR及びNRから選択され、その際、Rは1〜5の炭素原子を含有する1級、2級又は3級アルキル鎖であり;
、R’、R及びR’はそれぞれ独立してH、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C5−20アリール(置換されたアリールを含む)、C5−20ヘテロアリール基、−NH、−NHMe、−OH、及び−SHから選択され、その際、一部の実施形態では、アルキル、アルケニル及びアルキニルの鎖は5までの炭素原子を含み;
及びR’は独立してH、OR、NHR、及びNRから選択され、その際、Rは1〜5の炭素原子を含有する1級、2級又は3級アルキル鎖であり;
及びR’は独立してH、Me、及びOMeから選択され;
はC−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C5−20アリール(ハロ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル、ヘテロシクリルによって置換されたアリールを含む)及びC5−20ヘテロアリール基から選択され、その際、一部の実施形態では、アルキル、アルケニル及びアルキニルの鎖は5までの炭素原子を含み;
11は、H、C−Cアルキル、又は保護基(たとえば、アセチル、トリフルオロアセチル、t−ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(CBZ)、9−フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Fmoc)、又はバリン−シトルリン−PABのような自壊型単位を含む部分)であり;
12は、H、C−Cアルキル、又は保護基であり;
その際、R、R’、R、R’、R、若しくはR12のうちの1つの水素又はA環の間の−OCHCH(X)CHCHO−スペーサーの水素はADCのリンカーに接続される結合によって置き換えられる。
ADCの例となるPBD二量体部分には、(波線がリンカーへの共有結合の部位を示す)
Figure 2015527318
が挙げられるが、これに限定されない。
一部の実施形態では、PBD二量体を含む抗体−薬剤複合体は式(D):
Figure 2015527318
及びその塩及び溶媒和物の構造を有し、式中、
点線は、C1とC2又はC2とC3の間での二重結合の任意の存在を示し;
は独立してH、OH、=O、=CH、CN、R、OR、=CH−R、=C(R、O-SO-R、COR及びCORから選択され、任意でさらにハロ又はジハロから選択され;その際、Rは独立してR、COR、COR、CHO、COH、及びハロから選択され;
及びRは独立してH、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから選択され;
は独立してH、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから選択され;
Yは、単結合及び式a1又はa2の基から選択され;
Figure 2015527318
その際、Nは基がPBD部分のN10に結合する場所を示し;
L1及びRL2は独立してH及びメチルから選択され、又はそれらが結合する炭素原子と一緒になってシクロプロピレン基を形成し;
CBAは抗体を表し;
Qは独立してO、S及びNHから選択され;
11はH、又はRのいずれかであり、又は、QがOである場合、SOMであり、その際、Mは金属カチオンであり;
R及びR’はそれぞれ独立して、任意で置換されたC1−12アルキル基、C3−20ヘテロシクリル基及びC5−20アリール基から選択され、任意でNRR’基に関連して、R及びR’はそれらが連結される窒素原子と一緒に任意で置換された4、5、6又は7員環の複素環の環を形成し;
その際、R12、R16、R19及びR17はそれぞれ、R、R、R及びRについて定義されたとおりであり;
R”は、C3−12アルキレン基であり、その鎖は、1以上のヘテロ原子、たとえば、O、S、N(H)、NMe及び/又は芳香族環、たとえば、その環が任意で置換されるベンゼン又はピリジンによって中断されてもよく;
X及びX’は独立して、O、S及びN(H)から選択される。
一部の実施形態では、抗体はシステインを介してPBD二量体に連結され、たとえば、図4B及び4Cで示されるジスルフィド結合を形成する。
一部の実施形態では、式DはYに応じて以下の式D-I、D-II及びD-IIIから選択される。
Figure 2015527318
式Aの化合物では、
Figure 2015527318
がイオウ連結基である。
一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、
式中、CBAは抗体であり、nは0又は1である。Y、RL1及びRL2は以前定義されたとおりであり、R及びR は独立してH又はRから選択される。
上述の実施形態のいずれかでは、ある特定の置換基が以下のように定義されてもよく、その際、適宜、
nは0であり;
nは1であり;
はHであり;
はRであり、その際、Rは任意で置換されたアルキルであり;
はRであり、その際、Rはメチルであり;
L1及びRL2はHであり;
L1及びRL2はMeである。
一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、式中、CBAは抗体であり、nは0又は1である。Y、RL1及びRL2は以前定義されたとおりであり、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールである。Ar及びArは同一であってもよいし、異なっていてもよい。
一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから選択される。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ任意で置換されたフェニルである。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ任意で置換されたチエン−2−イル又はチエン−3−イルである。一部の実施形態では、Ar及びArはそれぞれ任意で置換されたキノリニル又はイソキノリニルである。
種々の実施形態では、キノリニル基又はイソキノリニル基は任意の利用可能な環の位置を介してPBDのコアに結合され得る。たとえば、キノリニルは、キノリン−2−イル、キノリン−3−イル、キノリン−4−イル、キノリン−5−イル、キノリン−6−イル、キノリン−7−イル及びキノリン−8−イルであってもよい。そのうち、キノリン−3−イル及びキノリン−6−イルが好まれ得る。イソキノリニルは、イソキノリン−1−イル、イソキノリン−3−イル、イソキノリン−4イル、イソキノリン−5−イル、イソキノリン−6−イル、イソキノリン−7−イル及びイソキノリン−8−イルであってもよい。そのうち、イソキノリン−3−イル及びイソキノリン−6−イルが好まれ得る。
一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、一部の実施形態では、ADCは構造:
Figure 2015527318
を含み、式中、CBAは抗体であり、nは0又は1である。Y、RL1及びRL2は以前定義されたとおりであり、RV1及びRV2はそれぞれ独立してH、メチル、エチル及びフェニル(フェニルは一部の実施形態では、4位にてフルオロによって任意で置換されてもよい)及びC5−6ヘテロシクリルから選択される。RV1及びRV2は同一であってもよいし、異なっていてもよい。一部の実施形態では、RV1及びRV2は独立してH、フェニル及び4−フルオロフェニルから選択され得る。
PBD二量体を含むADCの非限定の例となる実施形態は以下の構造:
Figure 2015527318
を有し、式中、nは0〜12である。一部の実施形態では、nは2〜10である。一部の実施形態では、nは4〜8である。一部の実施形態では、nは4、5、6、7及び8から選択される。
PBD二量体−val−cit−PAB−Ab及びPBD二量体−Phe−Lys−PAB−Abのリンカーはプロテアーゼで切断可能である。
PBD二量体を含むADCの非限定の例となる実施形態は以下の構造:
Figure 2015527318
を有する。
PBD二量体及びPBD二量体を含むADCは当該技術で既知の方法、及び本明細書で記載される方法に従って調製され得る。たとえば、WO2009/016516;US2009/304710;US2010/047257;US2009/036431;US2011/0256157;WO2011/130598を参照のこと。
(c)薬剤負荷
薬剤負荷は、式Iの分子における抗体当たりの薬剤部分の平均数pによって表される。薬剤負荷は抗体当たり1〜20の薬剤部分(D)の範囲であり得る。式IのADCは1〜20の範囲の薬剤部分と結合された抗体の集合を含む。結合反応に由来するADCの調製における抗体当たりの薬剤部分の平均数は、たとえば、質量分析法、ELISAアッセイ及びHPLCのような従来の手段によって特徴づけられ得る。pという点でADCの定量的な分布も決定され得る。場合によっては、pが他の薬剤負荷を伴うADCに由来するある特定の値である均質なADCの分離、精製及び特性評価は、たとえば、逆相HPLC又は電気泳動のような手段によって達成され得る。
一部の抗体/薬剤の複合体については、pは抗体上の結合部位の数によって限定され得る。たとえば、結合がシステインチオールである場合、上記のある特定の例となる実施形態におけるように、抗体はたった1つ又は数個のシステインチオール基を有してもよく、又はそれを介してリンカーが結合するたった1つの又は数個の十分に反応性のチオール基を有してもよい。ある特定の実施形態では、たとえば、p>5のような高い薬剤負荷は、ある特定の抗体/薬剤の複合体の凝集、不溶性、毒性又は細胞浸透性の喪失の原因となり得る。ある特定の実施形態では、ADCについての平均薬剤負荷は1〜約8、約2〜約6又は約3〜約5の範囲である。実際、ある特定のADCについて、抗体当たりの薬剤部分の最適な比は8未満であってもよく、約2〜約5であってもよい(US7498298)。
ある特定の実施形態では、結合反応の間に、理論的な最大数より少ない薬剤部分が抗体に結合される。以下で考察するように、抗体は、薬剤/リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しない、たとえば、リジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬剤部分に連結され得る遊離で反応性のシステインチオール基を多数は含有せず、実際、抗体におけるシステインチオール残基のほとんどはジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態では、抗体は、部分的な又は完全な還元条件下で、たとえば、ジチオスレイトール(DTT)又はトリカルボニルエチルホスフィン(TCEP)のような還元剤で還元されて反応性のシステインチオール基を生成し得る。ある特定の実施形態では、抗体は変性条件に供されて、たとえば、リジン又はシステインのような反応性の求核基を明らかにする。
ADCの負荷(薬剤/抗体の比)は、異なる方法によって、たとえば、(i)抗体に対する薬剤/リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰を制限すること、(ii)結合反応の時間又は温度を制限すること、及び(iii)システインチオールの修飾のための不完全な又は限定的な還元条件によって制御され得る。
1を超える求核基が薬剤/リンカー中間体又はリンカー試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗体に連結された1以上の薬剤部分の分布を伴ったADC化合物の混合物であることが理解されるべきである。抗体当たりの薬剤の平均数は、抗体に特異的であり、且つ薬剤に特異的である二重ELISA抗体アッセイによって混合物から算出され得る。個々のADC分子は質量分析法によって混合物にて特定され、HPLC、たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィによって分離され得る(たとえば、McDonaghら、(2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299−307; Hamblettら、(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063−7070; Hamblett, K.J.ら、 “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti−CD30 antibody−drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27−31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C.ら、“Controlling the location of drug attachment in antibody−drug conjugates,” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27−31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004を参照)。ある特定の実施形態では、単一の負荷値を持つ均質なADCは、電気泳動又はクロマトグラフィによって複合体混合物から単離され得る。
(d)免疫複合体を調製するある特定の方法
式IのADCは、(1)共有結合を介してAb−Lを形成するための抗体の求核基の二価リンカー試薬との反応、その後の薬剤部分Dとの反応;及び(2)共有結合を介してD−Lを形成するための薬剤部分の求核基の二価リンカー試薬との反応、その後の抗体の求核基との反応を含む、当業者に既知の有機化学の反応、条件及び試薬を用いた幾つかの経路によって調製され得る。後者の経路を介して式IのADCを調製する例となる方法は参照によって明らかに本明細書に組み入れられるUS7498298にて記載されている。
抗体上の求核基には、(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基、たとえば、リジン、(iii)側鎖チオール基、たとえば、システイン及び(iv)抗体がグリコシル化される場合の糖のヒドロキシル基又はアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン基、チオール基及びヒドロキシル基は、求核性であり、(i)たとえば、NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化合物のような活性エステル、(ii)たとえば、ハロアセトアミドのようなアルキル及びベンジルのハロゲン化合物、並びに(iii)アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬と反応して共有結合を形成することが可能である。ある特定の抗体は還元可能な鎖間のジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、完全に又は部分的に還元されるように、たとえば、DTT(ジチオスレイトール)又はトリカルボニルエチルホスフィン(TCEP)のような還元剤で処理することによって、リンカー試薬との結合について反応性にし得る。従って、各システイン架橋は理論的には2つの反応性チオール求核試薬を形成するであろう。たとえば、リジン残基を2−イミノチオラン(Trautの試薬)と反応させてアミンのチオールへの変換を生じることによって、リジン残基の修飾を介して追加の求核基を抗体に導入することができる。1、2、3、4以上のシステイン残基を導入することによって(たとえば、1以上のネイティブではないシステインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製することによって)、反応性のチオール基も抗体に導入し得る。
本発明の抗体/薬剤の複合体は、たとえば、アルデヒド基又はケトンカルボニル基のような抗体上の求電子基とリンカー試薬又は薬剤における求核基との間での反応によっても産生し得る。リンカー試薬上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗体は、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応することが可能である求電子部分を導入するように修飾される。別の実施形態では、グリコシル化された抗体の糖が、たとえば、過ヨウ素酸酸化試薬によって酸化されて、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応し得るアルデヒド基又はケトン基を形成する。得られるイミンSchiff塩基の基は、安定な結合を形成してもよく、又は、たとえば、ホウ化水素試薬によって還元されて安定なアミン結合を形成してもよい。一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとのグリコシル化された抗体の糖質部分の反応は、薬剤上の適当な基と反応することができる抗体におけるカルボニル(アルデヒドとケトン)基を生じ得る(Hermanson, Bioconjugate Techniques)。別の実施形態では、N末端のセリン又はスレオニン残基を含有する抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して第1のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生を生じることができる(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138−146; US 5362852)。そのようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカーの求核試薬と反応することができる。
薬剤部分における例となる求核基には、(i)たとえば、NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化合物のような活性エステル、(ii)たとえば、ハロアセトアミドのようなアルキル及びベンジルのハロゲン化合物、並びに(iii)アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬における求電子基と反応して共有結合を形成することが可能であるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
ADCを調製するのに使用され得る非限定の例となる架橋剤は「例となるリンカー」と題する節にて本明細書で記載されている。そのような架橋試薬を使用してタンパク質様部分と化学部分を含む2つの部分を連結する方法は当該技術で既知である。一部の実施形態では、抗体及び細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、たとえば、組換え法又はペプチド合成によって作製され得る。組換えDNA分子は、複合体の抗体と細胞傷害性部分を互いに隣接して、又は複合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されてコードする領域を含み得る。
さらに別の実施形態では、抗体は、腫瘍のプレターゲティングで利用するための「受容体」(たとえば、ストレプトアビジン)に結合されてもよく、抗体/受容体の複合体が患者に投与され、その後、取り除き剤を用いて未結合の複合体を循環から取り除き、次いで細胞傷害剤(たとえば、薬剤又は放射性ヌクレオチド)に結合される「リガンド」(たとえば、アビジン)を投与する。
E.診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗CD22抗体のいずれかは生物試料におけるCD22の存在を検出するのに有用である。用語「検出すること」は本明細書で使用されるとき、定量的な又は定性的な検出を包含する。「生物試料」は、たとえば、細胞又は組織(リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫及びマントル細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されないB細胞疾病及び/又はB細胞増殖性疾病を有する又は有することが疑われる対象からの組織を含む、癌性リンパ組織又は癌の可能性があるリンパ組織を含む生検材料)を含む。
一実施形態では、診断又は検出の方法に使用するための抗CD22抗体が提供される。さらなる態様では、生物試料におけるCD22の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態では、方法は、抗CD22抗体のCD22への結合を許容する条件下で本明細書で記載されるような抗CD22抗体に生物試料を接触させることと、生物試料にて抗CD22抗体とCD22との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は試験管内又は生体内の方法であり得る。一実施形態では、抗CD22抗体を用いて抗CD22抗体による治療に適格な対象を選択し、たとえば、その際、CD22は対象の選択のためのバイオマーカーである。さらなる実施形態では、生体試料は、たとえば、細胞又は組織(リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫及びマントル細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されないB細胞疾病及び/又はB細胞増殖性疾病を有する又は有することが疑われる対象からの組織を含む、癌性リンパ組織又は癌の可能性があるリンパ組織)である。
さらなる実施形態では、抗CD22抗体を用いて、たとえば、癌を診断する、予知する若しくは病期分類する、治療の適当な経過を判定する、又は治療に対する癌の応答をモニターする目的で、生体内での画像診断によって対象におけるCD22陽性の癌を生体内で検出する。生体内での検出のための当該技術で既知の方法の1つは、van Dongenら、The Oncologist、12:1379−1389(2007)及びVerelら、J.Nucl.Med.44:1271−1281(2003)にて記載されたような免疫ポジトロン放出断層撮影(免疫PET)である。そのような実施形態では、方法は対象にてCD22陽性の癌を検出するために提供され、該方法は、CD22陽性の癌を有する又は有することが疑われる対象に標識された抗CD22抗体を投与することと、対象にて標識された抗CD22抗体を検出することを含み、その際、標識された抗CD22抗体の検出が対象におけるCD22陽性の癌を示す。そのようなある特定の実施形態では、標識された抗CD22抗体は、ポジトロン放射体、たとえば、68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr、及び124Iに結合された抗CD22抗体を含む。特定の実施形態では、ポジトロン放射体は89Zrである。
さらなる実施形態では、診断又は検出の方法は、基材に固定化された第1の抗CD22抗体をCD22の存在について調べられる生物試料に接触させることと、基材を第2の抗CD22抗体に曝露し、生物試料における第1の抗CD22抗体とCD22との間の複合体に第2の抗CD22抗体が結合するかどうかを検出することを含む。基材は、支持媒体、たとえば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ及び他の基材であってもよい。ある特定の実施形態では、生物試料は、細胞又は組織(リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫及びマントル細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されないB細胞疾病及び/又はB細胞増殖性疾病を有する又は有することが疑われる対象からの組織を含む、癌性リンパ組織又は癌の可能性があるリンパ組織を含む生検材料)を含む。ある特定の実施形態では、第1又は第2の抗CD22抗体は本明細書で記載される抗体のいずれかである。
上記の実施形態のいずれかに従って診断され得る又は検出され得る例となる疾病には、たとえば、CD22陽性のリンパ腫、CD22陽性の非ホジキンリンパ腫(NHL;CD22陽性の侵攻性NHL、CD22陽性の再発した侵攻性NHL、CD22陽性の再発した緩慢型NHL、CD22陽性の難治性NHL、及びCD22陽性の難治性緩慢型NHLを含む)、CD22陽性の慢性リンパ性白血病(CLL)、CD22陽性の小リンパ性リンパ腫、CD22陽性の白血病、CD22陽性のヘアリー細胞白血病(HCL)、CD22陽性の急性リンパ性白血病(ALL)、CD22陽性のバーキットリンパ腫及びCD22陽性のマントル細胞リンパ腫が挙げられる。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、腫瘍細胞の>90%にて非常に弱い染色又は染色されないものに相当する「0」を上回る抗CD22免疫組織化学(IHC)スコアを受け取る癌である。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、1+、2+、又は3+のレベルでCD22を発現し、その際、1+は腫瘍細胞の>50%で弱い染色に相当し、2+は腫瘍細胞の>50%で中程度の染色に相当し、3+は腫瘍細胞の>50%で強い染色に相当する。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、その場でのハイブリッド形成(ISH)アッセイに従ってCD22を発現する癌である。そのような一部の実施形態では、IHCで使用されるものに類似するスコア化方式が使用される。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、CD22のmRNAを検出する逆転写酵素PCR(RT−PCR)に従ってCD22を発現する癌である。一部の実施形態では、RT−PCRは定量的RT−PCRである。
ある特定の実施形態では、標識された抗CD22抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分(たとえば、蛍光標識、発色団標識、電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識)、ならびに、たとえば酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が挙げられるが、これらに限定されない。例となる標識には、放射性同位元素、32P、14C、125I、H及び131I、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンのような蛍光色素分子、ルシフェラーゼ、たとえば、ホタルのルシフェラーゼ及び細菌のルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、たとえば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、たとえば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、たとえば、HRP、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼのような過酸化水素を用いる酵素とカップリングさせて色素前駆体を酸化する酵素、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、標識はポジトロン放射体である。ポジトロン放射体には、68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr、及び124Iが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポジトロン放射体は89Zrである。
F.医薬製剤
本明細書で記載されるような抗CD22抗体又は免疫複合体の医薬製剤は、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で、1以上の任意の薬学上許容可能なキャリア(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と共に所望の程度の純度を有するそのような抗体又は免疫複合体を混合することによって調製される。薬学上許容可能なキャリアは一般に、採用される投与量及び濃度にてレシピエントに非毒性であり、それには、たとえば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(たとえば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質;たとえば、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の糖類;EDTAのようなキレート剤;たとえば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖類;たとえば、ナトリウムのような塩形成性の対イオン;金属錯体(たとえば、Zn−タンパク質錯体);及び/又は非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリエチレングリコール(PEG)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で例となる薬学上許容可能なキャリアにはさらに、間質薬物分散剤、たとえば、可溶性で中性で活性のあるヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)たとえば、ヒトの可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、たとえば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International社)が挙げられる。rHuPH20を含む、ある特定の例となるsHASEGPs及び使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号にて記載されている。一態様では、sHASEGPは、たとえば、1以上の追加のコンドロイチナーゼのようなグリコサミノグリカナーゼと併用される。
例となる凍結乾燥した抗体又は免疫複合体は米国特許第6,267,958号に記載されている。水性の抗体又は免疫複合体の製剤には、米国特許第6,171,586号及びWO2006/044908にて記載されたものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン/酢酸緩衝液を含む。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症について必要に応じて1を超える有効成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的な活性を持つものも含有してもよい。
有効成分は、たとえば、液滴形成法によって、又は界面重合、たとえば、コロイド状薬剤送達システム(たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)における又はマクロエマルジョンにおけるそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセルに被包されてもよい。そのような技法は、RemingtonのPharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.編(1980)にて開示されている。
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の好適な例には、抗体又は免疫複合体を含有する固形の疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、マトリクスは成形された物品、たとえば、膜又はマイクロカプセルの形状である。
生体内投与で使用される製剤は一般に無菌である。たとえば、滅菌の濾過膜を介した濾過によって無菌性は容易に達成され得る。
G.治療方法及び治療用組成物
本明細書で提供される抗CD22抗体又は免疫複合体は、方法、たとえば、治療方法で使用され得る。
一態様では、CD22陽性細胞の増殖を阻害する方法にて本明細書で提供される抗CD22抗体又は免疫複合体が使用され、該方法は、細胞表面上のCD22への抗CD22抗体又は免疫複合体の結合を許容する条件下で細胞を抗CD22抗体又は免疫複合体に曝露することを含み、それによって細胞の増殖を阻害する。ある特定の実施形態では、方法は試験管内又は生体内の方法である。一部の実施形態では、細胞はB細胞である。一部の実施形態では、細胞は、たとえば、リンパ腫細胞又は白血病細胞のような腫瘍性B細胞である。
試験管内での細胞増殖の阻害は、Promega(ウィスコンシン州、マジソン)から市販されているCellTiter−Glo(商標)発光細胞生存率アッセイを用いてアッセイされ得る。そのアッセイは、代謝的に活性のある細胞の指標である、存在するATPの定量に基づいて培養物における生存細胞の数を決定する。たとえば、Crouchら(1993)、J.Immunol.Meth.160:81−88,米国特許第6602677号を参照のこと。アッセイは、自動化高処理能力スクリーニングに適する96穴又は384穴の形式で実施し得る。たとえば、Creeら(1995)、AntiCancer Drugs、6:398−404を参照のこと。アッセイ手順には、単一試薬(CellTiter−Glo(商標)試薬)を培養された細胞に直接添加することが関与する。これは細胞溶解を生じ、ルシフェラーゼ反応によって蛍光シグナルの生成を生じる。発光シグナルは存在するATPの量に比例し、それは培養物に存在する生存細胞の数に直接比例する。データはルミノメータ又はCCDカメラ画像化装置によって記録することができる。発光出力は相対的な光単位(RLU)として表される。
別の態様では、薬物として使用するための抗CD22抗体又は免疫複合体が提供される。さらなる態様では、治療方法で使用するための抗CD22抗体又は免疫複合体が提供される。ある特定の実施形態では、CD22陽性の癌を治療することにおいて使用するための抗CD22抗体又は免疫複合体が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、CD22陽性の癌を有する個体を治療する方法にて使用するための抗CD22抗体又は免疫複合体を提供し、該方法は、有効量の抗CD22抗体又は免疫複合体を個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、方法はさらに、たとえば、有効量の以下で記載されるような少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、薬物の製造又は調製における抗CD22抗体又は免疫複合体の使用を提供する。一実施形態では、薬物はCD22陽性の癌を治療するためのものである。さらなる実施形態では、薬物はCD22陽性の癌を治療する方法で使用するためのものであり、該方法は有効量の薬物をCD22陽性の癌を有する個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、方法はさらに、たとえば、有効量の以下で記載されるような少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、CD22陽性の癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、方法はそのようなCD22陽性の癌を有する個体に、有効量の抗CD22抗体又は免疫複合体を投与することを含む。そのような一実施形態では、方法はさらに、たとえば、有効量の以下で記載されるような少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを含む。
上記実施形態のいずれかに係るCD22陽性の癌は、たとえば、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫であり得る。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、腫瘍細胞の>90%にて非常に弱い染色又は染色されないものに相当する「0」を上回る抗CD22免疫組織化学(IHC)スコア又はその場でのハイブリッド形成(ISH)スコアを受け取る癌である。別の実施形態では、CD22陽性の癌は、1+、2+、又は3+のレベルでCD22を発現し、その際、1+は腫瘍細胞の>50%で弱い染色に相当し、2+は腫瘍細胞の>50%で中程度の染色に相当し、3+は腫瘍細胞の>50%で強い染色に相当する。一部の実施形態では、CD22陽性の癌は、CD22のmRNAを検出する逆転写酵素PCR(RT−PCR)に従ってCD22を発現する癌である。一部の実施形態では、RT−PCRは定量的RT−PCRである。
一部の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン細胞傷害性部分を含む免疫複合体は、たとえば、実施例B及びDにて示される異種移植モデルによって証拠づけられるように、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を治療するのに有用である。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を治療するのに使用するための免疫複合体は、一部の実施形態では、構造:
Figure 2015527318
を有するPBD二量体を含み、式中、nは0又は1である。一部の実施形態では、PBD二量体は、たとえば、図4Aに示す免疫複合体のようなプロテアーゼ切断可能リンカーを介して抗体に共有結合する。一部の実施形態では、PBD二量体は、たとえば、図4B及び4Cに示す免疫複合体のようなジスルフィドリンカーを介して抗体に共有結合する。一部の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン細胞傷害性部分を含む免疫複合体はマントル細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を治療するのに有用である。
上記実施形態のいずれかに係る「個体」はヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、たとえば、上記治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供される抗CD22抗体又は免疫複合体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書で提供される抗CD22抗体又は免疫複合体のいずれか及び薬学上許容可能なキャリアを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、、本明細書で提供される抗CD22抗体又は免疫複合体のいずれか及びたとえば、以下で記載されるような少なくとも1つの追加の治療剤を含む。
本発明の抗体又は免疫複合体は、治療にて単独で使用することができ、又は他の剤との併用で使用することができる。たとえば、本発明の抗体又は免疫複合体は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時に投与され得る。
一部の実施形態では、抗CD79b抗体又は免疫複合体との併用で抗CD22免疫複合体が投与される。非限定の例となる抗CD79b抗体又は免疫複合体は、huMA79bv28の超可変領域を含むので、抗CD79b抗体又は免疫複合体は、(i)配列番号32の配列を有するHVR H1、(ii)配列番号33の配列を有するHVR H2、(iii)配列番号34の配列を有するHVR H3、(iv)配列番号35の配列を有するHVR L1、(v)配列番号36の配列を有するHVR L2、及び(vi)配列番号37の配列を有するHVR L3を含む。一部の実施形態では、抗CD79b抗体又は免疫複合体は、huMA79bv28の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。そのような一部の実施形態では、抗CD79b抗体又は免疫複合体は、配列番号38の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号39の配列を有する軽鎖可変領域を含む。抗CD79b免疫複合体は、一部の実施形態では、オーリスタチン、ネモルビシン誘導体及びピロロベンゾジアゼピンから選択される細胞傷害剤を含む。一部の実施形態では、抗CD79b免疫複合体は、MMAE、PNU−159682及び構造:
Figure 2015527318
を有するPBD二量体から選択される細胞傷害剤を含み、式中、nは0又は1である。一部の実施形態では、抗CD79b免疫複合体は、たとえば、米国特許第8、088、378B2号に記載されたチオhuMA79bv28HCA118C−MC−val−cit−PAB−MMAE免疫複合体;チオhuMA79bv28HCS400C−MC−val−cit−PAB−MMAE免疫複合体、チオhuMA79bv28LCV205C−MC−val−cit−PAB−MMAE免疫複合体、チオhuMA79bv28HCA118C−MC−val−cit−PAB−PNU−159682、チオhuMA79bv28HCA118C−MC−アセタール−PNU−159682、チオhuMA79bv28HCA118C−MC−val−cit−PAB−PBD、チオhuMA79bv28HCS400C−MC−val−cit−PAB−PNU−159682、チオhuMA79bv28HCS400C−MC−アセタール−PNU−159682、チオhuMA79bv28HCS400C−MC−val−cit−PAB−PBD、チオhuMA79bv28LCV205C−MC−val−cit−PAB−PNU−159682、チオhuMA79bv28LCV205C−MC−アセタール−PNU−159682、及びチオhuMA79bv28LCV205C−MC−val−cit−PAB−PBDから選択される。チオhuMA79bv28HCA118Cの重鎖及び軽鎖をそれぞれ配列番号40及び41に示す。チオhuMA79bv28HCS400Cの重鎖及び軽鎖をそれぞれ配列番号43及び41に示す。チオhuMA79bv28LCV205Cの重鎖及び軽鎖をそれぞれ配列番号42及び44に示す。特異的な抗体の配列は別として、抗CD79b免疫複合体の構造は、本明細書及びUS2008/0050310にて記載された抗CD22免疫複合体の構造に類似する。PNU−159682を含む非限定の例となる免疫複合体は構造:Ab−MC−アセタール−PNU−159682
Figure 2015527318
有する。
一部の実施形態では、抗CD22免疫複合体は、抗CD20抗体(ネイキッド抗体又はADCのいずれか)との併用で投与される。一部の実施形態では、抗CD20抗体はリツキシマブ(リツキサン(登録商標)、又は2H7(Genentech社、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ)である。一部の実施形態では、抗CD22免疫複合体は抗VEGF抗体(たとえば、ベビシズマブ、商品名アバスチン(登録商標))との併用で投与される。
放射線療法及び/又は骨髄や末梢血の移植及び/又は細胞傷害剤を含むが、限定はされない他の治療計画が抗CD22免疫複合体の投与と併用され得る。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、たとえば、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン(オンコビン(商標)、プレドニゾロン、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用)、CVP(シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用)、又は、たとえば、抗CD20(たとえば、リツキシマブ、商品名リツキサン(登録商標))、抗VEGF(たとえば、ベビシズマブ、商品名アバスチン(登録商標))、タキサン(たとえば、パクリタキセル及びドセタキセル)及びアントラサイクリン抗生剤のような剤又は剤の併用である。
上記で言及されたそのような併用療法は、併用投与(2以上の治療剤を同一又は別々の製剤に含める)、及び別々の投与を包含し、別々の投与では、本発明の抗体又は免疫複合体の投与が、追加の治療剤及び/又は補助剤の投与に先立って、同時に及び/又はそれに続いて発生する。本発明の抗体又は免疫複合体を放射線療法との併用で使用することができる。
非経口投与、肺内投与、鼻内投与、及び所望であれば、局所治療のための病変内投与を含む任意の好適な手段によって本発明の抗体又は免疫複合体(及び任意の追加の治療剤)を投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下の投与が挙げられる。投与が手短なのか又は慢性的なのかにある程度応じて、好適な経路によって、たとえば、静脈内注射又は皮下注射のような注射によって投与することができる。単回投与又は種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与及びパルス点滴を含むが、これらに限定されない種々の投与計画が本明細書で企図される。
本発明の抗体又は免疫複合体は、適正な医療行為に一致する方法で製剤化され、投薬され、投与される。これに関連して検討するための因子には、治療される特定の疾病、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾病の原因、剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に知られた他の因子が挙げられる。抗体又は免疫複合体は、当該疾病を予防する又は治療するのに現在使用されている1以上の剤と共に製剤化される必要はないが、任意で製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤に存在する抗体又は免疫複合体の量、疾病又は治療の種類、及び上記で考察された他の因子に左右される。これらは一般に、本明細書で記載されるのと同一の投与量及び投与経路にて、又は本明細書で記載される投与量のほぼ1〜99%で、又は適宜経験的に/臨床的に決定される任意の投与量にて及び任意の投与経路によって使用される。
疾患の予防又は治療については、本発明の抗体又は免疫複合体の適当な投与量(単一で使用される又は1以上の他の追加の治療剤との併用で使用される場合)は、治療される疾患の種類、抗体又は免疫複合体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体又は免疫複合体が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるのか、以前の治療法、患者の既往歴及び抗体又は免疫複合体への応答、及び主治医の裁量に左右されるであろう。抗体又は免疫複合体は一度に又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(たとえば、0.1mg/kg〜10mg/kg)の抗体又は免疫複合体が、たとえば、1回以上の別々の投与であれ、連続点滴であれ、患者に対する投与量の当初の候補であり得る。典型的な1日投与量の1つは、上述の因子に応じて約1μg/kg〜100mg/kg以上の範囲であり得る。数日以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、治療は一般に疾患の症状の所望の抑制が生じるまで持続される。抗体又は免疫複合体の例となる投与量の1つは、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲である。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kg(又はそれらの組み合わせ)の1以上の用量を患者に投与し得る。そのような用量を間欠的に、たとえば、週に1回、又は3週に1回(たとえば、患者が約2〜約20回、又はたとえば、約6回、抗体を服用するように)投与し得る。最初の高い負荷用量、続いて1以上の低い用量を投与し得る。しかしながら、他の投与計画が有用であり得る、この治療法の進行は従来の技法及びアッセイによって容易にモニターされる。
一部の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)二量体を含む低用量の10F4v3ADCを用いてMMAE部分を含む高用量の10F4v3ADCの同じ有効性を達成し得る。
上記製剤化又は治療方法のいずれかは、本発明の免疫複合体及び抗CD22抗体の双方を用いて実施され得ることが理解される。
H.製造物品
本発明の別の態様では、上述された疾病の治療、予防及び/又は診断に有用な方法を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器及び容器についての又は容器に関連するラベル又は添付文書を含む。好適な容器には、たとえば、ビン、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、たとえば、ガラス又はプラスチックのような種々の素材から形成され得る。容器は、それ自体である組成物又は疾病を治療する、予防する及び/又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられる組成物を保持するが、滅菌のアクセスポートを有してもよい(たとえば、容器は皮下注射針によって穴開け可能なストッパーを有する静脈溶液バッグ又はバイアルであってもよい)。組成物における少なくとも1つの活性剤は本発明の抗体又は免疫複合体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択した状態を治療するのに使用されることを指示する。さらに、製造物品は、(a)組成物が本発明の抗体又は免疫複合体を含む、その中に含有される組成物を伴った第1の容器と、(b)組成物がさらに細胞傷害剤又はさもなければ治療剤を含むその中に含有される組成物を伴った第2の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製造物品はさらに特定の状態を治療するのに組成物を使用することができることを指示する添付文書を含み得る。代わりに又はさらに、製造物品はさらに、たとえば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液のような薬学上許容可能な緩衝液を含む第2(又は第3)の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含む、商業的な立場及びユーザーの立場から望ましい他の物資を含み得る。
III.実施例
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供された一般な記載を前提として種々の他の実施形態が実践され得ることが理解される。
A.抗CD22抗体薬剤複合体の作製
ヒト化変異体hu10F4v1及びhu10F4v3を含む抗CD22抗体10F4及びある特定の変異体は、たとえば、US2008/0050310に記載されている。抗体10F4、hu10F4v1及びhu10F4v3はそれぞれ配列番号9、10及び11の重鎖HVR(それぞれ、HVR H1、HVR H2及びHVR H3)を含む。抗体10F4及び10F4v1はそれぞれ配列番号12、13及び14の軽鎖HVR(それぞれHVR L1、HVR L2及びHVR L3)を含む。hu10F4v3は配列番号15、13及び14の軽鎖HVR(それぞれHVR L1、HVR L2及びHVR L3)を含み、その際、hu10F4v3のHVR L1は10F4及び10F4v1のHVR L1に比べて単一のアミノ酸変化(N28V)を含む。ヒトCD22に対する3つの抗体の結合親和性は似ている(1.4nM〜2.3nMの範囲)ことが分かった。ある特定のさらなるアミノ酸置換はhu10F4v1のHVR L1で行ったが、それを配列番号16〜22に示す。それらHVR L1配列のそれぞれを含む抗体は、hu10F4v1の結合親和性から2倍未満で変化するヒトCD22への結合親和性を有した。たとえば、US2008/0050310を参照のこと。
大規模な抗体製造については、抗体はCHO細胞にて産生された。VL及びVHをコードするベクターをCHO細胞に形質移入し、プロテインAアフィニティクロマトグラフィによって細胞の培養培地からIgGを精製した。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C抗体をある特定の薬剤部分に結合することによって抗CD22抗体/薬剤の複合体(ADC)を産生した。チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118Cは、結合可能なチオ基を付加する重鎖にてA118C変異を伴ったヒト化抗CD22 10F4v3抗体である。たとえば、US2008/0050310を参照のこと。チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118Cの重鎖のアミノ酸配列を配列番号26に示し(図3を参照)、チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118Cの軽鎖のアミノ酸配列を配列番号23に示す(図2を参照)。免疫複合体は以下のように調製した。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C−MC−val−cit−PAB−PBD(「10F4v3−PBD」)
結合に先立って、ジチオスレイトール(DTT)によって抗体を還元してチオ抗体の操作されたシステインからブロッキング基(たとえば、システイン)を取り除いた。この工程は抗体の鎖間ジスルフィド結合も還元する。還元した抗体を精製して放出されたブロッキング基を取り除き、デヒドロ−アスコルビン酸(dhAA)を用いて鎖間ジスルフィドを再酸化した。次いでインタクトな抗体を薬剤/リンカー部分MC−val−cit−PAB−PBD(「val−cit」は本明細書では「vc」とも呼ぶ)と化学結合させて、抗体の操作したシステイン残基への薬剤/リンカー部分の結合を可能にした。過剰なN−アセチルシステインを加えて遊離の薬剤/リンカー部分と反応させることによって結合反応を止め、ADCを精製した。ADCについての薬剤負荷(抗体当たりの薬剤部分の平均数)は以下の実施例で示すように約1.7〜約1.9の範囲だった。10F4v3−PBDは図4A(p=薬剤負荷)に示す構造を有する。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C−MC−val−cit−PAB−MMAE(「10F4v3−MMAE」)
結合に先立って、ジチオスレイトール(DTT)によって抗体を還元してチオ抗体の操作されたシステインからブロッキング基(たとえば、システイン)を取り除いた。この工程は抗体の鎖間ジスルフィド結合も還元する。還元した抗体を精製して放出されたブロッキング基を取り除き、デヒドロ−アスコルビン酸(dhAA)を用いて鎖間ジスルフィドを再酸化した。次いでインタクトな抗体を薬剤/リンカー部分MC−val−cit−PAB−MMAE(「val−cit」は本明細書では「vc」とも呼ぶ)と化学結合させて、抗体の操作したシステイン残基への薬剤/リンカー部分の結合を可能にした。過剰なN−アセチルシステインを加えて遊離の薬剤/リンカー部分と反応させることによって結合反応を止め、ADCを精製した。ADCについての薬剤負荷(抗体当たりの薬剤部分の平均数)は以下の実施例で示すように約2であると決定した。チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C−MC−val−cit−PAB−MMAEは、たとえば、US2008/0050310に記載されている。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C−ジスルフィド−PBD(「10F4v3−SS−PBD」)及び
チオHu抗−CD22 10F4v3HC A118C−ジスルフィドメチル−PBD(「10F4v3−SSMe−PBD」)
結合に先立って、ジチオスレイトール(DTT)によって抗体を還元してチオ抗体の操作されたシステインからブロッキング基(たとえば、システイン)を取り除いた。この工程は抗体の鎖間ジスルフィド結合も還元する。還元した抗体を精製して放出されたブロッキング基を取り除き、デヒドロ−アスコルビン酸(dhAA)を用いて鎖間ジスルフィドを再酸化した。
次いで50mMのトリス、pH8にてインタクトな抗体を6〜8倍モル過剰の薬剤/リンカー部分(それぞれ実施例H又はIの14又は22)と16〜24時間化学結合させた。次いでカチオン交換カラムによってADCを精製した。ADCについての薬剤負荷(抗体当たりの薬剤部分の平均数)は以下の実施例で示すように約1.7〜約1.9の範囲だった。10F4v3−SS−PBDは図4B(p=薬剤負荷)に示す構造を有する。10F4v3−SSMe−PBDは図4C(p=薬剤負荷)に示す構造を有する。
B.WSU−DLCL2異種移植モデルにおけるヒト化抗CD22抗体薬剤の複合体の生体内抗腫瘍活性
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118CのPBDとの複合体の有効性を調べるために、WSU−DLCL2腫瘍(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにおける複合体化された抗体の効果を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(12−13週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれの脇腹に2×10個のWSU−DLCL2細胞(DSMZ,German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,ドイツ、ブラウンシュヴァイク)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初で唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiro Jら、nlme: linear and nonlinear mixed effects models. 2009; R package, version 3.1-96を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C免疫複合体又は対照の抗体/薬剤複合体(対照ADC)の0.5又は2又は8mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって9匹のマウスの群を処理した。対照ADCはWSU−DLCL2細胞の表面には発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表2及び図5に示す。表2は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(TI)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表2.WSU−DLCL2異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表2に示したような薬剤複合体と用量を伴った35日間の経時変化において、プロテアーゼで切断可能なリンカーを介してPBDに結合された10F4v3ADC(「10F4v3−PBD」)は、溶媒及び対照ADC(「対照PBD)に比べてWSU−DLCL2腫瘍を持つSCIDマウスにて腫瘍増殖の阻害を示した。図5を参照のこと。
さらに、2mg/kgの10F4v3−PBDは、オーリスタチン薬剤MMAEと結合したヒト化抗CD22チオMab(「10F4v3−MMAE」)の8mg/kgと匹敵する抗腫瘍活性を示した。図5を参照のこと。表2に示すように、2mg/kgの10F4v3−PBDを与えられたマウスは9匹が著効を有したが、8mg/kgの10F4v3−MMAEを与えられたマウスは6匹が有効で3匹が著効だった。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3のADCは試験の間、体重に有意な低下を生じないことを示した。
C.Granta−519異種移植モデルにおけるヒト化抗CD22抗体薬剤の複合体の生体内抗腫瘍活性
PBDとのチオHu抗−CD22 10F4v3HCA118Cの複合体(「10F4v3−PBD」)の有効性を調べるために、Granta−519腫瘍(ヒトのマントル細胞リンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにおける複合体化された抗体の効果を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(10〜11週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれの脇腹に、2×10個のGranta−519細胞(DSMZ,German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,ドイツ、ブラウンシュヴァイク)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初の唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiro Jら、2009を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
10F4v3免疫複合体又は対照の抗体/薬剤の複合体(対照ADC)の1mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって9匹のマウスの群を処理した。対照ADCはGrant−519細胞の表面に発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表3及び図6に示す。表3は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(TI)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表3.Grant−519異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表3に示すように、1mgADC/kg用量の薬剤複合体による29日間の経時変化において、プロテアーゼ切断が可能なリンカーを介してPBDに結合されたチオHu抗CD22ADC(「10F4v3−PBD」)は溶媒に比べてGranta−519腫瘍を持つSCIDマウスにおける腫瘍増殖を阻害した。しかしながら、PBDに結合した対照ADC(「対照−PBD」)も抗腫瘍活性を示したということは、この腫瘍モデルがPBDに対して感受性が非常に高いことを示している。最終的に、オーリスタチン薬MMAEに結合したヒト化抗CD22チオMab(「10F4v3−MMAE」)よりも1mg/kgの10F4v3−PBDの方が腫瘍増殖を良好に阻害した。
10F4v3−PBDを与えられたマウスはすべて腫瘍の退行を示したが、10F4v3−MMAEで処理したマウスの大部分はそうではなかった。単回用量の10F4v3−PBDでは、有効が1匹及び著効が8匹だった。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3−PBDの投与が試験の間、有意な体重低下を生じないことを示した。
D.SuDHL4−luc異種移植モデルにおけるヒト化抗CD22抗体薬剤の複合体の生体内抗腫瘍活性
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118CのPBDとの複合体の有効性を調べるために、SuDHL4−luc腫瘍(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにおける複合体化された抗体の効果を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(11−12週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれに脇腹にて2×10個のSuDHL4−luc細胞(DSMZ,German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, ドイツ、ブラウンシュヴァイク、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するようにGenentechにて操作された)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初で唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiroら、2008を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
10F4v3免疫複合体又は対照の抗体/薬剤複合体(対照ADC)の2又は8mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって8匹のマウスの群を処理した。対照ADCはSuDHL4−luc細胞の表面には発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表4及び図7に示す。表4は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(「TI」)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表4.SuDHL4−luc異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表4にて示すような薬剤複合体及び用量による35日間の経時変化において、プロテアーゼ切断が可能なリンカーを介してPBDに結合されたチオHu抗CD22ADC(「10F4v3−PBD」)は溶媒及びADC対照(「対照−PBD」)に比べてSuDHL4−luc腫瘍を持つSCIDマウスにおける腫瘍増殖の阻害を示した。図7を参照のこと。
さらに、2mg/kgの10F4v3−PBDは、オーリスタチン薬剤MMAEと結合したヒト化抗CD22チオMab(「10F4v3−MMAE」)の8mg/kgと匹敵する抗腫瘍活性を示し;双方とも処理した動物すべてで著効を示した。図7及び表4を参照のこと。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3ADCの投与が試験の間、有意な体重低下を生じないことを示した。
E.SuDHL4−luc異種移植モデルにおける10F4v3−PBDの用量漸増試験
SuDHL4−luc腫瘍(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにて種々の用量レベルにおける10F4v3−PBDの有効性を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(9−10週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれに脇腹にて2×10個のSuDHL4−luc細胞(DSMZ,German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, ドイツ、ブラウンシュヴァイク、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するようにGenentechにて操作された)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初で唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiroら、2008を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
10F4v3免疫複合体又は対照のPBDの0.2、0.5、1又は2mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって8匹のマウスの群を処理した。対照PBDはSuDHL4−luc細胞の表面には発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表5及び図8に示す。表5は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(「TI」)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表5.SuDHL4−luc異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表5に示すような薬剤複合体及び用量による31日間の経時変化にて、10F4v3−PBDはSuDHL4−luc腫瘍を持つSCIDマウスにおいて腫瘍増殖の用量依存性の阻害を示した。0.5mg/kg以上の用量で投与した場合、10F4v3−PBDは溶媒又は対照ADCに比べて明瞭な阻害活性を示した。図8を参照のこと。加えて、2mgの10F4v3−PBDの単回投与は処理した動物すべてにおいて腫瘍の完全寛解を生じた。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3−PBDの投与が試験の間、有意な体重低下を生じないことを示した。
F.Bjab−luc異種移植モデルにおける10F4v3−PBDの用量漸増試験
Bjab−luc腫瘍(バーキットリンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにて種々の用量レベルにおける10F4v3−PBDの有効性を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(11−12週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれに脇腹に2×10個のBjab−luc細胞(たとえば、Lonza, Basel, Switzerlandから入手可能、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するようにGenentechにて操作された)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初で唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiroら、2008を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
10F4v3−PBD又は対照のPBDの0.05、0.2、0.5又は1mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって9匹のマウスの群を処理した。対照PBDはBjab−luc細胞の表面には発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表6及び図9に示す。表6は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(「TI」)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表6.Bjab−luc異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表6に示すような薬剤複合体及び用量による35日間の経時変化にて、10F4v3−PBDはBjab−luc腫瘍を持つSCIDマウスにおいて腫瘍増殖の用量依存性の阻害を示した。0.2mg/kg以上の用量で投与した場合、10F4v3−PBDは、溶媒又は対照ADCと比べて明瞭な阻害活性を示した。図9を参照。加えて、0.5又は1mgの10F4v3−PBDの単回投与は、処理した動物すべてにおいて腫瘍の完全寛解を生じた。対照のPBDが1mg/kgで実質的な抗腫瘍活性を示したということは、このモデルはPBDに対して感受性が非常に高いことを示している。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3−PBDの投与が試験の間、有意な体重低下を生じないことを示した。
G.WSU−DLCL2異種移植モデルにおけるヒト化抗CD22薬剤複合体の生体内抗腫瘍活性
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118CのPBDとの複合体の有効性を調べるために、WSU−DLCL2腫瘍(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)のマウス異種移植モデルにおける複合体化された抗体の効果を調べた。
メスCB17 ICR SCIDマウス(9−10週齢、Charles Rivers Laboratories由来;カリフォルニア州、ホリスター)それぞれの脇腹に2×10個のWSU−DLCL2細胞(DSMZ,German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, ドイツ、ブラウンシュヴァイク)を皮下接種した。異種移植した腫瘍が150〜300mmの平均腫瘍体積に達したら(0日目と呼ぶ)、最初で唯一の治療用量を投与した。腫瘍体積はノギスを用いて測定した2つの直径に基づいて算出し、式:V=0.5a×bに従ってmmで表したが、その際、a及びbはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。同一動物からの長時間にわたる腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリング法を用いた(たとえば、Pinheiro Jら、nlme: linear and nonlinear mixed effects models. 2009; R package, version 3.1-96を参照)。この方法は、反復測定と、非治療に関連する試験終了前の動物の除去による控えめな中断率の双方を取り扱うことができる。三次回帰スプラインを用いて、各用量レベルにてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを当てはめた。次いでこれらの非線形プロファイルを混合したモデルの範囲内での用量に関連づけた。
チオHu抗−CD22 10F4v3HCA118C免疫複合体又は対照の抗体/薬剤複合体(対照ADC)の0.5又は2又は10mgADC/kgの単回静脈内(i.v.)投与によって9匹のマウスの群を処理した。対照ADCはWSU−DLCL2細胞の表面には発現されないタンパク質に結合する。実験の全体を通して、週に1〜2回、マウスの腫瘍及び体重を測定した。腫瘍体積が3000mmに達する前に又は腫瘍が差し迫った潰瘍形成の兆候を示した場合、マウスを安楽死させた。動物の試験計画書はすべて研究機関の動物実験委員会(IACUC)によって認可された。
その実験の結果を表7及び図10に示す。表2は、各処理群、試験終了時に観察可能な腫瘍を伴ったマウスの数(TI)、有効を示すマウスの数(「PR」、投与後いつでも腫瘍体積が0日目で測定された腫瘍体積の50%を下回った)、著効を示すマウスの数(「CR」、投与後いつでも腫瘍体積が0mmに低下した)、各群の薬剤用量、各群の抗体用量、及び投与された各ADCの薬剤負荷を示す。
表7.WSU−DLCL2異種移植を伴ったマウスへの抗CD22ADCの投与
Figure 2015527318
表7に示すような薬剤複合体及び用量による28日間の経時変化にて、10F4v3−PBD及び10F4v3−SSMe−PBDは0.5mg/kgにて、溶媒又は対照ADCに比べてWSU−DLCL2腫瘍を持つSCIDマウスにおいて腫瘍増殖の阻害を示した。図7を参照のこと。
さらに、2mg/kgの10F4v3−SSMe−PBDは腫瘍増殖のほぼ完全な抑制を示した。図7を参照のこと。表2に示すように、2μg/kgの10F4v3−SSMe−PBDを与えられた2匹のマウス及び0.5μg/kgの10F4v3−SSMe−PBDを与えられた1匹のマウスが治療に対して部分寛解を示した。
この試験では、各投与群にて体重変化のパーセントを測定した。結果は、10F4v3−PBDの投与が試験の間、有意な体重低下を生じないことを示した。
H.ジスルフィドPBD試薬の合成
(a)塩化(S)−2−(メトキシカルボニル)−4−メチレンピロリジニウム(3)
Figure 2015527318
(i)(S)−1−tert−ブチル 2−メチル 4−メチレンピロリジン−1,2−カルボキシレート(2)
カルボン酸(1)(10.92g,48ミリモル,1当量)の撹拌されたDMF(270mL)溶液に炭酸カリウム(19.92g,14ミリモル,3当量)を加えた。得られた白色の懸濁液を室温で30分間撹拌し、その時点でヨードメタン(21.48g,9.5mL,151ミリモル,3.15当量)を加えた。反応混合物を室温で3日間撹拌した。減圧下での回転蒸発によってDMFを取り除いて黄色の残留物を得、それを酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を分離し、水性相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。減圧下での回転蒸発によって酢酸エチルを取り除いて黄色の油として粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィ(85%n−ヘキサン/15%酢酸エチル)によって粗生成物を精製して無色の油として生成物を得た(既知の化合物F、Manfreら、J. Org. Chem. 1992, 57, 2060−2065)。
(ii)塩化(S)−2−(メトキシカルボニル)−4−メチレンピロリジニウム(3)
4Mの塩酸のジオキサン(63mL,254.4ミリモル,4.5当量)溶液をBoc保護したC環断片(2)(13.67g,56.6ミリモル,1当量)に室温で加えた。COの遊離及びBoc基の取り外しを示す発泡が認められた。白色の固形物として生成物が沈殿し、追加のジオキサンを加えて撹拌を円滑にした。反応混合物を1時間撹拌し、次いでエーテルで希釈した。沈殿した生成物を真空濾過で回収し、追加のエーテルで洗浄した。風乾によって白色の粉末として所望の生成物を得た(9.42g,94%)(P Herdwijnら、Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903−7)。
(b) tert−ブチル (5−((5−(5−アミノ−4−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンプロピリジン−1−カルボニル)−2−メトキシフェノキシ)ペンチル)オキシ)−2−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−ジメチルピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシフェニル)カルバメート(9)
Figure 2015527318
(i)(S)−(4,4’−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(5−メトキシ−2−ニトロ−4,1−フェニレン))ビス(((S)−2−(メトキシカルバモイル)−4−メチレンピロリジン−1−イル)メタノン)(5)
触媒量の無水DMF(0.5mL)を塩化オキサリル(9.1g,6.25mL,71.7ミリモル,3当量)と二量体コア(4)(11.82g,23.9ミリモル,1当量)の撹拌した無水DCM(180mL)懸濁液に室温で加えた。DMFの添加の後、激しい発泡が認められ、塩化カルシウムの乾燥管を装着した丸底フラスコにて反応混合物を18時間撹拌した。得られた透明な溶液を減圧下で蒸発させ、固形物をエーテルで粉砕した。固形生成物を真空濾過によって回収し、追加のエーテルで洗浄し、40℃にて真空で1.5時間乾燥させた。次いでドライアイス/アセトニトリル槽の助けを借りて温度を−40〜−50℃の間で維持して、TEA(12.08g,119.6ミリモル,5当量)と無水DCM(110mL)におけるC環(3)(9.35g,52.6ミリモル,2.2当量)の懸濁液にこの固形物を少しずつ加えた。反応混合物を−40℃で1時間撹拌し、次いで室温に温め、この時点でLCMSは出発材料の完全な消費を示した。反応混合物を追加のDCMで希釈し、塩酸水溶液(1M,2×200mL)、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(2×250mL)、水(250mL)、ブライン(250mL)で順次洗浄し、乾燥させた(MgSO)。減圧下で回転蒸発によってDCMを取り除き、黄色の泡状物として生成物を得た(13.94g、79%)。分析データ:RT 3.95分;MS(ES)m/z(相対強度)741([M+1],100)。
(ii)(S)−(4,4’−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(5−メトキシ−2−ニトロ−4,1−フェニレン))ビス(((S)−2−(ヒドロキシメチル)−4−メチレンピロリジン−1−イル)メタノン)(6)
0℃(氷槽)にて窒素雰囲気下で無水THF(10mL)中のエーテル(5)(1.05g,142ミリモル,1当量)溶液に固形の水素化ホウ素リチウム(0.093g,4.3ミリモル,3当量)を一気に加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで室温に温め、その時点で橙色のゴムの沈殿が認められた。反応混合物を室温でさらに2時間撹拌し、次いで氷槽で冷却し、水(20mL)で処理して黄色の懸濁液を得た。塩酸を慎重に(激しい発泡)発泡が止まるまで加えた。反応混合物を酢酸エチルで抽出し(4×50mL)、合わせた有機層を水(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させた(MgSO)。減圧下での回転蒸発によって酢酸エチルを取り除いて黄色の泡状物として生成物を得た(0.96g、99%)。12.4g規模で反応を繰り返して11.06gの生成物を得た。分析データ:RT 3.37分;MS(ES)m/z(相対強度)685([M+H]+.,100)。
(iii)(S)−((ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(5−メトキシ−2−ニトロ−4,1−フェニレン))ビス(((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−イル)メタノン)(7)
アルゴン雰囲気下でのビス−ニトロアルコール(6)(7.94g,11.6ミリモル,1当量)と塩化tert−ブチルジメチルシリル(4.54g,30.15ミリモル,2.6当量)とイミダゾール(4.1g,60.3ミリモル,5.2当量)の無水DMF(100mL)溶液を室温で3時間撹拌した。反応混合物を水(250mL)で希釈し、DCMで抽出した(4×100mL)。合わせた抽出物を水(200mL)、飽和ブライン(200mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ(50%酢酸エチル/50%n−ヘキサンを10%増分にて100%酢酸エチル)によって精製し、黄色の泡状物として生成物を得た(10.0g、94%)。分析データ:RT 4.57分;MS(ES)m/z(相対強度)913([M+H]+.,100)。
(iv)(S)−((ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(2−アミノ−5−メトキシ−4,1−フェニレン))ビス(((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−イル)メタノン)(8)
酢酸エチル/エタノール(80mL/150mL)中の亜鉛粉(29.56g,0.45mol,40当量)と化合物(7)(10.34g,11.32ミリモル,1当量)の混合物に蟻酸溶液(5%v/v,15mL)を一気に加えた。12℃の発熱が認められた。15分後、酢酸エチル(過剰)で洗浄するセライトを介して反応混合物を濾過した。濾液を飽和重炭酸ナトリウム(3×150mL)、水(200mL)、飽和ブライン(200mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィ(酢酸エチル)による精製によって白色の泡状物として生成物を得た(8.09g、84%)。分析データ:RT 4.43分;MS(ES)m/z(相対強度)853([M+H]+.,100)。
(v)tert−ブチル(5−((5−(5−アミノ−4−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−2−メトキシフェノキシ)ペンチル)オキシ)−2−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシフェニル)カルバメート(9)
ビス−アニリン(8)(6.02g,7.1ミリモル,1当量)とジ−t−ブチル−ジカルボネート(1.54g,7.1ミリモル,1当量)の無水THF(50mL)溶液を16時間還流にて加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ(40%酢酸エチル/60%n−ヘキサンから60%酢酸エチル/40%n−ヘキサンから100%酢酸エチル)によって精製して白色泡状物として生成物を得た(3.22g、48%)。分析データ:RT 4.27分;MS(ES)m/z(相対強度)953([M+H]+.,100),MS(ES)m/z(相対強度)951([M−H]),100)。
(c)(11S,11aS)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチルl 11−ヒドロキシ−7−メトキシ−8−((5−(((S)−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(14)
Figure 2015527318
Jonesら、J.Am.Chem.Soc.,2006,128,6526−6527に従って化合物10を調製した。
(i)tert−ブチル(2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル) ((S)−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(2−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシ−5,1−フェニレン))ジカルバメート(11)
モノ−Boc保護ビス−アニリン(9)(1.05g,1.1ミリモル,1.0当量)とトリホスゲン(0.117g,0.4ミリモル,0.36当量)の撹拌された無水THF(10mL)溶液に室温にてアルゴン雰囲気下でトリエチルアミン(0.25g,0.34mL,2.42ミリモル,2.2当量)を加えた。反応混合物を40℃に加熱し、5分後、試料をメタノールで処理し、メチルカルバメートとしてLCMSによって分析した。分析データ:RT 4.37分;MS(ES)m/z(相対強度)1011([M+H]+.,100)。
2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エタノール(10)(0.31g,1.65ミリモル,1.5当量)とトリエチルアミン(0.17g,0.23mL,1.65ミリモル,1.5当量)の無水THF(10mL)溶液を新しく調製したイソシアネートに一滴ずつ加えた。反応混合物を40℃で1.5時間加熱し、その後、トリホスゲンのさらなる部分(0.058g,0.2ミリモル,0.18当量)を加えた。さらに30分後、反応混合物を冷却し、濾過してトリエチルアミン塩酸塩を除き、濾液を乾燥するまで蒸発させて黄色の油として粗生成物を得、それをフラッシュカラムクロマトグラフィ(60%n−ヘキサン/40%酢酸エチルから55%n−ヘキサン/45%酢酸エチルに代わる)によって精製して無色の油として所望の生成物を得た(0.63g、49%)。分析データ:RT 4.50分;MS(ES)m/z(相対強度)1166([M+H],100),MS(ES)m/z(相対強度)1164([M−H]),70)。
(ii)tert−ブチル (2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル) ((S)−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(2−((S)−2−(ヒドロキシメチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシ−5,1−フェニレン))ジカルバメート(12)
AcOH/HO(3/1/)(8mL)を化合物(11)(0.37g,0.32ミリモル,1当量)のTHF(2mL)溶液に加え、得られた溶液を室温で18時間撹拌した。飽和NaHCO溶液によって反応混合物のpHをpH8に合わせた。混合物を酢酸エチル(3×100mL)で抽出し、合わせた抽出物を飽和NaHCO溶液(100mL)、水(100mL)、飽和ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィ(1%増分におけるクロロホルム/メタノールの0%から5%の勾配溶出)による残留物の精製によって白色の泡状物として生成物を得た(0.24g、81%)。分析データ:RT 3.08分;MS(ES)m/z(相対強度)938([M+H],100),MS(ES)m/z(相対強度)936([M−H]),100)。
(iii)(11S,11aS)−tert−ブチル 11−ヒドロキシ−8−((5−(((11S,11aS)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−10−((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エトキシ)カルボニル)−2,3,5,10,11,11a−ヘキサヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(13)
−78℃(ドライアイス/アセトン)の温度にてアルゴン雰囲気下で、DMSO(79mg,72μL,1.0ミリモル,4.4当量)のDCM(5mL)溶液を塩化オキサリル(62mg,42μL,0.49ミリモル,2.15当量)のDCM(5mL)溶液に一滴ずつ加えた。溶液を−78℃で15分間撹拌した。化合物(12)(0.214g,0.23ミリモル,1.0当量)のDCM(6mL)溶液を一滴ずつ加え、混合物を−78℃で45分間撹拌した。トリエチルアミン(0.23g,0.32mL,2.28ミリモル,10当量)を加え、5分後、反応混合物を室温にした。飽和NHCl溶液(15mL)で反応混合物を処理し、有機部分を分離し、1Mのクエン酸溶液(3×50mL)、飽和NaHCO溶液(100mL)、水(100mL)、飽和ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させて、浅黄色の油を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製によって白色の泡状物として生成物を得た(68mg、32%)。分析データ:RT 2.90分;MS(ES)m/z(相対強度)933([M+H]+.,50),MS(ES)m/z(相対強度y)935([M−H]),55)。
(iv)(11S,11aS)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル 11−ヒドロキシ−7−メトキシ−8−((5−(((S)−7−メトキシ−2−メチレン−5−oxo−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(14)
95%のトリフルオロ酢酸の冷却溶液(氷槽)(1mL)を、氷槽で冷却しておいた化合物13に加えた。LCMSによって完全であることが示された時、溶液を0℃で15分間撹拌した。氷と飽和NaHCO溶液の混合物に反応混合物を一滴ずつ加え、トリフルオロ酢酸溶液を中和した。混合物をDCM(4×50mL)で抽出し、合わせた抽出物を飽和ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させて白色の泡状物を得た(26mg、96%)。分析データ:RT 2.72分;MS(ES)m/z(相対強度)816([M+H],70),MS(ES)m/z(相対強度)814([M−H]),40)。
I.ジスルフィドメチルPBD試薬の合成
(a)(R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(18)
Figure 2015527318
(i)(R)−メチル 2−(アセチルチオ)プロパノエート(16)
チオ酢酸(1.99g,1.86mL,26.1ミリモル,1.1当量)を炭酸セシウム(7.73g,23.72ミリモル,1.0当量)の無水DMF(40mL)懸濁液に加えた。30分後、(S)−メチル 2−クロロプロパノエート(15)を加え、混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル(150mL)と水(150mL)の間で分配し、水を分離し、ジエチルエーテルのさらなる部分(150mL)で洗浄した。合わせた有機部分を水(6×100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィ(10%酢酸エチル/90%n−ヘキサン)による精製によって無色の油として生成物を得た(3.01g、82%)。分析データ:RT 2.25分;MS(ES)m/z(相対強度)163([M+H]+.,10),185([M+Na],65);[α] =[+141]17.8°C (c,2.26CHCl
(ii)(R)−2−メルカプトプロパン−1−オール(17)
アルゴン雰囲気下で還流にて、チオアセテート(16)(0.57g3.54ミリモル,1.0当量)の無水THF(10mL)溶液を水素化リチウムアルミニウム(0.54g,14.15ミリモル,4.0当量)の無水THF(20mL)懸濁液に一滴ずつ加えた。1時間後、反応混合物を0℃に冷却し、30℃未満の温度を維持して発泡が止まるまで2MのHClを一滴ずつ加えた。反応混合物を室温にて1時間撹拌し、次いでTHF(40mL)で洗浄するセライトを介して濾過した。溶媒を蒸発させ、残留物をDCMに再溶解し、乾燥させた(MgSO)。減圧下でのDCMの蒸発に続いて、残留物のカラムクロマトグラフィ(60%n−ヘキサン/40%酢酸エチル)によって浅黄色の油として生成物を得た(0.193g、58%)。分析データ:[α] =[−22]17.2°C (c,0.972CHCl)。
(iii)(R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(18)
アルゴン雰囲気下にて0℃で、塩化スルフリル(DCM中で1M,2.0mL,2.0ミリモル,1.1当量)を2−メルカプトピリジン(0.2g,1.81ミリモル,1.0当量)の無水DCM(5mL)溶液に一滴ずつ加えた。得られた溶液を室温で2時間撹拌し、減圧下でDCMを蒸発させて黄色の固形物を得た。固形物を無水DCM(10mL)に懸濁し、(R)−2−メルカプトプロパン−1−オール(17)(0.18g,1.95ミリモル,1.08当量)の無水DCM(5mL)溶液を一滴ずつ加えた。アルゴン雰囲気下で混合物を室温にて18時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で蒸発させて黄色のゴムを得た。ゴムを水に再溶解し、水酸化アンモニウム溶液で溶液を塩基性化し、DCMで抽出し(3×50mL)、合わせた抽出物を水(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、蒸発させて黄色の油を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ(80%n−ヘキサン/20%酢酸エチルを5%増分で60%n−ヘキサン/40%酢酸エチルへ)による精製によって無色の油として生成物を得た(0.213g、59%)。分析データ:RT 2.43分;MS(ES)m/z(相対強度)202([M+H],50);[α] =[+273]26.2°C (c,0.28CHCl
(b)(11S,11aS)−(R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル 11−ヒドロキシ−7−メトキシ−8−((5−(((S)−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(22)
Figure 2015527318
(i)tert−ブチル ((R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル) ((S)−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(2−((S)−2−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシ−5,1−フェニレン))ジカルバメート(19)
アルゴン雰囲気下、室温にてトリエチルアミン(0.28g,0.39mL,2.8ミリモル,2.2当量)をモノ−Boc保護したビス−アニリン(9)(1.21g,1.27ミリモル,1.0当量)とトリホスゲン(0.136g,0.46ミリモル,0.36当量)の撹拌された無水THF(15mL)溶液に加えた。反応混合物を40℃に加熱し、5分後、メタノールで試料を処理して、カルバミン酸メチルとしてLCMSによって分析した。分析データ:RT 4.30分;MS(ES)m/z(相対強度)1011([M+H],100)。
(R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(18)(0.38g,1.91ミリモル,1.5当量)とトリエチルアミン(0.19g,0.27mL,1.91ミリモル,1.5当量)の無水THF(10mL)溶液を新しく調製したイソシアネートに一滴ずつ加えた。反応混合物を40℃で4時間撹拌し、次いで室温で18時間撹拌した。反応混合物を濾過してトリエチルアミン塩酸塩を取り除き、乾燥するまで濾液を蒸発させて黄色の油として粗生成物を得、それをフラッシュカラムクロマトグラフィ(60%n−ヘキサン/40%酢酸エチルを5%増分で40%n−ヘキサン/60%酢酸エチルへ)による精製によって白色の泡状物として所望の生成物を得た(0.75g、50%)。分析データ:RT 4.50分;MS(ES)m/z(相対強度)1180([M+H],60);[α] =[−18]21°C (c,0.28CHCl)。
(ii)tert−ブチル ((R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル) ((S)−(ペンタン−1,5−ジイルビス(オキシ))ビス(2−((S)−2−(ヒドロキシメチル)−4−メチレンピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシ−5,1−フェニレン))ジカルバメート(20)
酢酸/HO(3/1,16mL)をビス−シリルエーテル(19)(0.72g,0.61ミリモル,1当量)のTHF(4mL)溶液に加えた。得られた溶液を室温で16時間撹拌した。重炭酸ナトリウム飽和溶液で反応混合物のpHをpH8に合わせた。混合物を酢酸エチル(4×150mL)で抽出し、合わせた抽出物を重炭酸ナトリウム飽和溶液(2×150mL)、水(150mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製によって白色の泡状物として生成物を得た(0.56g、96%)。分析データ:RT 3.15分;MS(ES)m/z(相対強度)953([M+H],100);[α] =[−13.5]26°C (c,0.22CHCl)。
(iii)(11S,11aS)−tert−ブチル 11−ヒドロキシ−8−((5−(((11S,11aS)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−10−(((R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロポキシ)カルボニル)−2,3,5,10,11,11a−ヘキサヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(21)
アルゴン雰囲気下にて−40℃でDMSO(91mg,83μL,1.16ミリモル,4.4当量)の無水DCM(5mL)溶液を塩化オキサリル(DCM中で2.0M,318μL,0.635ミリモル,2.4当量)の無水DCM(5mL)溶液に一滴ずつ加えた。溶液を−40℃で15分間撹拌した。ビス−アルコール(20)(0.252g,0.26ミリモル,1当量)の無水DCM(10mL)溶液を一滴ずつ加え、得られた混合物を−40℃で45分間撹拌した。この時間の間に温度は−25℃に達するようにした。温度を−35℃に下げ、トリエチルアミン(0.27g,0.36mL,2.6ミリモル,10当量)を一滴ずつ加えた。5分後、温度は室温に達した。反応混合物をDCM(50mL)で希釈し、1Mのクエン酸溶液で抽出し(3×150mL)、重炭酸ナトリウム飽和溶液(150mL)、水(200mL)、ブライン(200mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させて黄色の泡状物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ(クロロホルム/メタノールを0.5%の増分で0%から2%)による精製によって白色の泡状物として生成物を得た(0.137g、53%)。分析データ:RT 3.17分;MS(ES)m/z(相対強度)948([M+H]+.,100);[α] =[+170]26°C (c,0.25CHCl
(iv)(11S,11aS)−(R)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル 11−ヒドロキシ−7−メトキシ−8−((5−(((S)−7−メトキシ−2−メチレン−5−オキソ−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル)オキシ)ペンチル)オキシ)−2−メチレン−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート(22)
95%トリフルオロ酢酸(8.5mL)の冷却溶液(氷槽)を氷槽で冷却しておいた化合物(21)(0.221g,0.23ミリモル,1当量)に加えた。LCMSによって完全であることが示された時、溶液を0℃で25分間撹拌した。氷と重炭酸ナトリウム飽和溶液(200mL)の混合物に反応混合物を一滴ずつ加え、トリフルオロ酢酸溶液を中和した。混合物をDCM(4×75mL)で抽出し、合わせた抽出物を水(100mL)、飽和ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO)、減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ(クロロホルム/メタノールを1%の増分で0%から3%)による精製によって白色の泡状物として生成物を得た(0.192g、99%)。分析データ:RT 3.00分;MS(ES)m/z(相対強度)830([M+H]+.,75);[α] =[+444]22°C (c,0.26CHCl)。
前述の発明は、理解の明瞭さを目的とする説明及び例のつもりで少々詳しく記載してきたが、説明及び実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書で引用した特許及び科学文献すべての開示はその全体が参照によって明瞭に本明細書に組み入れられる。
Figure 2015527318
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Claims (45)

  1. 細胞傷害剤に共有結合するCD22を結合する抗体を含む免疫複合体であって、前記抗体が配列番号28のアミノ酸20〜240の範囲内でのエピトープを結合し、前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンである免疫複合体。
  2. 前記抗体が、(i)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(ii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3及び(iii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2を含む請求項1に記載の免疫複合体。
  3. 前記抗体が、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2及び(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む請求項1又は2に記載の免疫複合体。
  4. 前記抗体が、(a)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(iv)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、又は(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む請求項1に記載の免疫複合体。
  5. 前記抗体が、(a)(i)配列番号12及び15〜22から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は(b)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  6. 前記抗体が、(a)配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、又は(b)配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列、又は(c)(a)にあるようなVH配列と(b)にあるようなVL配列を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  7. 配列番号7のアミノ酸配列を有するVH配列を含む請求項6に記載の免疫複合体。
  8. 配列番号6のアミノ酸配列を有するVL配列又は配列番号8のアミノ酸配列を有するVL配列を含む請求項6に記載の免疫複合体。
  9. 細胞傷害剤に共有結合するCD22を結合する抗体を含む免疫複合体であって、前記抗体が、(a)配列番号7のアミノ酸配列を有するVH配列と配列番号8のアミノ酸配列を有するVL配列とを含み、前記細胞傷害剤がピロロベンゾジアゼピンである免疫複合体。
  10. 前記抗体が、IgG1抗体、IgG2a抗体又はIgG2b抗体である請求項1〜9のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  11. 前記免疫複合体が、式Ab−(L−D)pを有し、式中
    (a)Abは前記抗体であり;
    (b)Lはリンカーであり;
    (c)Dは前記細胞傷害剤であり;
    (d)pは1〜8の範囲である請求項1〜10のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  12. Dが式A:
    Figure 2015527318
    のピロロベンゾジアゼピンであり、式中、
    波線は前記リンカーに対する共有結合部位を示し;
    点線はC1とC2の間又はC2とC3の間での二重結合の任意の存在を示し;
    はH、OH、=O、=CH、CN、R、OR、=CH−R、=C(R、O-SO-R、COR及びCORから独立して選択され、任意でさらにハロ又はジハロから選択され、その際、Rは、R、COR、COR、CHO、COH、及びハロから独立して選択され;
    及びRは、H、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから独立して選択され;
    は、H、R、OH、OR、SH、SR、NH、NHR、NRR’、NO、MeSn及びハロから独立して選択され;
    Qは、O、S及びNHから独立して選択され;
    11はH、又はRのいずれかであり、又は、QがOである場合、SOMであり、Mが金属カチオンであり;
    R及びR’はそれぞれ独立して、任意で置換されたC1−12アルキル基、C3-20ヘテロシクリル基及びC5−20アリール基から選択され、任意でNRR’基に関連して、R及びR’はそれらが結合する窒素原子と一緒に任意で置換された4、5、6又は7員環の複素環を形成し;
    12、R16、R19及びR17はそれぞれR、R、R及びRについて定義されたとおりであり;
    R”は、C3−12アルキレン基であり、1以上のヘテロ原子及び/又は任意で置換される芳香族環によってその鎖が中断されてもよく;
    X及びX’は独立してO、S及びN(H)から選択される請求項11に記載の免疫複合体。
  13. Dが、構造
    Figure 2015527318
    を有し、式中、nが0又は1である請求項12に記載の免疫複合体。
  14. Dが、
    Figure 2015527318
    から選択される構造を有し、式中、R及びRE”はそれぞれ独立してH又はRから選択され、その際、RはR、COR、COR、CHO、COH及びハロから独立して選択され、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールから選択され、nは0又は1である請求項12に記載の免疫複合体。
  15. Dが、式B:
    Figure 2015527318
    のピロロベンゾジアゼピンであり、式中、
    横波線は前記リンカーに対する共有結合部位を示し、RV1及びRV2は独立してH、メチル、エチル、フェニル、フルオロ置換されたフェニル及びC5−6ヘテロシクリルから選択され、nは0又は1である請求項11に記載の免疫複合体。
  16. 前記リンカーがプロテアーゼによって切断可能である請求項11〜15のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  17. リンカーが、val−citジペプチド又はPhe−Lysジペプチドを含む請求項16に記載の免疫複合体。

  18. Figure 2015527318
    を有する請求項11に記載の免疫複合体。
  19. pが1〜3の範囲である請求項11〜18のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  20. 構造
    Figure 2015527318
    を含み、式中、CBAは抗体(Ab)を表し;RL1及びRL2はそれぞれ独立してH及びメチルから選択され、又はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピレン基を形成し;Yは単結合、(a1)及び(a2):
    Figure 2015527318
    から選択され、式中、Nは上記基がPBD部分のN10に結合する場所を示す請求項12に記載の免疫複合体。
  21. Figure 2015527318
    から選択される構造を含む請求項20に記載の免疫複合体。
  22. 構造
    Figure 2015527318
    を含み、式中、R及びR はそれぞれ独立してH及びRから選択される請求項20又は21に記載の免疫複合体。
  23. 構造
    Figure 2015527318
    を含み、式中、Ar及びArはそれぞれ独立して、任意で置換されたC5−20アリールである請求項20又は21に記載の免疫複合体。
  24. Ar及びArがそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから選択される請求項23に記載の免疫複合体。
  25. 構造
    Figure 2015527318
    を含み、式中、RV1及びRV2はそれぞれ独立してH、メチル、エチル、任意で置換されたフェニル及びC5−6ヘテロシクリルから選択される請求項20又は21に記載の免疫複合体。
  26. V1及びRV2がそれぞれ独立してH、フェニル及び4−フルオロフェニルから選択される請求項25に記載の免疫複合体。
  27. Figure 2015527318
    から選択される式を有し、式中、Abは、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体であり、pは1〜3の範囲である免疫複合体。
  28. 式:
    Figure 2015527318
    を有し、式中、Abは、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(iii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(v)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(vi)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む抗体であり、pは1〜3の範囲である免疫複合体。
  29. 前記抗体が、配列番号7のVH配列と配列番号8のVL配列を含む請求項27又は28に記載の免疫複合体。
  30. 前記抗体が、配列番号26の重鎖と配列番号23の軽鎖を含む請求項29に記載の免疫複合体。
  31. 前記抗体がモノクローナル抗体である上記請求項のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  32. 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である上記請求項のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  33. 前記抗体が、CD22を結合する抗体断片である上記請求項のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  34. 前記抗体がヒトCD22を結合する上記請求項のいずれか1項に記載の免疫複合体。
  35. ヒトCD22が配列番号28又は配列番号29の配列を有する請求項34に記載の免疫複合体。
  36. 上記請求項のいずれか1項に記載の免疫複合体と薬学上許容可能なキャリアとを含む医薬製剤。
  37. さらに追加の治療剤を含む請求項36に記載の医薬製剤。
  38. CD22陽性のがんを有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項1〜35のいずれか1項に記載の免疫複合体を前記個体に投与することを含む方法。
  39. 前記CD22陽性のがんが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、侵攻性NHL、再発した侵攻性NHL、再発した緩慢型NHL、難治性NHL、難治性緩慢型NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ性リンパ腫、白血病、ヘアリー細胞白血病(HCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、バーキットリンパ腫及びマントル細胞リンパ腫から選択される請求項38に記載の方法。
  40. さらに、追加の治療剤を前記個体に投与することを含む請求項39に記載の方法。
  41. 前記追加の治療剤がCD79bを結合する抗体を含む請求項40に記載の方法。
  42. 前記追加の治療剤が細胞傷害剤に共有結合するCD79bを結合する抗体を含む免疫複合体である請求項41に記載の方法。
  43. CD22陽性細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞の表面におけるCD22への免疫複合体の結合を許容する条件下で請求項1〜35のいずれか1項に記載の免疫複合体に前記細胞を曝露し、それによって細胞の増殖を阻害することを含む方法。
  44. 前記細胞が腫瘍性B細胞である請求項43に記載の方法。
  45. 前記細胞がリンパ腫細胞である請求項44に記載の方法。
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