CN116829593A - 与癌细胞结合并将放射性核素靶向所述细胞的分裂抗体 - Google Patents

与癌细胞结合并将放射性核素靶向所述细胞的分裂抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与靶细胞上的抗原结合并且将效应子部分靶向所述细胞的抗体，以及使用所述抗体的方法。

Description

与癌细胞结合并将放射性核素靶向所述细胞的分裂抗体
技术领域
本发明涉及双特异性抗体的新颖形式。在某些实施方案中，本发明进一步涉及具有此新颖形式(其与靶细胞上的抗原结合并且其将放射性核素靶向所述细胞)的抗体，并且涉及其使用方法。
背景技术
在各种临床环境中，通常需要选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性破坏肿瘤细胞，同时保持健康细胞和组织完好无损。
在这方面，已经设计了双特异性抗体，其用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，用第二个“臂”结合诸如药物的效应子部分。已经开发了多种双特异性形式，但开发双特异性抗体的任务绝非易事。
在预靶向的放射免疫疗法(PRIT)中，使用的抗体构建体一方面对肿瘤相关抗原具有亲和力，另一方面对放射性标记的化合物具有亲和力。在第一步中，抗体被施用并定位于肿瘤。随后，施用放射性标记的化合物。由于放射性标记的化合物很小，因此它可以被快速递送至肿瘤，并且未结合的化合物会被快速清除，这减少了肿瘤外的辐射暴露(Goldenberg等人Theranostics 2012,2(5),523-540)。类似的程序也可用于成像。预靶向可以利用双特异性抗体或使用亲合素-生物素的系统，尽管后者有亲合素/链霉亲合素具有免疫原性的缺点。
预靶向的放射免疫疗法或成像的方法通常利用清除剂或阻断剂，其在施用抗体的步骤和施用放射性标记的化合物的步骤之间施用。目的是从血液中清除抗体和/或阻断循环抗体与放射性标记的化合物的结合位点(参见例如Karacay等人，Bioconj.Chem.,13(5),1054-1070(2002))。使用清除剂或阻断剂允许给予足够水平的放射性以进行有效治疗，同时限制不良毒性，但必须谨慎选择时间和剂量，并且清除剂存在引入不良反应诸如免疫反应的风险的可能性。因此，清除阶段的使用是预靶向方法中的复杂方面。
发明内容
本发明提供了双特异性抗体的新颖形式(其中效应子部分的VH结构域和VL结构域被分成两部分)，及其使用方法。
特别地，本发明涉及一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其包含：
a)抗原结合部分，其与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成；和
c)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(b)的多肽通过其N末端与(a)的抗体结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(c)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第一抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；和
ii)第二抗体，其包含：
d)抗原结合部分，其与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
e)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成；和
f)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(e)的多肽通过其N末端与(d)的抗原结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(f)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第二抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；
其中第一抗体的所述VH结构域和第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。
第一抗体和第二抗体本身都不包含针对效应子部分的功能抗原结合位点。第一抗体仅具有来自针对效应子部分的功能结合位点的VH结构域，而不具有VL结构域。第二抗体只有VL结构域，没有VH结构域。
当第一抗体和第二抗体的VH结构域和VL结构域缔合时，形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。例如，这可能在第一抗体和第二抗体与同一个体靶细胞或相邻细胞结合时发生。
本文所述的第一抗体和第二抗体在本文中可称为“单结构域分裂抗体”、“分裂抗体”、“SPLIT”、“半抗体”或“半抗体”。一起形成能够结合效应子部分的抗原结合位点的VH结构域和VL结构域在两种抗体之间分裂，并且不作为相同抗体的一部分存在。
分裂结构域形式意味着效应子部分既不能单独与第一抗体结合，也不能单独与第二抗体结合。在血液中，第一抗体和第二抗体之间有很少或没有稳定缔合，因此放射性标记的化合物的结合很少或没有稳定结合。
在靶细胞的表面上表达的抗原在本文中可以称为“靶抗原”、“靶细胞抗原”或“TA”。根据本发明，上述第一抗体和第二抗体可具有与不同靶抗原结合或针对相同靶抗原的抗原结合部分。(为避免疑义，在声明抗体结合相同靶抗原的情况下，这意味着它们具有能够与相同靶抗原结合的结合位点，并且包括抗体可能与两个彼此相同的单独的抗原分子结合的可能性)。例如，在一个实施方案中，第一抗体和第二抗体均与CEA结合。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以与相同靶抗原的相同表位结合(具有结合位点)。在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体可以与相同靶抗原的相同表位结合(具有结合位点)。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以包含靶抗原的相同抗原结合位点。例如，它们可以包含能够与靶抗原结合的抗原结合位点，包括VL和VH序列，其中形成该抗原结合位点的VL和VH序列在第一抗体和第二抗体中是相同的。
术语“效应子部分”是指负责对靶细胞产生期望的效果的部分。在一个实施方案中，期望的效果是细胞杀伤。例如，效应子部分可以是用于杀死靶细胞的放射性核素、药物或毒素。在一个实施方案中，效应子部分可以是适用于放射疗法的放射性标记的化合物。在另一个实施方案中，期望的效果是标记并且效应子部分可以是适用于成像的放射性标记的化合物。
在一些实施方案中，(a)和(d)的抗原结合部分可以是抗体片段，诸如Fv、Fab、交叉Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv或scFab)；或单结构域抗体(dAb)，诸如VHH；或非抗体结合支架，诸如DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)；亲和；Sso7d；单抗体或anticalin。
在一些实施方案中，可以优选，(a)的抗原结合部分和(d)的抗原结合部分是Fab。在此类实施方案中，(b)的多肽通过其N末端与(a)的Fab片段的链中的一条的C末端融合；并且(e)的多肽通过其N末端与(d)的Fab片段的链中的一条的C末端融合。同样，在抗原结合部分包含一条以上链的其他实施方案中，多肽可以通过其N末端与链中的一条的C末端融合。
Fc区的存在在免疫疗法和成像方面具有益处，例如延长蛋白质的循环半衰期和/或导致比使用较小片段观察到的更高的肿瘤摄取。本文所述的“分裂结构域”形式在这种情况下可能特别有利，因为它减轻了与效应子部分/放射性标记的化合物缔合的更大可能性，否则这种可能性会由于循环抗体的长期存在而发生。在一些实施方案中，修饰Fc结构域以降低或消除Fc效应子功能。
本文描述的形式避免了效应子部分的VL和VH的显著脱靶关联。此外，根据本发明的抗体可以具有在降低抗药物抗体反应和/或稳定性方面的优势。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的一组抗体。在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含两种单独的药物组合物，每种药物组合物包含一种本文所述的抗体(即分别为第一抗体和第二抗体)。
在进一步方面，本发明涉及编码本文所述的任何抗体或抗体组的多核苷酸或多核苷酸组。另一方面，本发明涉及包含所述多核苷酸或多核苷酸的载体或载体组，任选地涉及表达载体或一组表达载体。在进一步的目的中，本发明涉及包含本发明的载体或载体组的原核或真核宿主细胞或宿主细胞组。此外，提供了产生抗体的方法，该方法包含培养宿主细胞以产生抗体。
在一些实施方案中，其中效应子分子是放射性标记的化合物，如本文所述的抗体可用于预靶向的放射免疫疗法(PRIT)的方法或预靶向的放射成像的方法。
在一个方面，本发明提供了预靶向的放射免疫疗法的方法，其包含：
i)向受试者施用如上所述的第一抗体和第二抗体；和
ii)随后向所述受试者施用放射性标记的化合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第一抗体和第二抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并且随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第一抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第二抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。
在另一方面，本发明提供了放射成像的方法，其包含：
i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体，其中抗体与靶抗原结合并定位于表达靶抗原的细胞的表面；
ii)随后施用放射性标记的化合物；并且任选地
iii)对放射性核素定位的组织或器官进行成像。
在另一个方面，本发明提供了在人体或动物体上进行的诊断方法中使用的如本文所述的第一抗体和第二抗体，其中该方法包含
i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体，其中抗体与靶抗原结合并且定位于表达靶抗原的细胞的表面；
ii)随后施用放射性标记的化合物；并且任选地
iii)对放射性核素定位的组织或器官进行成像。
成像步骤之后可以是形成诊断的步骤和任选地将该诊断传递给受试者的步骤。在一些实施方案中，该方法可以进一步包含确定合适的治疗和任选地将该治疗施用于受试者。
在上述方法/用途中的每一个中，第一抗体和第二抗体与相同或相邻靶细胞的结合导致了放射性标记的化合物的抗原结合位点的VH结构域和VL结构域的缔合和放射性标记的化合物的功能抗原结合位点的形成。因此，在施用放射性标记的化合物后，放射性标记的化合物与由VH和VL缔合形成的功能抗原结合位点结合。
在本文所述的任何方法和用途中，第一抗体和第二抗体可以同时或以任一顺序依次施用。
在本领域中，PRIT或放射成像的方法经常涉及清除步骤。清除步骤包含在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间施用药剂，其中该药剂增加了将抗体从血液中去除的速率和/或阻断放射性标记的化合物与抗体的结合。
在本文所述的方法和用途的实施方案中，该方法不包含清除步骤。即，它不包含在施用第一抗体和第二抗体和施用放射性标记的化合物之间施用清除剂或阻断剂的步骤(即，在施用抗体之后但在施用放射性标记的化合物之前)。在另一个实施方案中，在施用第一抗体和第二抗体与施用放射性标记的化合物之间不施用药剂，除了任选地放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂。在另一个实施方案中，在施用第一抗体和第二抗体与施用放射性标记的化合物之间不施用药剂。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以作为联合疗法的一部分施用。例如，它们可以与一种或多种放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂组合施用：放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂和抗体可以同时或以任一顺序依次施用。
如本文进一步讨论的，本文所述的放射成像和放射免疫疗法的方法可以任选地组合。
在进一步方面，本发明提供了试剂盒，其包含：
i)如本文所述的第一抗体和第二抗体；
ii)放射性标记的化合物，其与由第一抗体和第二抗体缔合形成的抗原结合位点结合。
任选地，该试剂盒可以不包括(即，不包含)如本文所述的清除剂或阻断剂。
任选地，该试剂盒可以进一步包含放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以存在于相同的药物组合物中。在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体可以存在于单独的药物组合物中。在一些实施方案中，放射性标记的化合物存在于与抗体分开的药物组合物中。
在其他实施方案中，如本文所述的抗体可用于选择性杀死靶细胞的方法，例如，用于癌症治疗。
附图说明
图1示出属于比较例的靶抗原(TA)-DOTAM双特异性抗体(TA-DOTAM BsAb)和示例性TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的示意性结构。
图2是显示分裂-VH/VL DOTAM结合物在肿瘤细胞上组装体的示意图。TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体不会显著结合212Pb-DOTAM，除非与靶细胞上的肿瘤抗原(TA)结合，其中DOTAM结合物的两个结构域组装在一起。
图3示出三步TA-PRIT概念的示例的示意图，其涉及清除剂的使用。
图4示出两步TA-PRIT概念的示例的示意图，其中不使用清除剂。
图5示出分裂抗体与MKN45细胞的结合，以证明CEA结合能力。使用人IgG特异性二级抗体进行抗体检测
图6示出分裂抗体与MKN45细胞的结合，以证明DOTAM结合能力。使用Pb-DOTAM-FITC进行抗体检测。
图7A示出具有CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的两步PRIT的示例性方案，在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中进行(h＝小时，d＝天，w＝周)。
图7B示出在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中进行的三步PRIT对照的示例性方案(h＝小时，d＝天，w＝周)。
图8示出注射212Pb-DOTAM后6小时，通过单独CEA-分裂-DOTAM-VH、单独CEA-分裂-DOTAM-VL或两种互补抗体组合，或使用标准三步PRIT进行预靶向，预靶向212Pb-DOTAM在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(％ID/g±SD,n＝4)。
图9示出在SCID小鼠中进行IV注射后的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL药代动力学。
图10示出方案158的实验设计，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的2个(顶部)或3个步骤(底部)的CEA-PRIT。*调整CEA分裂DOTAM BsAb剂量以补偿2/4构建体中的孔/孔杂质。
图11示出预靶向212Pb-DOTAM在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(6hp.i.)。该分布是有关在注射212Pb-DOTAM后6小时，通过CEA-DOTAM BsAb或CEA-分裂-DOTAM抗体的双互补位组合进行预靶向，在荷瘤SCID小鼠中的212Pb。器官和组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝4)。
图12示出方案160的实验时间表，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的3步CEA-PRIT(顶部)、2步CEA-PRIT(中部)或1步CEA-RIT的一个周期。在放射性注射后24小时，对生物分布(BD)观测实施安乐死，而对功效组中的小鼠进行维护和仔细监测，直到达到终止标准。
图13示出预靶向212Pb-DOTAM和212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(24h p.i.)。该分布是有关在注射CEA-DOTAM预靶向212Pb-DOTAM或预孵育212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM后24小时，在荷瘤SCID小鼠中的212Pb。器官和组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝3)。
图14示出BxPC3模型中PRIT治疗组和对照组(组A-E)的具有标准误差的肿瘤生长平均值(n＝10)。曲线在n<5处被截短。根据研究设计，垂直虚线指示一些或所有组的212Pb-DOTAM施用(20μCi)。
图15示出BxPC3模型中PRIT治疗组和对照组(组A-E)的个体肿瘤生长曲线(n＝10)。垂直虚线指示施用212Pb标记化合物(20μCi)。
图16示出在BxPC3模型中用CEA-PRIT和CEA-RIT(组A-E，n＝10)处理的小鼠的平均体重减轻。曲线在n<5处被截短。根据研究设计，垂直虚线指示一些或所有组的212Pb标记化合物施用。
图17示出方案175的实验设计，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的两步CEA-PRIT，其中在212Pb-DOTAM注射后24小时进行处死和验尸。调整CEA-分裂-DOTAM-VH-AST剂量以补偿孔/孔杂质。
图18示出在注射212Pb-DOTAM后24小时，通过CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(方案175)进行预靶向，212Pb在荷瘤SCID小鼠中的分布。器官和组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝4)。
图19示出方案185的实验设计，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的两步CEA-PRIT，其中在212Pb-DOTAM注射后6小时进行处死和验尸。调整CEA-分裂-DOTAM-VH-AST(CH1A1A)剂量以补偿孔/孔杂质。
图20示出在注射212Pb-DOTAM后6小时，通过CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(方案185)进行预靶向，212Pb在荷瘤SCID小鼠中的分布。器官和组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝5)。
图21示出注射7天后两个选定的SC BxPC3肿瘤中CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对(VH和VL抗体组合)的分布。A和B示出来自小鼠A3的肿瘤切片，其注射靶向T84.66的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL，其中A示出CEA表达，并且B示出相应的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL分布。C和D示出来自小鼠C5的肿瘤切片，其注射靶向CH1A1A的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL：C示出CEA表达，并且D示出相应的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL分布。
图22示出方案189的实验设计，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的两步CEA-PRIT，其中在212Pb-DOTAM注射后6小时进行处死和验尸。调整CEA-分裂-DOTAM-VH-AST(CH1A1A)剂量以补偿孔/孔杂质。
图23示出与阳性对照(仅CH1A1A)相比，注射212Pb-DOTAM后6小时，通过CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(T84.66和CH1A1A)的双互补位对进行预靶向，212Pb在荷瘤SCID小鼠中的分布。器官和组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD。
图24示出由FACS测定的SPLIT抗体的平均荧光强度(MFI)。由FACS测定的Pb-DOTA-FITC的结合只能显示为两种SPLIT抗体与Pb-DOTA-FITC的共孵育。单一SPLIT抗体未产生显著信号。
图25A-C示出分裂抗体的示例性形式。
图26示出来自实施方案8实验1的结果，评估了在芯片上捕获的单个TA-分裂-DOTAM-VH和TA-分裂-DOTAM-VL抗体与生物素化DOTAM的结合。
图27示出来自实施方案8实验2的结果，评估了在芯片上捕获的DOTAM与单个TA-分裂-DOTAM-VH和TA-分裂-DOTAM-VL抗体的结合。
图28示出来自实施方案8实验3的结果，评估了在芯片上捕获的DOTAM与TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(抗体对)的结合。
图29示出进一步的示例性TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的示意性结构。图29A示出对于靶抗原是单价的形式。图29B示出对于靶抗原是二价的形式。
图30示出方案193的实验设计，包括在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的2步SPLIT PRIT方案。
图31示出在注射212Pb-DOTAM后6小时，通过N末端SPLIT(来自实例9)进行预靶向，212Pb在荷瘤SCID小鼠中的分布。
具体实施方式
I.定义
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性方法。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“与靶细胞的表面上所表达的抗原结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力所述抗原结合，使得该抗体可用作靶向所述抗原的诊断及/或治疗剂。在一个方面，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗体与不相关的非抗原蛋白的结合程度小于抗体与抗原的结合的约10％。在某些方面，与在靶细胞的表面上所表达的抗原结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。当抗体的KD为1μM或更小时，则称抗体与在靶细胞的表面上所表达的抗原“特异性结合”。在某些方面，抗体与该抗原的表位结合，该表位在来自不同物种的所述抗原中具有保守性。
术语“针对效应子部分的抗原结合位点”或“针对效应子部分的功能抗原结合位点”是指包含VH结构域和VL结构域的抗原结合位点，其能够以足够的亲和力与效应子部分结合，使得该抗体可用作诊断和/或治疗剂以将效应子部分与抗体缔合。在一个方面，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗原结合位点与不相关的非抗原化合物的结合程度小于抗体与效应子部分结合的约10％。在某些方面，与效应子部分结合的抗原结合位点的解离常数(KD)是≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10- 8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。可优选其KD为100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的KD结合效应子部分。当抗原结合位点的KD是1μM或更小时，称抗原结合位点与效应子部分“特异性结合”。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。如本文所用，术语“抗体”还涵盖单个半抗体，其包含功能抗原结合位点的VH结构域或VL结构域。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology23:1126-1136(2005)。术语“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链的VH结构域和CH1结构域以及轻链的VL结构域和CL结构域组成的蛋白质。“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基末端添加残基，该残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。
如本文所用，提及“Fab片段”旨在包括cross-Fab片段或scFab以及常规Fab片段(即，包含含有VL结构域和CL结构域的轻链的片段，以及包含VH结构域和CH1结构域的重链片段的Fab片段)。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。为清楚起见，在其中Fab轻链和Fab重链的可变区进行交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区进行交换的交叉Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性链接的氨基酸单体的分子。单链Fab分子是其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接以形成单肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中，单链Fab分子中Fab轻链的C末端连接至Fab重链的N末端。
还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头是10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。
术语“阻断剂”是指阻断效应子分子的结合，特别是放射性标记的化合物与该效应子分子的功能结合位点的结合的试剂。通常，所述阻断剂与效应子分子的功能结合位点结合，例如，特异性结合所述功能结合位点。
术语“清除剂”是指增加抗体从受试者的循环中的清除率的试剂。通常，清除剂与抗体结合，例如，与抗体特异性结合。
如本文所用，术语“清除步骤”或“清除阶段”涵盖阻断剂或清除剂的使用。一些试剂既可以用作清除剂，也可以用作阻断剂。
术语“表位”表示抗原结合的蛋白质或非蛋白质抗原上的位点。表位既可以由连续的氨基酸伸长段(线性表位)形成，也可以通过包含非连续的氨基酸(构象表位)形成，例如由于抗原折叠，即由于蛋白质抗原的三级折叠而在空间上接近。在蛋白质抗原暴露于变性剂后，线性表位通常仍被抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理后被破坏。表位包含独特的立体构象中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8至10个氨基酸。
抗体结合的筛选可以使用本领域常规的方法进行，例如但不限于丙氨酸扫描、肽印迹(参见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、表位切除，表位提取、抗原的化学修饰(参见Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉阻断(参见“Antibodies”,Harlow andLane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。
基于抗原结构的抗体谱(ASAP)(也称为修饰辅助谱(MAP))允许基于大量抗体中的每一种抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合概况，结合大量特异性结合抗原的单克隆抗体(参见，例如，US 2004/0101920)。每个组中的抗体结合相同的表位，该表位可以是独特的表位，该独特的表位与另一个组所代表的表位明显不同或部分重叠。
竞争性结合也可用于容易地确定抗体是否与参考抗体所结合的表位相同的表位结合，或是否与参考抗体竞争结合。例如，与参考抗体“与相同表位结合的抗体”所指的抗体在竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断达50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考抗体将该抗体与其抗原的结合阻断达50％或更多。同样例如，为了确定抗体是否与参考抗体所结合的表位相同的表位结合，使参考抗体在饱和条件下与抗原结合。在去除过量的参考抗体后，评定所讨论的抗体与抗原结合的能力。如果在参考抗体饱和结合后所讨论的抗体能够与抗原结合，则可以得出结论，所讨论的抗体与参考抗体所结合的表位不同的表位结合。但是，如果所讨论的抗体在参考抗体饱和结合后不能与抗原结合，则所讨论的抗体可能与参考抗体所结合的表位相同的表位结合。为了确认所讨论的抗体是与同一表位结合还是由于空间原因而使其受阻，可以使用常规实验(例如，使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或任何其他本领域可获得的定量或定性的抗体结合测定法进行的肽突变和结合分析)。该测定应以两种设置进行，即，两种抗体均为饱和抗体。如果在这两种设置中，只有第一(饱和)抗体能够结合抗原，则可以得出结论，所讨论的抗体和参考抗体竞争结合抗原。
在一些方面，如在竞争性结合测定中测量的，如果一种抗体1、5、10、20或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更高，则认为两种抗体结合相同或重叠的表位(参见例如Junghans等人，Cancer Res.50(1990)1495-1502)。
在一些方面，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同的表位。如果只有一种减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体被认为具有“重叠表位”。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链及/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些方面，抗体是IgG1同种型。在某些方面，抗体是具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能的IgG1同种型。在其他方面，抗体是IgG2同种型。在某些方面，抗体是在铰链区具有S228P突变的IgG4同种型，以改善IgG4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“Fc效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“串联Fab”是指包含通过肽接头/系链连接的两个Fab片段的抗体。在一些实施方案中，串联Fab可以包含一个Fab片段和一个cross-Fab片段，通过肽接头/系链连接。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。本文中的术语“Fc结构域”用于定义免疫球蛋白的C末端区域，其包含两条重链的恒定区，不包括第一恒定区。因此，Fc结构域是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据EU索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据EU索引编号)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用，Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够与形成二聚Fc结构域的两种多肽中的另一种稳定缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2恒定结构域和IgG CH3恒定结构域。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“融合”是指组分直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个方面，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。代替上述，本文所述的CDR-H1序列可以从Kabat26延伸至Kabat35，例如，对于Pb-DOTAM结合可变结构域。
在一个方面，CDR残基包含在序列表或说明书其他地方鉴定的那些。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR/CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上述Kabat等人编号。
“免疫偶联物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)偶联的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
如本文所述的分子可以是“分离的”。“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从实质上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备的生产过程中出现，此类变体通常以少量形式存在)之外，包含该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变结构域(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链均具有可变结构域(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后为恒定轻链(CL)结构域。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且出于比对的目的在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且在WO 2001/007611中有所描述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序，利用BLOSUM50比较矩阵生成氨基酸序列同一性百分比的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
术语“药物组合物”或“药物配制物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
除非另外指明，否则本文所用的靶抗原是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(诸如小鼠和大鼠)的任何天然靶抗原。该术语涵盖“全长”的未加工的靶抗原，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的靶抗原。该术语还涵盖天然存在的靶抗原的变体，例如剪接变体或等位基因变体。例如，靶抗原CEA可能具有人CEA的氨基酸序列，特别是癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，其在UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731(版本119)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2中显示。靶抗原的另一个实例是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。人FAP的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。靶抗原的另一个实例是GPRC5D(参见UniProt编号Q9NZD1(版本115)；人序列的NCBI RefSeq编号NP_061124.1)。
如本文所述的术语“分裂抗体”、“单结构域分裂抗体”或“SPLIT PRIT”是指一起形成能够与效应子部分结合的抗原结合位点的VH结构域和VL结构域是分裂的在两种抗体之间的，并且不作为同一抗体的一部分存在(在体内组装之前)。“靶向CEA的SPLIT PRIT”是指靶向CEA的分裂抗体。术语“SPLIT PRIT”也可以与术语“TA-分裂-DOTAM-VH/VL”互换使用(例如，其中“TA”或靶抗原是CEA、FAP或GPRC5D)。术语“靶向CEA的SPLITPRIT”可以与术语“CEA-分裂-DOTAM-VH/VL”互换使用。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用的，术语“Pb”或“铅”包括其离子，例如Pb(II)。其他金属的提及也包括其离子。因此，本领域技术人员理解，例如，术语铅、Pb、212Pb或203Pb旨在涵盖元素的离子形式，特别是Pb(II)。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于包含第一抗体和第二抗体的一组抗体，其中每种抗体可以与靶细胞上的抗原结合，但其中针对效应子部分的功能抗原结合位点是只有当第一抗体和第二抗体相互缔合时才形成。在一个实施方案中，根据本发明的多组抗体可用于细胞杀伤/癌症治疗。在另一个实施方案中，本发明的多组抗体可用于例如预靶向免疫疗法和/或预靶向成像的方法。在优选的方面，此类方法消除了施用清除剂或阻断剂的步骤。
分裂形式具有减少脱靶效应的优点。如本文所证明，在PRIT的背景下，它避免了对清除剂的需要。此外，如本文所述的该特定形式避免了分裂抗原结合位点的VH结构域的游离C末端，并且因此降低了涉及预先存在的人抗VH(HAVH)自身抗体的抗药物抗体反应的可能性。进一步，并且在不希望受理论束缚的情况下，发明人认为本文所述的形式有助于保护DOTAM VH/VL的疏水界面，并且因此有助于稳定性。
A.抗体形式
如上所述，本发明提供双特异性抗体的新颖形式(其中效应子抗原的VH和VL结构域被分成两部分)，及其使用方法。
特别地，本发明涉及一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其包含：
a)抗原结合部分，其中抗原结合部分与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成；和
c)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(b)的多肽通过其N末端与(a)的抗原结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(c)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第一抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；和
ii)第二抗体，其包含：
d)抗原结合部分，其中抗原结合部分与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
e)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成；和
f)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(e)的多肽通过其N末端与抗原结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(f)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第二抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；
其中第一抗体的所述VH结构域和第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。
融合可以是直接的或间接的，例如通过肽接头。
在一些实施方案中，(a)和/或(d)的抗原结合部分可以是Fab。
可以优选，(b)的多肽通过其N末端与(a)的Fab片段的重链的C末端融合。在一些实施方案中，(a)的Fab片段包含轻链和重链片段，该轻链包含VL结构域和CL结构域，该重链片段包含VH结构域和CH1结构域，并且(b)的多肽通过其N末端与CH1结构域的C末端融合。
可以类似地优选，(e)的多肽通过其N末端与(d)的Fab片段的重链的C末端融合。在一些实施方案中，(d)的Fab片段包含轻链和重链片段，该轻链包含VL结构域和CL结构域，该重链片段包含VH结构域和CH1结构域，并且(e)的多肽通过其N末端与CH1结构域的C末端融合。
可以优选，多肽(b)和(e)不包含恒定区(例如CH1或CL)。在一些实施方案中，可以优选，(b)的多肽由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成和/或(e)的多肽由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成。这可以有助于正确组装形成(a)和(d)的Fab片段的一部分的轻链和/或降低这两个部分在循环中形成结合感受态部分的趋势。
可以优选，第一抗体和第二抗体的缔合导致仅形成一个结合效应子部分的功能抗原，即，两个缔合的抗体提供对效应子部分的单价结合。因此，第一抗体可以仅包含针对效应子部分的抗原结合位点的一个VH结构域，并且第二抗体可以仅包含针对效应子部分的抗原结合位点的一个VL结构域，从而它们一起仅形成一个完整的效应子部分的功能结合位点。
在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体进一步包含与靶抗原结合的另一个抗原结合部分，例如与靶抗原结合的另一个抗体片段，诸如另一个Fab片段。因此，在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体(通常两者)各自包含两个能够与靶抗原结合的抗原结合部分。优选能够结合相同的靶抗原的两个抗原结合部分。任选地，第一抗体和第二抗体各自包含不超过两个能够与靶抗原结合的抗原结合部分。在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体可各自包含多于两个能够与靶抗原结合的抗原结合部分。
在一个实施方案中，该另外的抗原结合部分，例如Fab片段，通过其C末端与Fc结构域的另一个亚基的N末端融合。(在由多于一条链组成的Fab或其他部分的情况下，其可以通过其链中的一条(例如其重链)的C末端与Fc结构域的另一个亚基的N末端融合)。因此，在一个实施方案中，第一抗体和/或第二抗体可以是双臂抗体，其中每个臂带有针对靶抗原的结合位点。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其包含：
a)第一Fab片段，其中Fab片段与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成；和
c)Fc结构域，其包含第一亚基和第二亚基，
其中(b)的多肽通过其N末端与(a)的Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(c)的Fc结构域的第一亚基的N末端融合；
并且进一步包含与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的第二Fab片段，其中第二Fab通过其链中的一条的C末端与(c)的Fc结构域的第二亚基的N末端融合；
其中第一抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；和
ii)第二抗体，其包含：
d)第一Fab片段，其中Fab片段与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
e)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成；和
f)Fc结构域，其包含第一亚基和第二亚基，
其中(e)的多肽通过其N末端与(d)的Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(f)的Fc结构域的第一亚基的N末端融合；
并且进一步包含与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的第二Fab片段，其中第二Fab通过其链中的一条的C末端与(f)的Fc结构域的第二亚基的N末端融合；
其中第二抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；并且
其中第一抗体的所述VH结构域和第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。
可以优选，第一抗体的第二Fab片段通过其重链的C末端与Fc结构域的第二亚基融合。可以优选，第一抗体的第二Fab片段包含轻链和重链片段，该轻链包含VL结构域和CL结构域，该重链片段包含VH结构域和CH1结构域，并且第二Fab片段通过其CH1结构域的C末端与Fc结构域的第二亚基融合。可以类似地优选，第二抗体的第二Fab片段通过其重链的C末端与Fc结构域的第二亚基融合。可以优选，第二抗体的第二Fab片段包含轻链和重链片段，该轻链包含VL结构域和CL结构域，该重链片段包含VH结构域和CH1结构域，并且第二Fab片段通过其CH1结构域的C末端与Fc结构域的第二亚基融合。
可以优选，第一抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(例如，Fab片段)彼此与相同的靶抗原结合，即第一抗体对于靶抗原是二价的。可以类似地优选，第二抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(例如，Fab片段)彼此与相同的靶抗原结合，即第二抗体对于靶抗原是二价的。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体也彼此与相同的靶抗原结合。
在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体对于靶抗原的表位是多价的(例如，二价的)和单特异性的。因此，在一些实施方案中，第一抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(例如，Fab片段)彼此与靶抗原的相同的表位结合；和/或第二抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(例如，Fab片段)彼此与靶抗原上的相同的表位结合。优选地，由第一抗体和第二抗体结合的靶抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体也彼此与该靶抗体中相同的表位结合。因此，第一抗体的第一Fab和第二Fab、或第二抗体的第一Fab和第二Fab、或所有四个Fab的可变结构域序列(VH和VL)在一些实施方案中可以相同。
在其他实施方案中，第一抗体和第二抗原与相同的靶抗原结合但各自与该靶抗原上的不同表位结合，例如，第一抗体的第一Fab片段和第二Fab片段与靶抗原的表位A结合并且第二抗体的第一Fab片段和第二Fab片段与该靶抗原的表位B结合。
在一些实施方案中，第一抗体可以包含以下肽：
i)第一重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(i)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点；
iii)第二重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；以及
iv)另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(iii)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点。
任选地，(i)中的Fab重链与(iii)中的Fab重链具有相同的序列，并且(ii)和(iv)中的Fab轻链彼此具有相同的序列。
第二抗体可以包含以下肽：
v)第一重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
vi)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(v)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点；
vii)第二重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；以及
viii)另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(vii)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点。
任选地，(v)中的Fab重链与(vii)中的Fab重链具有相同的序列，并且(vi)和(viii)中的Fab轻链彼此具有相同的序列。
任选地，(i)、(iii)、(v)和(vii)中的Fab重链彼此具有相同的序列，并且(ii)、(iv)、(vi)和(viii)中的Fab轻链彼此具有相同的序列。
在其他实施方案中，在一些情况下可以优选第一抗体和/或第二抗体各自具有能够与靶抗原特异性结合的单个抗原结合部分。因此，第一抗体和/或第二抗体对于靶抗原可以是单特异性的和单价的。优选地，第一抗体和第二抗体彼此在相同或不同的表位处与相同的靶抗原结合。
在一个实施方案中，第一抗体和/或第二抗体是单臂抗体。在此类实施方案中，未与(b)的多肽融合的第一抗体的Fc亚基也未与任何其他抗原结合部分融合；和/或未与(e)的多肽融合的第二抗体的Fc亚基也未与任何其他抗原结合部分融合。因此，Fc结构域可包含缺少Fd的亚基。在一些实施方案中，构成抗体的多肽中的一者可以由Fc亚基组成或基本上由Fc亚基组成。
因此，在一些实施方案中，第一抗体可以包含以下多肽：
i)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
iii)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(i)的Fab重链和(ii)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段。
第二抗体可以包含以下多肽：
iv)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
v)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
vi)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(iv)的Fab重链和(v)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段。
在这些单臂抗体的一些实施方案中，(i)和(iv)的Fab重链可以彼此具有相同的序列；并且ii)和(v)的Fab轻链多肽可以彼此具有相同的序列。
在其中抗体包含具有不同互补位(例如，结合不同抗原和/或表位)的两个Fab片段的任何实施方案中，可以优选，Fab中的一个是常规Fab(包含重链VH-CH1和轻链VL-CL)，并且另一个是交叉Fab或scFab。具有第一特异性/可变结构域序列的Fab可以是常规Fab，并且具有第二特异性/可变结构域序列的Fab可以选自交叉Fab或scFab。这减少了轻链错配的可能性。
在任何上述中，抗原结合部分可以与Fc结构域融合或彼此直接融合或通过肽接头融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。接头(例如，在Fab片段与效应子部分的VH/VL之间和/或在效应子部分的VH/VL与Fc结构域之间)可以是至少5个氨基酸或至少10个氨基酸，优选5至100个，例如，10至70个、10至60个或10至50个氨基酸。在一些实施方案中，可以优选接头长度为15-30个氨基酸，例如15-25个，例如长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。接头可以是刚性接头或柔性接头。在一些实施方案中，它是包含或由Thr、Ser、Gly和/或Ala残基组成的柔性接头。例如，它可以包含或由Gly和Ser残基组成。在一些实施方案中，它可具有重复基序，诸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常是1至10之间的数字，通常是2至4之间。在另一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，例如x＝4并且n＝2或3，例如x＝4并且n＝2。在一些实施方案中，接头可以是或可以包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.:31)。在另一个实施方案中，接头可以是或包含GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(SEQ ID NO:148)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGS(SEQ ID NO:149)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(SEQ ID NO:150)。另一种示例性肽接头是EPKSC(D)-(G4S)2。(SEQID NO:151)另外，在抗原结合部分与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
本发明人已经确定，在由y个氨基酸组成的肽接头中，第y位的Ser(即，作为接头的最后/C末端氨基酸的Ser)可以诱导y+2个氨基酸的糖基化(即，从接头中的最后一个氨基酸开始，位于C末端方向2个残基的氨基酸)，这取决于该y+2个氨基酸的性质。因此，可以优选接头的最后一个丝氨酸残基位于第y-2或y-3位(即，接头的最后一个丝氨酸残基位于接头中最后一个氨基酸的N末端方向上的第2或3位氨基酸)。在一些实施方案中，接头可以由选自由Gly和Ser组成的组的y个连续氨基酸残基组成，例如，其中y＝至少5或至少10且小于或等于100，例如5至100，10至70、10至60、或10至50，例如15至31或15至30，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，并且其中最后一个丝氨酸在第y-2或y-3位。(因此，第y-2位可能有丝氨酸，第y-1和y位可能有甘氨酸；或者第y-3位可能有丝氨酸，第y-2、y-1和y位可能有甘氨酸)。在一些实施方案中，可以优选y＝20或21。在一些实施方案中，可以优选，接头是(GxS)n(GGSGG)或(GxS)n(GGSGGG)，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝4并且n＝1至20，例如1至10，例如2、3、4、5、6、7、8或9，例如n＝2至4。例如，接头可以是GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(SEQID NO:148)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(SEQ ID NO:150)。
在任何上述多组抗体的特定实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在具体实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个具体实施方案中，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在甚至更具体的实施方案中，Fc结构域是包含氨基酸取代S228P(Kabat编号)的IgG4 Fc结构域。在特定实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。
可以优选，对Fc区进行工程改造以减少或消除效应子功能。这可以包括替换Fc区残基234、235、238、265、269、270、297、327和/或329中的一个或多个，例如234、235和/或329中的一个或多个。在一些实施方案中，Fc区可以及进行工程改造以包括Pro 329替换为Gly、Leu 234替换为Ala和/或Leu 235替换为Ala(根据EU索引编号)。下文将进一步讨论减少Fc效应子功能的修饰。
已知用于制备多特异性抗体的技术也可用于制备本文所述的任何异二聚体。这些技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利号5731168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。其他方法包括工程化静电转向效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(参见例如WO 2009/089004)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如，美国专利号4676980和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；以及使用常见的轻链技术来避免轻链错误配对问题(参见例如WO 98/50431)。
如上所述的全长抗体的CH3结构域可以通过“杵臼结构”技术改变，该技术在例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人，Protein Eng 9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人，Nat Biotechnol.16(1998)677-681中以若干实例详细描述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链的异源二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中的一个可以是“杵”而另一个是“臼”。例如，一种包含所谓的“杵突变”(T366W和任选地S354C或Y349C中的一种)，并且另一种包含所谓的“臼突变”(T366S、L368A和Y407V，以及任选地Y349C或S354C)(参见例如Carter，P.等人，Immunotechnol.2(1996)73)，根据EU索引编号。
二硫桥的引入可以额外或替代性地用于稳定异二聚体(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
因此，在一些实施方案中，第一和/或第二抗体的特征还在于：全长抗体的一条重链的CH3结构域和全长抗体的另一条重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的原始界面的界面处相会；其中所述界面被改变以促进抗体的形成，其中该改变的特征在于：
a)一条重链的CH3结构域被改变，使得在与抗体内另一条重链的CH3结构域的原始界面相会的一条重链的CH3结构域的原始界面内，氨基酸残基被替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，从而在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可定位在另一条重链的CH3结构域界面内的空腔内
并且
b)另一条重链的CH3结构域被改变，使得在与抗体内第一CH3结构域的原始界面相会的第二CH3结构域的原始界面内，氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，从而在第二CH3结构域的界面内生成空腔，第一CH3结构域的界面内的突起可定位在该空腔内。
所述具有较大侧链体积的氨基酸残基可以任选地选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组。所述具有较小侧链体积的氨基酸残基可以任选地选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组。
任选地，在一些实施方案中，两个CH3结构域通过在每个CH3结构域的相应位置引入半胱氨酸(C)作为氨基酸来进一步改变，使得可以在两个CH3结构域之间形成二硫键。
在一些实施方案中，多特异性(例如，双互补位)抗体还可以在其中包含的Fab分子(包括交叉Fab分子)中包含氨基酸取代，该氨基酸取代在减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)方面特别有效地，该错配可以发生在基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的产生中，所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下是多个)结合臂中具有VH/VL替换(同样参见PCT公开号WO2015/150447，特别是其中的实例，该PCT公开的通过引用其全部并入本文)。所需的(多特异性)抗体与不期望的副产物，特别是在(多特异性)抗体的结合臂中的一个结合臂中产生的Bence Jones型副产物的比率，可以通过在Fab分子的CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电修饰”)来提高。
因此，在一些实施方案中，包含Fab分子的本发明的抗体包含至少一种Fab，其具有包含如本文所述的电荷修饰的重链恒定结构域CH1结构域和包含如本文所述的电荷修饰的轻链恒定CL结构域。
电荷修饰可以在包含在本发明的抗体中的常规Fab分子中进行，或者在包含在本发明的抗体中的交叉Fab分子中进行(但不是在两者中)。在具体的实施方案中，在本发明抗体中包含的常规Fab分子中进行电荷修饰。
在一些实施方案中，在包含含有电荷修饰的轻链恒定结构域CL和包含电荷修饰的重链恒定结构域CH1的Fab或交叉Fab中，轻链恒定结构域CL中的电荷修饰在第124位处和任选地在第123位处(根据Kabat编号)，并且重链恒定结构域CH1中的电荷修饰位于第147位处和/或第213位处(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施方案中，在轻链恒定结构域CL中，第124位处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中独立地被赖氨酸(K)取代)，并且在重链恒定结构域CH1中，第147位处的氨基酸或第213位处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号。
B.靶抗原
在靶细胞表面表达的抗原在本文中也称为“靶抗原”或“靶细胞抗原”。这些术语在本文中可互换使用。
就本发明涉及治疗方法和其中使用的产品而言，它适用于可通过靶向患者细胞(例如病变细胞)的细胞毒活性治疗的任何病症。因此，靶细胞是针对其希望靶向细胞毒性的任何细胞，例如任何病变细胞。治疗优选是肿瘤或癌症。然而，本发明的适用性不限于肿瘤和癌症。例如，治疗也可以是病毒感染(通过靶向感染细胞)或T细胞驱动的自身免疫疾病(通过靶向T细胞)。针对感染细胞表面表达的病毒抗原的免疫毒素已被研究用于各种病毒感染，诸如HIV、狂犬病和EBV。Cai和Berger 2011Antiviral Research 90(3):143-50使用含有PE38的免疫毒素靶向杀死感染卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒的细胞。此外，(A-dmDT390-bisFv(UCHT1))选择性杀死人恶性T细胞并暂时耗尽正常T细胞，并且被认为具有治疗T细胞驱动的自身免疫性疾病诸如多发性硬化症和移植物-抗宿主病，以及正在进行临床试验的T细胞血癌。同样，本发明的方法可适用于需要成像的任何细胞类型，包括但不限于癌症或肿瘤细胞。
因此，合适的靶抗原可以包括癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原。
抗原通常是过表达或在异常时间表达的正常细胞表面抗原。理想情况下，靶抗原仅在病变细胞(诸如肿瘤细胞)上表达，但在实践中很少观察到。因此，通常根据患病组织和健康组织之间的差异表达来选择靶抗原。
细胞表面标志物或靶抗原可以是例如肿瘤相关抗原。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤特异性抗原”是指如下任何分子(例如蛋白质、肽、脂质、碳水化合物等)，该分子由肿瘤细胞和/或癌症细胞，或由肿瘤间质的其他细胞诸如癌症相关成纤维细胞单独或主要表达或过表达，使得抗原与肿瘤和/或癌症相关。肿瘤相关抗原还可以由正常、非肿瘤或非癌细胞表达。然而，在这种情况下，正常、非肿瘤或非癌细胞对肿瘤相关抗原的表达不如肿瘤或癌细胞的表达强。在这方面，与正常、非肿瘤或非癌细胞对抗原的表达相比，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或以显著更高的水平表达抗原。此外，肿瘤相关抗原还可以由不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，肿瘤相关抗原可以由胚胎或胎儿阶段的细胞额外表达，这些细胞在成年宿主中通常不存在。或者，肿瘤相关抗原可以由干细胞或前体细胞额外表达，这些细胞在成年宿主中通常不存在。
肿瘤相关抗原可以是由任何癌症或肿瘤(包括本文所述的癌症和肿瘤)的任何细胞表达的抗原。肿瘤相关抗原可以是仅一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原，使得肿瘤相关抗原仅与一种类型的癌症或肿瘤相关或具有其特征。或者，肿瘤相关抗原可以是多于一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原(例如，可具有该多于一种类型的癌症或肿瘤的特征)。例如，肿瘤相关抗原可以由乳腺癌和前列腺癌细胞两者表达，而正常、非肿瘤或非癌细胞根本不表达。
本发明的抗体可以结合的示例性肿瘤相关抗原包括但不限于黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、粘蛋白1(MUCl；肿瘤相关上皮粘蛋白)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PSCA、EpCAM、Trop2(滋养层-2，也称为EGP-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)、CD56、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)(也称为erbB-2)、CDS、CD7、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)I和TRP2。在另一个实施方案中，肿瘤抗原可以选自下组，该组由以下各项组成：分化簇(CD)19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33(唾液酸结合Ig样凝集素3，骨髓细胞表面抗原)，CD79b、CD123(白介素3受体α)、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮素、钙粘蛋白、Lewis Y、Glypican-3、FAP(成纤维细胞活化蛋白α)、GPRC5D(G蛋白偶联受体C类第5组成员D)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CA9＝CAIX(碳酸酐酶IX)、Ll CAM(神经细胞粘附分子L1)、内皮唾酸蛋白、HER3(表皮生长因子受体家族成员3的活化构象)、Alkl/BMP9复合物(间变性淋巴瘤激酶1/骨形态发生蛋白9)、TPBG＝5T4(滋养层糖蛋白)、ROR1(受体酪氨酸激酶样表面抗原)、HER1(表皮生长因子受体的活化构象)和CLL1(C型凝集素结构域家族12，成员A)。间皮素在例如卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、输卵管癌、头颈癌、宫颈癌和胰腺癌中表达。CD22在例如毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中表达。CD25在例如白血病和淋巴瘤中表达，包括毛细胞白血病和霍奇金淋巴瘤。Lewis Y抗原在例如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肺癌和胰腺癌中表达。CD33在例如急性髓性白血病(AML)、慢性粒单核细胞白血病(CML)和骨髓增生性疾病中表达。
与肿瘤相关抗原特异性结合的示例性抗体包括但不限于针对转铁蛋白受体的抗体(例如，HB21及其变体)、针对CD22的抗体(例如，RFB4及其变体)、针对CD25的抗体(例如，抗Tac及其变体)、针对间皮素的抗体(例如SS 1、MORAb-009、SS、HN1、HN2、MN、MB及其变体)和针对Lewis Y抗原的抗体(例如B3及其变体)。在这方面，靶向部分(细胞结合剂)可以是选自由B3、RFB4、SS、SS1、MN、MB、HN1、HN2、HB21和MORAb-009组成的组的抗体，及其抗原结合部分。适用于本发明嵌合分子的其他示例性靶向部分公开于例如美国专利5242824(抗转铁蛋白受体)；5846535(抗CD25)；5889157(抗Lewis Y)；5981726(抗Lewis Y)；5990296(抗LewisY)；7081518(抗间皮素)；7355012(抗CD22和抗CD25)；7368110(抗间皮素)；7470775(抗CD30)；7521054(抗CD25)；和7541034(抗CD22)；美国专利申请公开2007/0189962(抗CD22)；Frankel等人，Clin.Cancer Res.,6:326-334(2000)，和Kreitman等人，AAPS Journal,8(3):E532-E551(2006)，每个都通过引用并入本文。
已经提出了其他抗体来靶向特异性肿瘤相关抗原，包括：Cripto、CD30、CD19、CD33、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、CD56(NCAM)、CD22(Siglec2)、CD33(Siglec3)、CD79、CD138、PSCA、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、CD20、CD70、E-选择素、EphB2、黑素转铁蛋白、Muc16和TMEFF2。这些中的任何一个或其抗原结合片段可用于本发明，即，可掺入本文所述的抗体中。
在本发明的一些实施方案中，可能优选的是肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
CEA在本发明的上下文中是有利的，因为它相对缓慢地内化，因此高百分比的抗体将在初始处理后保留在细胞表面上，用于与放射性核素结合。其他低内化靶标/肿瘤相关抗原也可能是优选的。肿瘤相关抗原的其他例子包括CD20或HER2。在更进一步的实施方案中，靶标可以是EGP-1(上皮糖蛋白-1，也称为滋养层-2)、结肠特异性抗原-p(CSAp)或胰腺粘蛋白MUC1。参见例如Goldenberg等人2012(Theranostics 2(5))，其通过引用并入本文。该参考文献还描述了抗体诸如Mu-9与CSAp结合(也参见Sharkey等人Cancer Res.2003；63：354-63)、hPAM4与MUC1结合(也参见Gold等人Cancer Res.2008：68：4819-26)，valtuzumab与CD20结合(也参见Sharkey等人Cancer Res.2008；68:5282-90)和结合EGP-1的hRS7(参见Cubas等人Biochim Biophys Acta 2009；1796:309-14)。这些或其抗原结合部分中的任何一个都可用于本发明，即，可掺入本文所述的抗体中。已针对CEA产生的抗体的一个实例是T84.66(如NCBI Acc No:CAA36980中所示的重链和CAA36979中的轻链，或如WO2016/075278的SEQ ID NO 317和318中所示)及其人源化形式和嵌合形式，诸如如WO2016/075278A1和/或WO2017/055389中所述的T84.66-LCHA。另一个实例是CH1A1a，如WO2012/117002和WO2014/131712中所述的抗CEA抗体，以及CEA hMN-14(也参见US 6 676 924和US 5 874540)。另一种抗CEA抗体是A5B7，如M.J.Banfield等人，Proteins 1997,29(2),161-171中所述。WO 92/01059和WO 2007/071422中公开了源自鼠抗体A5B7的人源化抗体。也参见共同未决申请PCT/EP2020/067582。A5B7的人源化形式的实例是A5H1EL1(G54A)。另一个示例性的针对CEA的抗体是MFE23及其在US7626011和/或共同未决申请PCT/EP2020/067582中描述的人源化形式。抗CEA抗体的另一个实例是28A9。这些或其抗原结合片段中的任何一种可用于形成本发明中的CEA结合部分。
在一些实施方案中，FAP(成纤维细胞活化蛋白α)或GPRC5D(G蛋白偶联受体C类第5组成员D)也可以是优选的。FAP是成像和治疗的既定目标，因为它广泛表达于多种肿瘤类型的微环境中，例如胰腺癌、乳腺癌和肺癌(Lindner,T.,Loktev,A.,Giesel,F.等人Targeting of activated fibroblasts for imaging and therapy.EJNMMIradiopharm.chem.4,16(2019))。在本发明的一个实施方案中，预计使用FAP作为靶抗原的SPLIT PRIT会在活化的癌症相关成纤维细胞上产生212Pb-DOTAM的特异性积累。因此，除了对邻近肿瘤细胞的有限直接肿瘤杀伤作用外，预计发射的α辐射会对表达FAP的恶性肿瘤的免疫抑制产生负面影响。G蛋白偶联受体家族C第5组成员D(GPRC5D)在多发性骨髓瘤浆细胞上过表达(Atamaniuk J,Gleiss A,Porpaczy E,Kainz B,Grunt TW,Raderer M等人，verexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow isassociated with poor prognosis in patients with multiple myeloma.Eur J ClinInvest.2012；42:953-60.)，建立的SC(皮下)体内模型反映了在多发性骨髓瘤患者中发现的表达，例如OPM-2和NCI-H929(Kodama T,Kochi Y,Nakai W,Mizuno H,Baba T,Habu K等人，Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatmentof multiple myeloma.Mol Cancer Ther.(2019)18:1555–64)。在本发明的一个实施方案中，我们因此预计使用GPRC5D作为靶抗原的SPLIT PRIT会产生212Pb-DOTAM的肿瘤特异性积累，接着是辐射诱导的肿瘤细胞死亡。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以特异性结合靶抗原(例如，本文讨论的任何靶抗原)。在一些实施方案中，它们可以以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、≤0.001nM(例如，10-7M或更小，例如10-7至10-13，例如10-8M或更小，例如10-8至10- 13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)结合。
在一个实施方案中，第一抗体和第二抗体可以各自与相同的靶抗原结合，其可以被称为“抗原A”(即，它们对相同的靶抗原具有结合特异性)。它们可以各自对抗原A上的相同表位具有结合特异性。或者，第一抗体可以与抗原A上的第一表位结合，并且第二抗体可以与抗原A上不同的第二表位结合。例如，在一个实施方案中，其中一种抗体可以与CEA的T84.66表位结合，并且另一种可以与CEA的A5B7表位结合。在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体中的一个或两个对于抗原A可以是双互补位的，即，单独的抗体中的每一个可以与抗原A的两个不同表位结合。第一抗体可以包含第一结合位点和第二结合位点，其分别与抗原A的第一表位和第二表位结合，其中第一表位和第二表位彼此不同。或者或另外，第二抗体可包含第一结合位点和第二结合位点，其与抗原A的第一表位和第二表位结合，其中第一表位和第二表位彼此不同。在一些实施方案中，由第一抗体结合的一个或两个表位可以不同于由第二个抗体结合的一个或两个表位。在其他实施方案中，由第一抗体结合的两个表位可以与由第二抗体结合的两个表位相同。
在另一个实施方案中，第一抗体和第二抗体可以分别与不同的靶抗原结合，该靶抗原可以分别称为抗原A和抗原B。
C.效应子部分
根据本发明，第一抗体和第二抗体的缔合形成针对效应子部分的功能结合位点。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的效应子部分选自药物、细胞毒素、显像剂和放射性标记的化合物。
在特定的实施方案中，根据本发明的效应子部分是包含放射性同位素(例如，是放射性标记半抗原)的放射性标记的化合物。
在一些实施方案中，效应子分子可以包含螯合的放射性同位素。
在一些实施方案中，效应子分子的功能结合位点可以与包含螯合剂和放射性同位素的螯合物结合。在其他实施方案中，抗体可以与螯合放射性同位素偶联的部分结合，例如组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、地高辛、生物素或咖啡因
螯合剂可以是例如多齿分子，诸如氨基多羧酸或氨基多硫代羧酸，或其盐或功能变体。螯合剂可以是例如二齿或三齿或四齿的。合适的金属螯合剂的实例包括包含以下的分子：EDTA(乙二胺四乙酸，或盐形式诸如CaNa2EDTA)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、NOTA(2,2',2”-(1,4,7-Triazanonane-1,4,7-三基)三乙酸)、IDA(亚氨基二乙酸)、MIDA((甲基亚氨基)二乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、TETA(2,2',2”,2”'-(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四基)四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨基甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、HEHA(1,4,7,10,13,16-六氮杂环十六烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸，得自得克萨斯州普莱诺市的Macrocyclics,Inc.)，NTA(次氮基三乙酸)EDDHA(乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)、BAL(2,3-二巯基丙醇)、DMSA(2,3-二巯基丁二酸)、DMPS(2,3-二巯基-1-丙磺酸)、D-青霉胺(B-二甲基半胱氨酸)，MAG3(巯基乙酰三甘氨酸)、Hynic(6-肼基吡啶-3-甲酸)、p-异硫氰苄基-去铁胺(例如，用锆标记用于成像)，以及能够螯合金属的盐或功能变体/衍生物。在一些实施方案中，优选螯合剂是DOTA或DOTAM或其能够螯合金属的盐或功能变体/衍生物。因此，螯合剂可以是或可以包含与放射性同位素螯合的DOTA或DOTAM。
效应子分子可以包含或由上述螯合剂的功能变体或衍生物以及放射性核素组成。合适的变体/衍生物具有在一定程度上不同的结构并保留作为螯合剂发挥作用的能力(即保留足够的活性以用于本文所述的一种或多种目的)。功能变体/衍生物还可以包括与一个或多个附加部分或取代基(包括小分子、多肽或碳水化合物)偶联的如上所述的螯合剂。这种连接可以通过组成碳之一、例如在螯合剂的主链部分中发生。合适的取代基可以是例如烃基，诸如烷基、烯基、芳基或炔基；羟基；醇基；卤素原子；硝基；氰基；磺酰基；硫醇基团；胺基；桥氧基；羧基；硫羧基；羰基；酰胺基团；酯基；或包括杂芳基的杂环。取代基可以是例如以下对基团“R1”定义的那些取代基之一。例如，小分子可以是染料(诸如Alexa 647或Alexa488)、生物素或生物素部分，或苯基或苄基部分。多肽可以是例如寡肽，例如两个或三个氨基酸的寡肽。示例性碳水化合物包括葡聚糖、直链或带支链的聚合物或共聚物(例如聚亚烷基、聚(乙烯-赖氨酸)、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸、多糖或寡糖、树枝状聚合物)。衍生物还可以包括螯合剂化合物的多聚体，其中上述化合物通过接头部分连接。衍生物还可以包括上述化合物的功能片段，其保留螯合金属离子的能力。
衍生物的具体实例包括苄基-EDTA和羟乙基-硫脲基-苄基EDTA、DOTA-苯(例如，(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)、DOTA-生物素、和DOTA-TyrLys-DOTA。
在本发明的一些实施方案中，由第一抗体和第二抗体缔合形成的功能结合位点与包含DOTAM和金属例如铅(Pb)的金属螯合物结合。如上所述，“DOTAM”的化学名称为：
1,4,7,10-四(氨基甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷，其是具有下式的化合物：
本发明在某些方面和实施方案中还可以利用结合金属离子的DOTAM的功能变体或衍生物。DOTAM的合适变体/衍生物具有在一定程度上不同于DOTAM结构的结构并保留发挥作用的能力(即保留足够的活性以用于本文所述的一种或多种目的)。在这些方面和实施方案中，DOTAM或DOTAM的功能变体/衍生物可以是WO 2010/099536中公开的活性变体之一。合适的功能变体/衍生物可以是下式的化合物：
或其药用盐；其中
RN是H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4-烷基、C1-7杂芳基和C1-7杂芳基-C1-4-烷基；其中C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被1、2、3或4个独立选择的Rw基团取代；并且其中所述C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4-烷基、C1-7杂芳基和C1-7杂芳基-C1-4-烷基各自任选地被1、2、3或4个独立择的Rx基团取代；
L1独立地为C1-6亚烷基、C1-6亚烯基或C1-6亚炔基，其各自任选地被1、2或3个独立选择的R1基团取代；
L2是C2-4直链亚烷基，其任选被独立选择的R1基团取代；并且其任选地被1、2、3或4个独立地选自C1-4烷基和或C1-4卤代烷基的基团取代；
R1独立地选自D1-D2-D3、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基亚磺酰基、C1-6烷基磺酰基、氨基、C1-6烷基氨基、二-C1-6烷基氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氨基、二-C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基羰基氨基、C1-6烷氧基羰基-(C1-6烷基)氨基、氨基甲酰基、C1-6烷基氨基甲酰基和二-C1-6烷基氨基甲酰基；
每个D1独立地选自C6-10芳基-C1-4烷基、C1-9杂芳基-C1-4烷基、C3-10环烷基-C1-4烷基、C2-9杂环烷基-C1-4烷基、C1-8亚烷基、C1-8亚烯基和C1-8亚炔基；其中所述C1-8亚烷基、C1-8亚烯基和C1-8亚炔基任选地被1、2、3或4个独立选择的R4基团取代；并且其中所述C6-10芳基-C1-4烷基、C1-9杂芳基-C1-4烷基、C3-10环烷基-C1-4烷基、C2-9杂环烷基-C1-4烷基各自任选地被1、2、3或4个独立选择的R5基团取代；
每个D2独立地不存在或是C1-20直链亚烷基，其中所述C1-20直链亚烷基的1至6个不-相邻的亚甲基各自任选地被独立选择的-D4-部分取代，条件是所述C1-20直链亚烷基中的至少一个亚甲基单元是不可选地被-D4-部分取代；其中所述C1-20直链亚烷基任选被一个或多个独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二-C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨基甲酰基、C1-4烷基氨基甲酰基和二-C1-4烷基氨基甲酰基的基团取代；
每个D3独立地选自H、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-4烷基、C2-14杂环烷基、C2-14杂环烷基C1-4烷基、C-6-14芳基、C6-14芳基-C1-4烷基、C1-13杂芳基、C1-13杂芳基-C1-4烷基；其中所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选被1、2、3或4个独立选择的R6基团取代；并且其中所述C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-4烷基、C2-14杂环烷基、C2-14杂环烷基-C1-4烷基、C6-14芳基、C6-14芳基C1-4烷基、C1-13杂芳基、C1-13杂芳基-C1-4烷基各自任选地被1、2、3或4个独立选择R7组的取代；
每个D4独立地选自–O-、-S-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝S)-、-NRbC(＝O)NRc-、-NRbC(＝S)NRc-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)NRa-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)NRa-、-OC(＝S)NRa-、-NRa-、-NRbS(＝O)NRc-和NRbS(＝O)2NRO-；
每个R4和R6独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、氨基、C1-4烷基氨基、二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二-C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨基甲酰基、C1-4烷基氨基甲酰基和二-C1-4烷基氨基甲酰基；
每个R5独立地选自卤素、氰基、氰酸酯、异硫氰酸酯、硝基、羟基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、氨基、C1-4烷基氨基、二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二-C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨基甲酰基、C1-4烷基氨基甲酰基和二-C1-4烷基氨基甲酰基；
每个R7独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基、-ORO、-SRO、-S(＝O)RP、-S(＝O)2RP、-S(＝O)NRsRt、-C(＝O)RP、-C(＝O)ORP、-C(＝O)NRsRt,-OC(＝O)RP、-OC(＝O)NRsRt、-NRsRt、-NRqC(＝O)Rr、-NRqC(＝O)ORr、-NRqC(＝O)NRr、-NRqS(＝O)2Rr和–NRPS(＝O)2NRsRt；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选被1、2、3或4个独立选择的R’基团取代；并且其中所述C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选地被1、2、3或4个独立选择的R”基团取代；
每个Ra、Rb和Rc独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基；其中所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选被1、2、3或4个独立选择的Rw基团取代；并且其中所述C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选地被1、2、3或4个独立选择的Rx基团取代；
每个Ro、Rp、Rq、Rr、Rs和Rt独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基，苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基；其中所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选被1、2、3或4个独立选择的Ry基团取代；并且其中所述C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选地被1、2、3或4个独立选择的Rz基团取代；
每个R'、Rw和Ry各自独立地选自羟基、氰基、硝基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基和二-C1-4烷基氨基；和
每个R”、Rx和Rz各自独立地选自羟基、卤素、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、氨基、1-4烷基氨基和二-C1-4烷基氨基；
条件是不超过任选地取代的部分中每个原子的化合价。
适当地，上式的功能变体/衍生物对本发明的抗体具有与DOTAM相当或更高的亲和力，并且对Pb具有与DOTAM相当或更高的结合强度(如上所述，“亲和力”由解离常数测量)。例如，功能/变体衍生物与本发明的抗体或/Pb的解离常数可以为1.1倍或更少、1.2倍或更少、1.3倍或更少、1.4倍或更少、1.5或更少，或相同抗体/Pb的DOTAM解离常数的2倍或更少。
每个RN可以是H、C1-6烷基或C1-6卤代烷基；优选H、C1-4烷基或C1-4卤代烷基。最优选地，每个RN是H。
对于DOTAM变体，优选1、2、3个或最优选每个L2都是C2亚烷基。有利地，DOTAM的C2亚烷基变体可以对Pb具有特别高的亲和力。L2的任选取代基可以是R1、C1-4烷基或C1-4卤代烷基。合适地，L2的任选取代基可以是C1-4烷基或C1-4卤代烷基。
任选地，每个L2可以是未取代的C2亚烷基-CH2CH2-。
每个L1优选为C1-4亚烷基，更优选C1亚烷基诸如-CH2-。
DOTAM的功能变体/衍生物可以是下式的化合物：
其中每个Z独立地为如上定义的R1；p、q、r和s为0、1或2；并且p+q+r+s为1或更大。优选地，p、q、r和s为0或1和/或p+q+r+s为1。例如，该化合物可具有p+q+r+s＝1，其中Z为p-SCN-苄基部分，这种化合物可从Macrocyclics,Inc.(普莱诺，德克萨斯州)商购获得。
可用于本发明的放射性核素可以包括金属的放射性同位素，诸如铅(Pb)、镥(Lu)或钇(Y)。
在成像应用中特别有用的放射性核素可以是作为伽马发射体的放射性核素。例如，它们可以选自203Pb或205Bi。
在治疗应用中特别有用的放射性核素是α或β发射体的放射性核素。例如，它们可以选自212Pb、212Bi、213Bi、90Y、177Lu、225Ac、211At、227Th、223Ra。
在一些实施方案中，可以优选DOTAM(或其盐或功能变体)与Pb或Bi诸如上面列出的Pb或Bi放射性同位素的其中一种螯合。在其他实施方案中，可以优选DOTA(或其盐或功能变体)与Lu或Y诸如上面列出的Lu或Y放射性同位素的其中一种螯合。
在一些实施方案中，方法和用途可以包含治疗和成像的组合方法，其利用放射性同位素的混合物，例如适合于治疗的放射性同位素和适合于成像的放射性同位素。例如，这些可能是由相同螯合剂螯合的相同金属的不同放射性同位素。在一个实施方案中，该方法可以包含以混合物形式施用203Pb-DOTAM和212Pb-DOTAM。在另一个实施方案中，该方法可以包含使用伽马发射体(诸如203Pb或205Bi)的第一轮剂量测定，接着使用α或β发射体(诸如212Pb、212Bi、213Bi、90Y、177Lu、225Ac、211At、227Th或223Ra)进行一轮或多轮治疗。此类方法在下文进一步描述。
在一些实施方案中，由第一抗体和第二抗体缔合形成的功能结合位点可以与Pb-DOTAM螯合物结合。
在一些实施方案中，由第一抗体和第二抗体缔合形成的功能结合位点可以与放射性标记的化合物特异性结合。在一些实施方案中，它可以与放射性标记的化合物结合，诸如Pb-DOTAM螯合物，对Pb-DOTAM和/或靶标的解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-7M或更小，例如从10-7到10-13、10-8M或更小，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)。在一些实施方案中，可以优选，它以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小的结合亲和力的KD值进行结合。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的KD结合金属螯合物。
D.DOTA的示例性抗原结合位点
在本发明的一个特定实施方案中，第一抗体和第二抗体缔合以形成DOTA(或其功能衍生物或变体)的功能结合位点，例如与Lu或Y(例如177Lu或90Y)螯合的DOTA。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记的化合物。
C825是已知的scFv，对与诸如177Lu和90Y的放射性金属络合的DOTA-Bn(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)具有高亲和力(例如参见Cheal等人2018，Theranostics 2018和WO2010099536，通过引用并入本文)。本文提供了C825的CDR序列以及VL和VH序列。在一个实施方案中，形成放射性标记的化合物的抗原结合位点部分的重链可变区可以包含至少一个、两个或所有三个选自以下的CDR：(a)含有35的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有36的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有37的氨基酸序列的CDR-H3。在一个替代实施方案中，CDR-H1可具有序列GFSLTDYGVH(SEQ ID NO.:148)。形成放射性标记的化合物的结合位点部分的轻链可变区可以包含至少一个、两个或所有三个选自以下的CDR：(d)含有38的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有39的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有40的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，形成放射性标记的化合物(在第一抗体上)的功能抗原结合位点的部分的重链可变结构域包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或其包含具有与SEQ IDNO:41至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的结合位点保留了与Lu或Y复合的DOTA结合的能力，优选地以本文所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:41中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:41中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列或序列GFSLTDYGVH(SEQ IDNO:148)的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，形成放射性标记的化合物(在第二抗体上)的功能抗原结合位点的部分的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其包含具有与SEQ ID NO:42至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的结合位点保留了与Lu或Y复合的DOTA结合的能力，优选地以本文所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:42中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:42中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L3。
与重链可变区和轻链可变区有关的实施方案被明确地组合考虑。因此，功能抗原结合位点可以分别由第一抗体和第二抗体上的如上定义的重链可变区和如上定义的轻链可变区形成。
在任何上述实施方案中，形成DOTA复合物结合位点的轻链和重链可变区可以是人源化的。在一个实施方案中，轻链和重链可变区包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，重链可变结构域可以延伸一个或多个C末端残基，诸如一个或多个C末端丙氨酸残基，或来自CH1结构域N末端的一个或多个残基，如下文进一步讨论的。
E.DOTAM的示例性抗原结合位点
在本发明的另一个具体的实施方案中，第一抗体和第二抗体缔合以形成Pb-DOTAM螯合物(Pb-DOTAM)的功能抗原结合位点。示例性抗原结合位点描述于WO 2019/201959，其通过引用其整体并入本文。
在某些实施方案中，与Pb-DOTAM结合的功能抗原结合位点可具有以下一种或多种特性：
·与Pb-DOTAM以及与Bi-DOTAM特异性结合；
·与其他螯合金属(诸如Cu-DOTAM)相比，对Pb-DOTAM(和任选地Bi-DOTAM)具有选择性；
·以非常高的亲和力与Pb-DOTAM结合；
·与WO2019/201959中描述的抗体(例如，PRIT-0213或PRIT-0214)在Pb-DOTAM上的相同表位结合和/或具有与所述抗体相同的接触残基。
Pb的放射性同位素可用于诊断和治疗方法。可用于本发明的特定铅放射性同位素包括212Pb和203Pb。
由于结合了短路径长度和高线性能量转移，作为α粒子发射体的放射性核素具有比β发射体更特异性的肿瘤细胞杀伤的潜力，且对周围组织的损伤更小。212Bi是α粒子发射体，但其较短的半衰期阻碍了其直接使用。212Pb是212Bi的母体放射性核素，并且可作为212Bi的体内发生器，从而有效克服212Bi的短半衰期(Yong和Brechbiel,Dalton Trans.2001June21；40(23)6068-6076)。
203Pb可用作成像同位素。因此，与203Pb-DOTAM结合的抗体可用于放射免疫成像(RII)。
通常，放射性金属以螯合形式使用。在本发明的某些方面，DOTAM用作螯合剂。DOTAM是稳定的Pb(II)螯合剂(Yong和Brechbiel，Dalton Trans.2001年6月21日；40(23)6068-6076；Chappell等人Nuclear Medicine and Biology，第27卷，第93-100页，2000年)。因此，DOTAM尤其适用于与上述铅的同位素(诸如212Pb和203Pb)结合使用。
在一些实施方案中，可以优选抗体以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小的结合亲和力的Kd值结合Pb-DOTAM。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记的化合物。
在某些实施方案中，抗体另外与被DOTAM螯合的Bi结合。在一些实施方案中，可以优选抗体以1nM、500pM、200pM、100pM、50pM、10pM或更小，例如，9pM、8pM、7pM、6pM、5pM或更小的结合亲和力的Kd值结合Bi-DOTAM(即，包含与铋络合的DOTAM的螯合物，本文也称为“Bi-DOTAM螯合物”)。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合金属螯合物。
在一些实施方案中，抗体可以以相似的亲和力与Bi-DOTAM和Pb-DOTAM结合。例如，可以优选Bi-DOTAM/Pb-DOTAM的亲和力比，例如Kd值比，在0.1-10的范围内，例如1-10。
在一个实施方案中，形成Pb-DOTAM的抗原结合位点的部分的重链可变区可以包含至少一个、两个或所有三个选自以下的CDR：(a)含有GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3。形成Pb-DOTAM结合位点的部分的轻链可变区可以包含至少一个、两个或所有三个选自以下的CDR：(d)CDR-L1，其包含QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含QASKLAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可包含CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3中的一种或多种，或CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3中的一种或多种，其具有分别与SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列相比的取代，例如1、2或3个取代。
在一些实施方案中，抗体可以共享与本文所述相同的接触残基：例如，这些残基可以是不变的。这些残基可能包括以下内容：
a)重链CDR2中:Phe50、Asp56和/或Tyr58，以及任选地还有Gly52和/或Arg 54；
b)重链CDR3中:Glu95、Arg96、Asp97、Pro98、Tyr99、Ala100C和/或Tyr100D，并且还有任选地Pro100E；
c)轻链CDR1中:Tyr28和/或Asp32；
d)轻链CDR3中:Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和/或Tyr96；
e)轻链CDR2中：任选地Gln50；
全部根据Kabat编号。
例如，在一些实施方案中，CDR-H2可以包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ IDNO:2)，或其在SEQ ID NO:2中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，并且任选地也不包括Gly52和/或Arg 54，均根据Kabat编号。
在一些实施方案中，CDR-H2可以在一个或多个位置被取代，如下所示。在此和随后的替换表中，替换基于种系残基(下划线)或基于理论上空间匹配并且也出现在该位点的结晶库中的氨基酸。在一些实施方案中，上述残基可以是固定的，并且其他残基可以根据下表进行替换：在其他实施方案中，任何残基的替换可以根据下表进行。
WolfGuy Kabat AA 取代
251 50 F Y,H
252 51 I
253 52 G
254 53 S A,G,T,I,N
288 54 R A,D,G,N,S,T,F,Y
289 55 G D,S,Y,T,A,N,R,V
290 56 D
291 57 T K,I,A,P,S
292 58 Y F,W,H
293 59 Y N,F,H,L,S
294 60 A G,N,S,T
295 61 S A,G,N,Q,T
296 62 W K,P,S,A,T,D,N,R,Q
297 63 A F,L,V,M,I
298 64 K N,Q,R,E
299 65 G S,T,D,N,A
任选地，CDR-H3可以包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)、或其在SEQID NO:3中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，并且任选地也不包括Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E和/或任选地也不包括Tyr99。例如，在一些实施方案中，取代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98、Tyr99Ala100C和Tyr100D。
在某些实施方案中，CDR-H3可以在一个或多个位置被取代，如下所示。在一些实施方案中，上述残基可以是固定的，并且其他残基可以根据下表进行替换：在其他实施方案中，任何残基的替换可以根据下表进行。
WolfGuy Kabat AA 取代
351 95 E
352 96 R K,E
353 97 D
354 98 P
355 99 Y F,G,S,T,D
356 100 G
392 100A G
393 100B G
394 100C A S,T
395 100D Y F
396 100E P
397 100F P
398 101 H A,T,V,D
399 102 L Y,V,I,H,F
任选地，CDR-L1可包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或其在SEQ IDNO:4中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Tyr28和/或Asp32(Kabat编号)。
在某些实施方案中，CDR-L1可以在一个或多个位置被取代，如下所示。同样，在一些实施方案中，如上所述的残基可以是固定的，并且可以根据下表替换其他残基：在其他实施方案中，可以根据下表进行任何残基的替换。
任选地，CDR-L3可包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或其在SEQ IDNO:6中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和/或Tyr96(Kabat)。
在某些实施方案中，CDR-L3可以在如下所示的以下位置被取代。(由于大多数残基都暴露在溶剂中并且没有抗原接触，因此可以进行许多替换)。同样，在一些实施方案中，如上所述的残基可以是固定的，并且可以根据下表替换其他残基：在其他实施方案中，可以根据下表进行任何残基的替换。
抗体可进一步包含CDR-H1或CDR-L2，任选地分别具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列，或其相对于其具有至少1、2或3个取代(任选地保守取代)的变体。
因此，形成Pb-DOTAM的抗原结合位点的部分的重链可变结构域可以至少包含：
a)重链CDR2，其包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)、或其在SEQ IDNO:2中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，并且任选地也不包括Gly52和/或Arg54；
b)重链CDR3，其包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)、或其在SEQ IDNO:3中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包含Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，并且任选地也不包含Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E和/或任选地也不包含Tyr99。
在一些实施方案中，重链可变结构域另外包括重链CDR1，其任选地为：
c)重链CDR1，其包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)或其在SEQ ID NO:1中具有多至1、2或3个取代的变体。
在另一个实施方案中，形成Pb-DOTAM抗原结合位点的部分的轻链可变结构域至少包含：
d)轻链CDR1，其包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或其在SEQ ID NO:4中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Tyr28和Asp32；
e)轻链CDR3，其包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或其在SEQ ID NO:6中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包含Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和Tyr96。
在一些实施方案中，轻链可变结构域另外包含轻链CDR2，其任选地为：
f)轻链CDR2，其包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO:5)或其在SEQ ID NO:5中具有至少1、2或3个取代的变体，任选地该取代不包括Gln50。
在本发明的任何实施方案中，包括包含上述CDR的序列(例如，可变结构域)的变体，蛋白质可以在一个或多个上述CDR残基上是不变的。
任选地，形成Pb-DOTAM(在第一抗体上)的功能抗原结合位点的一部分的重链可变结构域包含选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO 9组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的结合位点保留了与Pb-DOTAM结合的能力，优选以本文所述的亲和力结合。VH序列可以保留如上所述的不变残基。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7或SEQ ID NO 9中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:9的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，形成Pb-DOTAM(在第二抗体上)的功能抗原结合位点的部分的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。在某些方面，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗Pb-DOTAM结合位点保留了与Pb-DOTAM结合的能力，优选地以本文所述的亲和力结合。VL序列可以保留如上所述的不变残基。在某些实施例中，在SEQ ID NO:8中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗Pb-DOTAM抗体包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
与重链可变区和轻链可变区有关的实施方案被明确地组合考虑。因此，Pb-DOTAM的功能抗原结合位点可以分别由第一抗体和第二抗体上的如上定义的重链可变区和如上定义的轻链可变区形成。
任选地，对于Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以由重链可变结构域和轻链可变结构域形成，所述重链可变结构域包含如上定义的选自由SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9组成的组的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变结构域包含如上定义的SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体。例如，对Pb-DOTAM螯合物特异的抗原结合位点可以包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体，包括那些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，它可以包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体，包括这些序列的翻译后修饰。
在任何上述实施方案中，形成抗Pb-DOTAM结合位点的轻链和重链可变区可以是人源化的。在一个实施方案中，轻链和重链可变区包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，轻链和/或重链可变区包含如任何上述实施方案中的CDR，并且还包含源自vk 1 39和/或vh 2 26的框架区。对于vk 1 39，在一些实施方案中可能没有回复突变。对于vh 2 26，种系Ala49残基可以回复突变为Gly49。
F.针对CEA的示例性抗原结合位点
在本发明的另一个特定实施方案中，其可以与上述实施方案组合，由第一抗体和/或第二抗体结合的靶抗原可以是CEA(癌胚抗原)。已针对CEA产生的抗体包括T84.66及其人源化和嵌合形式，诸如WO2016/075278A1和/或WO2017/055389中描述的T84.66-LCHA、CH1A1a、如WO2012/117002和WO2014/131712中所述的抗CEA抗体以及CEA hMN-14或labetuzimab(例如，如US 6 676 924和US 5 874 540中所述的)。针对CEA的另一种示例性抗体是A5B7(例如，如M.J.Banfield等，Proteins 1997,29(2),161-171中所述)，或如WO92/01059和WO 2007/071422中所述的源自鼠A5B7的人源化抗体。也参见共同未决申请PCT/EP2020/067582。A5B7的人源化形式的实例是A5H1EL1(G54A)。针对CEA的其他示例性抗体是MFE23及其在US 7 626 011和/或共同未决申请PCT/EP2020/067582中描述的人源化形式。抗CEA抗体的其他实例是28A9。任何这些或其抗原结合片段可用于形成本发明中的CEA结合部分。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以以1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小、或100pM或更小的Kd值单价结合。
在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体可以与CEA的CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位、T84.66表位或28A9表位结合。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体中的至少一个与不存在于可溶性CEA(sCEA)上的CEA表位结合。可溶性CEA是CEA分子的部分，其被GPI磷脂酶裂解并释放到血液中。在可溶性CEA上未发现的表位的实例是CH1A1A表位。任选地，第一抗体和/或第二抗体中的一个与不存在于可溶性CEA上的表位结合，而另一个与存在于可溶性CEA上的表位结合。
CH1A1a及其亲本鼠抗体PR1A3的表位描述于WO2012/117002A1和Durbin H.等人，Proc.Natl.Scad.Sci.USA,91:4313-4317,1994。与CH1A1a表位结合的抗体与CEA分子的B3结构域和GPI锚点内的构象表位结合。在一个方面，该抗体与具有本文的SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO 26的VL的CH1A1a抗体所结合的表位相同的表位结合。A5B7表位在共同未决申请PCT/EP2020/067582中有所描述。与A5B7表位结合的抗体与CEA的A2结构域结合，即，与包含SEQ ID NO:141的氨基酸的结构域结合：
PKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILN(SEQ ID NO:141)。
在一个方面，该抗体与具有本文的SEQ ID NO:49的VH和SEQ ID NO:50的VL的A5B7抗体所结合的表位相同的表位结合。
在一个方面，抗体与WO2016/075278中描述的T84.66所结合的表位相同的表位结合。该抗体可以与具有本文的SEQ ID NO:17的VH和SEQ ID NO:18的VL的抗体所结合的表位相同的表位结合。
MFE23表位在共同未决申请PCT/EP2020/067582中有所描述。与MFE23表位结合的抗体与CEA的A1结构域结合，即，与包含SEQ ID NO:142的氨基酸的结构域结合：
PKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPR
LQLSNGNRTLTLFNVTRNDTAS YKCETQNPVSARRSDSVILN(SEQID NO:142)。
在一个方面，该抗体可以与具有本文的SEQ ID NO:127的VH结构域和SEQ ID NO:128的VL结构域的抗体所结合的表位相同的表位结合。
在一些实施方案中，第一和/或第二抗体可以与如本文提供的抗体相同的CEA表位结合，例如P1AD8749、P1AD8592、P1AE4956、P1AE4957、P1AF0709、P1AF0298、P1AF0710或P1AF0711。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体彼此结合相同的CEA表位。因此，例如，第一抗体和第二抗体可以两者都与CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位、T84.66表位或28A9表位结合。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体两者都可具有来自CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR和/或VH/VL结构域)；或者，第一抗体和第二抗体两者都可具有来自A5B7或其人源化形式的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自T84.66或其人源化形式的CEA结合序列；或者第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自MFE23或其人源化形式的CEA结合序列；或者第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列。本文公开了示例性序列。
在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体与CEA结合的不同表位。因此，例如，i)一种抗体可以结合CH1A1A表位，并且另一种抗体可以结合A5B7表位、T84.66表位、MFE23表位或28A9表位；ii)一种抗体可以结合A5B7表位，并且另一种抗体可以结合CH1A1A表位、T84.66表位、MFE23表位或28A9表位；iii)一种抗体可以结合MFE23表位，另一种可以结合CH1A1A表位、A5B7表位、T84.66表位或28A9表位；iv)一种抗体可以结合T84.66表位，另一种可以结合CH1A1A表位、A5B7表位、MFE23表位或28A9表位；或v)一种抗体可以结合28A9表位，并且另一种抗体可以结合CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位或T84.66表位。
在一些实施方案中，i)一种抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)，并且另一种抗体可具有来自A5B7或其人源化形式、来自T84.66或其人源化形式，来自MFE23或其人源化形式、或来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列；ii)一种抗体可具有来自A5B7或其人源化形式的CEA结合序列，并且另一种抗体可具有来自CH1A1A、来自T84.66或其人源化形式、来自MFE23或其人源化形式、或来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列；iii)一种抗体可具有来自MFE23或其人源化形式的CEA结合序列，并且另一种抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化形式、来自T84.66或其人源化形式、或来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列；iv)一种抗体可具有来自T84.66或其人源化形式的CEA结合序列，并且另一种抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化形式、来自MFE23或其人源化形式、或来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列；v)一种抗体可具有来自28A9或其人源化形式的CEA结合序列，并且另一种抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化形式、来自T84.66或其人源化形式、或来自MFE23或其人源化形式的CEA结合序列。
在一个特定实施方案中，一种抗体可以结合CH1A1A表位，并且另一种抗体可以结合A5B7表位。第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列，第二抗体可具有来自A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体可具有来自抗体A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列，并且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。
在另一个特定实施方案中，一种抗体可以结合CH1A1A表位，并且另一种抗体可以结合T84.66表位。第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列，第二抗体可具有来自T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列，并且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。在一些实施方案中，第一抗体可以结合T84.66表位和/或具有如下文(i)中所述的抗原结合位点，并且第二抗体可以结合CH1A1A表位和/或具有如下文(ii)中所述的抗原结合位点。
下面公开了示例性CEA结合序列i)-v)。这些提供了来自i)T84.66、ii)CH1A1A、iii)A5B7、iv)28A9和v)MFE23(或来自其人源化形式)的CEA结合序列的实例。
i).在一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2、(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3、(d)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2、(c)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；所述VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2、和(c)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，与CEA结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:17中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:17的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:18中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:18的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
ii).在其他特定实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2、(c)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；所述VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2、和(c)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，与CEA结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:25中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:25的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:26中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:26的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
iii)在进一步的特定实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2、(c)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；所述VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2、和(c)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
在另一个方面，与CEA结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:49中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:49的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列或序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2以及(c)含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:50中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:50的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
iv)在进一步的特定实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2、(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；所述VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2、和(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，与CEA结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:65中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与CEA结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:65的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:66中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:66的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
v).在进一步的特定实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ IDNO:119的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与CEA结合的抗原结合位点可以包含：
VH CDR序列(a)含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR-H3；和/或
VL CDR序列(a)含有SEQ ID NO:120、121或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含有SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个实施方案中，针对CEA的抗原结合位点包含重链可变区(VH)，其包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列，或(更优选地)选自SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:134的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:128或(更优选地)选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个具体方面，能够与CEA结合的抗原结合结构域包含：
(a)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(b)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(c)含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(d)含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(e)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(f)含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(g)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与上述a)至g)中提及的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施方案中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含与上述a)至g)中提及的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与CEA结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施方案中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。
在另一个实施方案中，与CEA结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。
G.针对GPRC5D或FAP的示例性抗原结合位点
在本发明的另一个特定实施方案中，其可以与上述实施方案组合(例如，针对DOTA或DOTAM的结合位点)，被第一抗体和第二抗体结合的靶抗原可以是GPRC5D或FAP。
任选地，与GPRC5D或FAP结合的抗原结合位点可以以1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小、或100pM或更小的Kd值单价结合。
示例性GPRC5D结合序列如下所述。
在一个实施方案中，与GPRC5D结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列CDR-L3。
任选地，与GPRC5D结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，与GPRC5D结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含有SEQID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；(c)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，该VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3；该VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的CDR-L2和(c)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗GPRC5D抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与GPRC5D结合的能力，优选以上文所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:73中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:73中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与GPRC5D结合的能力，优选以上文所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:74中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对GPRC5D的抗原结合位点包含SEQ ID NO:74的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与GPRC5D结合的抗原结合位点包含如上述提供的任一实施方案中的VH和如上述提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQID NO:73和SEQ ID NO:74中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
下面描述了示例性的FAP结合序列。
在一个实施方案中，与FAP结合的抗原结合位点可以包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与FAP结合的抗原结合位点可以包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:76的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，与FAP结合的抗原结合位点包含选自以下各项的至少一个、至少两个或所有三个VL CDR序列：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2、(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，与FAP结合的抗原结合位点包含(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或所有三个VH CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)含有选自SEQID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；所述VL结构域包含选自以下项的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(i)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2、和(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，与FAP结合的抗原结合位点包含：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；(d)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何上述实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗FAP抗原结合位点包含任一上述实施方案中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个实施方案中，与FAP结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与FAP结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:81中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，与FAP结合的抗原结合位点包含SEQ ID NO:81的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含一、二或三个选自以下的CDR：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1，(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一个实施方案中，与FAP结合的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗原结合位点保留了与FAP结合的能力，优选以如上所述的亲和力结合。在某些实施例中，在SEQ ID NO:82中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，针对FAP的抗原结合位点包含SEQ ID NO:82的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下项的CDR：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1、(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2以及(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施方案中，与FAP结合的抗原结合位点包含如上提供的任一实施方案中的VH和如上提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
H.示例性抗体
有关靶抗原结合(例如，CEA、GPRC5D或FAP)的方面和实施方案以及有关效应子部分结合(例如，DOTA、DOTAM)的方面和实施方案被明确地组合考虑。上述任何示例性靶抗原结合位点可与上述任何效应子部分结合位点组合使用。
在一些具体的实施方案中，结合了有关靶抗原结合(例如，CEA、GPRC5D或FAP)的方面和实施方案以及有关DOTAM结合被组合的方面和实施方案。在一些实施方案中，可以优选，靶抗原是CEA。
在一些实施方案中，第一抗体可以包含：
a)Fab片段，其中Fab片段与在选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶细胞的表面上表达的抗原结合；
b)包含针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成的多肽，其中重链可变结构域包含SEQ ID NO 1至3的重链CDR，并且/或者其中重链可变结构域与SEQ ID NO 7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和
c)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(b)的多肽通过其N末端与(a)的Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(c)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第一抗体不包含针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VL结构域。
第二抗体可以包含：
d)Fab片段，其中Fab片段与在选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶细胞的表面上表达的抗原结合；
e)包含针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成的多肽，其中轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4-6的CDR，并且/或者其中轻链可变结构域与SEQ ID NO 8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；和
f)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(e)的多肽通过其N末端与(d)的Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(f)的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；
并且其中第二抗体不包含针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VH结构域。
第一抗体的所述VH结构域和第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对Pb-DOTAM的功能抗原结合位点。
在一个特定的实施方案中，第一抗体和/或第二抗体(例如，第一抗体和第二抗体中的每个)可以包含与CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)结合的另外的Fab片段。可以优选，第一抗体中的靶抗原结合Fab中的每个彼此与相同的靶抗原(例如，在一些实施方案中是CEA)结合，并且第二抗体中的靶抗原结合Fab中的每个彼此与相同的靶抗原(例如，在一些实施方案中是CEA)结合，其可以进一步与由第一抗体结合的靶抗原相同。可以进一步优选，第一抗体中的靶抗原结合Fab中的每个与靶抗原的相同表位(例如CEA)结合(即，第一抗体对于靶抗原是单特异性的)，并且第二抗体中的靶抗原结合Fab中的每个与靶抗原的相同表位(例如CEA)结合(即，第二抗体对于靶抗原是单特异性的)。由两种抗体结合的表位可以相同或不同。
在一些实施方案中，第一抗体可以包含以下肽：
i)第一重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VH结构域，其中重链可变结构域包含SEQ ID NO 1至3的重链CDR，并且/或者其中重链可变结构域与SEQ ID NO 7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(i)的Fab重链配对以形成针对选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原的结合位点；
iii)第二重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；以及iv)另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(iii)的Fab重链配对以形成针对选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原的结合位点。
任选地，(i)中的Fab重链与(iii)中的Fab重链具有相同的序列，并且(ii)和(iv)中的Fab轻链彼此具有相同的序列。
第二抗体可以包含以下肽：
v)第一重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VL结构域，其中轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4-6的CDR，并且/或者其中轻链可变结构域与SEQ ID NO 8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
vi)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(v)的Fab重链配对以形成针对选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原的结合位点；
vii)第二重链多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；以及
viii)另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)，其与(vii)的Fab重链配对以形成针对选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原的结合位点。
任选地，(v)中的Fab重链与(vii)中的Fab重链具有相同的序列，并且(vi)和(viii)中的Fab轻链彼此具有相同的序列。任选地，这些也与针对第一抗体的相同。
在特定的实施方案中，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)和(iv)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 22至24的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，可以优选，(ii)和(iv)中的两条轻链彼此相同。
(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:19-21的CDR和/或(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(i)和(iii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)和(iv)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 46至48的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，可以优选，(ii)和(iv)中的两条Fab轻链多肽彼此相同。
在一些实施方案中，(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:43-45的CDR和/或(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(i)和(iii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)和(iv)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 14至16的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:11-13的CDR和/或(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(i)和(iii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)和(iv)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 62至64的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:59-61的CDR和/或(i)和(iii)中的两条Fab重链可以包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(i)和(iii)中的两条Fab重链彼此相同。
在一些实施方案中，第二抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(vi)和(viii)中的两条Fab轻链可以包含SEQ ID NO 22至24的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(v)和(vii)中的两条Fab重链包含SEQ ID NO:19-21的CDR和/或(v)和(vii)中的两条Fab重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(v)和(vii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(vi)和(viii)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 46至48的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO 58具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(v)和(vii)中的两条Fab重链包含SEQ ID NO:43-45的CDR和/或(v)和(vii)中的两条Fab重链包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(v)和(vii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(vi)和(viii)中的两条Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 14至16的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(v)和(vii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:11-13的CDR和/或(v)和(vii)中的两条Fab重链包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(v)和(vii)中的两条Fab重链彼此相同。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(vi)和(vii)中的两条Fab轻链可以包含SEQ ID NO 62至64的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它们可以与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，(v)和(vii)中的两条Fab重链可以包含SEQ ID NO:59-61的CDR和/或(v)和(vii)中的两条Fab重链包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。在一些实施方案中，可以优选，(v)和(vii)中的两条Fab重链彼此相同。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体结合相同的CEA表位。因此，例如，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以都具有来自A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自MFE23(包括其人源化形式)的CEA结合序列。在一些实施方案中，可以优选，(vi)和(viii)中的两条轻链多肽与第一抗体的(ii)和(iv)中的轻链具有相同的序列，例如，全部所述轻链具有相同的序列。
在一些实施方案中，(ii)和(iv)中的第一抗体的两条Fab轻链多肽均可以包含与SEQ ID NO 26具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变结构域；(i)和(iii)中第一抗体的两条Fab重链均可以包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变结构域；(vi)和(viii)中的第二抗体的两条Fab轻链多肽均可以包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域；并且(v)和(vii)中的第二抗体的两条Fab重链均可以包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变结构域。
在一个特定的实施方案中，第一抗体包含：
-SEQ ID NO:146的第一重链多肽；
-SEQ ID NO:147的第二重链多肽；
-SEQ ID NO:143的第一轻链多肽和第二轻链多肽；和/或
第二抗体包含
--SEQ ID NO:145的第一重链多肽；
-SEQ ID NO:147的第二重链多肽；
-SEQ ID NO:143的第一轻链多肽和第二轻链多肽。
在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体与CEA的不同表位结合，如上所述。因此，例如，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列，并且第二抗体可具有来自A5B7的CEA结合序列；或者，第一抗体可具有来自抗体A5B7的CEA结合序列并且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。
在其他实施方案中，抗体是单臂抗体。例如，在一些实施方案中，第一抗体包含以下多肽：
i)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VH结构域，其中重链可变结构域包含SEQ ID NO 1至3的重链CDR，并且/或者其中重链可变结构域与SEQ ID NO 7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
iii)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(i)的Fab重链和(ii)的Fab轻链形成能够与选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原结合的Fab片段。
第二抗体可以包含以下多肽：
iv)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对Pb-DOTAM的抗原结合位点的VL结构域，其中轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4-6的CDR，并且/或者其中轻链可变结构域与SEQ ID NO 8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
v)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
vi)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(iv)的Fab重链和(v)的Fab轻链形成能够与选自CEA、GPRC5D或FAP(任选地CEA)的靶抗原结合的Fab片段。
在这些单臂抗体的一些实施方案中，(i)和(iv)的Fab重链可以彼此具有相同的序列；并且(ii)和(v)的Fab轻链多肽可以彼此具有相同的序列。
在特定的实施方案中，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 22至24的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
(i)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:19-21的CDR和/或(i)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 46至48的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(i)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:43-45的CDR和/或(i)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 14至16的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(i)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:11-13的CDR和/或(i)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(ii)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 62至64的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(i)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:59-61的CDR和/或(i)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，第二抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(v)中的Fab轻链可以包含SEQ ID NO 22至24的CDR和/或可以包含与SEQ IDNO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(iv)中的Fab重链包含SEQ ID NO:19-21的CDR和/或(iv)中的Fab重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(v)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 46至48的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO 58具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(iv)中的Fab重链包含SEQ ID NO:43-45的CDR和/或(iv)中的Fab重链包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(v)中的Fab轻链多肽可以包含SEQ ID NO 14至16的CDR和/或可以包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(iv)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:11-13的CDR和/或(iv)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在另一个特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列(即，CDR或VH/VL结构域)。
例如，(v)中的Fab轻链可以包含SEQ ID NO 62至64的CDR和/或可以包含与SEQ IDNO 66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。在一些实施方案中，它可以与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，(iv)中的Fab重链可以包含SEQ ID NO:59-61的CDR和/或(iv)中的Fab重链可以包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体结合相同的CEA表位。因此，例如，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以都具有来自A5B7(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自T84.66(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自28A9(包括其人源化形式)的CEA结合序列；或者，第一抗体和第二抗体可以两者都具有来自MFE23(包括其人源化形式)的CEA结合序列。在一些实施方案中，可以优选(ii)中的轻链多肽具有与(v)中的轻链相同的序列。
在特定的实施方案中，(ii)和(v)中的Fab轻链均包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域；并且(i)和(iv)中的Fab重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可变结构域。
在一个特定的实施方案中，
第一抗体包含：
-SEQ ID NO:146的第一重链；
-SEQ ID NO:144的第二重链；
-SEQ ID NO:143的轻链；和/或
第二抗体包含：
-SEQ ID NO:145的第一重链；
-SEQ ID NO:144的第二重链；
-SEQ ID NO:143的轻链。
在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体与CEA的不同表位结合，如上所述。因此，例如，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列，并且第二抗体可具有来自A5B7的CEA结合序列；或者，第一抗体可具有来自抗体A5B7的CEA结合序列并且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。
I.抗体变体
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
取代、插入和删除性变体
在某些实施方案中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目的位点包括HVR(CDR)和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表1中的“示例性取代”标题下，并且在下文中关于氨基酸侧链类别予以进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或降低的或改善的ADCC或CDC)筛选。
表1
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可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简要地说，对一个或多个CDR残基进行突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴别。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些方面，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的某些变体VH和VL序列中，每个CDR要么保持不变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或附加地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT(抗体定向酶前药治疗))或多肽融合。
糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
一方面，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
可以优选抗体被修饰以降低糖基化程度。在一些实施方案中，抗体可以是无糖基化或去糖基化的。抗体可以包括在N297处的取代，例如N297D/A。
Fc区变体
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有降低的Fc效应子功能，例如降低的或消除的CDC、ADCC和/或FcγR结合的抗体变体。在某些方面，本发明考虑具有一些但不是全部Fc效应子功能的抗体变体，这使其成为其中体内抗体的半衰期很重要而某些Fc效应子功能(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))不必要或有害的应用的理想候选者。
可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO2013/120929 Al)。
具有降低的Fc效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(例如P329G)中一个或多个的取代的那些(美国专利号6737056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327处的两条或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7332581)。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的234位和235位的取代(残基的EU编号)。一方面，取代是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体进一步包含在源自人IgG1 Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。在一个方面，在源自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见例如WO2012/130831)。在另一个方面，在源自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。替代性取代包括L234F和/或L235E，任选地与D265A和/或P329G和/或P331S组合。
在其他实施方案中，可以使用Fc效应子功能降低的IgG亚型，诸如IgG4或IgG2。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，导致改变的(即，改善的或减少的，优选减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6194551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的253、和/或310和/或435位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置253、310和435位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是I253A、H310A和H435A。参见例如Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的310、和/或433和/或436位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置310、433和436位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是H310A、H433A和Y436A。(参见例如WO 2014/177460 Al)。例如，在一些实施方案中，可以使用正常的FcRn结合。
有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
如本文报告的全长抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。重链的C末端可以是结束PG的缩短的C末端。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。这仍然明确地包含在本文所用的术语“全长抗体”或“全长重链”中。
抗体衍生物
在某些方面，本文提供的抗体可被进一步修饰以包含本领域已知的并且容易获得的附加非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
J.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在美国专利号4816567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的一组抗体的分离的核酸或一组分离的核酸。
例如，一组核酸可以包含以下编码第一抗体的核酸：
i)编码第一重链多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)编码Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸，其与(i)的Fab重链配
对以形成针对靶抗原的结合位点；
iii)编码第二重链多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
iv)编码另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸，其与(iii)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点。
根据本发明的一组核酸可以另外或替代地包含以下编码第二抗体的核酸：
v)编码第一重链多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
vi)编码Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸，其与(v)的Fab重链
配对以形成针对靶抗原的结合位点；
vii)编码第二重链多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
viii)编码另外的Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸，其与(vii)的Fab重链配对以形成针对靶抗原的结合位点。
在一些实施方案中，这些核酸中的某些可以彼此相同。例如，(ii)中的核酸可以与(iv)中的相同，并且/或者(vi)中的核酸可以与(viii)中的相同，使得整个组包含少于8个不同的核酸序列。
在另一个实施方案中，一组核酸可以包含以下编码第一抗体的核酸：
i)编码多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)编码Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸；和
iii)编码Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)的核酸，
其中(i)的Fab重链和(ii)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段。
根据本发明的一组核酸可以另外或替代地包含以下编码第二抗体的核酸：
iv)编码多肽的核酸，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
v)编码Fab轻链多肽(例如，VL-CL)的核酸，和
vi)编码Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)的核酸；
其中(iv)的Fab重链和(v)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段。
同样，在一些实施方案中，这些核酸中的某些可以彼此相同。例如，(ii)中的核酸可以与(v)中的相同，使得整个组仅包含5个不同的核酸序列。
该核酸可包含在一种或多种核酸分子或表达载体中。
在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，每条各自的重链和轻链均由单独的质粒表达。
在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸或载体的宿主细胞或一组宿主细胞。在一个实施方案中，提供了表达第一抗体的第一宿主细胞，并且提供了表达第二抗体的第二宿主细胞。
在一个此类实施方案中，第一宿主细胞包含：一个或多个共同编码第一抗体的核酸的载体。第二宿主细胞包含一个或多个共同编码第二抗体的核酸的载体(例如，已经使用一个或多个共同编码第二抗体的核酸的载体转化)。
在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备根据本发明的抗体的方法，其中该方法包含在适于表达抗体的条件下培养包含编码如本文所提供的抗体的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体的重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆及/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.主编，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
一方面，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
K.测定
可通过本技术领域中已知的各种测定，对本文所提供的抗体的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。
在一个方面，本发明的抗体通过诸如ELISA、蛋白质印迹等已知方法测试其抗原结合活性。
抗体亲和力
在某些方面，本文提供的抗体针对靶抗原的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)，或如本文中另外说明的。
在某些实施方案中，针对效应子部分(例如，放射性标记的化合物)的抗原结合位点针对效应子部分/放射性标记的化合物的解离常数(KD)是≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在一些实施方案中，KD为1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小、100pM或更小、50pM或更小、20pM或更小、10pM或更小、5pM或更小或1pM或更小，或如本文中另外说明的。例如，功能结合位点可以以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的KD结合放射性标记的化合物/金属螯合物。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量KD。在一个实施方案中，用目标抗体的Fab形式及其抗原执行RIA。例如，通过在一系列滴定的未标记抗原存在下用最小浓度(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定用于测定法的条件，用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被多孔板(Thermo Scientific)过夜，并且随后在室温(大约23℃)，用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液(例如，遵循在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体(Fab-12)的评定)混合。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下孵育(例如，一小时)。然后去除溶液并用在PBS中的0.1％聚山梨酯20(吐温/>)洗涤所述板八次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施方案，使用表面等离子体共振测定法测量KD。例如，使用/>-2000或/>-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下用固定的抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)进行测定。在一个实施方案中，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速进行注射以获得大约10响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃，以大约25μl/min的流量，注射在含有0.05％聚山梨酯20(吐温-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔结合模型(/> 评估软件3.2版)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参加例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，即如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测得的，在浓度渐增的抗原存在下，测量在25℃PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发波长＝295nm；发射波长＝340nm，带通＝16nm)的增加或减少。
在另一个实施方案中，使用SET(溶液平衡滴定)测定法测量KD。根据该测定，测试抗体通常以恒定浓度应用，并与测试抗原的系列稀释液混合。在温育以建立平衡之后，游离抗体的部分被捕获在抗原包被的表面上并用标记/标记的抗物种抗体检测，通常使用电化学发光(例如，如Haenel等人Analytical Biochemistry 339(2005)182-184中所述)。
例如，在一个实施方案中，将384孔链霉亲合素板(Nunc,Microcoat#11974998001)与浓度为20ng/ml的PBS缓冲液中的25μl/孔的抗原-生物素-异构体混合物在4℃下温育过夜。用游离抗原平衡抗体样品：从2500nM、500nM或100nM的抗原浓度开始，以1:3、1:2或1:1.7稀释步骤用相关抗原滴定0.01nM-1nM抗体。将样品在密封的REMP Storage聚丙烯微孔板(Brooks)中于4℃温育过夜。过夜温育后，用每孔90μl PBST洗涤链霉亲合素板3次。将15μl来自平衡板的每个样品转移到测定板并在室温下温育15分钟，接着用PBST缓冲液进行3x90μl洗涤步骤。通过添加25μl山羊抗人IgG抗体-POD偶联物(Jackson,109-036-088,OSEP中1:4000)进行检测，接着用PBST缓冲液进行6x 90μl洗涤步骤。将25μlTMB底物(RocheDiagnostics GmbH，目录号：11835033001)添加到每个孔中。在Safire2阅读器(Tecan)上在370/492nm处进行测量。
在另一个实施方案中，使用KinExA(动力学排除)测定法测量KD。根据该测定，通常将抗原滴定成恒定浓度的抗体结合位点，使样品平衡，然后快速通过流动池，其中游离抗体结合位点被捕获在抗原包被的珠子上，而抗原-饱和抗体复合物被洗掉。然后用标记的抗物种抗体(例如荧光标记的)检测珠捕获的抗体(Bee等人PloS One,2012；7(4):e36261)。例如，在一个实施方案中，KinExA实验在室温(RT)下使用PBS pH 7.4作为运行缓冲液进行。样品在补充有1mg/ml BSA(“样品缓冲液”)的运行缓冲液中制备。使用0.25ml/分钟的流速。从100pM(浓度范围0.049pM–100pM)开始，用抗原通过两倍连续稀释来滴定具有5pM结合位点浓度的恒定量抗体。一份不含抗原的抗体样品可作为100％信号(即无抑制)。抗原-抗体复合物在室温下孵育至少24小时以达到平衡。然后将平衡的混合物以5ml的体积通过KinExA系统中的抗原偶联珠柱，使未结合的抗体被珠子捕获，而不会扰乱溶液的平衡状态。使用样品缓冲液中的250ng/ml Dylight偶联抗人Fc片段特异性二抗检测捕获的抗体。对于所有平衡实验，每个样品均一式两份测量。KD是通过使用KinExA软件(版本4.0.11)中包含的单位点同质结合模型，使用“标准分析”方法对数据进行非线性回归分析而获得的。
L.治疗方法和组合物
本文所述的抗体组可用于治疗方法。在一个方面，提供了本文所述的一组抗体用作药物。在某些方面中，提供用于治疗方法中的抗体组。
在一些方面，如本文所述的一组抗体可用作免疫治疗剂，例如用于增殖性疾病，例如癌症的治疗。治疗可以诱导靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。
如上所述，在一些方面，根据本发明的抗体组适用于希望将放射性核素递送至受试者的靶细胞的任何治疗。例如，提供了如本文所述的抗体组，用于预靶向的放射免疫疗法的方法，例如用于癌症治疗。
在某些方面，本发明提供了用于在个体中用于免疫疗法或预靶向放射免疫疗法的方法中的该一组抗体，该方法包括向个体施用有效量的该一组抗体。根据上述方面中的任一者的“个体”优选地是人。
如上所述，治疗可以是可通过靶向患者病变细胞的细胞毒活性来治疗的任何病症。治疗优选是肿瘤或癌症。然而，本发明的适用性不限于肿瘤和癌症。例如，治疗也可以是病毒感染，或另一种病原生物体如原核生物的感染。任选地，靶向也可以是用于治疗T细胞驱动的自身免疫性疾病或T细胞血癌的T细胞。因此，待治疗的病症可以包括病毒感染，诸如HIV、狂犬病、EBV和卡波西肉瘤相关疱疹病毒，以及自身免疫性疾病，诸如多发性硬化症和移植物抗宿主病药物。
如本文所用的术语“癌症”包括实体癌和血液学癌症两者，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌(包括胰腺导管腺癌(PDAC))、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结直肠癌(其可以是结肠癌和/或直肠癌)、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌症中的难治形式、任何上述癌症的检查点抑制剂经历形式或一种或多种上述癌症的组合。
治疗的方法可以包括同时或依次施用第一抗体和第二抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以作为联合疗法的一部分施用。例如，它们可以与一种或多种化疗剂联合施用：化疗剂和抗体可以同时或以任一顺序依次施用。另外或可选地，它们可以与一种或多种免疫治疗剂组合施用：免疫治疗剂和抗体可以同时或以任一顺序依次施用。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂，例如放射性标记的化合物)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，诸如通过注射，例如静脉内或皮下注射。
在一个实例中，将放射性同位素靶向细胞、组织或器官以用于疗法的方法可以包括：
i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体(同时或依次，以任一顺序)，其中抗体与结合靶抗原并且定位于表达靶抗原的细胞的表面；并且其中第一抗体和第二抗体的缔合形成针对放射性标记的化合物的功能结合位点；
并且
ii)随后施用放射性标记的化合物，其中所述放射性标记的化合物与针对所述放射性标记的化合物的功能结合位点结合。
放射性标记的化合物用对细胞具有细胞毒性的放射性同位素进行标记。合适的放射性同位素包括如上所述的α和β发射体。
在使用双特异性抗体(即，不是根据本发明的“分裂”抗体)的预靶向的放射免疫疗法的方法中，通常的做法是在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间施用清除剂或阻断剂。清除剂与抗体结合并提高其从体内的清除率。它们包括抗独特型抗体。阻断剂通常是与放射性标记的化合物的抗原结合位点的药剂结合，但它们本身没有放射性标记。例如，当放射性标记的化合物包含负载有某种化学元素(例如金属)的放射性同位素的螯合剂时，阻断剂可以包含负载有相同元素(例如金属)的非放射性同位素的相同螯合剂，或可以包含未负载的螯合剂或负载有不同的非放射性部分(例如，不同元素的非放射性同位素)的螯合剂，条件是它仍然可以被抗原结合位点结合。在一些情况下，阻断剂可以另外包含增加分子大小和/或流体动力学半径的部分。这些阻碍了分子进入肿瘤的能力，而不会干扰分子与循环中抗体结合的能力。示例性部分包括亲水性聚合物。该部分可以是聚合物或共聚物，例如葡聚糖、糊精、PEG、聚唾液酸(PSA)、透明质酸、羟乙基淀粉(HES)或聚(2-乙基2-恶唑啉)(PEOZ)的。在其他实施方案中，该部分可以是非结构化肽或蛋白质，诸如XTEN多肽(非结构化亲水性蛋白质聚合物)、同型氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)或明胶样蛋白(GLK)。其他示例性部分包括蛋白质，诸如白蛋白，例如牛血清白蛋白或IgG。该部分/聚合物的合适分子量可以在例如至少50kDa的范围内，例如在50kDa至2000kDa之间。例如，分子量可以是200-800kDa，任选地大于300、350、400或450kDa，并且任选地小于700、650、600或550kDa，任选地约500kDa。
根据本发明的某些方面，没有向受试者施用清除剂或阻断剂的步骤。在某些方面，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间没有施用任何与第一抗体或第二抗体结合的试剂的步骤。在某些方面，在施用抗体和放射性标记的化合物之间没有施用任何药剂的步骤，除了任选地选自化疗剂、免疫治疗和放射增敏剂的化合物。在一些实施方案中，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间不施用药剂。在一些实施方案中，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间可以不向受试者注射或输注任何其他药剂。
在一些实施方案中，该方法可以是预靶向的放射免疫疗法的两步法，由或基本上由以下步骤组成：i)施用该组抗体(其中第一抗体和第二抗体可以同时施用或以任一顺序依次施用)和ii)随后施用放射性标记的化合物。治疗可涉及此类治疗的多个周期，即这两个步骤的多个周期。示例性治疗周期持续时间为28天，其中该组抗体在周期的第1天施用，并且放射性标记的化合物任选地在周期的第1、2、3、4、5、6、7或8天施用，例如，在第7天施用。治疗周期的数量可能会有所不同。在一个实施方案中，可以有4、5或6个治疗周期。
本发明人出人意料地测定，使用根据本发明的抗体，能够获得放射性标记的化合物在肿瘤中的治疗有效摄取，同时避免放射性在正常组织中过度积累。实际上，在实例中，发现非靶组织中的放射性积累水平低于使用双特异性抗体和清除步骤的三步PRIT方法，同时还使用了更简单的程序。
在一些实施方案中，一旦第一抗体和第二抗体已经被给予合适的时间段以定位到靶细胞，就可以将放射性标记的化合物施用于受试者。例如，在一些实施方案中，放射性标记的化合物可以在第一抗体和第二抗体之后立即或在第一抗体和第二抗体之后至少4小时、8小时、1天或2天后施用于受试者。任选地，它可以在第一抗体和第二抗体之后不超过3天、5天或7天施用。在一个特定实施方案中，放射性标记的化合物可以在第一抗体和第二抗体后2至7天施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以另外或可选地与放射增敏剂联合施用。放射增敏剂和抗体可以同时或以任一顺序依次施用。
在一些实施方案中，可以在如上所述的一个或多个治疗周期之前使用一个或多个剂量测定周期。剂量学周期可以包括以下步骤：i)施用该组抗体(其中第一抗体和第二抗体可以同时或以任一顺序依次施用)和ii)随后施用适合于用伽马发射体放射性标记的成像的化合物(其中所述放射性标记的化合物与针对放射性标记的化合物的功能结合位点结合)。该化合物可以与在随后的治疗周期中使用的化合物相同，除了它用γ发射体而不是α或β发射体标记。例如，在一个实施方案中，用于剂量学周期的放射性标记的化合物可以是203Pb-DOTAM，而用于治疗周期的放射性标记的化合物可以是212Pb-DOTAM。可以对患者进行成像以确定化合物吸收到肿瘤中和/或估计化合物的吸收剂量。该信息可用于估计后续治疗步骤中的预期辐射暴露，并将治疗步骤中使用的放射性标记的化合物的剂量调整到安全水平。
M.药物制剂
本文所述的第一抗体和第二抗体可以配制成单一药物组合物或分开的药物组合物。因此，在进一步方面，本发明提供包含本发明的第一抗体和第二抗体的药物组合物，或包含本发明的第一抗体的第一药物制剂和包含本发明的第二抗体的第二药物组合物，例如用于本文所述的任何治疗或诊断方法。在一些实施方案中，药物组合物和制剂进一步包含药用载体。在另一个实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种额外的治疗剂，例如，如下所述。
本文所述的抗体的药物组合物可以通过将具有期望纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干组合物或水性溶液的形式制备。
药用载体在所用的剂量和浓度下对受治疗者一般无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Halozyme,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体组合物描述于美国专利号6267958中。水性抗体组合物包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者中的组合物包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，可能需要进一步提供如上所述的化疗剂、免疫治疗剂和/或放射增敏剂。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)中。
可以制备缓释制备物。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
N.用于诊断和检测的方法和组合物
在效应子剂是放射性标记的部分的情况下，如本文所述的该一组抗体还可以用于诊断或成像的方法，优选预靶向放射免疫成像方法或包括预靶向放射免疫成像方法的方法。因此，本发明提供诊断和成像方法。它进一步提供了该组抗体在如本文所述的成像方法中的用途，以及如本文所述的一组抗体(即，如本文所述的第一抗体和第二抗体)用于对受试者(例如，在人体或动物身上)进行的诊断方法中的用途。
成像方法适用于对体内靶抗原的存在和/或分布进行成像。例如，该方法可以是使表达与疾病(诸如上述任何疾病状况)相关的抗原的细胞成像的方法。任选地，该方法用于对肿瘤或癌症进行成像。该方法可以用于诊断怀疑患有诸如癌症的增殖性疾病或传染病的受试者的目的。
在一些实施方案中，可以优选受试者是人。
将放射性同位素靶向组织或器官以进行成像或诊断的方法可以包含：
i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体(同时或依次，以任一顺序)，其中抗体与靶抗原结合并且定位于表达靶抗原的细胞的表面，其中第一抗体和第二抗体的缔合形成放射性标记的化合物的功能结合位点；
并且
ii)随后施用放射性标记的化合物，其中所述放射性标记的化合物与针对所述放射性标记的化合物的功能结合位点结合。
任选地，该方法可以进一步包含：
iii)对放射性标记的化合物已经定位或预期定位的组织或器官进行成像。
任选地，该方法可以进一步包含形成诊断、向受试者提供诊断和/或基于诊断确定和/或施用合适治疗的一个或多个步骤。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以包含对受试者的组织或器官进行成像，其中受试者之前已经被施用过：
i)本文所述的第一抗体和第二抗体(同时或依次，以任一顺序)，其中所述抗体与靶抗原结合并且定位于表达靶抗原的细胞的表面，并且其中第一抗体和第二抗体的缔合形成放射性标记的化合物的功能结合位点；和
ii)放射性标记的化合物，其中放射性标记的化合物与第一抗体和第二抗体缔合形成的所述放射性标记的化合物的抗原结合位点结合。
在如本文所述的成像和/或诊断方法中，放射性标记的化合物用适合成像的放射性同位素标记。合适的放射性同位素包括如上所述的伽马发射体。
在预靶向放射成像的常规方法中，通常的做法是在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间施用清除剂或阻断剂，例如如上所述的清除剂或阻断剂。
在本发明的某些实施方案中，没有施用清除剂或阻断剂的步骤。在某些方面，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间没有施用任何与第一抗体或第二抗体结合的试剂的步骤。在某些方面，在施用抗体和放射性标记的化合物之间没有施用任何药剂的步骤，除了任选地选自化疗剂、免疫治疗剂和放射增敏剂的化合物。在一些实施方案中，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间不施用药剂。在一些实施方案中，在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间可以不向受试者注射或输注任何其他药剂。
在一些实施方案中，一旦第一抗体和第二抗体已经被给予合适的时间段以定位到靶细胞，就可以将放射性标记的化合物施用于受试者。例如，在一些实施方案中，放射性标记的化合物可以在第一抗体和第二抗体之后立即或在第一抗体和第二抗体之后至少4小时、8小时、1天或2天后施用于受试者。任选地，它可以在第一抗体和第二抗体之后不超过3天、5天或7天施用。在一个特定实施方案中，放射性标记的化合物可以在第一抗体和第二抗体后2至7天施用于受试者。
在一些实施方案中，成像方法可以是预靶向放射成像方法，由或基本上由以下步骤组成：i)施用该组抗体(其中第一抗体和第二抗体可以同时或以任一顺序依次施用)ii)随后施用放射性标记的化合物和iii)对目标组织或器官进行成像。诊断方法可以由或基本上由所述步骤组成，接着是形成诊断的步骤，然后可以将其递送给患者并且可以用作选择和/或施用治疗方案的基础。
靶抗原可以是本文讨论的任何靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原可以是如上所述的肿瘤特异性抗原，并且成像可以是对一个或多个肿瘤进行成像的方法。个体可能已知或怀疑患有肿瘤。
例如，该方法可以是对在患有或怀疑患有以下的个体中的肿瘤成像的方法：肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌(包括PDAC)、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌(其可以是直肠癌和/或结肠癌)、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌症中的难治形式、任何上述癌症的检查点抑制剂经历形式或一种或多种上述癌症的组合。
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IV.实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
缩写词表
ADA 抗药物抗体
AST 丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸
BsAb 双特异性抗体
CA 清除剂
CEA 癌胚抗原
DOTAM 1,4,7,10-四(氨基甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷
ID 注射剂量
ELISA 酶联免疫吸附测定(ELISA)
FAP 成纤维细胞活化蛋白
GPRC5D G蛋白偶联受体家族C第5组成员D
IV 静脉内注射
MW 分子量
PBS 磷酸盐缓冲盐水
p.i. 注射后
PK 药代动力学
PRIT 预靶向的放射免疫疗法
RIT 放射免疫疗法
RT 室温
SC 皮下注射
SCID 严重联合免疫缺陷
SD 标准差
SOPF 无特异性和机会性病原体
SPLIT 分离的v-结构域联动技术
TA 靶抗原
TGI 肿瘤生长抑制
TR 肿瘤消退
实例1：CEA-分裂-DOTAMVH/VL抗体的产生
使用具有针对靶抗原的结合位点和针对放射性标记的化合物的结合位点的双特异性抗体的PRIT(预靶向的放射免疫疗法)方法，通常在施用抗体和放射性配体之间使用清除剂(CA)，以确保有效靶向和高的肿瘤与正常组织的吸收剂量比(见图3)。在这样一种方法的实例中，注射的BsAb有足够的时间渗透到肿瘤中，通常是4-10天，然后使用Pb-DOTAM-dextran-500CA中和循环的BsAb。CA阻断212Pb-DOTAM与非靶向BsAb的结合，而不会穿透到肿瘤中，这将阻断预靶向位点。这种预靶向方案允许随后施用的放射性标记的螯合物212Pb-DOTAM有效地积聚肿瘤。
然而，在涉及清除剂的方法中，CA的使用在该方法中引入了低效的进一步的步骤。此外，谨慎选择CA施用的时间和剂量很重要，这是一个复杂的因素。
为了解决与使用清除剂相关的问题，本发明人提出了分裂DOTAM VL和VH结构域的策略，使得它们存在于单独的抗体上。
下面进一步讨论示例性分裂DOTAM VH/VL抗体的产生
用于抗体重链或轻链的重组表达的质粒的产生
通过瞬时转染人胚肾细胞(HEK 293)表达所需的蛋白质。用于表达所需的基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或包含额外结构域的全长抗体重链(例如在其C末端的免疫球蛋白重链或轻链可变结构域)使用了包含以下功能元件的转录单元：
-来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，
-要表达的基因/蛋白质，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括所希望的待表达基因的表达单元/盒外，基础/标准哺乳动物表达质粒还包含
-来自载体pUC18的复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
a)抗体重链的表达质粒
抗体重链编码基因包括C末端融合基因，该融合基因包含完整的和功能的抗体重链，接着是额外的抗体V-重链或V-轻链结构域，通过将编码各自被G4Sx4接头分离的序列元件(V-重或V-轻)的DNA片段与人IgG分子(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)融合的CH3结构域C末端来组装。在两个CH3结构域的C末端分别带有一个VH和一个VL结构域的重组抗体分子使用杵臼结构技术来表达。
用于在HEK293细胞中瞬时表达具有C末端VH或VL结构域的抗体重链的表达质粒除了具有C末端VH或VL结构域表达盒的抗体重链片段之外，还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许在大肠杆菌中复制该质粒)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。具有C端VH或VL结构域融合基因的抗体重链片段的转录单元包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码核酸的抗体重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
b)抗体轻链的表达质粒
通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能抗体轻链的抗体轻链编码基因。
用于抗体轻链瞬时表达的表达质粒除抗体轻链片段外还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予对氨苄青霉素的耐药性的β-内酰胺酶基因。抗体轻链片段的转录单位包含以下功能元件:
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码核酸的抗体轻链(VL-CL)，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
抗体分子的瞬时表达
在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生)中产生抗体分子。对于转染，使用“没有293的”转染试剂(Novagen)。如上所述的相应抗体重链和轻链分子是从单个表达质粒表达的。按照制造商的说明进行转染。在转染后三至七(3-7)天收获含有免疫球蛋白的细胞培养上清液。将上清液储存于降低的温度(例如-80℃)直至纯化。
关于在例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息给出于：Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203.
PRIT Hemibodies(分裂抗体)通过MabSelect Sure(亲和色谱)纯化，接着是Superdex 200(尺寸排阻色谱)。
示例性抗体/半抗体的序列总结如下。
抗体名称 第一重链 第二重链 轻链
P1AD8592 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34
P1AD8749 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34
P1AE4956 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:54
P1AE4957 SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO:58
对于带有DOTAM-VL-P1AD8592的PRIT分裂抗体，制备了5mg，浓度为1.372mg/mL(基于分析SEC和CE-SDS纯度>96％)。对于带有DOTAM-VH-P1AD8749的PRIT分裂抗体，制备了14mg，浓度为2.03mg/mL，纯度>91％(基于分析SEC和CE-SDS)。
还产生了抗体P1AE4956和P1AE4957。对于带有DOTAM-VL-P1AE4957的PRIT分裂抗体，制备了19mg，浓度为2.6mg/mL，纯度>81.6％(基于分析SEC和CE-SDS)。对于带有DOTAM-VH-P1AE4956的PRIT分裂抗体，制备了6.9mg，浓度为1.5mg/mL，纯度>90％(基于分析SEC和CE-SDS)。ESI-MS用于确认PRIT半抗体的同一性。
实例2：分裂抗体功能的FACS分析
为了评估分裂抗体或半抗体的功能，在37℃下使用accutase将MKN-45细胞从培养容器中分离10分钟。随后，将细胞在PBS中洗涤两次，并接种到96孔v形底板中，最终密度为4x106个细胞/孔。
将半抗体P1AD8749和P1AD8592以及人ISO对照1:1混合添加到细胞中，浓度如图5所示。随后，将细胞在冰上孵育1小时并在PBS中洗涤两次。重新悬浮细胞沉淀并添加40μl/孔的检测试剂，在PBS/5％FCS中<人IgG(H+L)>FITC,(10μg/ml)或Pb_Dotam_FITC 1:100＝>(10μg/ml)。在冰上孵育60分钟后，将细胞在PBS中洗涤两次并重新悬浮在200μl PBS/5％FCS中，以使用FACS canto测量FITC荧光。
为了评估半抗体与MKN-45细胞上CEA的结合能力，使用人IgG特异性二抗的抗体进行检测(图5)。正如预期的那样，在这些细胞上没有观察到人ISO对照的显著结合。当调整到相同的IgG浓度时，两种半抗体以及两者的组合都显示出与MKN-45细胞的剂量依赖性结合，如预期的那样在非常高的浓度下具有明显的钩状效应。该实验证明CEA结合在半抗体中是起作用的。
为了评估半抗体与DOTAM的结合能力，它们在人ISO对照或其各自的分裂抗体伴侣存在下以1:1的比例与细胞结合。在它们与MKN-45细胞结合后，洗涤细胞以去除未结合的抗体。随后，添加Pb-DOTAM-FITC(荧光标记的Pb-DOTAM)以检测DOTAM结合感受态细胞结合抗体(图6)。正如预期的那样，当分裂抗体伴侣之一与人ISO对照结合时，在这些细胞上没有观察到显著的FITC。只有两个半抗体以1:1比例的组合显示出剂量依赖性FITC信号。该实验示出，当两个半抗体聚集在一个细胞上时，DOTAM结合位点就会起作用。
实例3：体内研究
实例3a：材料和方法-概述
所有实验方案均由地方当局审查和批准(ComitéRégional d'Ethique de l'Experimentation Animale du Limousin[CREEAL]，Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)。根据伦理准则，将雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Charles River)维持在无特定和机会性病原体(SOPF)条件下，每天都有光明和黑暗的循环(12h/12h)。在到达后的前5天没有进行任何操作，以使动物适应新环境。每天控制动物的临床症状和不良事件的检测。
通过皮下(SC)注射在与基底膜基质(生长因子降低；目录号354230)1:1混合的细胞培养基中表达CEA的肿瘤细胞建立实体异种移植物。每周3次通过手动卡尺估计肿瘤体积，根据以下公式计算：体积＝0.5×长度×宽度2。根据肿瘤生长速率，按照需要进行额外的肿瘤测量。
如果小鼠因肿瘤负荷、注射副作用或其他原因而表现出难以忍受的痛苦或疼痛迹象，则在预定终点之前对其实施安乐死。疼痛、痛苦或不适的迹象包括但不限于急性体重(BW)下降、毛皮邋遢、腹泻、驼背姿势和嗜睡。每周测量3次经处理的动物的BW，根据健康状况按照需要进行额外测量。从放射性注射后的第二天开始，向所有小鼠提供湿食，持续7天或直到所有个体从任何急性BW损失中充分恢复。BW损失超过其初始BW的20％或肿瘤体积达到3000mm3的小鼠立即被安乐死。出于伦理原因考虑安乐死的其他因素为肿瘤状态(例如坏死区域、血液/液体泄漏、自残迹象)和动物的一般外观(例如皮毛、姿势、运动)。
为了最大限度地减少放射性尿液/粪便的再摄入，所有功效研究小鼠在212Pb-DOTAM施用后被放置在有格栅地板的笼子中4小时，然后转移到带有标准垫子的新笼子中。然后在注射(p.i.)后24小时更换所有笼子。对因生物分布目的而在放射性注射后24小时内处死的小鼠不进行此程序。
在安乐死时，在麻醉小鼠上使用眶后出血从静脉窦收集血液，然后按照协议的要求，通过颈椎脱位终止，接着采集额外的组织进行放射性测量和/或组织学分析。记录了意外或异常情况。收集用于福尔马林固定的组织立即放入10％中性缓冲福尔马林(4℃)中，然后在5天后转移到磷酸盐缓冲盐水(PBS；4℃)中。为生物分布目的收集的器官和组织使用2470WIZARD2自动伽马计数器(PerkinElmer)称重并测量放射性，随后计算每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)，包括对衰减和背景的校正。
使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software,Inc.)和JMP 12(SAS InstituteInc.)进行统计分析。使用以下公式基于平均肿瘤体积进行肿瘤生长抑制(TGI)的曲线分析：
其中d表示研究日，0表示基线值。载体被选为参考组。肿瘤消退(TR)根据以下公式计算：
其中正值表示肿瘤消退，低于–1的值表示超出双基线值的生长。
测试化合物
所述研究中使用的化合物分别列于下表中，分别用于双特异性抗体、清除剂和放射性标记的螯合物。
CEA-DOTAM(RO7198427,PRIT-0213)是一种完全人源化的BsAb，靶向CEA的T84.66表位(还请参见WO2019/201959)。PRIT-0213由
i)如下所示的第一重链；
ii)如下所示的第二条重链；和
iii)如下所示的两条抗体轻链构成。
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DIG-DOTAM(RO7204012)是一种非CEA结合BsAb，用作阴性对照。
P1AD8749、P1AD8592、P1AE4956和P1AE4957是针对CEA的CH1A1A或A5B7表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体。它们的序列如上所述。所有抗体构建体均在–80℃下储存，直到注射当天解冻并在标准载体缓冲液(20mM组氨酸、140mM NaCl；pH 6.0)或0.9％NaCl中稀释至各自的最终浓度用于静脉内(IV)或腹膜内(IP)施用。
将Pb-DOTAM-葡聚糖-500CA(RO7201869)储存在–20℃直至注射当天解冻并在PBS中稀释以进行IV或IP施用。
用于放射性标记的DOTAM螯合物由Macrocyclics提供，并在放射性标记前保持在–20℃，由Orano Med(Razès，法国)进行。212Pb-DOTAM(RO7205834)是通过用DOTAM从钍发生器中洗脱产生的，随后在标记后用Ca淬灭。用0.9％NaCl稀释212Pb-DOTAM溶液以获得IV注射所需的212Pb活性浓度。
载体对照组中的小鼠接受载体缓冲液的多次注射而不是BsAb、CA和212Pb-DOTAM。
双特异性抗体
清除剂
放射性标记螯合物
肿瘤模型
用于接种小鼠的肿瘤细胞系和注射量如下表所述。BxPC3是人原发性胰腺腺癌细胞系，天然表达CEA。细胞在富含10％胎牛血清(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)的RPMI 1640培养基、GlutaMAXTM补充剂、HEPES(Gibco,参考编号72400-021)中培养。在研究的第0天，通过将与基底膜基质(生长因子降低；目录号354230)以1:1混合的RPMI培养基中的细胞皮下注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。
肿瘤细胞系
*欧洲认证细胞培养物保藏中心(索尔兹伯里，UK)
实例3b：方案144
方案144的目的是在使用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAbs进行2步PRIT后，在携带SCBxPC3肿瘤的SCID小鼠中提供预靶向212Pb-DOTAM的PK和体内分布数据。
通过分别或一起注射CEA-分裂-DOTAM-VH和CEA-分裂-DOTAM-VL(P1AD8749和P1AD8592)进行两步PRIT，7天后注射212Pb-DOTAM。放射性注射后6小时处死小鼠，采集血液和器官用于放射性测量。使用标准CEA-DOTAM双特异性抗体将2步方案与3步PRIT进行比较，7天后使用Ca-DOTAM-dextran-500CA，并且CA后24小时使用212Pb-DOTAM。
CEA-分裂-DOTAM-VH/VL清除率的PK数据通过抗体注射后1小时至7天的重复采血收集，随后通过ELISA分析。
研究概要在图7中示出。图7a示出携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠的2步PRIT方案的概要，包括CEA-分裂-DOTAM-VH/VL PK的血液取样。图7b示出3步PRIT方案的概要，在携带SCBxPC3肿瘤的SCID小鼠中进行(h＝小时，d＝天)。
研究设计
方案144的时间进程和设计如下表所示。
方案144的时间进程
方案144中的研究组
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第26代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射14天后，将小鼠分成平均肿瘤体积为116mm3的实验组。212Pb-DOTAM在接种后第22天注射；第21天的平均肿瘤体积为140mm3。
在CEA-分裂-DOTAM-VH/VL注射后1小时(右眼)、24小时(左眼)和168小时(右眼，终止时)，通过在麻醉下眶后出血收集Aa、Ba和Ca组小鼠的血液。类似地，在CEA-分裂-DOTAM-VH/VL注射后4小时(右眼)、72小时(左眼)和168小时(右眼，终止时)从Ab、Bb和Cb组的小鼠中采集样本。
在注射212Pb-DOTAM后6小时处死Aa、Ba、Ca和D组的小鼠并进行尸检，并收获以下器官和组织用于测量放射性含量：血液、皮肤、膀胱、胃、小肠、结肠、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肺脏、心脏、股骨、肌肉、大脑、尾巴、耳朵和肿瘤。
结果
图8显示了注射后6小时在所有收集的组织中的平均212Pb积累和清除。单独使用CEA-分裂-DOTAM-VH或CEA-分裂-DOTAM-VL进行预靶向不会导致肿瘤中的放射性积累。结合起来，这两种互补抗体导致2步PRIT后的肿瘤摄取为65±12％ID/g，而标准的3步PRIT方案则为87±15％ID/g。采用Tukey多重比较检验的双向方差分析(ANOVA)示出，两种PRIT治疗之间的肿瘤摄取差异显著，膀胱差异也显著(1±2％ID/g和38±17％ID/g分别用于2步和3步PRIT)；使用该测试，组织积累的其他差异没有统计学意义(p＝0.05)。
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析IV注射的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建体的清除率如图9所示。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。
结论
研究结果证明了使用互补的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的CA非依赖性2步预靶向的概念验证。使用2步PRIT和标准3步PRIT实现了212Pb-DOTAM的高特异性肿瘤摄取，使用互补CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体在正常组织中几乎没有放射性积累。
实例3c：方案158
方案158的目的是评估212Pb-DOTAM与双互补位(CH1A1A和A5B7)对CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体预靶向的小鼠皮下BxPC3肿瘤的缔合，用于清除剂非依赖性2步CEA-PRIT。将肿瘤摄取与标准3步CEA-PRIT进行比较。
携带皮下BxPC3肿瘤的小鼠被注射
·CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体，7天后使用放射性标记的212Pb-DOTAM(2步PRIT)，或
·CEA-DOTAM BsAb之后是7天后CA，并且最后是24小时后的放射性标记的212Pb-DOTAM(3步PRIT)。
在放射性注射后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概要在图10中示出。
研究设计
方案158的时间进程和设计如下表所示。
方案158的时间进程
方案158中的研究组
*P1AD8749剂量调整为154μg，以补偿35％的孔/孔杂质；**P1AD8592剂量调整为167μg，以补偿40％的孔/孔杂质。
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第27代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射14天后，将小鼠分成平均肿瘤体积为177mm3的实验组。212Pb-DOTAM在接种后第20天注射；第21天的平均肿瘤体积为243mm3。
所有组中的小鼠在注射212Pb-DOTAM 6小时后处死并尸检，收获以下器官和组织进行放射性含量测定：血液、皮肤、膀胱、胃、小肠、结肠、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肺、心脏、股骨、肌肉、脑、尾巴和肿瘤。
结果
注射后6小时在所有收集的组织中的平均212Pb分布如图11所示。采用Tukey多重比较检验的双向ANOVA示出，三种处理之间的正常组织摄取212Pb没有显著差异，除了膀胱，其中两个双互补位CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对产生的积累低于标准的3步PRIT。所有三种经处理的肾脏摄取为3-4％ID/g。两种双互补位组合导致约56％ID/g的肿瘤积累，而3步PRIT为67％ID/g；2步和3步PRIT之间的差异具有统计学意义(p<0.0001)。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。
结论
本研究评估了212Pb-DOTAM与小鼠SC BxPC3肿瘤的缔合，与标准的3步PRIT相比，CA非依赖性2步CEA-PRIT的双互补位CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体对预靶向小鼠。注射后6小时后，212Pb的分布与2步和3步PRIT相当，在肿瘤中积累高，在健康组织中放射性非常低。这证明了使用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体对表达CEA的肿瘤进行2步CEA-PRIT的双互补位预靶向概念的证明。
实例3d：方案160
方案160的目的是比较使用互补CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体进行3个周期的CA非依赖性2步CEA-PRIT后与标准3步CEA-PRIT对带有SC BxPC3肿瘤的小鼠的治疗效果。还与1步CEA-RIT进行了比较，使用在注射前与212Pb-DOTAM预孵育的BsAb。
携带SC BxPC3肿瘤的小鼠被注射了
·CEA-DOTAM BsAb，7天后进行CA，最后在24小时后注射放射性标记的212Pb-DOTAM(3步PRIT)，
·CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体，7天后使用放射性标记的212Pb-DOTAM(2步PRIT)，或
·212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM BsAb(预孵育；1步RIT)。
该疗法在20μCi的212Pb-DOTAM的3个重复周期中进行，还包括与非CEA结合对照抗体(DIG-DOTAM)的比较，并且不进行治疗(载体)。为生物分布目的处死专用小鼠，以确认每个治疗周期的212Pb-DOTAM靶向和清除。根据TGI和TR评估治疗效果，并在研究期间仔细监测小鼠以评估治疗的耐受性。研究概要在图12中示出。
方案160的时间进程和设计如下表所示。
方案160的时间进程
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方案160中的研究组
*P1AD8749：剂量调整为154μg，以补偿储备溶液中35％的孔/孔杂质；**P1AD8592；***由于第一个治疗周期的急性辐射诱导毒性，从3个周期调整为1个周期。
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106个细胞(第24代)通过SC注射到右侧腹中，在SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射后15天，将小鼠分成平均肿瘤体积为122mm3的实验组。212Pb-DOTAM在接种后第23天注射；第22天的平均肿瘤体积为155mm3。
根据上表(方案160中的研究组)，将CEA-DOTAM和DIG-DOTAM抗体在载体缓冲液中稀释至终浓度为100μg/200μL，用于IP施用。将CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体混合到一个用于IP施用的单一注射溶液中，每200μL含有100μg每种构建体。对于P1AD8749，剂量调整为154μg，以补偿储备溶液中35％的孔/孔杂质(分子不携带VH/VL的一侧)。在BsAb注射后7天，IP注射Ca-DOTAM-葡聚糖-500CA(每200μL PBS 25μg)，24小时后根据图12中的实验时间表注射212Pb-DOTAM(RO7205834)。PRIT处理的小鼠(2步和3步)IV注射100μL的Ca淬灭的212Pb-DOTAM溶液(20μCi在100μL 0.9％NaCl中)。
用1步RIT处理的小鼠只接受一次注射：预结合的212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM(20μCi/20μg BsAb在100μL 0.9％NaCl中用于IV注射)。通过将212Pb-DOTAM与CEA-DOTAM BsAb在37℃下孵育10分钟来制备直接标记的抗体。
在安乐死时从A-E组的小鼠中采集以下器官和组织：血清、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺和肿瘤。在安乐死之前，将活小鼠麻醉用于眶后采血。收集的血样以10000rcf离心5分钟，并且分离、冷冻和储存在–20℃下的血清部分。将切除的组织立即放入10％中性缓冲福尔马林(4℃)中，然后在24小时后转移到1X PBS(4℃)中。福尔马林固定的样品被运送到RochePharma Research and Early Development，Roche Innovation Center Basel，用于进一步处理和分析。
F、G、J和M组的小鼠在其第一次和唯一一次注射212Pb-DOTAM或212Pb-DOTAM-BsAb后24小时处死并尸检；H组和K组在其第二次212Pb-DOTAM注射后24小时处死并尸检；I组和L组在其第三次注射212Pb-DOTAM后24小时处死并进行尸检。在通过颈椎脱位终止之前，使用麻醉小鼠的眶后出血在安乐死时从静脉窦收集血液。还收获了以下器官和组织用于生物分布目的：膀胱、脾脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、尾巴、皮肤和肿瘤。
结果
在图13中显示了每个治疗和治疗周期在注射后24小时内所有收集的组织中的平均212Pb积累和清除。阴性对照导致肿瘤中没有摄取(0.4％ID/g)。采用Tukey多重比较检验的双向方差分析(ANOVA)表明，2步和3步PRIT的分布在任何周期均无显著差异；然而，与阴性对照和1步RIT相比，所有周期的差异均具有统计学意义(p<0.05)。3步PRIT的肿瘤摄取率为25-45％ID/g，2步PRIT的肿瘤摄取率为25-30％ID/g，治疗或周期之间没有任何统计学上的显著差异。对于1步RIT，在一个也是唯一一个治疗周期中肿瘤摄取率为99％。两种PRIT方案在正常组织中的摄取量都非常低，但在1步RIT后所有器官和组织中的摄取量显著增加，这是因为与小的放射性标记的DOTAM螯合物相比，预孵育抗体的循环时间要长得多。
平均肿瘤发生和个体肿瘤生长曲线分别如图14和图15所示。未经处理的载体组和DIG-DOTAM组的肿瘤稳定增长，尽管后者在第三次治疗后的加倍率略低。相比之下，PRIT和RIT组的肿瘤在第一个治疗周期后缩小，并保持肿瘤对照，直到接种后约10周，此时肿瘤开始增大。2步和3步PRIT治疗导致几乎相同的肿瘤对照。没有肿瘤完全消退。
在研究第83天，即所有治疗组可以根据平均值进行分析的最后一天，使用CEA-DOTAM(3步)和CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的PRIT的TGI分别为91.7％和88.4％(2步)，分别与载体对照进行比较。1步RIT的相应数字为72.6％，而非特异性DIG-DOTAM对照的TGI为–59.7％。同一天，基于均值的TR为–1.9(3步CEA-DOTAM PRIT)、–2.9(2步CEA-分裂-DOTAM-VH/VL PRIT)、–4.7(1步RIT)、–28.8(DIG-DOTAM PRIT和–39.3用于载体对照。
由于下述不良事件，生存分析不被认为具有统计学意义。
不良事件和毒性
所有治疗组的BW发展如图16所示。使用20μCi的212Pb-DOTAM的2步和3步PRIT多个周期耐受性良好，但接受1步RIT的小鼠出现急性BW损失，E组8/10小鼠在第一个RIT周期后因BW下降20％或更多而安乐死(212Pb照射后6-11天)。剩余的2只RIT小鼠未再进行212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM注射，但继续进行肿瘤生长评估。
此外，由于肿瘤状态下降，即肿瘤开放或渗漏，出于伦理原因，许多小鼠被处死。在DIG-DOTAM组中，9/10的小鼠因此在达到3000mm3的肿瘤体积之前被安乐死；对于未处理的载体对照，相应的数字是5/10。该问题在PRIT和RIT组中不太明显，分别在3步PRIT、2步PRIT和1步RIT组中分别有1/10、2/10和2/10小鼠安乐死。这反映在图15中的单个肿瘤生长曲线中。
最后，C组1只小鼠因肛门下有退化性伤口而被安乐死。所有不良事件列于下表。
方案160中的不良事件
在研究第23天(第1周期)、第37天(第2周期)和第51天(第3周期)进行212Pb照射。
结论
使用3步方案(CEA-DOTAM BsAb、CA和212Pb-DOTAM)和2步方案(CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体和212Pb-DOTAM)的CEA-PRIT没有发现差异；两种处理的TGI显著且几乎相同，并且在两种情况下都可以安全地施用3个周期的20μCi。相比之下，大多数经处理的小鼠在注射前(1步RIT)不耐受与CEA-DOTAM预结合的20μCi 212Pb-DOTAM。
因此，该研究证明了使用开发的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建体的CA非依赖性2步PRIT的耐受性和治疗功效。
实例4：方案175
方案175的目的是评估增加注射的预靶向抗体量对随后在肿瘤和健康组织中积累的212Pb的影响。比较了两种不同剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体：标准量(100μg)和2.5倍高剂量(250μg)。此外，对CEA-分裂-DOTAM-VH构建体进行了修改，以扩展其VH以避免形成抗药物抗体(ADA)(这与先前测试的CEA-分裂-DOTAM-VL构建体一起使用)。VH被扩展以包含来自抗体CH1结构域的前三个氨基酸：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸(AST)，并且构建体在下文中称为CEA-分裂-DOTAM-VH-AST。
抗体P1AD8592已在上文实施方案1中进行了描述。除了融合HC通过残基AST延伸外，P1AF0171与P1AD8749相同，因此，抗体P1AD0171由如上所述的轻链D1AA3384(SEQ IDNO:34)、如上所述的第一重链D1AC4022(SEQ ID NO:28)，以及如下图所示的第二重链D1AE3669组成：
D1AE3669(HC杵<CEA>CH1A1A Dotam-VH-AST)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSAST(SEQ IDNO:153)。
携带SC BxPC3肿瘤的小鼠被注射了
·1倍标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb，7天后使用放射性标记的212Pb-DOTAM，或
·2.5倍标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb，7天后使用放射性标记的212Pb-DOTAM。
在放射性注射后24小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述在图17中示出。
研究设计
方案175的时间过程和设计如下所示。
方案175的时间进程
研究日 实验程序
0 BxPC3细胞的制备和注射器的填充
0 BxPC3细胞的SC注射
22 CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb的IP*注射
29 212Pb-DOTAM的洗脱和注射器的填充
29 212Pb-DOTAM的IV注射
30 安乐死和组织收获(24h p.i.)+伽马计数
*由于化合物浓度低，所以需要进行IP注射(每个构建体200μL，总共＝400μL)
方案175中的研究组
*P1AF0171剂量调整为143和357μg，以补偿约30％的孔/孔杂质。
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第24代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射后21天，将小鼠分成平均肿瘤体积为310mm3的实验组。212Pb-DOTAM在接种后第29天注射；第30天的平均肿瘤体积为462mm3。
注射212Pb-DOTAM 24小时后处死所有小鼠并进行尸检，并收获以下器官和组织用于测量放射性含量：血液、皮肤、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肌肉、尾巴和肿瘤。
结果
注射后24小时在所有收集的组织中的平均212Pb分布如图18所示。在两个剂量水平之间，肿瘤或正常组织对212Pb的吸收没有显著差异。两个治疗组的肿瘤积累为30-31％ID/g，此时肾脏摄取为<2％ID/g。由于212Pb-DOTAM注射问题，一只小鼠的尾巴有约1％ID/g，但没有其他收集的健康组织显示任何明显的212Pb积累。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。
结论
在此体内模型中，将预靶向CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的剂量增加2.5倍并未改善随后施用的212Pb-DOTAM的肿瘤积累。然而，也没有增加放射性在正常组织中的积累，突出了使用这种两步预靶向方案实现的强特异性。最后，结果验证了扩展-VH CEA-分裂-DOTAM-VH-AST结构的功能。
实例5：方案185
方案185的目的是评估靶向T84.66表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL。本文提供了P1AF0709和P1AF0298的序列。P1AF0709具有D1AE4688(SEQ ID NO:83)的第一重链和D1AA4920(SEQ ID NO:84)的第二重链。P1AF0298具有D1AE4687(SEQ ID NO:86)的第一重链和D1AE3668(SEQ ID NO:87)的第二重链。两者都具有D1AA4120(SEQ ID NO:89)的轻链。
携带SC BxPC3肿瘤的小鼠被注射标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb(每种抗体100μg)，6天后注射放射性标记的212Pb-DOTAM。在放射性注射后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述在图19中示出。
研究设计
方案185的时间进程和设计如下所示。
方案185的时间进程
研究日 日期 实验程序
0 2020-03-04 BxPC3细胞的制备和注射器的填充
0 2020-03-04 BxPC3细胞的SC注射
22 2020-03-26 CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb的IV注射
27 2020-03-31 212Pb-DOTAM的洗脱和注射器的填充
28 2020-04-01 212Pb-DOTAM的IV注射
28 2020-04-01 安乐死和组织收获(6h p.i.)+伽马计数
方案185中的研究组
*P1AF0171剂量调整为143μg，以补偿约30％的孔/孔杂质。
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第27代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射后22天，将小鼠分成平均肿瘤体积为224mm3的实验组。212Pb-DOTAM于接种后第28天注射，此时平均肿瘤体积已达到385mm3。
注射212Pb-DOTAM 6小时后处死所有小鼠并进行尸检，并收获以下器官和组织用于测量放射性含量：血液、皮肤、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肌肉、尾巴和肿瘤。将收集的肿瘤分成两块：一块测量放射性含量，并且另一块放入含有最佳切割温度(OCT)包埋介质的冷冻模具中，然后放在干冰上快速冷冻。在冷冻切片、免疫荧光染色和使用ZeissAxio Scope.A1模块化显微镜进行分析之前，OCT中的冷冻样品保持在–80℃。
结果
注射后6小时在所有收集的组织中的平均212Pb分布如图20所示。肿瘤积累为40％ID/g(CH1A1A)或44％ID/g(T84.66)。在肾脏中发现了唯一其他明显的放射性积累：两组在在6h p.i.3–5％ID/g。
图21显示了靶向T84.66(组A)或CH1A1A(组B)的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对的瘤内分布示例。板A和C示出CEA表达在BxPC3肿瘤中高且均匀，板B和D显示注射后7天的抗体分布相似。然而，与来自B组的肿瘤样本相比，来自A组的样本总体上显示出更强的信号，这证明T84.66是比CH1A1A更强的结合物。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。
结论
结果验证了CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建体靶向CEA的T84.66表位的功能。由此产生的212Pb在预靶向表达CEA的肿瘤中的积累是高且特异性的，并且靶向CH1A1A或T84.66表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对均匀分布在表达CEA的肿瘤内。
实例6：方案189
方案189的目的是评估靶向T84.66 VH-AST/CH1A1A VL和T84.66VL/CH1A1 VH-AST的双互补位CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体对与靶向阳性对照对CH1A1A VH-AST/VL。这种双互补位组合排除了在仅表达两个表位之一的可溶性CEA上形成完整的Pb-DOTAM结合物(例如T84.66)，从而减轻其潜在的不良时间，诸如增加的循环放射性和相关的辐射诱导的毒性，并且由于与非肿瘤靶标的竞争而降低了疗效。
携带SC BxPC3肿瘤的小鼠被注射标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb(每种抗体100μg)，7天后注射放射性标记的212Pb-DOTAM。在放射性注射后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述在图22中示出。
研究设计
方案189的时间进程和设计如下所示。
方案189的时间进程
研究日 实验程序
0 BxPC3细胞的制备和注射器的填充
0 BxPC3细胞的SC注射
15 CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb的IV注射
21 212Pb-DOTAM的洗脱和注射器的填充
22 212Pb-DOTAM的IV注射
22 安乐死和组织收获(6h p.i.)+伽马计数
方案189中的研究组
*P1AF0171剂量调整为143μg，以补偿约30％的孔/孔杂质。
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第31代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射14天后，将小鼠分成平均肿瘤体积为343mm3的实验组。212Pb-DOTAM在接种后第22天注射；第21天平均肿瘤体积达到557mm3。
注射212Pb-DOTAM 6小时后处死所有小鼠并进行尸检，并收获以下器官和组织用于测量放射性含量：血液、皮肤、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肌肉、尾巴和肿瘤。
结果
注射6小时后所有收集的组织中的平均212Pb分布如图23所示。对于T84.66 VH-AST+CH1A1A VL和T84.66 VL+CH1A1A VH-AST，双互补位变异的肿瘤积累分别为71％ID/g和46％ID/g。阳性CH1A1A对照产生37％ID/g。采用Tukey多重比较检验的双向ANOVA示出，所有三组在肿瘤摄取方面都存在显著差异(T84.66 VH-AST+CH1A1A VL与其他两组相比p<0.0001；T84.66 VL+CH1A1A VH-AST与仅CH1A1A相比p＝0.0020)。尽管与其他两组相比，T84.66 VH-AST+CH1A1A VL组合的血液保留略高，但组间没有其他器官显示出统计学上的显著差异：2％ID/g与<1％ID/g相比。肾脏摄取量同样略高，尽管在统计学上没有显著差异：T84.66 VH-AST+CH1A1A为4.5％ID/g，而其他两个为3％ID/g。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。然而，与标准生长速率相比，本研究中BxPC3肿瘤的生长明显更快，并且变异性更大。尸检得出结论，大肿瘤(大部分)充满液体，在放射性测量前将肿瘤切成两半时液体被清空；这种液体可能导致生长速度加快，但对％IA/g没有太大影响，因为肿瘤是在打开后称重和测量的。
结论
结果验证了使用测试的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建体对CEA的T84.66和CH1A1A表位的双互补位靶向功能，并证明与阳性CH1A1A对照相比，该组合具有令人惊讶的高功效。由此产生的212Pb在预靶向表达CEA的肿瘤中的积累是高且特异性的，表明T84.66 VH-AST+CH1A1A VL对具有特殊优势。
实例7
这些实例研究了通过如本文所述的分裂抗体将Pb-DOTA募集到细胞中。
P1AF0712具有SEQ ID NO:97的第一重链、SEQ ID NO:98的第二重链和SEQ ID NO:103的轻链。P1AF0713具有SEQ ID NO:100的第一重链、SEQ ID NO:101的第二重链和SEQ IDNO:103的轻链。
使用胰蛋白酶将MKN-45细胞从培养瓶中分离出，并使用Casy细胞计数器进行计数。在4℃下造粒后，将300g细胞重悬于FACS缓冲液(2.5％FCS在PBS中)中，调节至2.0E+06细胞/mL，并分配至96孔PP V型底板(25μL/孔＝5.0E+04Zellen/孔)。
使用DOTA-FITC进行FACS染色
在FACS缓冲液中将CEA特异性SPLIT抗体(分别为P1AF0712或P1AF0713)调整为40μg/mL，从而导致终浓度为10μg/mL。将两种抗体加入到细胞中，结合或分离，接着加入缓冲液并在4℃下孵育1小时。随后，将用FITC标记的Pb-DOTA以与抗体等摩尔的比例添加到细胞中，并在4℃下孵育1小时。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并重新悬浮在70μl/孔FACS缓冲液中，以使用FACS Canto(BD,Pharmingen)进行测量。显示(图24)SPLIT两半都没有产生荧光信号，表明缺乏Pb-DOTA结合能力。只有两半SPLIT的组合才能将Pb-DOTAM-FITC募集到靶细胞(图24)。
使用<huIgG(H+L)A488>进行FACS染色
在FACS缓冲液中将CEA特异性SPLIT抗体(分别为P1AF0712或P1AF0713)调整为40μg/mL，从而导致终浓度为10μg/mL。将两种抗体添加到细胞中，或者分离后添加缓冲液，或者合并并在4℃下孵育1小时。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次。洗涤后，将细胞重悬于含有二抗(<huIgG(H+L)>-Alexa488,c＝10μg/mL)的50μL FACS缓冲液中，并在4℃下孵育1小时。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并重新悬浮在70μl/孔FACS缓冲液中，以使用FACSCanto(BD,Pharmingen)进行测量。两种SPLIT抗体的EC50相当，表明两种SPLIT抗体的CEA特异性细胞结合。由于混合物中抗体的量较高，在这些情况下获得了较低的EC50，如下表所示。
SPLIT抗体的EC50测定
使用基于二抗的检测(<hu>488，上板)或Pb-DOTA-FITC(DOTA-FITC，下板)确定SPLIT抗体的EC50
实例8：Biacore结合实验
本实例测试了TA-分裂-DOTAM-VH和TA-分裂-DOTAM-VL与参考抗体CEA-DOTAM(RO7198427,PRIT-0213)相比分别与DOTAM的结合。与参考抗体相比，它进一步测试了DOTAM与TA-分裂-DOTAM-VH/VL对的结合。
这些实例中使用的编码与本申请中其他地方使用的蛋白质编号之间的对应关系如下所示。还提供了序列。在本实例中，参考抗体编码为“PRIT_RS”。
对于这些实验，PRIT SPLIT抗体通过第一步MabSelect Sure(亲和色谱)和第二步离子交换色谱(例如POROS XS)纯化，然后通过Superdex200(尺寸排阻色谱)进行抛光。
实验使用Biacore T200在25℃测量温度下进行。所有Biacore T200实验均在HBS-P+(GE Healthcare，Br-1008-27)pH 7.4运行缓冲液中进行。使用不同的DOTAM级分对每个测试抗体/抗体对进行两次实验。
1.在第一个实验中，相对于参考抗体，评估了单个TA-分裂-DOTAM-VH和TA-分裂-DOTAM-VL抗体与在芯片上捕获的生物素化DOTAM的结合。
DOTAM(HBS-P+中的120nM溶液)在CAP芯片表面(10μl/分钟，60秒)上以高密度捕获。然后将Prodrug_A或Prodrug_B在HBS-P+中的600nM溶液注入DOTAM表面(10μl/分钟，90秒)。以10μl/分钟的流速监测解离240秒。使用T200评估软件评估相对最大响应测定。
结果如图26所示。没有一个单独的抗体显示与捕获的DOTAM结合。
2.在第二个实验中，首先使用固定的抗hFab在芯片中捕获单个的TA-分裂-DOTAM-VH和TA-分裂-DOTAM-VL抗体，然后评估DOTAM-单链亲合素复合物(DOTAM+单链亲合素偶联600nM，1:1摩尔，RT 1h)的结合。
将前药_A或前药B在HBS-P+中的600nM溶液注射到抗hFab(GE Healthcare，BR-1008-27)CM5芯片表面(10μl/分钟，120秒)。在高密度捕获前药A或B溶液后，注射DOTAM-单链霉亲合素复合物(20μl/分钟，90秒)。以20μl/分钟的流速监测解离180秒。对于新的周期，通过使用Glycin 2.1和75秒再生时间(10μl/分钟)再生表面。使用T200评估软件评估相对最大响应测定。
结果如图27所示。低百分比最大响应(如图中用*标记)被认为是与DOTAM-SA的“微量”或非特异性相互作用，并反映了优化分析的需要。
3.在第三个实验中，与参考抗体相比，评估了TA-分裂-DOTAM-VH/VL对与DOTAM的结合。首先使用固定的抗hFab在芯片中捕获抗体，然后评估DOTAM-单链霉亲合素复合物(DOTAM+单链霉亲合素偶联600nM，1:1摩尔，RT 1h)的结合。
将前药_A和前药B在HBS-P+中的300nM溶液注射到抗hFab(GE Healthcare，BR-1008-27)CM5芯片表面(10μl/分钟，120秒)。在高密度捕获前药A和B溶液后，注射DOTAM-单链霉亲合素复合物(20μl/分钟，90秒)。以20μl/分钟的流速监测解离180秒。对于新的周期，通过使用Glycin 2.1和75秒再生时间(10μl/分钟)再生表面。使用T200评估软件评估相对最大响应测定。
结果如图28所示。除了P6_AB(P1AF0712/P1AF0713)对之外(它们是DOTA结合物)，所有TA-分裂-DOTAM-VH/VL对都显示出对DOTAM的大量结合。
对于FAP结合物P1AF8286和P1AF8287，也获得了类似的结果，显示TA-分裂-DOTAM-VH/VL对的DOTAM结合量很大，但该对的单个成员没有。P1AF8286由SEQ ID NO:108的第一重链、SEQ ID NO:109的第二重链和SEQ ID NO:111的轻链组成，P1AF8287由SEQ ID NO:108的第一重链、SEQ ID NO:110的第二重链和SEQ ID NO:111的轻链组成。然而，该测定仍需要优化。
实例9
材料和方法
概述
所有实验方案均由地方当局审查和批准(ComitéRégional d'Ethique de l'Experimentation Animale du Limousin[CREEAL]，Laboratoire Départemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)。根据伦理准则，将雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Charles River)维持在无特定和机会性病原体(SOPF)条件下，每天都有光明和黑暗的循环(12h/12h)。在到达后的前5天没有进行任何操作，以使动物适应新环境。每天控制动物的临床症状和不良事件的检测。
通过皮下(SC)注射在与基底膜基质(生长因子降低；目录号354230)1:1混合的细胞培养基中表达CEA的肿瘤细胞建立实体异种移植物。每周3次通过手动卡尺估计肿瘤体积，根据以下公式计算：体积＝0.5×长度×宽度2。根据肿瘤生长速率，按照需要进行额外的肿瘤测量。
如果小鼠因肿瘤负荷、注射副作用或其他原因而表现出难以忍受的痛苦或疼痛迹象，则在预定终点之前对其实施安乐死。疼痛、痛苦或不适的迹象包括但不限于急性体重(BW)下降、毛皮邋遢、腹泻、驼背姿势和嗜睡。立即安乐死的一般标准是BW损失超过初始BW的20％或肿瘤体积达到3000mm3。每周测量3次经处理的动物的BW，根据健康状况按照需要进行额外测量。出于伦理原因考虑安乐死的其他因素为肿瘤状态(例如坏死区域、血液/液体泄漏、自残迹象)和动物的一般外观(例如皮毛、姿势、运动)。
在通过颈椎脱位终止之前，使用麻醉小鼠的眶后出血在安乐死时从静脉窦收集血液，接着采集额外的组织进行放射性测量和组织学分析。记录了意外或异常情况。为生物分布目的收集的器官和组织使用2470WIZARD2自动伽马计数器(PerkinElmer)称重并测量放射性，随后计算每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)，包括对衰减和背景的校正。
使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software,Inc.)进行统计分析。
测试化合物
P1AF6241、P1AF6239、P1AF7887和P1AF7889是靶向CEA的CH1A1A表位的N末端CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体。P1AF6241和P1AF6239对于CEA是单价的，而P1AF7887和P1AF7889对于CEA是二价的。它们的序列如下。
所有抗体构建体均在–80℃下储存，直到注射当天解冻并在标准载体缓冲液(20mM组氨酸、140mM NaCl；pH 6.0)或0.9％NaCl中稀释至各自的最终浓度用于静脉内(IV)施用。
用于放射性标记的DOTAM螯合物由Macrocyclics提供并在进行放射性标记之前维持在–20℃，放射性标记由Orano Med(Razès,France)进行。212Pb-DOTAM(RO7205834)是通过用DOTAM从钍发生器中洗脱产生的，随后在标记后用Ca淬灭。用0.9％NaCl稀释212Pb-DOTAM溶液以获得IV注射所需的212Pb活性浓度。
肿瘤模型
BxPC3是人原发性胰腺腺癌细胞系，天然表达CEA。细胞由ECACC(欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures)(Salisbury,UK))提供，并且在富含10％胎牛血清(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)的RPMI 1640培养基、GlutaMAXTM补充剂、HEPES(Gibco，参考编号72400-021)中培养。在研究的第0天，通过将与基底膜基质(生长因子降低；目录号354230)以1:1混合的RPMI培养基中的细胞皮下注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。在每只小鼠中注射5x106个BxPC3细胞，注射体积是100μL。
研究
方案193
方案193的目的是在使用N末端SPLIT构建体进行2步PRIT后，在携带SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中提供预靶向212Pb-DOTAM的体内分布数据。
通过注射CEA-分裂-DOTAM-VH和CEA-分裂-DOTAM-VL进行两步PRIT，7天后注射212Pb-DOTAM。放射性注射后6小时处死小鼠，采集血液和器官用于放射性测量。
研究概要在图30中示出。
研究设计
方案193的时间进程和设计如下表所示。
方案193的时间进程
研究日 日期 实验程序
0 2020-10-22 BxPC3细胞的制备和注射器的填充
0 2020-10-22 BxPC3细胞的SC注射
15 2020-11-06 SPLIT结构的IV注射
22 2020-11-13 212Pb-DOTAM的洗脱和注射器的填充
22 2020-11-13 212Pb-DOTAM的IV注射
22 2020-11-13 安乐死和组织收获(6h p.i.)+伽马计数
方案193中的研究组
在研究第0天，通过将RPMI/Matrigel中的5×106细胞(第28代)SC注射到右侧腹中，在每只SCID小鼠中建立实体异种移植物。肿瘤细胞注射后15天，将小鼠分成均值肿瘤体积是272mm3的实验组。212Pb-DOTAM于接种后第22天注射，到那时均值肿瘤体积是400mm3。
全部小鼠在注射212Pb-DOTAM 6小时后处死并尸检，收获以下器官和组织进行放射性含量测定：血液、皮肤、卵巢、胃、小肠、结肠、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、肺、心脏、股骨、肌肉、脑、尾巴和肿瘤。
结果
图31显示了注射后6小时在所有收集的组织中的均值212Pb积累和清除。使用CEA单价N末端SPLIT(P1AF6241+P1AF6239)进行预靶向导致均值肿瘤摄取是24.3±5.4％ID/g。CEA二价N末端SPLIT(P1AF7887+P1AF7889)导致均值肿瘤摄取是7.1±2.2％ID/g。使用Sidak多重比较检验的双向方差分析(ANOVA)表明，肿瘤212Pb积累的差异对于治疗具有统计学意义(p<0.0001)。使用该测试(p＝0.05)，在组织积累方面没有其他差异具有统计学意义，并且对于任何一个SPLIT对都没有看到意外的摄取。两条治疗组的肾脏摄取是2.7–3.8％ID/g。
不良事件和毒性
没有与该研究相关的不良事件或毒性。
结论
研究结果证明了使用N末端SPLIT构建体的CA非依赖性2步预靶向的概念验证。实现了212Pb-DOTAM的高肿瘤摄取和特异性肿瘤摄取，在正常组织中几乎没有放射性积累。
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
序列表
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<223> 合成的构建体
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Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
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Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
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Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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<220>
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Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
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Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Gly
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<223> 合成的构建体
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<400> 25
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<223> 合成的构建体
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<400> 27
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 30
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
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165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 32
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 33
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
515 520 525
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 34
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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Asp Tyr Gly Val His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 36
Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala
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<213> 人工序列
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<223> 合成的构建体
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Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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Gly His Asn Asn Arg Pro Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 41
His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 42
Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Pro Pro Gly Glu
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser
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65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asp
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His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 43
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 44
Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 45
Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 46
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
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<211> 7
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 47
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 48
Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
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Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 52
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
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Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
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Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 53
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 54
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
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100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 55
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 56
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 58
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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<220>
<223> 合成的构建体
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 60
Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
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<223> 合成的构建体
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<223> 合成的构建体
<400> 65
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 66
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<223> 合成的构建体
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 71
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1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 72
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 74
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<223> 合成的构建体
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<223> 合成的构建体
<400> 76
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Gly
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 77
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<211> 7
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<220>
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<211> 117
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 81
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 84
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
515 520 525
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 85
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 85
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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260 265 270
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 86
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 86
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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Pro Gly
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 87
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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485 490 495
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<213> 人工序列
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<223> 合成的构建体
<400> 88
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 89
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 90
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 91
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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385 390 395 400
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser
485 490 495
Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
515 520 525
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Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys
580
<210> 92
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 93
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 94
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val
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Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
580 585 590
Thr
<210> 95
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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195 200 205
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210
<210> 97
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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355 360 365
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly
450
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<211> 579
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu
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485 490 495
Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
500 505 510
Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro
515 520 525
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala
530 535 540
Leu Thr Ile Ala Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu
565 570 575
Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 100
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
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Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 101
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
465 470 475 480
Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
485 490 495
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly
500 505 510
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala
515 520 525
Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp Asn Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe
565 570 575
Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
580 585 590
<210> 102
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 103
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
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195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 104
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 105
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 105
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser
260 265 270
Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
275 280 285
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala
290 295 300
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
325 330 335
Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly
340 345 350
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
355
<210> 106
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 106
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
260 265 270
Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
275 280 285
Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
325 330 335
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala
340 345 350
Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Ala
<210> 107
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 108
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 108
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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195 200 205
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 109
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 109
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser
260 265 270
Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
275 280 285
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala
290 295 300
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
325 330 335
Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly
340 345 350
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
355
<210> 110
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 110
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
260 265 270
Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
275 280 285
Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
325 330 335
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala
340 345 350
Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Ala
<210> 111
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 111
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 112
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
<210> 113
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 113
Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp
85 90 95
Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 114
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 114
Gly Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Lys
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 115
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 116
Asp Ser Tyr Met His
1 5
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 117
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 118
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 119
Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 120
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 121
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 122
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Met
1 5 10
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 123
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 124
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 125
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 126
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 127
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 128
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 128
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 129
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 130
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 136
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 136
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 137
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 138
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 138
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 139
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 140
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 140
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 141
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 141
Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu
1 5 10 15
Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn
50 55 60
Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser Val Asp
65 70 75 80
His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn
85
<210> 142
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 142
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
1 5 10 15
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
50 55 60
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
65 70 75 80
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn
85
<210> 143
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 143
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 144
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 144
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 145
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
245 250 255
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser
260 265 270
Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
275 280 285
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
290 295 300
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
305 310 315 320
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly
325 330 335
Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys
340 345 350
Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
370 375 380
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
385 390 395 400
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
405 410 415
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
420 425 430
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
435 440 445
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
450 455 460
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
465 470 475 480
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
485 490 495
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
500 505 510
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
515 520 525
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
530 535 540
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
545 550 555 560
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
565 570 575
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
580 585 590
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 146
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val
245 250 255
Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
260 265 270
Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala
275 280 285
Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala
290 295 300
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser
305 310 315 320
Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro
340 345 350
Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
385 390 395 400
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
405 410 415
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
420 425 430
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
435 440 445
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
450 455 460
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
465 470 475 480
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
485 490 495
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
500 505 510
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
515 520 525
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
530 535 540
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
545 550 555 560
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
565 570 575
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
580 585 590
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
595 600 605
Leu Ser Pro Gly Lys
610
<210> 147
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 148
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 148
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly
20
<210> 149
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 150
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly
20
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 151
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 152
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 153
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
580 585 590
Ser Thr

Claims (88)

1.一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其包含：
a)抗原结合部分，其中所述抗原结合部分与靶抗原结合；
b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成；和
c)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(b)的所述多肽通过其N末端与(a)的所述抗原结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(c)的所述Fc结构域的所述亚基中的一个的N末端融合；
并且其中所述第一抗体不包含针对所述效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；和
ii)第二抗体，其包含：
d)抗原结合部分，其中所述抗原结合部分与靶抗原结合；
e)多肽，其包含针对所述效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对所述效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成；和
f)Fc结构域，其包含两个亚基，
其中(e)的所述多肽通过其N末端与(d)的所述抗原结合部分的C末端融合并且通过其C末端与(f)的所述Fc结构域的所述亚基中的一个的N末端融合；
并且其中所述第二抗体不包含针对所述效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；
其中所述第一抗体的所述VH结构域和所述第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对所述效应子部分的功能抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的一组抗体，其中(a)的所述抗原结合部分和(d)的所述抗原结合部分为Fab。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体为单臂抗体。
4.根据权利要求3所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体对于靶抗原是单特异性的和单价的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中：
所述第一抗体包含以下多肽：
i)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
ii)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
iii)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(i)的所述Fab重链和(ii)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段；并且
所述第二抗体包含以下多肽：
iv)多肽，其从N末端到C末端包含：Fab重链(例如，VH-CH1)；任选的接头；针对效应子部分的抗原结合位点的VL结构域；任选的接头；和Fc亚基(例如，CH2-CH3)；
v)Fab轻链多肽(例如，VL-CL)；和
vi)Fc亚基多肽(例如，CH2-CH3)；
其中(iv)的所述Fab重链和(v)的Fab轻链形成能够与靶抗原结合的Fab片段。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与靶抗原结合的另外的抗原结合部分。
7.根据权利要求6所述的一组抗体，其中所述第一抗体的另外的抗体部分与(a)的所述抗原结合部分结合至相同的靶抗原。
8.根据权利要求1、2、6或7中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与靶抗原结合的另外的抗原结合部分。
9.根据权利要求8所述的一组抗体，其中所述第二抗体的所述另外的抗原结合部分与(d)的所述抗原结合部分结合至相同的靶抗原。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的一组抗体，其中：
所述第一抗体包含：
a)第一Fab片段，其中所述Fab片段与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(VH)组成；和
c)Fc结构域，其包含第一亚基和第二亚基，
其中(b)的所述多肽通过其N末端与(a)的所述Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(c)的所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合；
并且进一步包含与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的第二Fab片段，其中第二Fab通过其链中的一条的C末端与(c)的所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合；
并且所述第二抗体包含：
d)第一Fab片段，其中所述Fab片段与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；
e)多肽，其包含针对所述效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)或由针对所述效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(VL)组成；和
f)Fc结构域，其包含第一亚基和第二亚基，
其中(e)的所述多肽通过其N末端与(d)的所述Fab片段的链中的一条的C末端融合并且通过其C末端与(f)的所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合；
并且进一步包含与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的第二Fab片段，其中第二Fab通过其链中的一条的C末端与(f)的所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合；
其中所述第二抗体不包含针对所述效应子部分的抗原结合位点的VH结构域；并且
其中所述第一抗体的所述VH结构域和所述第二抗体的所述VL结构域能够一起形成针对所述效应子部分的功能抗原结合位点。
11.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中对Fc区进行工程改造以降低或消除Fc效应子功能。
13.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中
在所述第一抗体中，(b)的所述多肽通过其N末端经由接头与(a)的所述Fab片段的所述链中的一条的所述C末端融合，并且通过其C末端经由接头与(c)的所述Fc结构域的所述亚基中的一个的所述N末端融合；并且
在第二抗体中，(e)的所述多肽通过其N末端经由接头与(d)的所述Fab片段的所述链中的一条的所述C末端融合，并且通过其C末端经由接头与(f)的所述Fc结构域的所述亚基中的一个的所述N末端融合。
14.根据权利要求13所述的一组抗体，其中所述接头为10至70、10至60、10至50个氨基酸的或15至30个氨基酸的柔性接头。
15.根据权利要求13所述的一组抗体，其中所述接头为柔性接头，其包含选自Gly和Ser的15至30个连续残基，任选地，选自Gly和Ser的15至25个连续残基，任选地选自Gly和Ser的16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续残基。
16.根据权利要求15所述的一组抗体，其中所述接头为或包含GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(SEQ ID NO:148)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGS(SEQ ID NO:149)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(SEQ ID NO:150)，任选地GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(SEQ ID NO:148)或GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(SEQ ID NO:150)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述效应子部分选自药物、细胞毒素、显像剂或放射性标记的化合物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述效应子部分为放射性标记的化合物。
19.根据权利要求18所述的一组抗体，其中所述放射性标记的化合物包含放射性标记的DOTA或其盐或功能变体。
20.根据权利要求19所述的一组抗体，其中所述放射性标记的化合物为用Lu或Y放射性同位素来放射性标记的DOTA或其盐或功能变体。
21.根据权利要求19或20所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VH结构域包含：(a)含有SEQID NO:35的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-H3。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VH结构域包含SEQID NO:41的氨基酸序列、或其包含与SEQID NO:41具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VL结构域包含：(d)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L3。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VL结构域包含SEQID NO:42的氨基酸序列、或其包含与SEQID NO:42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
25.根据权利要求18所述的一组抗体，其中所述放射性标记的化合物包含Pb-DOTAM。
26.根据权利要求25所述的一组抗体，其中针对Pb-DOTAM的功能结合位点以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小、或0.5pM或更小的结合亲和力的KD值进行结合。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的一组抗体，其中针对Pb-DOTAM的所述功能结合位点与Pb-DOTAM以及与Bi-DOTAM结合。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VH结构域包含：
a)重链CDR2，其包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)、或其在SEQ ID NO:2中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，并且任选地也不包括Gly52和/或Arg54；
b)重链CDR3，其包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)、或其在SEQ ID NO:3中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，并且任选地也不包括Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E并且/或者任选地也不包括Tyr99；
和重链CDR1，其任选地为：
c)重链CDR1，其包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)或其在SEQ ID NO:1中具有多至1、2或3个取代的变体。
29.根据权利要求28所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VH结构域包含：(a)CDR-H1，其包含GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列和(c)CDR-H3，其包含ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VH结构域包含选自由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VL结构域包含
d)轻链CDR1，其包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或其在SEQ ID NO:4中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Tyr28和Asp32；
e)轻链CDR3，其包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或其在SEQ ID NO:6中具有多至1、2或3个取代的变体，其中这些取代不包括Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和Tyr96,和轻链CDR2，其任选地为
f)轻链CDR 2，其包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO:5)或其在SEQ ID NO:5中具有至少1、2或3个取代的变体，任选地所述取代不包括Gln50。
32.根据权利要求31所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VL结构域包含：(d)CDR-L1，其包含QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含QASKLAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的一组抗体，其中针对所述放射性标记的化合物的所述抗原结合位点的所述VL结构域包含SEQID NO:8的氨基酸序列、或其包含与SEQ IDNO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
34.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体与相同的靶抗原结合。
35.根据权利要求34所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体与所述相同的靶抗原的相同表位结合。
36.根据权利要求34所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体与所述相同的靶抗原的不同表位结合。
37.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述靶抗原为肿瘤相关抗原。
38.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述靶抗原选自由癌胚抗原(CEA)、CD20、HER2、EGP-1(上皮糖蛋白-1，也称为滋养层-2)、结肠特异性抗原-p(CSAp)、胰腺粘蛋白MUC1、GPRC5D和FAP组成的组。
39.根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体，其中所述靶抗原选自由CEA、GPRC5D和FAP组成的组。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的一组抗体，其中所述靶抗原为CEA。
41.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含：
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQ IDNO:25组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ IDNO:26组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
44.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区，其包含(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
45.根据权利要求40或44所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQ ID NO:49组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
46.根据权利要求40、44或45中任一项所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQID NO:50组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
47.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
48.根据权利要求40或47所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQ ID NO:17组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
49.根据权利要求40、47或48所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
50.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
51.根据权利要求40或权利要求50所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQ IDNO:65组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
52.根据权利要求40、50或51所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ ID NO:66组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
53.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区，其包含(a)含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:117或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQ IDNO:119的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)含有SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:121或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR-L3。
54.根据权利要求40或53所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:134的氨基酸序列、或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；以及轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140的氨基酸序列、或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
55.根据权利要求40、53或54所述的一组抗体，其中所述第一抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：
(a)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(b)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(c)含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(d)含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(e)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(f)含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(g)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域。
56.根据权利要求40至55中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
57.根据权利要求40至56中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQ IDNO:25组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
58.根据权利要求40至57中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ IDNO:26组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
59.根据权利要求40至55中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区，其包含(a)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含有SEQID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
60.根据权利要求40至55或59中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQID NO:49组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
61.根据权利要求40至55、59或60中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ ID NO:50组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
62.根据权利要求40至55中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
63.根据权利要求40至55或62中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQID NO:17组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
64.根据权利要求40至55、62或63中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
65.根据权利要求40至55中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含
重链可变区，其包含：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR-H2；
和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含：(d)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；和
(f)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
66.根据权利要求40至55或65中任一项所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VH序列，所述VH序列包含选自由SEQID NO:65组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
67.根据权利要求40至55、65或66所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含针对CEA的抗原结合位点，所述针对CEA的抗原结合位点包含VL序列，所述VL序列包含选自由SEQ IDNO:66组成的组的氨基酸序列、或其包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的变体。
68.根据权利要求40至55所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区，其包含(a)含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR-H2；(c)含有SEQID NO:119的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)含有SEQ ID NO:120、SEQID NO:121或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-L1；(e)含有SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)含有SEQID NO:126的氨基酸序列的CDR-L3。
69.根据权利要求40至55或68所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:134的氨基酸序列、或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；以及轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140的氨基酸序列、或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
70.根据权利要求40至55、68或69所述的一组抗体，其中所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：
(a)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(b)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(c)含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VL结构域；或者
(d)含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(e)含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(f)含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域；或者
(g)含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL结构域。
71.根据权利要求40所述的一组抗体，其中所述第一抗体为根据权利要求47至49中任一项所述的抗体并且所述第二抗体为根据权利要求56至58中任一项所述的抗体。
72.根据权利要求71所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体包含与CEA结合的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：轻链可变结构域，其与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；以及
重链可变结构域，其与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
73.根据权利要求71或72所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体对于所述靶抗原是单特异性的和单价的。
74.根据权利要求73所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体各自包含与CEA结合的两个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：轻链可变结构域，其与SEQ ID NO26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；以及重链可变结构域，其与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
75.根据权利要求1或72所述的一组抗体，其中
所述第一抗体包含：SEQ ID NO:146的第一重链；SEQ ID NO:144的第二重链；和SEQ IDNO:143的轻链；并且/或者
所述第二抗体包含SEQ ID NO:145的第一重链；SEQ ID NO:144的第二重链；和SEQ IDNO:143的轻链。
76.根据权利要求1或权利要求74所述的一组抗体，其中：
所述第一抗体包含：SEQ ID NO:146的第一重链多肽；SEQ ID NO:
147的第二重链多肽；以及SEQ ID NO:143的第一轻链多肽和第二轻链多肽；并且/或者
所述第二抗体包含：SEQ ID NO:145的第一重链多肽；SEQ ID NO:
147的第二重链多肽；以及SEQ ID NO:143的第一轻链多肽和第二轻链多肽。
77.一组核酸，其表达根据前述权利要求中任一项所述的一组抗体。
78.一种表达载体或一组表达载体，其包含根据权利要求77所述的一组核酸。
79.一种宿主细胞或一组宿主细胞，其包含根据权利要求78所述的表达载体或一组表达载体。
80.一种预靶向放射免疫疗法的方法，其包括
i)向受试者施用根据权利要求1至76中任一项所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体同时或以任一顺序依次施用，其中所述抗体与所述靶抗原结合并且定位于表达所述靶抗原的细胞的表面；并且其中所述第一抗体和所述第二抗体的缔合形成针对所述放射性标记的化合物的功能结合位点；
并且
ii)随后施用放射性标记的化合物，其中所述放射性标记的化合物与针对所述放射性标记的化合物的功能结合位点结合。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述方法不包括施用清除剂或阻断剂的步骤。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述受试者为人。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中所述靶抗原为癌症相关抗原或肿瘤相关抗原并且所述方法为肿瘤或癌症的放射免疫疗法的方法。
84.根据权利要求1至76中任一项所述的一组抗体，其用于根据权利要求80至83中任一项所述的预靶向放射免疫疗法的方法中。
85.一种将放射性同位素靶向组织或器官以进行放射成像的方法，其包括：
i)向受试者施用根据权利要求1至76中任一项所述的一组抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体同时或以任一顺序依次施用，其中所述抗体与靶抗原结合并且定位于表达所述靶抗原的细胞的表面，其中所述第一抗体和所述第二抗体的缔合形成针对所述放射性标记的化合物的功能结合位点；
并且
ii)随后施用放射性标记的化合物，其中所述放射性标记的化合物与针对所述放射性标记的化合物的所述功能结合位点结合。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述方法不包括施用清除剂或阻断剂的步骤。
87.根据权利要求85或86所述的方法，其中所述方法进一步包括成像的步骤。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述靶抗原为癌症相关抗原或肿瘤相关抗原并且所述方法为对肿瘤或癌症成像的方法。
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